Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

6 lutego 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Streszczenie

Przeciwciała monoklonalne (mAb) są potężnymi narzędziami przydatnymi zarówno w badaniach podstawowych, jak i w biomedycynie. Ich wysoka swoistość jest niezbędna, gdy przeciwciało musi rozróżnić wysoce spokrewnione struktury (np. normalne białko i jego zmutowaną wersję). Obecny sposób generowania takich dyskryminujących mAb obejmuje szeroko zakrojone badania przesiewowe wielu komórek B wytwarzających Ab, co jest zarówno kosztowne, jak i czasochłonne. Proponujemy tutaj szybką i opłacalną metodę generowania dyskryminujących, w pełni ludzkich mAb, zaczynając od ludzkich limfocytów B krążących we krwi. Oryginalność tej strategii wynika z selekcji specyficznych komórek B wiążących antygen w połączeniu z kontrselekcją wszystkich innych komórek, przy użyciu łatwo dostępnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po wyizolowaniu określonych komórek B, sekwencje cDNA (komplementarny kwas dezoksyrybonukleinowy) kodujące odpowiednie mAb są uzyskiwane przy użyciu technologii jednokomórkowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR), a następnie ulegają ekspresji w komórkach ludzkich. W ciągu zaledwie 1 miesiąca możliwe jest wyprodukowanie miligramów wysoce dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko praktycznie każdemu pożądanemu antygenowi naturalnie wykrywanemu przez repertuar limfocytów B.

Wprowadzenie

Opisana tutaj metoda pozwala na szybką i wszechstronną produkcję w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych (mAb) przeciwko pożądanemu antygenowi (Ag). MAb są niezbędnymi narzędziami w wielu podstawowych zastosowaniach badawczych in vitro i in vivo: na przykład cytometria przepływowa, histologia, western-blotting i eksperymenty blokujące. Co więcej, mAb są coraz częściej stosowane w medycynie do leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów oraz do kontroli odrzucenia przeszczepu1. Na przykład przeciwciała monoklonalne anty-CTLA-4 i anty-PD-1 (lub anty-PD-L1) były ostatnio stosowane jako inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych w leczeniu raka2.

Pierwsze mAb były wytwarzane przez hybrydomy wydzielające immunoglobuliny (Ig) uzyskane z komórek śledziony immunizowanych myszy lub szczurów. Jednak silna odpowiedź immunologiczna przeciwko mysim lub szczurzym przeciwciałom monoklonalnym utrudnia ich terapeutyczne zastosowanie u ludzi, ze względu na ich szybki klirens i prawdopodobną indukcję reakcji nadwrażliwości3. Aby rozwiązać ten problem, sekwencje białek zwierzęcych mAb zostały częściowo zastąpione ludzkimi w celu wytworzenia tak zwanych chimerycznych przeciwciał mysich i ludzkich lub humanizowanych. Jednak strategia ta tylko częściowo zmniejsza immunogenność, jednocześnie znacznie zwiększając zarówno koszty, jak i skalę czasową produkcji. Lepszym rozwiązaniem jest generowanie ludzkich mAb bezpośrednio z ludzkich limfocytów B i dostępnych jest kilka strategii w tym zakresie. Jednym z nich jest wykorzystanie fagów lub drożdży. Polega to na wyświetleniu zmiennych domen z kombinatorycznej biblioteki losowych ciężkich i lekkich łańcuchów ludzkiego Ig na fagach lub drożdżach i przeprowadzeniu etapu selekcji przy użyciu określonego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Główną wadą tej strategii jest to, że łańcuchy ciężkie i lekkie są losowo powiązane, co prowadzi do bardzo dużego wzrostu różnorodności generowanych przeciwciał. Jest mało prawdopodobne, aby uzyskane przeciwciała odpowiadały tym, które powstałyby w wyniku naturalnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko określonemu Ag. Co więcej, fałdowanie białek ludzkich i modyfikacje potranslacyjne nie są systematycznie odtwarzane u prokariontów ani nawet u drożdży. Drugą metodą produkcji mAb u ludzi jest unieśmiertelnienie naturalnych ludzkich limfocytów B przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr lub ekspresję czynników antyapoptotycznych BCL-6 i BCL-XL4. Jednak metoda ta ma zastosowanie tylko do komórek B pamięci i jest nieefektywna, wymagając badań przesiewowych wielu nieśmiertelnych komórek B wytwarzających mAb w celu zidentyfikowania kilku (jeśli w ogóle) klonów mAb o pożądanej swoistości antygenowej. Metoda ta jest więc zarówno kosztowna, jak i czasochłonna.

