Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie medycyny spersonalizowanej do leczenia rzadkich chorób monogenowych, takich jak lizosomalne zaburzenia spichrzeniowe (LSD), jest kwestionowane przez skomplikowane projekty badań klinicznych, wysokie koszty i małą liczbę pacjentów. Setki zmutowanych alleli są zaangażowane w większość LSD. Choroby są zwykle klasyfikowane jako 2 do 3 różnych typów klinicznych w zależności od ciężkości. Co więcej, charakterystyka molekularna genotypu może pomóc w przewidywaniu wyników klinicznych i informowaniu o opiece nad pacjentem. Dlatego opracowaliśmy prosty test hodowli komórkowej oparty na HEK293H komórkach heterologicznie nadmiernie eksprymujących mutacje zidentyfikowane w chorobie Fabry'ego i Pompego. Podobny test został niedawno wprowadzony jako test przedkliniczny w celu identyfikacji mutacji podatnych na farmakologiczną terapię opiekuńczą (PCT) w chorobie Fabry'ego. Niniejszy manuskrypt opisuje zmieniony test hodowli komórkowej, który umożliwia szybką ocenę fenotypową wariantów alleli w chorobie Fabry'ego i Pompego w celu identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do PCT i może pomóc w opracowaniu nowych farmakochaperonów.
Wprowadzenie
Istnieje ponad tuzin lizosomalnych zaburzeń spichrzeniowych (LSD) związanych z dysfunkcją glikozydazy w wyniku mutacji genów pierwotnych. W chorobie Fabry'ego (OMIM #301500) i Pompego (OMIM #232300) zgłoszono odpowiednio ponad 500 i 200 mutacji typu missense1,2,3, co odpowiada około 60% całkowitej liczby mutacji. Wciąż identyfikowane są liczne nowe warianty genów, z których wiele ma nieznane znaczenie. Szeroko zakrojone badania biochemiczne wykazały, że niektóre genotypy nie prowadzą do całkowitej utraty funkcji genu GLA (OMIM *300644) w chorobie Fabry'ego, ale powodują, że odpowiadający mu enzym nie osiąga termodynamicznie korzystnego stanu fałdowania4. Powoduje to retencję ER i przedwczesną degradację inaczej funkcjonalnego enzymu. Podobne wnioski zostały wyciągnięte w przypadku innych LSD, w tym choroby Pompego5. Co więcej, molekularna charakterystyka wariantów enzymów może ułatwić kliniczną interpretację mutacji w momencie diagnozy6, co sugeruje, że progresja LSD jest procesem indywidualnym w zależności od charakteru mutacji. W związku z tym konwencjonalna klasyfikacja na zazwyczaj 2 do 3 różnych typów klinicznych powinna zostać ponownie oceniona w celu usprawnienia poradnictwa klinicznego i podejmowania decyzji terapeutycznych.
Enzymatycznej Terapii Zastępczej (ERT) jest dostępna dla obu chorób. ERT ma jednak ograniczoną skuteczność w dotkniętych tkankach/narządach, takich jak mózg i mięśnie szkieletowe. Co więcej, ERT może wywołać odpowiedź immunogenną, która zagraża jego korzyściom terapeutycznym. Farmakologiczne białka opiekuńcze (PC) są atrakcyjną alternatywą leczenia dla pacjentów z tzw. mutacjami reagującymi. PC służą jako rusztowanie molekularne do prawidłowego fałdowania i stabilizacji białek, co z kolei zapobiega zatrzymywaniu retikulum endoplazmatycznego (ER) i degradacji enzymu związanej z ER. Co więcej, PC mogą być podawane doustnie i są potencjalnie zdolne do przekraczania bariery krew-mózg. W związku z tym PCT może być bardziej realną opcją w leczeniu pacjentów z niektórymi genotypami. Obszerną recenzję aplikacji LSD na PC można znaleźć w doskonałej recenzji autorstwa Parenti7.
Odkrycie setek zmutowanych alleli powodujących choroby stanowi wyzwanie dla przedklinicznych testów leków i wymaga prostej, szybkiej i wysoce ustandaryzowanej oceny podatnych pacjentów na spersonalizowane podejście medyczne. W celu oceny szkodliwych skutków mutacji genu LSD i przetestowania mutacji kandydujących w celu przewidywania pacjentów podatnych na PCT, opracowano wysoce standaryzowany system nadekspresji w HEK293H komórkach, który pozwala na szybki i wiarygodny pomiar aktywności enzymów. Podobne systemy nadekspresji zostały wcześniej opisane dla choroby Fabry'ego i Pompego przy użyciu COS-78,9,10,11, HeLa cells12, lub HEK29313,14,15,16 komórek dla genu glikozydazy.
