Method Article

Wykorzystanie urządzenia mikroprzepływowego do stymulacji mechanicznej i obrazowania C. elegans w wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/56530

⸱

February 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowe narzędzia do badań mechanobiologii są potrzebne, aby zrozumieć, jak stres mechaniczny aktywuje szlaki biochemiczne i wywołuje reakcje biologiczne. W tym artykule prezentujemy nową metodę selektywnej stymulacji mechanicznej unieruchomionych zwierząt za pomocą pułapki mikroprzepływowej, umożliwiającej obrazowanie odpowiedzi komórkowych w wysokiej rozdzielczości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych celów mechanobiologii jest zrozumienie wzajemnego wpływu stresu mechanicznego na białka i komórki. Pomimo swojego znaczenia, wpływ stresu mechanicznego na funkcjonowanie komórek jest nadal słabo poznany. Luka w wiedzy wynika po części z tego, że niewiele narzędzi umożliwia jednoczesną deformację tkanek i komórek, obrazowanie aktywności komórkowej u żywych zwierząt oraz skuteczne ograniczanie ruchliwości w organizmach modelowych, które w przeciwnym razie byłyby wysoce mobilne, takie jak nicienie Caenorhabditis elegans. Niewielkie rozmiary C. elegans sprawiają, że doskonale pasują do urządzeń badawczych opartych na mikrofluidyce, a rozwiązania do immobilizacji zostały zaprezentowane przy użyciu urządzeń mikroprzepływowych. Chociaż urządzenia te pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zwierzę jest całkowicie zamknięte w polidimetylosiloksanach (PDMS) i szkle, co ogranicza fizyczny dostęp do dostarczania siły mechanicznej lub zapisów elektrofizjologicznych. Niedawno stworzyliśmy urządzenie, które integruje siłowniki pneumatyczne z konstrukcją pułapki, która jest kompatybilna z mikroskopią fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości. Kanał uruchamiający jest oddzielony od kanału wychwytywania ślimaków cienką membraną PDMS. Membrana ta jest odchylana w bok ślimaka poprzez wywieranie nacisku z zewnętrznego źródła. Urządzenie może celować w poszczególne neurony wrażliwe mechanicznie. Aktywacja tych neuronów jest obrazowana w wysokiej rozdzielczości za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. W artykule przedstawiono ogólną metodę z wykorzystaniem szczepów C. elegans wykazujących ekspresję wskaźnika aktywności wrażliwej na wapń (GCaMP6s) w neuronach receptora dotyku (TRN). Metoda ta nie ogranicza się jednak do TRN ani do czujników wapnia jako sondy, ale może być rozszerzona na inne mechanicznie wrażliwe ogniwa lub czujniki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmysł dotyku dostarcza zwierzętom kluczowych informacji o ich otoczeniu. W zależności od przyłożonej siły, dotyk jest postrzegany jako nieszkodliwy, przyjemny lub bolesny. Deformacja tkanki pod wpływem dotyku jest wykrywana przez wyspecjalizowane komórki mechanoreceptorowe osadzone w skórze, które wyrażają białka receptorowe, najczęściej kanały jonowe. Kroki łączące percepcję siły z aktywacją kanałów jonowych podczas dotyku i bólu nie są w pełni zrozumiałe. Jeszcze mniej wiadomo o tym, w jaki sposób tkanka skórna filtruje deformacje mechaniczne i czy mechanoreceptory wykrywają zmiany w odkształceniu lub stresie1,2,3. Ta luka w zrozumieniu wynika po części z braku odpowiednich narzędzi do stosowania precyzyjnych stymulacji mechanicznych na powierzchni skóry żywego zwierzęcia przy jednoczesnej obserwacji reakcji na poziomie komórkowym. Podczas gdy mikroskopia sił atomowych była szeroko stosowana do przykładania i mierzenia sił w izolowanych komórkach4,5, a także do aktywacji receptorów Piezo1 w żywych komórkach6, podobne eksperymenty z użyciem żywych zwierząt, zwłaszcza C. elegans, były notorycznie trudne ze względu na wewnętrzną mobilność obiektu. To wyzwanie jest tradycyjnie obchodzone poprzez użycie kleju cyjanoakrylowego klasy weterynaryjnej lub chirurgicznej do unieruchamiania poszczególnych zwierząt na podkładkach agarowych1,7,8,9. To podejście było produktywne, ale ma ograniczenia związane z umiejętnościami wymaganymi do unieruchomienia przez klejenie i miękką powierzchnią agaru w zakresie podatności mechanicznej. Strategia mikrofluidyczna jest komplementarną alternatywą, która pozwala uniknąć niektórych komplikacji związanych z klejeniem.