Niedawno opisano nowy protokół produkcji ludzkich mAb z izolowanych pojedynczych komórek B5. Opiera się na zoptymalizowanej jednokomórkowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) do amplifikacji zarówno segmentów kodujących łańcuchy ciężkie, jak i lekkie z pojedynczej posortowanej komórki B. Następnie następuje klonowanie i ekspresja tych segmentów w eukariotycznym systemie ekspresji, co pozwala na rekonstrukcję w pełni ludzkiego mAb. Protokół ten jest z powodzeniem stosowany począwszy od limfocytów B od zaszczepionych dawców. Komórki pobrano kilka tygodni po szczepieniu, aby uzyskać wyższe częstotliwości limfocytów B skierowanych przeciwko pożądanemu Ag, a tym samym ograniczyć czas wymagany do przeprowadzenia badań przesiewowych6. Inne w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne zostały również wyprodukowane od pacjentów zakażonych wirusem HIV+ (ludzki wirus niedoboru odporności)7 i pacjentów z czerniakiem8. Pomimo tych postępów, nadal nie ma dostępnej procedury, która umożliwiałaby izolację komórek B specyficznych dla Ag niezależnie od ich fenotypu pamięci lub częstotliwości.

Opisana tutaj procedura prowadzi do efektywnej izolacji ex vivo krążących ludzkich komórek B na podstawie ich specyficzności BCR, a następnie do produkcji w pełni ludzkich przeciwciał specyficznych dla antygenu w wysokiej wydajności i z krótkim czasem badania. Metoda nie ogranicza się do limfocytów B pamięci lub limfocytów B wydzielających przeciwciała indukowanych po odpowiedzi immunologicznej, ale może być również stosowana do repertuaru ludzkich naiwnych limfocytów B. To, że działa nawet zaczynając od komórek B specyficznych dla Ag obecnych na bardzo niskich częstotliwościach, jest dobrym wskaźnikiem jego skuteczności. Zasada metody jest następująca: komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są barwione dwoma tetramerami prezentującymi antygen będący przedmiotem zainteresowania, z których każdy jest znakowany innym fluorochromem (np. fikoerytryną (PE) i allofikocyjaniną (APC)), a trzeci tetramer prezentujący blisko spokrewniony antygen sprzężony z trzecim fluorochromem (np., Brillant Violet 421 (BV421)). Aby wzbogacić komórki wiążące antygen, komórki są następnie inkubowane z kulkami pokrytymi anty-PE i anty-APC Abs i sortowane w kolumnach separacji komórek. Frakcja komórkowa PE+ APC+ jest selekcjonowana, barwiona różnymi mAb specyficznymi dla różnych typów komórek PBMC, aby umożliwić identyfikację komórek B, i poddawana sortowaniu komórek metodą cytometrii przepływowej. Limfocyty B, które są PE+ i APC+, ale Brilliant Violet-, są izolowane. Ten krok przeciwselekcjonuje komórki, które nie są komórkami B lub nie wiążą się z tetrameryzowanym antygenem, ale wiążą się z PE lub APC (komórki te będą PE+ APC- lub PE- APC+) lub z nieantygenową częścią użytych tetramerów (komórki te będą BV421+). Limfocyty B, które nie są wysoce specyficzne dla epitopu będącego przedmiotem zainteresowania, są również poddawane kontrselekcji na tym etapie (komórki te również będą BV421+). W ten sposób metoda ta może oczyścić wysoce specyficzne limfocyty B z ekspresją receptorów komórek B (BCR) zdolnych do rozróżniania dwóch bardzo blisko spokrewnionych antygenów. Pojedyncze specyficzne limfocyty B są zbierane w probówkach, a ich amplifikowane PCR Ig cDNA (komplementarne kwasy dezoksyrybonukleinowe) klonowane i wyrażane przez ludzką linię komórkową jako wydzielane mAb IgG.

Jako dowód koncepcji, to badanie opisuje efektywne generowanie ludzkich mAb, które rozpoznają peptyd prezentowany przez cząsteczkę głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHC-I) i mogą odróżnić ten peptyd od innych peptydów załadowanych na ten sam allel MHC-I. Chociaż poziom złożoności tego Ag jest ważny, metoda ta pozwala (i) na odzysk mAb specyficznych dla Ag z wysoką wydajnością; (ii) wytwarzanie mAb zdolnych do rozróżniania dwóch strukturalnie bliskich Ag. Podejście to może być rozszerzone na zaszczepionych lub zakażonych pacjentów bez żadnej modyfikacji protokołu, a także zostało już z powodzeniem wdrożone w humanizowanym systemie szczurów9. W związku z tym badanie to opisuje wszechstronne i skuteczne podejście do generowania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które można wykorzystać w badaniach podstawowych i immunoterapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki ludzkiej krwi obwodowej zostały pobrane od anonimowych dorosłych dawców po świadomej zgodzie, zgodnie z lokalną komisją etyki (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedura PLER NTS-2016-08).

1. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

UWAGA: Materiałem wyjściowym mogą być próbki całkowitej ludzkiej krwi obwodowej lub cytaferezy. Próbki nie powinny być starsze niż 8 godzin i uzupełnione antykoagulantami (np. heparyną).

  1. Rozcieńczyć krew 2 objętościami (ludzka krew obwodowa) lub 5 objętościami (próbka cytaferezy) podłoża RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  2. Ostrożnie nałożyć 35 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek na 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przygotuj tyle probówek, ile potrzeba, aby rozprowadzić całą rozcieńczoną krew. Wirować przy 1 290 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej w wirniku wahliwym z wyłączonym hamulcem.
  3. Ostrożnie zassać jednojądrzastą warstwę komórkową na granicy faz między ośrodkiem gradientu gęstości a warstwą plazmy i przenieść komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Napełnij probówkę pożywką RPMI, wymieszaj i odwiruj przy 1 290 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki RPMI i odwirować przy 200 x g przez 10 minut w celu usunięcia płytek krwi. Ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok raz.
  6. Zawiesić osad komórkowy w pożywce RPMI za pomocą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    UWAGA: Przejdź bezpośrednio do znakowania tetramerem lub utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C przez noc w stężeniu 10-7 komórek/ml.

2. Magnetyczne wzbogacanie komórek B specyficznych dla Ag związanych z tetramerami

  1. Przygotować tetramery Ag, dodając streptawidynę klasy premium znakowaną PE lub APC lub streptawidynę znakowaną BV421 w stosunku molowym 1:4 do biotynylowanych monomerów antygenu. Dodać odpowiednią ilość koniugatu streptawidyny w trzech oddzielnych porcjach, dodając jedną podwielokrotność co 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Rozprowadzić komórki (do 3 x 108 na probówkę) w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i odwirować przy 460 x g przez 5 minut
    UWAGA: Poniższy protokół dotyczy jednej probówki.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) z 2% FBS. Dodaj tetramery sprzężone z PE, APC i BV421, każdy do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować lodowaty bufor do separacji komórek (SB) przy użyciu PBS z 0,5% BSA (albumina surowicy bydlęcej) i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) 2 mM.
  5. Dodać 10 ml SB. Komórki osadu przez odwirowanie przy 460 x g przez 5 min.
  6. Zawieś komórki w 500 μl lodowatego SB. Dodaj 50 μl anty-PE i 50 μl mikrokulek magnetycznych anty-APC.
  7. Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Powtórz krok 2.5 dwa razy.
  9. Ostrożnie usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w stężeniu 2 x 108 komórek/ml w lodowatym SB.
  10. Zrównoważ dużą kolumnę magnetyczną umieszczoną na magnesie z 3 ml SB.
  11. Przenieść zawiesinę komórek z 2,9 na wierzch zrównoważonej kolumny i pozwolić jej całkowicie spłynąć. KROK KRYTYCZNY: Aby uniknąć zbrylania się kolumny, przepuść komórki przez siatkę nylonową o grubości 70 μm.
  12. Przepłukać probówkę, w której znajdowały się komórki, 3 ml lodowatego SB i przenieść bufor bezpośrednio do kolumny (w przypadku filtracji przepłukać siatkę nylonową o grubości 70 μm).
  13. Gdy bufor całkowicie spłynie do kolumny, dodaj kolejne 3 ml lodowatego SB do kolumny.
  14. Powtórz krok 2.13 dla kolejnych 3 ml prania.
  15. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją na stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
  16. Dodać 5 ml lodowatego SB na wierzch kolumny i natychmiast wypłukać komórki z kolumny za pomocą tłoka. Powtórz ten krok raz.
  17. Odwirować pobrane komórki (wzbogacone odpowiednią tetramerowo-dodatnią frakcję komórkową) przy 460 x g przez 5 minut i przystąpić do dodatkowego barwienia przeciwciałami.
    UWAGA: W razie potrzeby należy zebrać komórki ze wszystkich probówek.

