Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Summary

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Abstract

Badanie różnych zdarzeń regulacyjnych cyklu komórkowego w sposób zależny od fazy dostarcza jasnego zrozumienia wzrostu i podziału komórek. Stwierdzono, że synchronizacja populacji komórek na określonych etapach cyklu komórkowego jest bardzo przydatna w takich eksperymentalnych przedsięwzięciach. Synchronizacja komórek poprzez leczenie substancjami chemicznymi, które są stosunkowo mniej toksyczne, może być korzystna w porównaniu ze stosowaniem farmakologicznych leków hamujących do badania następujących po sobie zdarzeń cyklu komórkowego i uzyskania specyficznego wzbogacenia wybranych etapów mitotycznych. W tym miejscu opisujemy protokół synchronizacji komórek ludzkich na różnych etapach cyklu komórkowego, w tym zarówno w fazie S, jak i w fazie M z procedurą podwójnej blokady i uwalniania tymidyny w celu zbadania funkcjonalności białek mitotycznych w wyrównaniu i segregacji chromosomów. Protokół ten okazał się niezwykle przydatny do badania mitotycznych ról wielofunkcyjnych białek, które mają ustalone funkcje interfazowe. W naszym przypadku mitotyczna rola Cdt1, białka krytycznego dla licencjonowania pochodzenia replikacji w fazie G1, może być skutecznie badana tylko wtedy, gdy Cdt1 specyficzny dla G2/M może zostać wyczerpany. Opisujemy szczegółowy protokół usuwania Cdt1 specyficznego dla G2/M przy użyciu podwójnej synchronizacji tymidyny. Wyjaśniamy również protokół utrwalania komórek i obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości po uwolnieniu tymidyny. Metoda jest również przydatna do analizy funkcji białek mitotycznych zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i zaburzonych, takich jak Hec1, składnik kompleksu Ndc80, ponieważ umożliwia uzyskanie dużych rozmiarów próbek komórek mitotycznych do analizy komórek stałych i żywych, jak pokazujemy tutaj.

Introduction

W cyklu komórkowym komórki przechodzą serię wysoce regulowanych i czasowo kontrolowanych zdarzeń w celu dokładnego powielania ich genomu i proliferacji. U ssaków cykl komórkowy składa się z interfazy i fazy M. W interfazie, która składa się z trzech etapów - G1, S i G2, komórka duplikuje swój genom i ulega wzrostowi, który jest niezbędny do normalnej progresji cyklu komórkowego^1,2. W fazie M, która składa się z mitozy (profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza) i cytokinezy, komórka rodzicielska wytwarza dwie genetycznie identyczne komórki potomne. W mitozie chromatydy siostrzane zduplikowanego genomu są kondensowane (profaza) i są wychwytywane w swoich kinetochorach przez mikrotubule zmontowanego wrzeciona mitotycznego (prometafaza), które napędza ich wyrównanie na płytce metafazowej (metafaza), a następnie ich równa segregacja, gdy chromatydy siostrzane są dzielone w kierunku i transportowane do przeciwległych biegunów wrzeciona (anafaza). Dwie komórki potomne są fizycznie oddzielone przez aktywność pierścienia kurczliwego opartego na aktynie (telofaza i cytokineza). Kinetochor jest wyspecjalizowaną strukturą białkową, która gromadzi się w regionie centromerowym chromatyd i służy jako miejsca przyczepu mikrotubul wrzeciona. Jego główną funkcją jest sterowanie wychwytywaniem, wyrównywaniem chromosomów i pomoc w korygowaniu nieprawidłowego mocowania mikrotubul wrzeciona, jednocześnie pośrednicząc w punkcie kontrolnym montażu wrzeciona w celu utrzymania wierności segregacji chromosomów^3,4.

Technika synchronizacji komórek służy jako idealne narzędzie do zrozumienia molekularnych i strukturalnych zdarzeń związanych z postępem cyklu komórkowego. Podejście to zostało wykorzystane do wzbogacenia populacji komórek w określonych fazach do różnych rodzajów analiz, w tym profilowania ekspresji genów, analiz komórkowych procesów biochemicznych i wykrywania subkomórkowej lokalizacji białek. Zsynchronizowane komórki ssaków mogą być wykorzystywane nie tylko do badania pojedynczych produktów genowych, ale także do podejść obejmujących analizę całych genomów, w tym analizę ekspresji genów w mikromacierzach⁵, wzorce ekspresji miRNA⁶, regulacja translacyjna⁷, oraz analiza proteomiczna modyfikacji białek⁸. Synchronizacja może być również wykorzystana do badania wpływu ekspresji genów lub knock-down lub knock-out białek lub substancji chemicznych na postęp cyklu komórkowego.