Nicień C. elegans to genetyczny organizm modelowy z całkowicie zmapowanym układem nerwowym, który, ze względu na rozmiar zwierzęcia, dobrze pasuje do technologii mikrofluidycznej. Urządzenia oparte na mikrofluidyce mają tę zaletę, że niezwykle ruchliwe zwierzęta mogą być skrępowane podczas wykonywania obrazowania w wysokiej rozdzielczości i dostarczania odpowiednich bodźców neuromodulacyjnych. Za pomocą technologii mikroprzepływowych żywe zwierzęta mogą być unieruchomione bez szkody10,11, umożliwiając monitorowanie aktywności behawioralnej przez całe życie12,13 i obrazowanie aktywności neuronalnej w wysokiej rozdzielczości14,15,16,17. Co więcej, wiele neuronów mechanoreceptorowych potrzebnych do zmysłu dotyku i bólu można scharakteryzować na podstawie ich fizjologicznych1,8, mechanical4,18,19, oraz poziom molekularny20,21,22.

C. elegans wyczuwa delikatne bodźce mechaniczne na ścianie swojego ciała za pomocą sześciu TRN, z których trzy unerwiają przednią część zwierzęcia (ALML/R i AVM), a trzy z nich unerwiają tylną część zwierzęcia (PLML/R i PVM). Cząsteczki kanału jonowego potrzebne do przekształcenia przyłożonej siły w sygnał biochemiczny zostały szeroko zbadane w TRNs8. W tym artykule przedstawiono platformę mikroprzepływową23, która umożliwia naukowcom przyłożenie precyzyjnych sił mechanicznych do skóry unieruchomionej glisty C. elegans, jednocześnie odczytując deformację jej wewnętrznych tkanek za pomocą obrazowania optycznego. Oprócz prezentowania dobrze zdefiniowanych bodźców mechanicznych, przejściowe stany wapnia mogą być rejestrowane w neuronach mechanoreceptorowych z rozdzielczością subkomórkową i skorelowane z cechami morfologicznymi i anatomicznymi. Urządzenie składa się z centralnego kanału pułapkowego, który utrzymuje pojedyncze zwierzę i prezentuje jego skórę obok sześciu pneumatycznych kanałów uruchamiających (Rysunek 1 i Rysunek 2). Sześć kanałów jest rozmieszczonych wzdłuż kanału pułapkowego, aby dostarczać bodźce mechaniczne do każdego z sześciu TRN robaka. Kanały te są oddzielone od komory pułapkowej cienkimi membranami PDMS, które mogą być napędzane przez zewnętrzne źródło ciśnienia powietrza (Rysunek 1). Skalibrowaliśmy ugięcie w odniesieniu do ciśnienia i przedstawiliśmy pomiary w tym artykule. Każdy siłownik może być adresowany indywidualnie i używany do stymulacji wybranego mechanoreceptora. Ciśnienie jest dostarczane za pomocą pompy ciśnieniowej z napędem piezoelektrycznym, ale można zastosować dowolne urządzenie alternatywne. Pokazujemy, że protokół ciśnienia może być wykorzystany do aktywacji TRN in vivo i zademonstrowania urządzeń operacyjnych odpowiednich do dostarczania bodźców mechanicznych dorosłym C. elegans, ładowania dorosłych zwierząt do urządzeń, wykonywania eksperymentów obrazowania wapnia i analizowania wyników. Produkcja urządzenia składa się z dwóch głównych etapów: 1) fotolitografii w celu wykonania formy z SU-8; oraz 2) formowanie PDMS w celu wykonania urządzenia. Dla zwięzłości i jasności czytelnicy są odsyłani do wcześniej opublikowanych artykułów i protokołów24,25 w celu uzyskania instrukcji dotyczących produkcji form i urządzeń.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja urządzeń

  1. Pobierz załączony plik maski (Plik uzupełniający 1) i wygeneruj maskę chromowaną za pomocą usługi komercyjnej lub własnego obiektu. Ponieważ najmniejszy wymiar na urządzeniu wynosi 10 μm (grubość membrany siłownika), upewnij się, że maska ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, w granicach ± 0,25 μm, aby niezawodnie wytwarzać cechy.
  2. Postępuj zgodnie ze standardowymi metodami fotolitografii SU-8 (np. referencje24,25,26), aby wyprodukować formę do późniejszej produkcji urządzeń PDMS; podsumowanie kroków znajduje się poniżej.
    UWAGA: SU-8 jest materiałem światłoczułym, który sieciuje się pod wpływem światła ultrafioletowego (maksymalna absorpcja ~ 365 nm). Skorzystaj z instrukcji producenta jako punktu wyjścia do określenia parametrów przetwarzania dla miękkiego pieczenia, ekspozycji (UV) i po wypieku.
