Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56530

⸱

19 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Jednym z głównych celów mechanobiologii jest zrozumienie wzajemnego wpływu stresu mechanicznego na białka i komórki. Pomimo swojego znaczenia, wpływ stresu mechanicznego na funkcjonowanie komórek jest nadal słabo poznany. Luka w wiedzy wynika po części z tego, że niewiele narzędzi umożliwia jednoczesną deformację tkanek i komórek, obrazowanie aktywności komórkowej u żywych zwierząt oraz skuteczne ograniczanie ruchliwości w organizmach modelowych, które w przeciwnym razie byłyby wysoce mobilne, takie jak nicienie Caenorhabditis elegans. Niewielkie rozmiary C. elegans sprawiają, że doskonale pasują do urządzeń badawczych opartych na mikrofluidyce, a rozwiązania do immobilizacji zostały zaprezentowane przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych. Chociaż urządzenia te pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zwierzę jest całkowicie zamknięte w polidimetylosiloksanach (PDMS) i szkle, co ogranicza fizyczny dostęp do dostarczania siły mechanicznej lub zapisów elektrofizjologicznych. Niedawno stworzyliśmy urządzenie, które integruje siłowniki pneumatyczne z konstrukcją pułapki, która jest kompatybilna z mikroskopią fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości. Kanał uruchamiający jest oddzielony od kanału wychwytywania ślimaków cienką membraną PDMS. Membrana ta jest odchylana w bok ślimaka poprzez wywieranie nacisku z zewnętrznego źródła. Urządzenie może celować w poszczególne neurony wrażliwe mechanicznie. Aktywacja tych neuronów jest obrazowana w wysokiej rozdzielczości za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. W artykule przedstawiono ogólną metodę z wykorzystaniem szczepów C. elegans wykazujących ekspresję wskaźnika aktywności wrażliwej na wapń (GCaMP6s) w neuronach receptora dotyku (TRN). Metoda ta nie ogranicza się jednak do TRN ani do czujników wapnia jako sondy, ale może być rozszerzona na inne mechanicznie wrażliwe ogniwa lub czujniki.

Wprowadzenie

Zmysł dotyku dostarcza zwierzętom kluczowych informacji o ich otoczeniu. W zależności od przyłożonej siły, dotyk jest postrzegany jako nieszkodliwy, przyjemny lub bolesny. Deformacja tkanki pod wpływem dotyku jest wykrywana przez wyspecjalizowane komórki mechanoreceptorowe osadzone w skórze, które wyrażają białka receptorowe, najczęściej kanały jonowe. Kroki łączące percepcję siły z aktywacją kanałów jonowych podczas dotyku i bólu nie są w pełni zrozumiałe. Jeszcze mniej wiadomo o tym, w jaki sposób tkanka skórna filtruje deformacje mechaniczne i czy mechanoreceptory wykrywają zmiany w odkształceniu lub stresie1,2,3. Ta luka w zrozumieniu wynika po części z braku odpowiednich narzędzi do stosowania precyzyjnych stymulacji mechanicznych na powierzchni skóry żywego zwierzęcia przy jednoczesnej obserwacji reakcji na poziomie komórkowym. Podczas gdy mikroskopia sił atomowych była szeroko stosowana do przykładania i mierzenia sił w izolowanych komórkach4,5, a także do aktywacji receptorów Piezo1 w żywych komórkach6, podobne eksperymenty z użyciem żywych zwierząt, zwłaszcza C. elegans, były notorycznie trudne ze względu na wewnętrzną mobilność obiektu. To wyzwanie jest tradycyjnie obchodzone poprzez użycie kleju cyjanoakrylowego klasy weterynaryjnej lub chirurgicznej do unieruchamiania poszczególnych zwierząt na podkładkach agarowych1,7,8,9. To podejście było produktywne, ale ma ograniczenia związane z umiejętnościami wymaganymi do unieruchomienia przez klejenie i miękką powierzchnią agaru w zakresie podatności mechanicznej. Strategia mikrofluidyczna jest komplementarną alternatywą, która pozwala uniknąć niektórych komplikacji związanych z klejeniem.

Nicień C. elegans to genetyczny organizm modelowy z całkowicie zmapowanym układem nerwowym, który, ze względu na rozmiar zwierzęcia, dobrze pasuje do technologii mikrofluidycznej. Urządzenia oparte na mikrofluidyce mają tę zaletę, że niezwykle ruchliwe zwierzęta mogą być skrępowane podczas wykonywania obrazowania w wysokiej rozdzielczości i dostarczania odpowiednich bodźców neuromodulacyjnych. Za pomocą technologii mikroprzepływowych żywe zwierzęta mogą być unieruchomione bez szkody10,11, umożliwiając monitorowanie aktywności behawioralnej przez całe życie12,13 i obrazowanie aktywności neuronalnej w wysokiej rozdzielczości14,15,16,17. Co więcej, wiele neuronów mechanoreceptorowych potrzebnych do zmysłu dotyku i bólu można scharakteryzować na podstawie ich fizjologicznych1,8, mechanical4,18,19, oraz poziom molekularny20,21,22.