Komórki mogą być synchronizowane na różnych etapach cyklu komórkowego. Zarówno metody fizyczne, jak i chemiczne są szeroko stosowane do synchronizacji komórek. Najważniejszym kryterium synchronizacji komórek jest to, że synchronizacja powinna być niecytotoksyczna i odwracalna. Ze względu na potencjalne niekorzystne konsekwencje komórkowe synchronizacji komórek przez czynniki farmakologiczne, metody zależne od substancji chemicznych mogą być korzystne w badaniu kluczowych zdarzeń cyklu komórkowego. Na przykład hydroksymocznik, amfidikolina, mimozyna i lowastatyna mogą być używane do synchronizacji komórek w fazie G1/S, ale ze względu na ich wpływ na szlaki biochemiczne, które hamują, aktywują mechanizmy punktów kontrolnych cyklu komórkowego i zabijają ważną część komórek9^,10. Z drugiej strony, hamowanie replikacji DNA przez sprzężenie zwrotne poprzez dodanie tymidyny do pożywki wzrostowej, znane jako "blok tymidynowy", może zatrzymać cykl komórkowy w określonych punktach^11,12,13. Komórki można również synchronizować w fazie G2/M poprzez traktowanie nokodazolem i RO-3306^9,14. Nokodazol, który zapobiega tworzeniu się mikrotubul, ma stosunkowo wysoką cytotoksyczność. Co więcej, komórki zatrzymane przez nokodazol mogą przedwcześnie powrócić do interfazy w wyniku poślizgu mitotów. Podwójne komórki zatrzymujące blok tymidyny w fazie G1 / S, a po uwolnieniu z bloku stwierdzono, że komórki przechodzą synchronicznie przez G2 i do mitozy. Normalny postęp cyklu komórkowego dla komórek uwolnionych z bloku tymidynowego można zaobserwować pod mikroskopią konfokalną o wysokiej rozdzielczości za pomocą utrwalenia komórek lub obrazowania na żywo. Efekt zaburzeń białek mitotycznych można badać konkretnie, gdy komórki wchodzą i przechodzą mitozę po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidyny. Cdt1, wielofunkcyjne białko, bierze udział w licencjonowaniu pochodzenia replikacji DNA w fazie G1 i jest również wymagane do przyłączania mikrotubul kinetochorowych podczas mitozy¹⁵. Aby zbadać funkcję Cdt1 podczas mitozy, należy przyjąć metodę, która pozwala uniknąć wpływu jego wyczerpania na licencjonowanie replikacji w fazie G1, jednocześnie powodując jego wyczerpanie specyficznie tylko w fazie G2 / M. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły oparte na podwójnym bloku tymidyny w celu zbadania mitotycznej roli białek pełniących wiele funkcji na różnych etapach cyklu komórkowego zarówno za pomocą obrazowania stałych, jak i żywych komórek.

Protocol

1. Podwójna blokada i uwalnianie tymidyny: preparaty odczynników

1. Przygotuj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% FBS, penicyliną i streptomycyną.
2. Przygotować 100 mM zapasu tymidyny w sterylnej wodzie i przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C.