    1. Osadzaj SU-8 2002 na płytce krzemowej i powlekaj ją wirowo do przybliżonej grubości 2 μm, aby uzyskać lepszą przyczepność małych struktur. Piec na miękko na płycie grzejnej przez 1 minutę w temperaturze 95 °C, lekko prześwietlić (UV) całą powierzchnię (~ 100 mJ/cm2) i piec na gorącej płycie przez 2 minuty w temperaturze 95 °C.
    2. Powłoka wirowa warstwy SU-8 2050 o grubości 47 μm w celu zdefiniowania funkcji urządzenia. Użyj prędkości wirowania 500 obr./min przez 15 s (przyspieszenie 130 obr./min), a następnie 2 000 obr./min przez 90 s (przyspieszenie 260 obr./min). W razie potrzeby powtórz i dostosuj prędkość wirowania, aby uzyskać odpowiednią grubość fotorezystu.
    3. Piec na miękko na płycie grzejnej przez 2 minuty w temperaturze 65 °C, a następnie przez 7 minut w temperaturze 95 °C. Naświetlić fotorezystor zgodnie z instrukcją producenta (~ 160 mJ/cm2) za pomocą chromowanej maski i filtra długoprzepustowego, aby zapewnić proste ściany boczne.
    4. Wyjmij wafel i upiecz na gorącej płycie przez 1 minutę w temperaturze 65 °C i przez 7 minut w temperaturze 95 °C.
    5. Rozpuść nienaświetlony SU-8 za pomocą wywoływacza i wyczyść 2-propanolem.
    6. Piecz wafel na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C przez 30 minut (pieczenie na twardo), aby ustabilizować właściwości fotorezystu.
  3. Wykonaj replikę PDMS z modelu SU-8 przy użyciu standardowych metod formowania repliki27.
    1. Potraktuj formę SU-8 parą trichlorometylosilanu (TCMS), aby zmniejszyć przyczepność PDMS (silanizację).
      UWAGA: TCMS jest toksyczny i reaguje z wodą.
      1. Umieść wzorzystą płytkę w stojaku na wafle w eksykatorze próżniowym w słoiku dzwonkowym w dygestoriach wolnych od wody lub odczynników rozpuszczalnych w wodzie.
      2. Pod maską użyj zakraplacza, aby nałożyć 1 kroplę TCMS na szklane naczynie i umieścić wewnątrz eksykatora.
      3. Zamknij pokrywę eksykatora i pozwól, aby para TCMS pokryła płytkę przez co najmniej 20 minut.
      4. Odpowietrzyć, a następnie otworzyć eksykator. Otwórz pokrywkę słoika i wyjmij wafel za pomocą plastikowej pęsety. Umieść na szalce Petriego lub łódce z folii aluminiowej do formowania replik PDMS. Materiały pokryte TCMS należy utylizować wraz z odpowiednimi odpadami niebezpiecznymi.
    2. Wymieszać PDMS (w stosunku 10:1) używając 40 g polimeru bazowego i 4 g utwardzacza PDMS.
    3. Wylej mieszaninę na formę SU-8 i odgazowuj mieszaninę przez co najmniej 30 minut w komorze próżniowej.
    4. Utwardzać przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 70 °C w suszarce.
  4. Podnieś PDMS z płytki, ustawiając płytkę poziomo na płaskiej powierzchni i ostrożnie odklejając PDMS. Na tym etapie nie zginaj wafla do góry, ponieważ może to spowodować pęknięcie formy.
    UWAGA: Niepełne przyleganie SU-8 do płytki lub niepełna silanizacja może spowodować zniszczenie struktur SU-8 na tym etapie.
  5. Pokrój PDMS wokół urządzeń na pojedyncze chipy tak, aby urządzenia zmieściły się na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm.
  6. Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 1 mm wykonaj otwory we wlocie, dwóch wylotach i sześciu siłownikach za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 1 mm. Celuj w okręgi o średnicy 2 mm wokół krawędzi urządzenia.
  7. Klej chipy PDMS do szkiełek nakrywkowych.
    1. Wystaw obie powierzchnie na działanie plazmy tlenowej o mocy 80 W (30 s).
    2. Delikatnie umieść odsłoniętą powierzchnię PDMS na odsłoniętej powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać uszczelnienie konforemne.
    3. Wyżarzać urządzenie na płycie grzejnej (100 °C, 10 min).
      UWAGA: Niewystarczające połączenie może doprowadzić do awarii urządzenia z powodu wycieku.