C. elegans wyczuwa delikatne bodźce mechaniczne na ścianie swojego ciała za pomocą sześciu TRN, z których trzy unerwiają przednią część zwierzęcia (ALML/R i AVM), a trzy z nich unerwiają tylną część zwierzęcia (PLML/R i PVM). Cząsteczki kanału jonowego potrzebne do przekształcenia przyłożonej siły w sygnał biochemiczny zostały szeroko zbadane w TRNs8. W tym artykule przedstawiono platformę mikroprzepływową23, która umożliwia naukowcom przyłożenie precyzyjnych sił mechanicznych do skóry unieruchomionej glisty C. elegans, jednocześnie odczytując deformację jej wewnętrznych tkanek za pomocą obrazowania optycznego. Oprócz prezentowania dobrze zdefiniowanych bodźców mechanicznych, przejściowe stany wapnia mogą być rejestrowane w neuronach mechanoreceptorowych z rozdzielczością subkomórkową i skorelowane z cechami morfologicznymi i anatomicznymi. Urządzenie składa się z centralnego kanału pułapkowego, który utrzymuje pojedyncze zwierzę i prezentuje jego skórę obok sześciu pneumatycznych kanałów uruchamiających (Rysunek 1 i Rysunek 2). Sześć kanałów jest rozmieszczonych wzdłuż kanału pułapkowego, aby dostarczać bodźce mechaniczne do każdego z sześciu TRN robaka. Kanały te są oddzielone od komory pułapkowej cienkimi membranami PDMS, które mogą być napędzane przez zewnętrzne źródło ciśnienia powietrza (Rysunek 1). Skalibrowaliśmy ugięcie w odniesieniu do ciśnienia i przedstawiliśmy pomiary w tym artykule. Każdy siłownik może być adresowany indywidualnie i używany do stymulacji wybranego mechanoreceptora. Ciśnienie jest dostarczane za pomocą pompy ciśnieniowej z napędem piezoelektrycznym, ale można zastosować dowolne urządzenie alternatywne. Pokazujemy, że protokół ciśnienia może być wykorzystany do aktywacji TRN in vivo i zademonstrowania urządzeń operacyjnych odpowiednich do dostarczania bodźców mechanicznych dorosłym C. elegans, ładowania dorosłych zwierząt do urządzeń, wykonywania eksperymentów obrazowania wapnia i analizowania wyników. Produkcja urządzenia składa się z dwóch głównych etapów: 1) fotolitografii w celu wykonania formy z SU-8; oraz 2) formowanie PDMS w celu wykonania urządzenia. Dla zwięzłości i jasności czytelnicy są odsyłani do wcześniej opublikowanych artykułów i protokołów24,25 w celu uzyskania instrukcji dotyczących produkcji form i urządzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Fabrykacja urządzenia