2. Protokół obrazowania progresji mitotycznej komórek stałych (Rysunek 1A)

1. W dniu 1 wysiewaj ~ 2 x 10⁵ komórek HeLa do dołków 6-dołkowej płytki ze szkiełkiem nakrywkowym (sterylizowanym 70% etanolem i promieniowaniem UV) i 2 ml pożywki DMEM. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. 1. blok tymidyny: W dniu 2 dokładnie wymieszaj wymaganą objętość tymidyny ze świeżymi pożywkami DMEM (100 mM bulionu, 2 mM stężenie końcowe).
3. Dodać 2 ml pożywki zawierającej tymidynę do komórek w każdym dołku płytki 6-dołkowej i inkubować przez 18 godzin.
4. W dniu 3 odessać pożywkę i umyć komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM; hodować komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym pożywce DMEM przez 9 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.
5. 2. blok tymidyny: Ponownie dodaj 2 ml pożywki zawierającej tymidynę (końcowe stężenie 2 mM) do komórek w każdym dołku płytki 6-dołkowej.
6. Inkubować przez kolejne 18 godzin.
7. W 4 dniu odessać pożywkę i przemyć komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM.
8. Rozcieńczyć siRNA (kontrolne i Cdt1) i odczynnik do transfekcji w pożywce wzrostowej wolnej od surowicy oddzielnie przez 10 minut. Wymieszać je ze sobą i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie siRNA użyte w każdej transfekcji wynosiło 100 nM. Dodaj mieszaninę reakcyjną do komórek, które zostały wypłukane z tymidyny.
9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 9-10 godzin, aby uwolnić się od zablokowania i utrwalić komórki na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA przez 20 minut w temperaturze RT.
   Uwaga: PFA jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.
10. Komórki immunostainowe, po przepuszczalności 0,5% (v/v) detergentu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dwukrotnym przemyciu komórek 1x PBS przez 5 minut każda.
    1. Zablokuj komórki z 1% BSA (w/v) w 1x PBS przez 1 godzinę w RT, a następnie potraktuj komórki 50 μl przeciwciał pierwszorzędowych (mysie przeciwciało anty-α-tubulinowe rozcieńczone w stosunku 1:1,000, królicze przeciwciało anty-Zwint1 rozcieńczone w 1:400 i mysie anty-fosfo-ɣ H2AX rozcieńczone w 1:300) w 1% (w/v) BSA w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 ^oC.
    2. Po trzykrotnym wypłukaniu komórek 1x PBS, potraktuj komórki 50 μl przeciwciał drugorzędowych dla każdego szkła nakrywkowego (Alexa 488 i czerwień rodaminowa w rozcieńczeniach 1:250 w 1% (w/v) BSA w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Po umyciu komórek 1x PBS dwukrotnie przez 5 minut każde, potraktuj komórki DAPI (0,1 μg / ml w 1x PBS) przez 5 minut w RT.
    4. Po dwukrotnym umyciu komórek 1x PBS przez 5 minut każde, umieścić szkiełko nakrywkowe skierowane do odpowiednich mediów montażowych na przezroczystym mikroskopijnym szkiełku.
11. Zobrazuj komórki pod kątem białek barwionych immunologicznie za pomocą 60-krotnego lub 100-krotnego lub 1,4-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju NA 1,4 NA, zamontowanego na odwróconym mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości, wyposażonym w odpowiednią kamerę, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi wymaganej jakości obrazów.
12. Rejestruj obrazy w temperaturze pokojowej jako stosy z o grubości 0,2 μm za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla mikroskopu.