2. Przygotowanie mikroskopu

UWAGA: Zwierzęta transgeniczne: wyrażają wskaźnik wapnia, taki jak GCaMP6s28 lub inną genetycznie zakodowaną sondę aktywności w interesującym nas neuronie (np. TRN); współwyrażają niezależne od aktywności białko fluorescencyjne emitujące na innej długości fali, aby skorygować małe boczne i nieostre artefakty ruchu, które powstają w wyniku stymulacji mechanicznej. Zautomatyzowane oprogramowanie analityczne śledzi i kompensuje zmiany intensywności sondy aktywności wywołane ruchem. Szczepy robaka GN69223 (lub AQ323629) wyrażają GCaMP6s (lub GCaMP6m) i niezależny od wapnia tagRFP pod kontrolą promotora mec-7. Dodatkowo GN692 zawiera mutację lite-1 (ce314), która zapobiega aktywacji TRN z powodu czujnika światła niebieskiego lite-130 podczas wzbudzenia fluorescencji GCaMP6s23.

  1. Skonfiguruj system mikroskopowy do jednoczesnego wzbudzania GCaMP i RFP.
    1. Należy użyć ciągłego źródła światła i dwupasmowego filtra wzbudzenia, który przepuszcza tylko światło błękitne i żółte, lub użyć źródła światła, które emituje tylko długości fal w określonym paśmie, takim jak jednoczesne cyjaniczne (0,77 mW) i żółte (1,21 mW) źródła wzbudzenia LED do jednoczesnego wzbudzenia odpowiednio fluorescencji zależnej od wapnia i niezależnej.
    2. Użyj aparatu cyfrowego, aby umożliwić rejestrowanie obrazów mikroskopowych.
      UWAGA: Większość aparatów jest dostarczana z oprogramowaniem do akwizycji obrazu. Alternatywnie dostępne jest ogólnodostępne oprogramowanie, które można wykorzystać do sterowania kamerą, a potencjalnie także innymi częściami systemu mikroskopowego.
    3. Dostosuj intensywność wzbudzenia na podstawie intensywności fluorescencji, aby uniknąć nasycenia kamery.
  2. Użyj kostki fluorescencyjnej, która w zależności od wyboru źródła wzbudzenia musi być wyposażona w filtr wzbudzenia.
    UWAGA: Zastosowano tu filtr wzbudzenia GFP 488 nm i 580 nm mCherry.
    1. Dodaj rozdzielacz wiązki do sześcianu, aby odbijać światło cyjanowe i żółte oraz przepuszczać światło zielone i czerwone.
    2. Wyposaż mikroskop w obiektyw 10X i obiektyw o dużym powiększeniu (np. olej 63X/1.32 NA), aby skupić światło wzbudzenia na próbce.
  3. Zamontuj rozdzielacz wiązki przed kamerą, aby uzyskać jednoczesny zapis GCaMP i sygnału niezależnego od wapnia. Upewnij się, że rozdzielacz wiązki ma zwierciadło dichroiczne (długie przelotowe, odcięcie przy 570 nm) do oddzielania światła zielonego i czerwonego za pomocą jednego filtra emisyjnego dla zielonego (pasmo przepustowe wyśrodkowane na 525 nm o szerokości 50 nm) i jednego filtra emisyjnego dla światła czerwonego (pasmo przepustowe wyśrodkowane na 632 nm o szerokości 60 nm).
  4. Rzutuj zieloną i czerwoną fluorescencję odpowiednio na górną połowę (zielony) i dolną połowę (czerwony) chipa aparatu (patrz Rysunek 3). Ta orientacja jest warunkiem wstępnym dla dostarczonego oprogramowania analitycznego.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Przygotuj zsynchronizowanego z wiekiem młodego dorosłego lub dorosłego C. elegans pierwszego dnia, jak opisano wcześniej przez Porta-de-la-Riva i wsp.31
  2. Przygotuj chip mikroprzepływowy.
    1. Podłączyć zbiornik przepływu grawitacyjnego (~ 60 cm nad poziomem chipa) zawierający przefiltrowany (0,2 μm filtr strzykawkowy z polieterosulfonu) bufor M9 do jednego wylotu chipa. Drugi wylot podłączyć do jednego wylotu dwuwylotowego pojemnika na odpady, tj. kolby filtrującej. Podłączyć drugi wylot pojemnika na odpady do pompy perystaltycznej.
      UWAGA: Do wszystkich połączeń należy używać rurek z polietylenu (PE) i używać metalowych łączników rurowych do łączenia rurki PE z chipem. W ten sposób wszystkie roztwory odpadowe zostaną wypłukane z wióra i zebrane w pojemniku na odpady. Przepływ przez kanały wylotowe tworzy delikatne ssanie, które utrzyma robaka w ciasnym miejscu podczas późniejszego procesu chwytania.