  1. Pobierz załączony plik maski (Supplemental File 1) i zamów maskę chromową w komercyjnym serwisie lub wewnętrznym zakładzie. Ponieważ najmniejszy wymiar urządzenia wynosi 10 µm (grubość membrany siłownika), należy upewnić się, że maska posiada wystarczająco wysoką rozdzielczość, w granicach ± 0.25 µm, aby wiarygodnie odwzorować te elementy.
  2. Zastosuj standardowe metody fotolitografii z użyciem SU-8 (np. referencje24,25,26) w celu wykonania formy do późniejszej produkcji urządzeń z PDMS; podsumowanie poszczególnych kroków znajduje się poniżej.
    UWAGA: SU-8 jest materiałem światłoczułym, który sieciuje pod wpływem promieniowania ultrafioletowego (maksymalna absorpcja ~ 365 nm). Jako punkt wyjścia do określenia parametrów procesowych dla wstępnego wygrzewania (soft-bake), naświetlania (UV) i wygrzewania końcowego (post-bake) należy wykorzystać instrukcje producenta.
    1. Nanieś SU-8 202 na wafer krzemowy i rozprowadź za pomocą wirówki (spin-coating) do przybliżonej grubości 2 µm, aby zapewnić lepszą adhezję małych struktur. Przeprowadź wstępne wygrzewanie na płycie grzejnej przez 1 min w 95 °C, lekko prześwietl (UV) całą powierzchnię (~ 100 mJ/cm2) i przeprowadź wygrzewanie końcowe na płycie grzejnej przez 2 min w 95 °C.
    2. Nanieś za pomocą wirówki warstwę SU-8 2050 o grubości 47 µm w celu zdefiniowania elementów urządzenia. Zastosuj prędkość wirowania 50 rpm przez 15 s (przyspieszenie 130 rpm/s), a następnie 2 0 rpm przez 90 s (przyspieszenie 260 rpm/s). W razie potrzeby powtórz i skoryguj prędkość wirowania, aby uzyskać odpowiednią grubość fotorezystu.
    3. Przeprowadź wstępne wygrzewanie na płycie grzejnej przez 2 min w 65 °C, a następnie przez 7 min w 95 °C. Naświetl fotorezyst zgodnie z instrukcjami producenta (~ 160 mJ/cm2) przy użyciu maski chromowej i filtra długoprzepustowego, aby zapewnić prostopadłe ścianki boczne.
    4. Wyjmij wafer i przeprowadź wygrzewanie końcowe na płycie grzejnej przez 1 min w 65 °C oraz przez 7 min w 95 °C.
    5. Usuń nienaświetlony SU-8 za pomocą wywoływacza, a następnie oczyść 2-propanolem.
    6. Wypal wafer na płycie grzejnej w 180 °C przez 30 min (hard-bake), aby ustabilizować elementy fotorezystu.
  3. Wykonaj replikę z PDMS z modelu SU-8, stosując standardowe metody odlewania replik27.
    1. Potraktuj formę SU-8 oparami trichlorometylosilanu (TCMS), aby zmniejszyć adhezję PDMS (silanizacja).
      OSTROŻNIE: TCMS jest toksyczny i reaguje z wodą.
      1. Umieść wzorowany wafer w statywie w dzwonowym eksykatorze próżniowym w dygestorium wolnym od wody lub reagentów rozpuszczalnych w wodzie.
      2. W dygestorium, za pomocą zakraplacza, nanieś 1 kroplę TCMS na szklaną płytkę i umieść ją wewnątrz eksykatora.
      3. Zamknij pokrywę eksykatora i pozwól, aby opary TCMS pokryły wafer przez co najmniej 20 min.
      4. Wypuść powietrze, a następnie otwórz eksykator. Otwórz pokrywę dzwonu i wyjmij wafer za pomocą plastikowej pęsety. Umieść go w szalce Petriego lub łódce z folii aluminiowej do odlewania repliki z PDMS. Materiały pokryte TCMS zutylizuj jako odpowiednie odpady niebezpieczne.
    2. Wymieszaj PDMS (w stosunku 10:1), używając 40 g polimeru bazowego i 4 g czynnika sieciującego PDMS.
    3. Wlej mieszaninę na formę SU-8 i odgazuj ją przez co najmniej 30 min w komorze próżniowej.
    4. Utwardzaj przez co najmniej 6 h w temperaturze 70 °C w piekarniku.
  4. Oddziel PDMS od wafera, kładąc wafer poziomo na płaskiej powierzchni i ostrożnie odklejając PDMS. Nie wyginaj wafera do góry podczas tego kroku, ponieważ może to zniszczyć formę.
    UWAGA: Niepełna adhezja SU-8 do wafera lub niepełna silanizacja mogą doprowadzić do zniszczenia struktur SU-8 podczas tego kroku.
  5. Wytnij PDMS wokół urządzeń na pojedyncze chipy w taki sposób, aby urządzenia zmieściły się na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm.
  6. Za pomocą 1-mm wycinaka do biopsji wykonaj otwory wlocie, dwóch wylotach i sześciu siłownikach. Celuj w okręgi o średnicy 2 mm znajdujące się przy krawędziach urządzenia.
  7. Przytwierdź chipy PDMS do szkiełek nakrywkowych.
    1. Poddaj obie powierzchnie działaniu plazmy tlenowej o mocy 80 W (30 s).
    2. Ostrożnie nałóż naświetloną powierzchnię PDMS naświetloną powierzchnię szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać szczelne połączenie.
    3. Przeprowadź wyżarzanie urządzenia na płycie grzejnej (10 °C, 10 min).
      UWAGA: Niewystarczające połączenie może prowadzić do awarii urządzenia z powodu wycieków.

2. Przygotowanie mikroskopu

UWAGA: Zwierzęta transgeniczne: wykazują ekspresję wskaźnika wapnia, takiego jak GCaMP6s28 lub innej genetycznie kodowanej sondy aktywności w interesujących badacza neuronach (np. TRN); co-wyrażają niezależne od aktywności białko fluorescencyjne emitujące promieniowanie o innej długości fali, aby skorygować niewielkie artefakty ruchowe w płaszczyźnie bocznej i poza ogniskiem, które powstają w wyniku stymulacji mechanicznej. Automatyczne oprogramowanie analityczne śledzi i kompensuje zmiany intensywności sondy aktywności wywołane ruchem. Szczepy nicieni GN69223 (lub AQ323629) wykazują ekspresję GCaMP6s (lub GCaMP6m) oraz niezależnego od wapnia tagRFP pod kontrolą promotora mec-7. Dodatkowo GN692 posiada mutację lite-1(ce314), która zapobiega aktywacji TRN za pośrednictwem sensora światła niebieskiego lite-130 podczas wzbudzenia fluorescencji GCaMP6s23.