3. Barwienie ludzkich komórek B specyficznych dla Ag i sortowanie komórek

  1. Zawiesić osad komórkowy koktajlem przeciwciał anty-ludzkich przeciwko CD3 (końcowe rozcieńczenie: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50) i 7AAD (1:1000) w końcowej objętości 100 μl PBS z 2% FBS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Dodać 10 ml PBS do komórek, odwirować przy 460 x g przez 5 minut i wyeliminować supernatant. Powtórz ten krok raz. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS, przefiltrować na siatkę nylonową o grubości 70 μm.
  3. Kontynuuj sortowanie określonych komórek B na poziomie pojedynczej komórki na cytometrze sortera komórek z dyszą 100 μm i ciśnieniem 20 psi bez przekraczania 1,000 zdarzeń/s9.
    UWAGA: Zastosowana strategia bramkowania jest pokazana w Rysunek 1. Komórki najpierw bramkowano na komórkach CD14-CD16-7AAD-, aby wykluczyć monocyty, NK i martwe komórki (nie pokazano w Rysunek 1). Następnie komórki B CD19 + wybrano przed bramkowaniem na podwójnie wybarwionych komórkach za pomocą odpowiednich dla PE i APC tetramerów Ag. Niespecyficzne limfocyty B wykluczono przez bramkowanie na komórkach ujemnych BV421 (niebarwionych nieistotnym tetramerem Ag).
  4. Zbierz pojedyncze komórki B do 8-paskowych probówek PCR uprzednio wypełnionych 10 μl 1x PBS i 10 jednostek inhibitora RNAzy i umieszczonych na stojaku na 96 mikroprobówek. Natychmiast zamrozić probówki do PCR w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Maski sortowania wybrane na przyrządzie cytometru to maska wydajności: 0, maska czystości: 32 i maska fazy: 0. W razie potrzeby ten depozyt jednokomórkowy można dostosować do 96- lub 384-dołkowej płytki PCR. Pojedyncze komórki B muszą zostać zamrożone tak szybko, jak to możliwe i w razie potrzeby można je pozostawić w temperaturze -80 °C na kilka tygodni.

4. Jednokomórkowy RT-PCR

  1. Lizować komórki poprzez bezpośrednie podgrzewanie zamrożonych próbek w paskach PCR w temperaturze 70 °C przez 5 minut w suchej kąpieli.
  2. Przenieś paski do lodu i przystąp do odwrotnej transkrypcji (RT), dodając 10 μl na probówkę 2x buforu master mix zawierającego 1 mM dNTP, 25 μg/ml starterów oligod(T), 5 μM losowych heksamerów, 20 jednostek inhibitora RNAzy i 400 jednostek odwrotnej transkryptazy.
    UWAGA: Po rozmrożeniu komórek RT należy wykonać szybko, aby uniknąć degradacji RNA.
  3. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut, aby umożliwić losowe heksamery do hybrydyzacji, następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C i zakończyć inkubacją w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, aby zatrzymać reakcję.
  4. Kontynuuj dwie rundy zagnieżdżonej amplifikacji PCR dla każdego z regionów kodujących zmienne łańcuchy ciężkie (vH) i kappa (vLκ) lub lambda (vLλ).
    UWAGA: Alternatywnie, próbki RT można zamrozić w temperaturze -20 °C i przechowywać przez tydzień.
    1. W pierwszej rundzie PCR dodaj 3 μl cDNA dla 40 μl końcowej objętości zawierającej 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTP, 2,5 jednostki polimerazy DNA i 200 nM zewnętrznych starterów (patrz Rysunek 2 i Tabela materiałów dla sekwencji starterów).
      UWAGA: Skład podkładów zewnętrznych wymieszać. Do wzmocnienia ciężkiego łańcucha: 4 startery do przodu (mieszanka 5'LVH) i 2 startery do tyłu (mieszanka 3'CμCγ). Do lekkiego wzmocnienia łańcucha kappa, 3 startery do przodu (5'LV| mix) i 1 starter odwrotny (3'Cκ543-566). Do lekkiego wzmocnienia łańcucha lambda, 7 starterów do przodu (mieszanka 5'LVl) i 1 starter odwrotny (3'Cl).
      UWAGA: Startery zostały zaprojektowane przez Tillera i wsp. do amplifikacji wszystkich genów rodziny ciężkich i lekkich łańcuchów5.
    2. Stosować następujące warunki cyklu: 94 °C przez 4 minuty, następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 58 °C dla VH i VLκ (60 °C dla VLλ) i 55 s w temperaturze 72 °C, z końcowym krokiem wydłużania w temperaturze 72 °C przez 7 minut.
    3. W przypadku drugiej rundy PCR należy użyć 3 μl pierwszego produktu do amplifikacji dla końcowej objętości 40 μL zawierającej 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM dNTP, 2,5 jednostki polimerazy DNA i 200 nM wewnętrznych starterów zawierających miejsca enzymów restrykcyjnych do klonowania w wektory ekspresyjne (patrz Rysunek 2 i Tabela materiałów dla sekwencji starterów).
      UWAGA: Skład podkładów wewnętrznych wymieszać. Do wzmocnienia ciężkiego łańcucha: 9 starterów do przodu (5'AgeIVH mix) i 3 startery do tyłu (3'SalIJH mix). Do lekkiego wzmocnienia łańcucha kappa, 9 starterów do przodu (5'AgeIV| mix) i 3 startery odwrotne (3'BsiWIJκ mix). Do lekkiego wzmocnienia łańcucha lambda, 6 starterów do przodu (5'AgeIVl mix) i 1 starter odwrotny (3'XhoICl).
      UWAGA: Startery zostały zaprojektowane przez Tillera i wsp., do amplifikacji wszystkich genów rodziny łańcuchów ciężkich i lekkich5.
    4. Stosować następujące warunki cyklu: 94 °C przez 4 minuty, następnie 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 58 °C dla VH i LCκ (60 °C dla LCλ) i 45 s w temperaturze 72 °C z końcowym krokiem wydłużania w temperaturze 72 °C przez 7 minut.
  5. Zidentyfikuj dołki dodatnie, migrując 5 μl produktów PCR vH, vLκ i vLλ na 1,5% żelu agarozowym (produkty 500 pz dla segmentów kodujących zmienne łańcuchy ciężkie i produkt 350 pz dla segmentów kodujących zmienne łańcuchy lekkie).
  6. Pozostałe 35 μl produktów PCR pozostałych z dołków dodatnich należy oczyścić za pomocą membran ultrafiltracyjnych przeznaczonych do oczyszczania produktów PCR.
  7. Elute produkty PCR za pomocą 60 μLH2O.