    2. Przygotuj interkonekty składające się z rurki PE o długości 50 mm (średnica zewnętrzna 0,9652 mm, średnica wewnętrzna 0,5842 mm) z metalową rurką (rozmiar 23TW, średnica zewnętrzna 0,635 mm) na obu końcach. Wciśnij te połączenia w każdy z sześciu palców uruchamiających i do wlotu ślimaka (patrz Rysunek 1). Pozostaw te interkonektory w chipie, ponieważ wielokrotne usuwanie prowadzi do zużycia otworów PDMS.
  3. Umieść chip na mikroskopie. Zbierz 2–5 robaków do kropli przefiltrowanego (filtr strzykawkowy 0,2 μm) buforu M9 i użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby wciągnąć je do rurki PE (średnica zewnętrzna 0,9652 mm, średnica wewnętrzna 0,5842 mm) podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml, delikatnie pociągając za tłok. Zwierzęta należy przechowywać w probówce PE, a nie w strzykawce.
    UWAGA: Zbyt wiele robaków lub niefiltrowanych roztworów w chipie może prowadzić do zatkania.
  4. Podłącz rurkę PE strzykawki do interkonektu na wlocie ślimaka (Rysunek 1 i Rysunek 2) chipa. Aktywuj przepływ grawitacyjny, otwierając zawór i uruchom pompę perystaltyczną. Następnie delikatnie naciśnij tłok strzykawki strzykawki, aby przesunąć zwierzęta do kanału pułapki, obserwując kanał pod mikroskopem z soczewką 10X w trybie jasnego pola.
    UWAGA: Pojawiające się od czasu do czasu pęcherzyki powietrza nie stanowią problemu; Zazwyczaj są one automatycznie przenoszone do gniazdka. W poczekalni można "zaparkować" kilka zwierząt i wykorzystywać je sekwencyjnie.
    1. Po załadowaniu zwierzęcia do kanału pułapki (zobacz również Rysunek 2), dostosuj jego pozycję, delikatnie naciskając lub pociągając tłok strzykawki, aby ustawić głowę zwierzęcia w zwężającym się kształcie przedniej części kanału.
    2. Upewnij się, że robak (dorosły dzień 1) ma odpowiedni rozmiar, aby mógł zostać uwięziony w chipie.
      1. Jeżeli robak nie wypełnia całego przekroju poprzecznego kanału od nosa do prawie końca korpusu (nie włączając końca ogona) lub robak porusza się wzdłuż osi kanału, nie poruszając tłokiem strzykawki, należy usunąć ślimaka, naciskając tłok strzykawki, aż zniknie z kanału pułapkowego i załadować nowy (patrz krok 3.8).
    3. Przełącz się na tryb fluorescencji mikroskopu i soczewkę o większym powiększeniu (40X lub więcej) i sprawdź, czy neuryt interesującego neuronu znajdzie się w poprzek membrany jednego z siłowników. Jeśli nie, wyreguluj pozycję zwierzęcia, pociągając lub popychając tłok. Jeśli to nie pomoże, usuń robaka i załaduj nowy.
  5. Skoncentruj się na ciele komórki neuronu będącego przedmiotem zainteresowania i podłącz interkonekt siłownika znajdującego się najbliżej neuronu po przedniej stronie ciała komórki do programowalnej pompy ciśnieniowej za pomocą rurki PE.
    1. Jeśli eksperyment wymaga zmierzenia odległości między siłownikiem a neuronem, przesuń pole widzenia tak, aby oba znalazły się w polu widzenia, a ściana kanału była równoległa do górnej i dolnej krawędzi obrazu.
  6. Zdefiniuj protokół ciśnienia za pomocą programowalnej pompy ciśnieniowej.
    UWAGA: Ten protokół można dostosować do żądanego eksperymentu.
    1. Zacznij od stałego ciśnienia 0 kPa przez czas odpowiadający co najmniej 50 obrazom sekwencji obrazów (niezbędne do normalizacji). W przypadku częstotliwości obrazowania 10 Hz odpowiada to 5 s. Dodaj żądany kształt fali bodźca i ciśnienie, a następnie zdefiniuj długość bodźca jako drugi krok.
      UWAGA: Do stymulacji TRN zalecany jest sinusoidalny przebieg fali (tj. 75 kPa, 10 Hz) nałożony krokiem (tj. 275 kPa), ponieważ generuje on dużą odpowiedź neuronalną.
    2. Jeśli eksperyment wymaga dodatkowych bodźców, należy uwzględnić okres co najmniej 10 s przy stałym ciśnieniu 0 kPa pomiędzy bodźcami. Przed włączeniem pompy ciśnieniowej upewnij się, że ciśnienie w przyrządzie jest na stałym poziomie 0 kPa, aby uniknąć przypadkowej stymulacji ślimaka przed właściwym eksperymentem.