3. Protokół obrazowania progresji mitotycznej na żywo komórek (Rysunek 3A)

1. W dniu 1 wysiewaj około 0,5-1 x 10⁵ komórek HeLa stabilnie eksprymujących mCherry-H2B i GFP-α-tubulinę (nieznacznie zmienną w zależności od typu komórki i białek, które wyrażają) do 35-milimetrowych szklanych naczyń z dnem 1,5 ml pożywki DMEM i hoduj je w wilgotnym inkubatorze przez 24 godziny w temperaturze 37 ^oC i 5% CO₂ .
2. 1. blok tymidyny: W drugim dniu dodaj 1,5 ml pożywki zawierającej tymidynę do komórek w naczyniu (100 mM tymidyny, 2 mM stężenie końcowe).
3. Inkubować przez 18 godzin.
4. W dniu 3 odessać pożywkę zawierającą tymidynę i trzykrotnie przemyć komórki, dwa razy 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM.
5. Rozcieńczyć siRNA (kontrolne i Hec1) i odczynnik do transfekcji pożywką wzrostową wolną od surowicy oddzielnie przez 10 minut. Wymieszać je ze sobą i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Końcowe stężenie siRNA użyte w każdej transfekcji wynosiło 100 nM. Dodaj mieszaninę reakcyjną do komórek, które zostały wypłukane z tymidyny.
6. Hoduj komórki w 1,5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki DMEM przez 8 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.
7. 2. blok tymidyny: Dodaj 1,5 ml pożywki zawierającej tymidynę (2 mM stężenie końcowe) do komórek w naczyniu.
8. Inkubować przez kolejne 18 godzin.
9. W 4 dniu odessać pożywkę i umyć komórki trzykrotnie, dwa razy 2 ml 1x PBS i raz świeżym, wstępnie podgrzanym DMEM. Następnie hoduj komórki w świeżym, podgrzanym podłożu Leibovitza (L-15) uzupełnionym 10% FBS i 20 mM HEPES o pH 7,0 przez 8 godzin, aby uwolnić komórki z bloku.
10. Umieść czaszę w komorze kontroli temperatury ustawionej w mikroskopie konfokalnym o wysokiej rozdzielczości, który włączył się już co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania w celu ustabilizowania temperatury na scenie i eksperymentalnej.
11. Ustaw ostrość w jasnym polu za pomocą obiektywu 60x, aż komórki będą widoczne, a następnie ręcznie przesiej stół montażowy do wybranego obszaru.
12. Ustaw światło/moc/ekspozycję/ekspozycję, parametry akwizycji obrazu i czas trwania eksperymentu za pomocą wybranego oprogramowania do akwizycji obrazu mikroskopu. Do pozyskiwania obrazów należy używać filtrów GFP (wzbudzenie 488; emisja 385 nm) i mCherry (wzbudzenie 561 nm i emisja 385 nm).
13. Wykonaj eksperyment poklatkowy, oddzielnie rejestrując pulsacyjne obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencji co 10 minut przez okres do 16 godzin.
14. Rejestruj obrazy jako dwanaście płaszczyzn z oddzielonych od siebie 1,0 μm po 9 godzinach od uwolnienia z podwójnego bloku tymidynowego za pomocą oprogramowania odpowiedniego dla mikroskopu.
15. Przeanalizuj obrazy śledzące poszczególne komórki pod kątem progresji mitotycznej i na koniec zmontuj odpowiedni film za pomocą oprogramowania źródłowego Fiji/ImageJ.

Results

Badanie progresji mitotycznej i stabilności mikrotubul w komórkach utrwalonych po uwolnieniu z podwójnego bloku tymidyny
Cdt1 bierze udział w licencjonowaniu początków replikacji DNA w fazie G1. Ulega degradacji w fazie S, ale ponownie gromadzi się w fazie G2/M. Aby zbadać jego rolę w mitozie, endogenny Cdt1 musi zostać wyczerpany w fazie G/M przy użyciu najbardziej odpowiedniej techniki synchronizacji komórek, podwójnego bloku tymidyny¹⁵. Komó...

Discussion

Najważniejszą zaletą podwójnej synchronizacji tymidyny jest to, że zapewnia ona zwiększoną wielkość próbki komórek mitotycznych w krótkim czasie, przy czym wiele z tych komórek jednocześnie wchodzi w mitozę, umożliwiając w ten sposób również analizy wyrównania chromosomów, tworzenia wrzeciona dwubiegunowego i segregacji chromosomów ze znacznie wyższą wydajnością.

Wiele regulatorowych kompleksów białkowych i szlaków sygnałowych jest poświęconych zapewnieniu prawidłowego postępu poprzez mitozę, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	Sklep pod adresem 4 ° C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	Sklep pod adresem 4 & deg; C.
Leibovitz' s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	Przechowywać pod adresem 4 ° C
Pożywka o obniżonej surowicy (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Penicylina i streptomycyna	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	Rozcieńczenie 1:1,000
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	Przechowywać w 4 &stopni; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	Rozpuszczony w sterylnej destylowanej wodzie
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
Komórki HeLa eksprymujące GFP-H2B
Komórki HeLa eksprymujące GFP-&alfa;-tubulinę i mCherry H2B	Hojny prezent od dr Kozo Tanaka z Tohoku uniwersytet, Japonia
Roztwór formaldehydu	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	Toksyczny, wymaga ostrożności
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	Toksyczny, wymaga ostrożności
Mysia anty-&alfa;-tubulina	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	Rozcieńczenie 1:1,000
Królik ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 rozcieńczenie
Mysi anty-fosfo-γ H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, klon JBW301	1:300 rozcieńczenie
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 rozcieńczenie
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 rozcieńczenie
BioLite 6 well multidish	Thermo Fisher Scientific	130184
35 mm Szklane naczynie denne	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments
Wirująca tarcza do konfokalnego	Kamera Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD Andor		iXon Ultra EMCCD
Laser o długości fali 4	Agilent Technologies
System inkubacji do mikroskopów	Tokai Hit	TIZB
Oprogramowanie NIS-elements	firmy Nikon Instruments