5. Klonowanie wyrażeń

  1. Przygotuj wkładki
    UWAGA: Strawić 60 μl każdego oczyszczonego produktu PCR w końcowej objętości 100 μl zawierającej odpowiedni bufor enzymu restrykcyjnego.
    1. W przypadku produktów vH PCR dodać 50 jednostek AgeI i 50 jednostek SalI i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. W przypadku produktów vLλ PCR dodać 50 jednostek AgeI i 50 jednostek XhoI i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. W przypadku produktów vLκ PCR dodać 50 jednostek AgeI i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Oczyszczać trawić przy użyciu 96 membran PCR i eluować 60 μlH2O. Trawić 60 μl eluatu w końcowej objętości 100 μL buforu enzymu restrykcyjnego BsiWI, dodać 50 jednostek BsiWI, i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C.
    4. Dezaktywować enzymy przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 15 minut.
  2. Przygotowanie wektorów wyrażających
    UWAGA: Produkty vH PCR są klonowane w wektorze ekspresyjnym (HCγ1) zawierającym stały łańcuch ciężki Cγ1 IgG1. Produkty vLκ PCR klonuje się w wektorze ekspresyjnym (LCκ) zawierającym stały łańcuch lekki Cκ. vLλ Produkty PCR klonuje się w wektorze ekspresyjnym (LCλ) zawierającym stały łańcuch lekki Cλ.
    1. Wykonaj następujące trawienie:
      1. Zmieszać 1 μg wektora ekspresyjnego HCγ1 z 10 jednostkami endonukleaz AgeI i 10 jednostkami endonukleaz SalI w całkowitej objętości 20 μl buforu restrykcyjnego zalecanego przez producenta i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      2. Zmieszać 1 μg wektora ekspresyjnego LCκ z 10 jednostkami enzymu restrykcyjnego AgeI w całkowitej objętości 20 μl buforu restrykcyjnego zalecanego przez producenta i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Dodać 10 jednostek enzymu restrykcyjnego BsiWI i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 55 °C.
      3. Zmieszać 1 μg wektora ekspresyjnego LCλ z 10 jednostkami AgeI i 10 jednostkami endonukleaz XhoI w całkowitej objętości 20 μl buforu restrykcyjnego zalecanego przez producenta i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C
    2. Podgrzewać każdą mieszaninę wytrawiania w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu dezaktywacji enzymów restrykcyjnych.
    3. Przeprowadzić ligację 5 μl strawionego produktu PCR z 2 μl (100 ng) odpowiedniego linearyzowanego wektora ekspresyjnego w całkowitej objętości 20 μL 1x buforu ligazy DNA z 1 jednostką ligazy DNA T4 przez inkubację przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Alternatywnie podwiązanie wykonuje się przez 3 godziny w temperaturze 4°C.
  3. klonowanie
    1. Elektroporować 1 μl z 20 μl mieszaniny ligacyjnej do 45 μl domowej elektrokompetentnej TOP10 E. coli (Aktualne protokoły biologii molekularnej, sekcja 1.8.4-1.8.8). Natychmiast dodać 500 μL pożywki 2X YT i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min. Rozprzestrzeniaj przekształcone bakterie na 2x płytkach ampicyliny YT. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Dla każdej transformacji należy przebadać osiem kolonii metodą PCR.
      1. Ustaw premiks reakcyjny w następujący sposób na lodzie: 45 μl 5x buforu PCR, 12 μl MgCl2 (25 mM), 4 μl dNTP (z zapasu zawierającego 10 mM każdy), 10 μl startera do przodu (zapas 10 μM) hybrydyzującego do sekwencji wektorowej (starter Ab-vec-sense) i 10 μl startera odwrotnego (zapas 10 μM) ukierunkowany na stały obszar łańcucha ciężkiego lub lekkiego (patrz Tabela materiałów dla sekwencji starterów). Uzupełnić do końcowej objętości 200 μl roztworemH2O. Następnie dodać 4 μl enzymu polimerazy DNA (5 U/μL).
      2. Rozprowadzić 25 μl premiksu reakcyjnego na 8-paskowej probówce PCR na lodzie.
      3. Użyj sterylnej wykałaczki, aby zebrać poszczególne kolonie. Nałóż wykałaczkę na płytkę z ampicyliną 2x TY, aby utworzyć płytkę z repliką, a następnie zanurz ją w probówce reakcyjnej PCR.
      4. Przeprowadzić przesiewowy PCR w następujących warunkach cyklicznych: 94 °C przez 10 minut, a następnie 25 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 50 s w temperaturze 72 °C.
      5. Zidentyfikuj pozytywne bakterie, migrując 5 μl produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym.
        UWAGA: Kolonie dodatnie dają produkt PCR około 850 pz dla wektora łańcucha ciężkiego i 600 pz dla wektora łańcucha lekkiego.
    3. Zaszczepić cztery dodatnie kolonie z kontrpróby do 2 ml pożywki LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    4. Ekstrahować plazmidy z płynnych kultur za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu, zgodnie ze wskazaniami producenta.
    5. Sprawdź poprawność insercji domen zmiennych przez sekwencjonowanie plazmidów metodą Sangera za pomocą startera Ab-vec-sense.
      UWAGA: Plazmidy z odpowiednią wstawką (kodującą HC i odpowiadający jej LC) należy poddać kotransfekcji do komórek 293A w celu wydzielania. Specyficzność mAb produkowanych na małą skalę jest oznaczana za pomocą testu ELISA. Następnie, w razie potrzeby, wykonywana jest produkcja na dużą skalę.