  7. Uruchom protokół obrazowania i ciśnienia.
    1. W oprogramowaniu do akwizycji obrazu kamery ustaw sekwencję obrazów z częstotliwością 10 Hz, używając czasu naświetlania 100 ms na czas trwania protokołu ciśnienia. Dostosuj intensywność wzbudzenia tak, aby maksymalny wzrost fluorescencji nie nasycał aparatu. Zapisz obrazy jako plik *.tif z co najmniej 50 obrazami przed pierwszym bodźcem do normalizacji.
    2. Uruchom protokół obrazowania w oprogramowaniu do akwizycji obrazu i protokół ciśnienia w oprogramowaniu programowalnej pompy. Podczas nagrywania obserwuj, czy interesujący go neuron jest najjaśniejszym punktem w obszarze 10 x 10 pikseli, nie przesuwa się dalej niż 10 pikseli na obrazach sekwencyjnych i pozostaje w polu widzenia podczas nagrywania.
      UWAGA: Jeśli nie zostanie to zrobione, oprogramowanie analityczne zakończy się niepowodzeniem. Jasne punkty (tj. autofluorescencja) wokół neuronu utrudniają czyste zapisy neuronów. Aby to naprawić, wyjmij robaka z pułapki i załaduj nowego robaka do chipa. Jeśli robak porusza się zbyt mocno, spróbuj ponownie nagrać tego samego robaka i obserwuj jego ruch. Jeśli problem będzie się powtarzał, robak może być zbyt mały, aby można go było złapać w pułapkę. W takim przypadku usuń tego robaka i załaduj nieco większego robaka do pułapki.
    3. W razie potrzeby nagrywaj sygnały z wielu neuronów w polu widzenia jednocześnie, o ile neurony są oddalone od siebie o co najmniej 10 pikseli podczas całego nagrania.
    4. Aby zbadać habituację, przeprowadź eksperyment w sposób powtarzalny na zwierzęciu.
  8. Usuń robaka z kanału pułapkowego.
    1. Jeśli pożądane jest zachowanie robaka do kolejnych badań, należy odłączyć wyloty chipa w kierunku przepływu grawitacyjnego i pojemnika na odpady. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki, aż cały ślimak zostanie wepchnięty przez kanał pułapkowy do kanału przepływowego.
    2. Naciskać tłok strzykawki, aż zwierzę pojawi się w postaci kropli poza chipem. Odłączyć strzykawkę wraz z rurką PE od wlotu ślimaka, użyć jej do zassania robaków w kropli i przenieść ją na płytkę agarową.
    3. Jeśli nie jest pożądane zatrzymanie robaka, należy go usunąć, naciskając tłok strzykawki, aż cały robak zostanie wepchnięty przez kanał pułapkowy do kanału przepływowego; przepływ grawitacyjny i ssanie pompy perystaltycznej przeniosą zwierzę z chipa do pojemnika na odpady.

4. Analiza

  1. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Fidżi32.
  2. Pobierz i zainstaluj najnowszą wersję java SDK.
    UWAGA: W razie potrzeby usuń lub zmień nazwę folderu java w folderze Fiji, aby Fidżi korzystało z nowo zainstalowanego kompilatora Java.
  3. Otwórz oprogramowanie Fiji.
    1. Sprawdź, czy oprogramowanie uruchamia nowo zainstalowany kompilator Java, otwierając "Wtyczki| Narzędzia| ObrazJ| Nieruchomości".
  4. Pobierz plik pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, patrz Plik uzupełniający 2).
  5. Przeciągnij i upuść plik .java do okna oprogramowania, aby otworzyć go jako wtyczkę.
  6. Skompiluj i uruchom plik pokinganalyzer*.java, naciskając Ctrl+R na Fidżi; otworzy się graficzny interfejs użytkownika (Poking Analyzer) (Rysunek 3).
    1. Kliknij w zakładkę "Pomoc" i zapoznaj się z wymaganiami oprogramowania oraz sposobem wykonania analizy. Aby rozpocząć, wybierz zakładkę "Otwórz wideo". Określ lokalizację pliku wideo dla analizatora: kliknij przycisk "Otwórz wideo", przejdź do lokalizacji wideo i otwórz go.
      UWAGA: Oprogramowanie uruchamia się po otwarciu tej karty. Jeśli nie jest otwarty podczas rozpoczynania nowej analizy, kliknij zakładkę "Otwórz wideo". Jeśli wideo jest w a.tif formacie, program wewnętrznie otworzy wideo i wyświetli pierwszy obraz w dolnej części interfejsu. Jeśli obraz nie przedstawia filmu, który należy przeanalizować, kliknij przycisk "Otwórz wideo", aby otworzyć inny film.