  1. Przygotuj system mikroskopowy do jednoczesnego wzbudzania GCaMP i RFP.
    1. Użyj ciągłego źródła światła i dwupasmowego filtru wzbudzeniowego, który przepuszcza tylko światło cyjanowe i żółte, lub użyj źródła światła emitującego fale tylko w określonym pasmie, takiego jak jednoczesne źródła wzbudzenia LED cyjanowe (0,77 mW) i żółte (1,21 mW), odpowiednio do jednoczesnego wzbudzania fluorescencji zależnej i niezależnej od wapnia.
    2. Użyj kamery cyfrowej, aby umożliwić rejestrację obrazów mikroskopowych.
      UWAGA: Większość kamer jest dostarczona z oprogramowaniem do akwizycji obrazu. Alternatywnie można skorzystać z bezpłatnie dostępnego oprogramowania, które pozwala sterować kamerą, a potencjalnie także innymi elementami systemu mikroskopowego.
    3. Dostosuj intensywność wzbudzenia w zależności od intensywności fluorescencji, aby uniknąć nasycenia kamery.
  2. Użyj kostki fluorescencyjnej, która w zależności od wyboru źródła wzbudzenia musi być wyposażona w filtr wzbudzeniowy.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano filtr wzbudzeniowy 48 nm dla GFP i 580 nm dla mCherry.
    1. Dodaj do kostki rozdzielacz wiązki, który odbija światło cyjanowe i żółte oraz przepuszcza światło zielone i czerwone.
    2. Wyposaż mikroskop w obiektyw 10X oraz obiektyw o dużym powiększeniu (np. 63X/1,32 NA olejowy), aby skupić światło wzbudzenia na próbce.
  3. Zamontuj rozdzielacz wiązki przed kamerą do jednoczesnej rejestracji sygnału GCaMP oraz sygnału niezależnego od wapnia. Upewnij się, że rozdzielacz wiązki posiada lustro dichroiczne (długoprzepustowe, odcięcie przy 570 nm), aby rozdzielić światło zielone i czerwone, stosując jeden filtr emisyjny dla koloru zielonego (pasmo przepustowe wycentrowane na 525 nm o szerokości 50 nm) oraz jeden filtr emisyjny dla światła czerwonego (pasmo przepustowe wycentrowane na 632 nm o szerokości 60 nm).
  4. Rzutuj fluorescencję zieloną i czerwoną odpowiednio na górną połowę (zieloną) i dolną połowę (czerwoną) matrycy kamery (patrz Rycina 3). Taka orientacja jest warunkiem niezbędnym dla dostarczonego oprogramowania analitycznego.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Przygotuj zsynchronizowane pod względem wieku młode dorosłe osobniki lub osobniki w pierwszym dniu dorosłości C. elegans, jak opisano wcześniej przez Porta-de-la-Riva i wsp.31
  2. Przygotuj chip mikrofluidyczny.
    1. Podłącz zbiornik przepływu grawitacyjnego (ok. 60 cm powyżej poziomu chipa), zawierający przefiltrowany (0,2-µm bufor M9 (przefiltrowany przez filtr strzykawkowy z polietersulfonu) do jednego z wylotów chipa. Drugi wylot należy podłączyć do jednego z wylotów dwukomorowego pojemnika na odpady, t. j., kolbę ssawkową. Drugie wyjście pojemnika na odpady podłącz do pompy perystaltycznej.
      UWAGA: Do wszystkich połączeń należy używać rurek polietylenowych (PE), a do połączenia rurek PE z chipem należy zastosować metalne złączki rurkowe. W ten sposób wszystkie roztwory odpadowe zostaną wypłukane z chipu i zebrane w pojemniku na odpady. Przepływ przez kanały wylotowe tworzy delikatne ssanie, które zapewni stabilne unieruchomienie nicienia podczas późniejszego procesu pułapkowania.
    2. Przygotować połączenia składające się z rurek PE o długości 50 mm (średnica zewnętrzna 0,9652 mm, średnica wewnętrzna 0,5842 mm) z rurkami metalowymi (rozmiar 23TW, średnica zewnętrzna 0,635 mm) na obu końcach. Połączenia te należy wcisnąć w każdy z sześciu palców aktywujących oraz w wlot śruby (patrz Rysunek 1). Pozostaw te łączniki w chipie, ponieważ wielokrotne ich wyjmowanie prowadzi do zużycia otworów w PDMS.
  3. Umieść chip na mikroskopie. Przenieś 2–5 nicieni do kropli przefiltrowanej (0,2-µm filtr strzykawkowy) bufor M9, a następnie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać je do rurki z PE (średnica zewnętrzna 0,9652 mm, średnica wewnętrzna 0,5842 mm) połączonej ze strzykawką o pojemności 1 ml, powoli odciągając tłok. Zwierzęta należy trzymać w rurce z PE, a nie w strzykawce.
    UWAGA: Zbyt duża liczba nicieni lub zastosowanie nieprzefiltrowanych roztworów w chipie może prowadzić do jego zapchania.
  4. Podłączyć rurkę PE strzykawki do połączenia przy wlocie dla dżdżownicy (Rycina 1 i Rycina 2) chipa. Aktywuj przepływ grawitacyjny poprzez otwarcie zaworu i uruchom pompę perystaltyczną. Następnie delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aby przetransportować zwierzęta do kanału pułapkowego, obserwując kanał pod mikroskopem z obiektywem 10X w trybie jasnego pola.
    UWAGA: Sporadycznie pojawiające się pęcherzyki powietrza nie stanowią problemu; są one zazwyczaj automatycznie przemieszczane do wylotu. W komorze oczekiwania można „zaparkować” kilka zwierząt i wykorzystywać je sekwencyjnie.
    1. Po umieszczeniu zwierzęcia w kanale chwytnym (patrz również Rysunek 2), skoryguj jego pozycję, delikatnie pchając lub ciągnąc tłok strzykawki, aby ustawić głowę zwierzęcia w zwężającej się części przedniej części kanału.