6. Produkcja mAb

  1. Produkcja na małą skalę do sprawdzania specyficzności
    1. Dzień przed transfekcją wysiewaj 15 000 ludzkich embrionalnych komórek nerki 293A (HEK 293A) w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% FBS na studzienkę w 96-dołkowych płytkach. Inkubować przez noc w inkubatorze CO2 (5 % CO2 ) w temperaturze 37 °C.
    2. Komórki kotransfekcyjne 293A w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS przy użyciu liniowej pochodnej polietyleniny jako odczynnika do transfekcji.
      UWAGA: Wykonaj transfekcję w trzech egzemplarzach. Poniższy protokół dotyczy jednego dołka na 96-dołkowej płytce z płaskim dnem.
      1. Rozcieńczyć 0,5 μl odczynnika do transfekcji DNA w 10 μl 150 mM NaCl. Rozcieńczyć 0,125 μg vH i 0,125 μg wektorów wyrażających vL do 10 μl 150 mM NaCl. Wirować każde rozcieńczenie przez 10 s.
      2. Dodać 10 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji DNA do 10 μl roztworu DNA. Wirować 15 s i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 20 μl mieszanki kroplami na ogniwa 293A i wymieszaj, delikatnie obracając płytkę.
    3. Wymień pożywkę 16 godzin po transfekcji i hoduj komórki przez 5 dni w pożywce bez surowicy.
      UWAGA: Użyj pożywki bez surowicy, aby uniknąć zanieczyszczenia wytworzonych przeciwciał Igs w surowicy.
    4. Usunąć komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 460 x g przez 5 minut.
    5. Zebrać supernatanty przez aspirację za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść je do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
    6. Odpowiednie Ag pokryć przez noc w temperaturze 4 °C w 100 μl na studzienkę przygotowanego buforu powlekającego ELISA/ELISPOT 1x przy końcowym stężeniu 2 μg/ml w 96-dołkowych płytkach ELISA. Zobacz przykłady w 9.
    7. Studzienki blokowe z 10% podłożem FBS DMEM przez 2 h w temperaturze 37 °C
    8. Dodać 50 μl supernatantów transfekowanych komórek 293A z kroku 6.1.5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    9. Dodać 100 μl anty-ludzkiej IgG Ab sprzężonej z enzymem peroksydazy chrzanowej (HRP) w stężeniu 1 μg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodać 50 μl substratu chromogennego (TMB) i inkubować przez 20 minut.
    10. Odczyt gęstości optycznej przy 450 nm na spektrofotometrze.
      UWAGA: Specyficzne przeciwciała monoklonalne ujawnione w teście ELISA mogą być dalej wytwarzane na dużą skalę i oczyszczane w kolumnie białka A wykazującej powinowactwo do ludzkiej IgG.
  2. Produkcja na dużą skalę i oczyszczanie określonych mAb
    1. Dzień przed transfekcją, wysiew 6 x 106 komórek ludzkiego zarodka nerki 293A (HEK 293A) do 175 cm2 kolb zawierających 25 ml DMEM uzupełnionych 10% FBS. Inkubować przez noc w inkubatorze CO2 (5 % CO2 ) w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Komórki powinny zlewać się w 70% podczas transfekcji.
    2. Komórki kotransfekcyjne 293A w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS przy użyciu liniowej pochodnej polietyleniminy jako odczynnika do transfekcji.
      1. Rozcieńczyć 50 μl odczynnika do transfekcji DNA w 450 μl 150 mM NaCl. Rozcieńczyć 10 μg vH i 10 μg wektorów wyrażających vL do 500 μl 150 mM NaCl. Wirować 10 s przy każdym rozcieńczeniu.
      2. Dodać rozcieńczony odczynnik do transfekcji DNA do roztworu DNA. Wirować 15 s i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodać kroplami 1 ml mieszanki do komórek i wymieszać, delikatnie obracając kolbą.
    3. Wymień pożywkę 16 godzin po transfekcji i hoduj komórki przez 5 dni w pożywce bez surowicy.
    4. Zebrać podłoże, zasysając pipetą o pojemności 25 ml.
    5. Usunąć komórki i zanieczyszczenia przez odwirowanie przy 460 x g przez 5 minut.
    6. Oczyścić przeciwciała za pomocą kolumny o pojemności 1 ml pokrytej białkiem A w systemie szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) w temperaturze 4 °C.
      1. Zrównoważyć kolumnę sefarozy białka A z 20 mM buforem fosforanowym (pH 7).
      2. Przefiltrować pożywkę do hodowli komórkowych z ppkt 6.2.5 za pomocą filtra 1,22 μm, a następnie filtra 0,45 μm.
      3. Załaduj przefiltrowane medium na kolumnę.
      4. Przemyć 20 mM buforem fosforanowym (pH 7) i wymyć 0,1 M buforem cytrynianowym (pH 3,5).
      5. Odczytać gęstości optyczne przy 280 nm na spektrofotometrze absorpcyjnym i natychmiast zneutralizować frakcje zawierające białka za pomocą 1 M buforu Tris (pH 9).