    2. Aby kontynuować, kliknij zakładkę "Zdefiniuj ROI". W tej zakładce określ pozycję TRN. Zwróć uwagę, że pierwszy obraz otwartego filmu jest wyświetlany w dolnej części tej zakładki. Kliknij przycisk "Zdefiniuj TRN", a następnie kliknij na neuron w górnej części wyświetlanego obrazu, który powinien wyświetlać fluorescencję GCaMP.
    3. Opcjonalnie: Jeśli siłownik jest widoczny w górnej połowie obrazu, program może w razie potrzeby automatycznie śledzić odległość między neuronem a siłownikiem. W tym celu zaznacz pole "Zdefiniuj siłownik?", kliknij przycisk "Zdefiniuj siłownik" i kliknij siłownik w górnej połowie obrazu.
    4. Kliknij zakładkę "Analiza". Zdefiniuj szybkość pozyskiwania obrazu. Wprowadź liczbę w polu lub kliknij przycisk w górę lub w dół, aby zwiększyć lub zmniejszyć liczbę. Jeśli w poprzedniej zakładce zaznaczone jest pole "Zdefiniować siłownik?", zdefiniuj rozmiar komórki kamery, powiększenie i współczynnik kategoryzacji, aby program mógł obliczyć odległość.
    5. Kliknij przycisk "Rozpocznij analizę".
      UWAGA: Program będzie teraz śledził neuron przez jego fluorescencję w sekwencji obrazu w górnej połowie (zależnej od wapnia) i w dolnej połowie (niezależnej od wapnia) sekwencji obrazu. Aby uwzględnić ruch neuronu w płaszczyźnie zapisu, program zbada obszar o wymiarach 10 x 10 pikseli wokół lokalizacji neuronu na poprzednim obrazie, aby znaleźć pozycję neuronu na następnym obrazie. Obliczy fluorescencję w obu połówkach, korygując fluorescencję tła (Fbg) i dzieląc przez fluorescencję na pierwszych 50 obrazach (F0):
      figure-protocol-1
      Zmiany fluorescencji w zielonym, zależnym od aktywności kanale (FCa2+), które są spowodowane ruchem neuronów poza płaszczyzną kodowania, są następnie korygowane za pomocą fluorescencji w czerwonym, niezależnym od aktywności kanale (Fcorr) i odchylenia standardowego przed bodźcem fluorescencji zależnej od wapnia (sdCa2+) i niezależnej (sdcorr) poprzez:
      figure-protocol-2
    6. Program pokaże swój postęp na pasku stanu w dolnej części interfejsu; gdy pasek stanu osiągnie 100%, kliknij zakładkę "Wyniki". Jeśli pasek stanu zatrzyma się przed 100%, program wyświetli komunikat o błędzie wskazujący powód, dla którego program nie mógł przeanalizować wideo.
      1. Jeśli stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski, program nie może zidentyfikować neuronu; dostosować parametry obrazowania w kolejnych nagraniach.
      2. Jeśli neuron opuści pole widzenia podczas nagrywania, program nie będzie już mógł go śledzić i zatrzyma się. W przypadku kolejnych nagrań umieść neuron w środku pola widzenia na początku nagrania.
      3. Jeśli niektóre obszary w polu widzenia są przesycone, automatyczna analiza da nieprawidłowe wyniki. W przypadku kolejnych nagrań upewnij się, że sygnał fluorescencji nie nasyca matrycy aparatu.
    7. W zakładce 'wyniki' wynik jest wyświetlany w górnej części. Zapisz plik *.txt tabeli wyników rozdzielony tabulatorami, klikając "Zapisz tabelę wyników".
      UWAGA: Ta tabela składa się z czasu w sekundach i znormalizowanej fluorescencji zależnej od wapnia (skorygowanej przez fluorescencję niezależną od wapnia). Jeśli została wcześniej zdefiniowana, zawiera również całkowitą odległość między TRN a siłownikiem w μm oraz odległość między TRN a siłownikiem prostopadłą do ściany kanału w μm. Reprezentatywne wyniki wzrostu intensywności fluorescencji po stymulacji w stosunku do odległości ciała komórki od najbliższego siłownika przedstawiono na wykresie Rysunek 4.