    2. Upewnij się, że nicień (dorosły, 1. dzień) ma odpowiednią wielkość, aby został uwięziony w chipie.
      1. Jeśli nicień nie wypełnia całego przekroju kanału od przedniej części ciała do miejsca blisko jego końca (z wyłączeniem końca ogona) lub jeśli nicień przemieszcza się wzdłuż osi kanału bez ruchu tłoka strzykawki, należy usunąć go, naciskając tłok strzykawki do momentu, aż zniknie on z kanału pułapki, a następnie wprowadzić nowy osobnik (patrz krok 3.8).
    3. Przełącz mikroskop w tryb fluorescencyjny i użyj obiektywu o większym powiększeniu (40X lub więcej), a następnie sprawdź, czy neuryt badanego neuronu znajduje się na przekroju przysłony jednego z siłowników. Jeśli tak nie jest, skoryguj położenie zwierzęcia, pociągając za tłok lub go pchając. Jeśli to nie pomoże, usuń robaka i wprowadź nowego.
  5. Skup się na ciele komórki interesującego neuronu i połącz złącze siłownika znajdujące się najbliżej neuronu po przedniej stronie ciała komórki z programowalną pompą ciśnieniową za pomocą rurki PE.
    1. Jeśli eksperyment wymaga pomiaru odległości między aktuatorem a neuronem, przesuń pole widzenia tak, aby oba obiekty znajdowały się w polu widzenia, a ścianka kanału była równoległa do górnej i dolnej krawędzi obrazu.
  6. Zdefiniuj protokół ciśnienia za pomocą programowalnej pompy ciśnieniowej.
    UWAGA: Protokół ten można dostosować do potrzeb konkretnego eksperymentu.
    1. Rozpocznij od stałego ciśnienia 0 kPa przez czas odpowiadający co najmniej 50 obrazom z sekwencji obrazów (niezbędne do normalizacji). Przy częstotliwości obrazowania 10 Hz odpowiada to 5 s. W drugim kroku dodaj pożądaną falę bodźca i ciśnienie oraz zdefiniuj długość bodźca.
      UWAGA: Do stymulacji jąder siatkowatych wzgórza (TRNs) zastosowano przebieg sinusoidalny o (tj., 75 kPa, 10 Hz) z nałożonym skokiem (t.j., 275 kPa), jest zalecane, ponieważ generuje silną odpowiedź neuronalną.
    2. Jeśli eksperyment wymaga dodatkowych bodźców, należy wprowadzić przerwę trwającą co najmniej 10 s przy stałym ciśnieniu 0 kPa pomiędzy bodźcami. Przed włączeniem pompy ciśnieniowej należy upewnić się, że ciśnienie w urządzeniu jest stałe i wynosi 0 kPa, aby uniknąć przypadkowej stymulacji nicienia przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu.
  7. Uruchom protokół obrazowania i pomiaru ciśnienia.
    1. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu kamery należy ustawić sekwencję obrazów z częstotliwością 10 Hz i czasem ekspozycji 100 ms przez cały czas trwania protokołu ciśnieniowego. Należy dostosować intensywność wzbudzenia tak, aby maksymalny wzrost fluorescencji nie spowodował nasycenia detektora kamery. Obrazy należy zapisać w formacie pliku *.tif, uwzględniając co najmniej 50 obrazów przed pierwszym bodźcem w celu normalizacji.
    2. Uruchom protokół obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu oraz protokół ciśnienia w oprogramowaniu pompy programowalnej. Podczas rejestracji sprawdź, czy badany neuron jest najjaśniejszym punktem w obszarze 10 x 10 pikseli, czy nie przemieszcza się o więcej niż 10 pikseli na kolejnych obrazach oraz czy pozostaje w polu widzenia podczas rejestracji.
      UWAGA: Pominięcie tego kroku spowoduje błąd oprogramowania analitycznego. Jasne punkty (tj. autofluorescencja) wokół neuronu utrudniają uzyskanie czystych zapisów. Aby to naprawić, należy usunąć nicienia z pułapki i wprowadzić do chipa nowy okaz. Jeśli nicień wykazuje zbyt dużą ruchliwość, należy podjąć kolejną próbę rejestracji tego samego osobnika i obserwować jego ruchy. Jeśli problem nadal występuje, nicień może być zbyt mały, aby został uwięziony. W takim przypadku należy usunąć tego osobnika i wprowadzić do pułapki nieco większego nicienia.
    3. W razie potrzeby można jednocześnie rejestrować sygnały z wielu neuronów w polu widzenia, pod warunkiem że neurony te są oddalone od siebie o co najmniej 10 pikseli przez cały czas trwania rejestracji.
    4. Aby zbadać habituację, należy wielokrotnie powtórzyć eksperyment na zwierzęciu.
  8. Usuń nicienia z kanału pułapkowego.
    1. Jeśli istnieje potrzeba zachowania nicienia do dalszych badań, należy odłączyć wyloty układu w kierunku przepływu grawitacyjnego oraz pojemnika na odpady. Należy delikatnie nacisnąć tłok strzykawki, aż cały nicień zostanie wypchnięty z kanału pułapkowego do kanału przepływowego.
    2. Nadal naciskaj tłok strzykawki, aż zwierzę pojawi się w kropli poza chipem. Odłącz strzykawkę wraz z rurką PE od wlotu dla nicieni, a następnie użyj jej do aspiracji nicieni z kropli i przenieś je na płytkę agarową.
    3. Jeśli nie ma potrzeby zachowania nicienia, należy go usunąć, naciskając tłok strzykawki tak długo, aż cały organizm zostanie przepchnięty przez kanał pułapki do kanału przepływowego; przepływ grawitacyjny oraz ssanie pompy perystaltycznej wyniosą zwierzę z chipa do pojemnika na odpady.