    7. Dializuj oczyszczony Ab przez noc w temperaturze 4 °C w kasecie z odcięciem masy cząsteczkowej 3,5 K w stosunku do buforu PBS (pH 7,4).
    8. Sterylizować przez filtrację 0,2 μm i kontrolować czystość za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, zgodnie ze wskazaniami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wychodząc od PBMC od zdrowych dawców, projekt ten przedstawia generowanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych (mAbs), które rozpoznają peptyd Pp65495 (Pp65, pochodzący z ludzkiego cytomegalowirusa) prezentowany przez cząsteczkę głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHC-I) HLA-A*0201 (HLA-A2). Te mAbs potrafią odróżnić ten kompleks od kompleksów reprezentujących inne peptydy załadowane na tę samą cząsteczkę MHC-I.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Proponowany protokół jest potężną metodą wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych bezpośrednio z limfocytów B specyficznych dla Ag krążących we krwi. Łączy w sobie trzy ważne aspekty: (i) zastosowanie wzbogacenia magnetycznego związanego z tetramerem, które umożliwia izolację ex vivo nawet rzadkich limfocytów B wiążących Ag; (ii) strategia bramkowania wykorzystująca trzy tetramery Ag (dwa istotne i jeden nieistotny) znakowane trzema różnymi fluorochromami w celu wyizolowania, za pomocą cytometrii przepływ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Ośrodkowi Cytometrii "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy również wszystkim pracownikom zajmującym się produkcją białek rekombinowanych (P2R) oraz platformom IMPACT (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) za wsparcie techniczne. Dziękujemy Emmanuelowi Scotetowi i Richardowi Breathnachowi za konstruktywne uwagi na temat manuskryptu. Prace te były wspierane finansowo przez projekt IHU-Cesti finansowany przez program rządu francuskiego « Investissements d'Avenir », zarządzany przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projekt IHU-Cesti jest również wspierany przez Nantes Métropole i Région Pays de la Loire. Praca ta została zrealizowana w ramach programu LabEX IGO wspieranego przez Narodową Agencję Badawczą poprzez inwestycję przyszłego programu ANR-11-LABX-0016-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa HEK 293AThermo Fisher scientificR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco firmy life technologies21969-035(+) 4,5g/L D-Glukoze
0,11g/L Pirogronian sodu
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco firmy life technologies31870-025
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (10X) pH 7,4 AmbionAM9624
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) 0,5M pH=8Invitrogen firmy Life Technologies15575-020
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - separacja limfocytów średniaEuroBioCMSMSL01-01gęstość 1,0777 +/- 0,001
koniugat streptawidyny R-fikoerytrynyInvitrogen firmy Life TechnologiesS21388klasa premiun 1 mg / ml zawiera 5 mM azydek sodu
Streptawidyna, koniugat allofikocyjaninyInvitrogen firmy thermoFisher scientificS323621 mg / ml
2 mM azydek premium klasy
Fioletowy brylantowy 421 streptawidynaBiolegend405225stężenie: 0,5 mg/ml
Mikrokulki magnetyczne sprzężone anty-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Mikrokulki magnetyczne sprzężone anty-APCMiltenyi Biotec130-090-855
Separatory MidiMAC lub QuadroMACSMiltenyi Biotec130-042-302/130-090-976
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109Używane rozcieńczenie 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788Stosowane rozcieńczenie 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116Stosowane rozcieńczenie 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440Używane rozcieńczenie 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)Używane rozcieńczenie 1:1000
FACS ARIA III Cytometr do sortowania komórekBD Biosciences
8-paskowe probówki do PCRAxygen321-10-061
Stojaki na 96 mikroprobówekDominique Dutscher45476
RNAseOUT Inhibitor rybonukleazy (rekombinowany)Invitrogen firmy thermoFisher scientific10777-019ilość: 5000U (40U / ul)
Woda destylowana Bez dnazy / RnazyGibco10977-035
Oligod(T)18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
Losowe heksameryInvitrogen by thermoFisher scientificN8080127Ilość: 50uM, 5nmole
Indeks górny III Odwrotna transkryptazaInvitrogen firmy thermoFisher scientific18080-044Ilość: 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA PolimerazaPromegaM7805