    8. Jeśli w jednym nagraniu znajduje się wiele neuronów (oddalonych od siebie o więcej niż 10 pikseli), kliknij ponownie zakładkę "Zdefiniuj ROI" i wróć do kroku 4.6.2 z drugim neuronem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SU-8 Litografia i klejenie chipów
Protokół litograficzny i formowanie PDMS są zgodne ze standardowymi procedurami. Szczegóły można znaleźć gdzie indziej23,24,25,26. PDMS powinien bez problemu odkleić się od płytki po utwardzeniu. Jeśli cechy SU-8 oderwały się podczas złuszczania PDMS, oznacza to, że albo warstwa adhezyjna SU-8, albo silaniza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten demonstruje metodę dostarczania precyzyjnej stymulacji mechanicznej do skóry glisty uwięzionej w chipie mikroprzepływowym. Ma on na celu ułatwienie integracji bodźców fizycznych w celu udzielenia odpowiedzi na pytania biologiczne i ma na celu usprawnienie badań mechanobiologicznych w laboratoriach biologicznych. Metoda ta rozszerza wcześniejsze testy w celu oceny funkcji neuronów mechanosensorycznych u C. elegans. Poprzednie techniki ilościowe i półilościowe mierzyły siły

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sandrze N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divyi Gopisetty i Veronice Sanchez za wsparcie w projektowaniu urządzeń i generowaniu zmutowanych zwierząt. Badania te były wspierane przez granty NIH R01EB006745 (dla BLP), R01NS092099 (dla MBG), K99NS089942 (dla MK), F31NS100318 (dla ALN) i otrzymały finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa grantowa nr 715243 do MK).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Maska ChromeCompugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chromowanamaska Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chromowanamaska Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/5'', zaprojektowana w AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4-calowy wafel krzemowy (test B)Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
Spin-coaterLaurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP/LITE
Zegar ekspozycjiOptical Associates, IncOAI 150
KontroleroświetleniaOptical Associates, Inc2105C2
SU-8 deweloperMicroChem
2-PropanolFisher ScientificA426F-1GAL
AcetonFisher ScientificA18-4
Trichloromethylsilane (TCMS)Sigma-Aldrich92361-500MLUwaga: TCMS jest toksyczny i reaguje na wodę
Zestaw elastomerów Sylgard 184Dow CorningPDMS prepolimer
Dziurkacz do biopsji, 1 mmVWR95039-090
Plazma tlenowa AsherBranson/IPC
Małe metalowe rurki (0,635 mm średnica zewnętrzna, 0,4318 mm średnica wewnętrzna, długość 12,7 mm); rozmiar miernika 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
Filtr strzykawkowy Nalgene, 0,22 μ mThermo Scientific725-2520do filtrowania całego roztworu, małe cząsteczki zatkałyby chip
Rurka polietylenowa; 0,9652 mm średnicy zewnętrznej, 0,5842 mm średnicy wewnętrznejSolomon ScientificBPE-T50
, 1 ml StrzykawkaScientific309628do wychwytywania i uwalniania robaków
, 20 ml309661 BD Scientificdo przepływu grawitacyjnego
Gilson Minipuls 3, perystaltyczny pompaGilsondo zasysania roztworów i ślimaków z chipa
Mikroprzepływowy regulator przepływu, wyposażony w 0– Kanał ciśnieniowy 800 kPaDostarczanie ciśnieniaElveflowOB1 MK3
Wodoodporna, przezroczysta rurka poliuretanowa, 4 mm ID i 6 mm ODMcMaster-Carr5195 T52Przyłącze od powietrza domowego do pompy ciśnieniowej
Wodoodporna przezroczysta rurka poliuretanowa, średnica wewnętrzna 2,6 mm i średnica zewnętrzna 4 mmMcMaster-Carr5195 T51podłącz pompę ciśnieniową do małej rurki
Złączka rurkowa Push-to-Connect do powietrzaMcMaster-Carr5111K468konwerter calowy
Łącznik prosty do 6 mm & czas; 1/4″ Rura zewnętrznaMcMaster-Carr5779 K258
System mikroskopowy Leica DMI 4000 BLeica
63×/1.32 NA HCX PL APO obiektyw olejowyLeica506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT aparat cyfrowy CMOSHamamatsuC11440-42U
Lumencor Silnik świetlny Spectra XLumencorZ cyjanem i zielono-żółtym źródłem światła
Rozdzielacz wiązki wzbudzeniaChroma59022bsw mikroskopie
Hamamatsu W-view Gemini Optyka rozdzielająca obrazHamamatsuA12801-01do podziału emisji zielonej i czerwonej i rzutowania ich na różne obszary na chipie kamery
Rozdzielacz wiązki emisyjnejChromaT570lpxrw rozdzielaczu obrazu
Filtry emisyjne GCamp6sChromaET525/50mw rozdzielaczu obrazu
Filtry emisyjne mCherryChromaET632/60mw rozdzielaczu obrazu
Strzykawka BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151(2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998(2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172(2017).
  20. Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276(2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080(2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599(2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipMechanical StimulationC ElegansHigh Resolution ImagingGCaMP6sTouch Receptor NeuronsPneumatic ActuatorsPressure ActuationFluorescence MicroscopyWorm Trapping

Related Articles