4. Analiza

  1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję programu Fiji32.
  2. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Java SDK.
    UWAGA: Jeśli jest to konieczne, należy usunąć lub zmienić nazwę folderu java wewnątrz folderu Fiji, aby program Fiji mógł korzystać z nowo zainstalowanego kompilatora java.
  3. Uruchom oprogramowanie Fiji.
    1. Sprawdź, czy oprogramowanie korzysta z nowo zainstalowanego kompilatora Java, otwierając sekcję „Plugins| Utilities| ImageJ| Properties”.
  4. Pobierz plik pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, patrz Plik uzupełniający 2).
  5. Przeciągnij i upuść plik .java do okna oprogramowania, aby otworzyć go jako wtyczkę.
  6. Skompiluj i uruchom plik pokinganalyzer*.java, naciskając klawisze Ctrl+R w programie Fiji; otworzy się interfejs graficzny (Poking Analyzer) (Rycina 3).
    1. Kliknij kartę „Pomoc” i zapoznaj się z wymaganiami oprogramowania oraz sposobem przeprowadzania analizy. Aby rozpocząć, wybierz kartę „Otwórz wideo”. Określ lokalizację pliku wideo dla analizatora: kliknij przycisk „Otwórz wideo”, przejdź do folderu z plikiem wideo i otwórz go.
      UWAGA: Oprogramowanie uruchamia się z otwartą tą kartą. Jeśli nie jest ona otwarta podczas rozpoczynania nowej analizy, należy kliknąć kartę „Open video”. Jeśli wideo jest w formacie .tif, program wewnętrznie otworzy plik i wyświetli pierwszy obraz w dolnej części interfejsu. Jeśli wyświetlony obraz nie pochodzi z analizowanego wideo, należy kliknąć przycisk „Open a video”, aby otworzyć inny plik wideo.
    2. Aby kontynuować, kliknij kartę „Define ROIs”. W tej karcie zdefiniuj położenie TRN. Należy zauważyć, że w dolnej części tej karty wyświetlany jest pierwszy obraz z otwartego filmu. Kliknij przycisk „Define TRN”, a następnie kliknij neuron w górnej części wyświetlanego obrazu, który powinien wykazywać fluorescencję GCaMP.
    3. Opcjonalnie: jeśli siłownik jest widoczny w górnej połowie obrazu, program może automatycznie śledzić odległość między neuronem a siłownikiem, jeśli jest taka potrzeba. W tym celu należy zaznaczyć pole „Define the actuator?”, kliknąć przycisk „Define Actuator”, a następnie kliknąć siłownik w górnej połowie obrazu.
    4. Kliknij kartę „Analysis”. Określ częstotliwość akwizycji obrazów. Wpisz liczbę w odpowiednim polu lub użyj przycisków w górę i w dół, aby zwiększyć lub zmniejszyć jej wartość. Jeśli w poprzedniej karcie zaznaczono pole „Define the actuator?”, określ rozmiar piksela kamery, powiększenie oraz współczynnik binningu, aby program mógł obliczyć odległość.
    5. Kliknij przycisk „Start Analysis”.
      UWAGA: Program będzie teraz śledzić neuron na podstawie jego fluorescencji w sekwencji obrazów w górnej połowie (zależnej od wapnia) oraz w dolnej połowie (niezależnej od wapnia) sekwencji obrazów. Aby uwzględnić ruch neuronu w płaszczyźnie rejestracji, program przeszuka obszar o wymiarach 10 x 10 pikseli wokół położenia neuronu na poprzednim obrazie, aby zlokalizować pozycję neuronu na kolejnym obrazie. Program obliczy fluorescencję w obu połowach poprzez korektę o fluorescencję tła (Fbg) i dzieląc przez fluorescencję w pierwszych 50 obrazach (F0):
      Wzór na wygaszanie fluorescencji (F-Fbq)/(F0-Fbq); schemat w badaniu spektroskopowym.