dNTP Zestaw, klasa biologii molekularnejThermo ScientificR01824*100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery zewnętrzne - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers
3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery zewnętrzne -Odwrotne startery do ludzkiego Ig- Badanie przesiewowe PCR bakterii
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTCACA
GGAGACGA		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów ciężkich - Startery zewnętrzne -Startery odwrotne dla ludzkiego Ig
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTTGGAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Startery do przodu
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Startery do przodu
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAGAG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery odwrotne
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery odwrócone
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Podkłady wewnętrzne -Startery odwrócone
5' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery odwrócone - Badania przesiewowe PCR pod kątem bakterii
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeIVk1_9_1– 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC Druga		runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTGTT
TGATATCCACTTTGGTC		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC Druga		runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich i lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGCCCA
GTCTGCCCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Naprzód startery
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5'LVl7EurofinsGGTCCATTCYCA
GGCTGTGGTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Startery do przodu
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery zewnętrzne -Naprzód startery
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne -startery forward
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne - startery do przodu
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne - startery do przodu
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTGGGGCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne - startery do przodu
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGGGCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne - startery do przodu
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich λ - Startery wewnętrzne - startery do przodu
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich i lambda; - Startery wewnętrzne -Startery odwrócone - Badania przesiewowe PCR
pod kątem bakterii Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		Badania przesiewowe PCR bakterii
QA Agarose-TM, Biologia molekularna GradeMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCR PlateMacherey Nagel743.100.100
Enzyme Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U/ml
Enzym SalI HFNew England BiolabsR3138L20000U/ml
Enzym Xho INew England BiolabsR0146L20000U/ml
Enzym BSIWINew England BiolabsR0553L10000U/ml
HCg1 (numer dostępu do Genbank FJ475055)
LCk (numer dostępu do Genbank FJ475056 )
LCl (akces Genbank numer FJ517647)Ligaza
DNA T4Invitrogen firmy thermoFisher scientific15224.017100U (1U/ul)
2X YT mediumSigmaAldrich Y1003-500ML
AmpicylinaSigma Aldrich10835242001
LB (Luria Bertani) Rosół (Lennox)Sigma AldrichL3022-250G
Nukleospinowy plazmid DNA, RNA i Oczyszczanie białekMacherey Nagel740588.250
Odczynnik do transfekcji DNA Jet PEIPolyPlus101-40
Płaskie dno96-dołkowa płytkaFalcon353072
V-bottom 96-dołkowa płytkaNunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2Kolby Nunc/Thermofisher12-562-000
ELISA/ELISPOT Bufor powlekającyeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp płaskie dno 96-dołkowe płytki ELISANunc/Thermofisher44-2404-21wysokie wiązanie białek
Anty-ludzkie IgG Ab sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)BD Pharmingen / BD Biosciences55788
Podłoże TMBBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 mL-HiTrap białko A kolumna HPGE Healthcare17-0402-01
Ä KTA FPLCGE Healthcare18190026
Kolumna Superdex 200 10/300 GLHealthcare17517501
System chromatograficzny NGC Quest 10 PlusBioRad7880003
GE

Bibliografia

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

Tagi

Mononuklearne komórki krwi obwodowejRT-PCR pojedynczych komóreksortowanie przepływowetetramery HLA-A2/Pp65separacja magnetyczna za pomocą mikrokulektest ELISApowierzchniowy rezonans plazmonowyamplifikacja genów immunoglobulin
Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.