      Zmiany fluorescencji w zielonym kanale zależnym od aktywności (FWapń2+) które są spowodowane ruchem neuronów poza płaszczyznę rejestracji, są następnie korygowane z wykorzystaniem fluorescencji w czerwonym kanale niezależnym od aktywności (Fkorelacja) oraz odchylenie standardowe przed bodźcem dla zależnego od wapnia (sdCa2+) i niezależnej fluorescencji (sdkorekta) przez:
      Wzór równowagi chemicznej, Fc(a)2+ z poprawką (Fcorr), przedstawienie równania.
    6. Program będzie wyświetlać postęp w pasku stanu w dolnej części interfejsu; gdy pasek stanu osiągnie 10%, należy kliknąć kartę „Results”. Jeśli pasek stanu zatrzyma się przed osiągnięciem 10%, program wyświetli komunikat o błędzie wskazujący przyczynę, dla której analiza wideo nie była możliwa.
      1. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski, program nie będzie w stanie zidentyfikować neuronu; w kolejnych pomiarach należy dostosować parametry obrazowania.
      2. Jeśli neuron opuści pole widzenia podczas rejestracji, program nie będzie mógł go już śledzić i zostanie zatrzymany. W przypadku kolejnych pomiarów należy umieścić neuron w środku pola widzenia na początku rejestracji.
      3. Jeśli niektóre obszary w polu widzenia są przesycone, automatyczna analiza wygeneruje błędne wyniki. W przypadku kolejnych pomiarów należy upewnić się, że sygnał fluorescencyjny nie powoduje nasycenia sensora kamery.
    7. W karcie „wyniki” (results) wynik jest wyświetlany w górnej części. Zapisz tabelę wyników jako plik *.txt z rozdzielaczami tabulacyjnymi, klikając „Zapisz tabelę wyników” (Save the Result Table).
      UWAGA: Tabela ta zawiera czas w sekundach oraz znormalizowaną fluorescencję zależną od wapnia (skorygowaną o fluorescencję niezależną od wapnia). Jeśli została wcześniej określona, zawiera ona również całkowitą odległość między TRN a aktuatorem w µm oraz odległość między TRN a siłownikiem prostopadle do ściany kanału w µmPrzedstawiono reprezentatywne wyniki wzrostu intensywności fluorescencji po stymulacji w zależności odległości ciała komórki od najbliższego aktuatora na wykresie w Rycina 4.
    8. Jeśli w jednym nagraniu znajduje się wiele neuronów (oddzielonych od siebie więcej niż 10 pikselami), należy ponownie kliknąć kartę „Define ROIs” i wrócić do kroku 4.6.2 z drugim neuronem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Litografia SU-8 i bondowanie chipa
Protokół litografii i formowania w PDMS przebiega zgodnie ze standardowymi procedurami. Szczegóły można znaleźć w innych źródłach23,24,25,26. Po utwardzeniu PDMS powinien bez problemu oddzielić się od wafla. Jeśli elementy z SU-8 odrywają się podczas oddzielania PDMS, oznacza to, że warstwa adhezyjna SU-8 l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten demonstruje metodę dostarczania precyzyjnej stymulacji mechanicznej do skóry glisty uwięzionej w chipie mikroprzepływowym. Ma on na celu ułatwienie integracji bodźców fizycznych w celu udzielenia odpowiedzi na pytania biologiczne i ma na celu usprawnienie badań mechanobiologicznych w laboratoriach biologicznych. Metoda ta rozszerza wcześniejsze testy w celu oceny funkcji neuronów mechanosensorycznych u C. elegans. Poprzednie techniki ilościowe i półilościowe mierzyły siły

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Sandrze N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divyi Gopisetty i Veronice Sanchez za wsparcie w projektowaniu urządzeń i generowaniu zmutowanych zwierząt. Badania te były wspierane przez granty NIH R01EB006745 (dla BLP), R01NS092099 (dla MBG), K99NS089942 (dla MK), F31NS100318 (dla ALN) i otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa grantowa nr 715243 do MK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Maska ChromeCompugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chromowanamaska Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chromowanamaska Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4-calowy wafel krzemowy (test B)Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
Spin-coaterLaurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP/LITE
Zegar ekspozycjiOptical Associates, IncOAI 150
KontroleroświetleniaOptical Associates, Inc2105C2
SU-8 deweloperMicroChem
2-PropanolFisher ScientificA426F-1GAL
AcetonFisher ScientificA18-4
Trichloromethylsilane (TCMS)Sigma-Aldrich92361-500MLUwaga: TCMS jest toksyczny i reaguje na wodę
Zestaw elastomerów Sylgard 184Dow CorningPDMS prepolimer
Dziurkacz do biopsji, 1 mmVWR95039-090
Plazma tlenowa AsherBranson/IPC
Małe metalowe rurki (0,635 mm średnica zewnętrzna, 0,4318 mm średnica wewnętrzna, długość 12,7 mm); rozmiar miernika 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
Filtr strzykawkowy Nalgene, 0,22 μ mThermo Scientific725-2520do filtrowania całego roztworu, małe cząsteczki zatkałyby chip
Rurka polietylenowa; 0,9652 mm średnicy zewnętrznej, 0,5842 mm średnicy wewnętrznejSolomon ScientificBPE-T50
, 1 ml StrzykawkaScientific309628do wychwytywania i uwalniania robaków
, 20 ml309661 BD Scientificdo przepływu grawitacyjnego
Gilson Minipuls 3, perystaltyczny pompaGilsondo zasysania roztworów i ślimaków z chipa
Mikroprzepływowy regulator przepływu, wyposażony w 0– Kanał ciśnieniowy 800 kPaDostarczanie ciśnieniaElveflowOB1 MK3
Wodoodporna, przezroczysta rurka poliuretanowa, 4 mm ID i 6 mm ODMcMaster-Carr5195 T52Przyłącze od powietrza domowego do pompy ciśnieniowej
Wodoodporna przezroczysta rurka poliuretanowa, średnica wewnętrzna 2,6 mm i średnica zewnętrzna 4 mmMcMaster-Carr5195 T51podłącz pompę ciśnieniową do małej rurki
Złączka rurkowa Push-to-Connect do powietrzaMcMaster-Carr5111K468konwerter calowy
Łącznik prosty do 6 mm & czas; 1/4″ Rura zewnętrznaMcMaster-Carr5779 K258
System mikroskopowy Leica DMI 4000 BLeica
63×/1.32 NA HCX PL APO obiektyw olejowyLeica506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT aparat cyfrowy CMOSHamamatsuC11440-42U
Lumencor Silnik świetlny Spectra XLumencorZ cyjanem i zielono-żółtym źródłem światła
Rozdzielacz wiązki wzbudzeniaChroma59022bsw mikroskopie
Hamamatsu W-view Gemini Optyka rozdzielająca obrazHamamatsuA12801-01do podziału emisji zielonej i czerwonej i rzutowania ich na różne obszary na chipie kamery
Rozdzielacz wiązki emisyjnejChromaT570lpxrw rozdzielaczu obrazu
Filtry emisyjne GCamp6sChromaET525/50mw rozdzielaczu obrazu
Filtry emisyjne mCherryChromaET632/60mw rozdzielaczu obrazu
Strzykawka BD

Bibliografia

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151(2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998(2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172(2017).
  20. Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276(2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080(2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599(2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chip mikroprzepływowyGCaMP6sneurony receptorowe dotykusiłowniki pneumatyczneaktywacja ciśnieniowamikroskopia fluorescencyjnapułapkowanie nicponiowców
Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.