Bardzo podobna metoda została nawet opatentowana jako "Metoda przewidywania odpowiedzi na leczenie chorób metodą Pharmacological Chaperone"17, co wskazuje na znaczenie systemu hodowli komórek, który można zintegrować z praktyką kliniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie zmutowanych konstruktów pcDNA3.1/GLA i pcDNA3.1/GAA
UWAGA: Strategie klonowania sekwencji kodowania GLA i GAA (cds) zostały zgłoszone wcześniej15,18.
- Mutageneza ukierunkowana na miejsce za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce
- Użyj sekwencji referencyjnych NM_000169.2 i NM_000152.4 jako matryc dla mutagenezy genów GLA i GAA, odpowiednio. Zsyntetyzuj zestaw starterów o wysokiej czystości wolnych od soli (25-37 merów) przez komercyjnego dostawcę, ze starterami sensownymi i antysensownymi zawierającymi jedną z odpowiednich modyfikacji sekwencji kluczowych dla ich długości, aby indywidualnie wprowadzić mutację. Skorzystaj z bezpłatnego narzędzia do projektowania podkładu, aby wesprzeć projekt podkładu19.
- W przypadku mieszaniny reakcyjnej należy zastosować standardowe warunki dla roztworu reakcyjnego i warunki PCR dostarczone przez producenta.
- Wymieszać 5 μl 10x buforu reakcyjnego, 10 ng dwuniciowego matrycowego plazmidu DNA (pcDNA3.1/GLA lub pcDNA3.1/GAA), 125 ng każdego startera, 1 μl dostarczonej mieszaniny dNTP, 3 μl odczynnika DMSO w odpowiedniej objętości wody dejonizowanej (końcowa objętość reakcji: 50 μL). Na koniec dodaj 2,5 U polimerazy DNA i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Jako kontrolę ujemną należy zabrać ze sobą próbkę bez startera.
- Rozpocznij PCR za pomocą następującego programu: krok 1: 95 °C przez 1 minutę, krok 2: 95 °C przez 50 s, krok 3: 60 °C przez 50 s, krok 4: 68 °C przez 8 minut, powtórz krok 2-4 18 razy i krok 5: 68 °C przez 10 minut.
- Po PCR dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego DpnI (10 U/μL) i dalej inkubować fiolkę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Transformacja i selekcja dla pożądanego klonu
- Przekształć podwielokrotność ultrakompetentnych ogniw zgodnie z zaleceniami producenta. Zamiast pożywki producenta należy użyć pożywki SOC (trypton 2% (w/v), ekstrakt drożdżowy 0,5% (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, sterylizować w temperaturze 121 °C, a następnie dodać sterylnie przefiltrowane roztwory MgCl2 i glukozy do końcowych stężeń odpowiednio 10 i 20 mM) zamiast pożywki producenta. Po zabiegu umieścić 250 μl próbki mutagenezie na płytce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
- Upewnij się, że liczba transformantów wynosi >10, a reakcja daje co najmniej trzy razy więcej kolonii niż reakcja kontrolna bez starterów, np. za pomocą świecącej płytki ułatwiającej liczenie kolonii. Następnie wybierz 3 kolonie i przygotuj 3 ml kultur na noc w pożywce LB Bulion.
- Następnego dnia przeprowadź przygotowanie plazmidu za pomocą standardowego zestawu i przeanalizuj całą sekwencję za pomocą starterów T7 (5ʹ-TAA, TAC, GAC, TCA, CTA, TAG, GG-3ʹ) i BGHr (5ʹ-TAG, AAG, GCA, CAG, TGG, AGG-3ʹ) za pomocą standardowego sekwencjonowania Sangera.
- Użyj odpowiedniego narzędzia biologii molekularnej, aby przeanalizować sekwencję. Gdy zostanie wykryta pożądana mutacja i nie zostanie zaobserwowana dalsza nieprawidłowość sekwencji w porównaniu z NM_000169.2 (α-galaktozydaza A) lub NM_000152.4 (kwaśna α-glukozydaza), wybierz klon do oczyszczenia plazmidu o stopniu transfekcji.
- Oznaczyć czystość DNA, mierząc absorbancję w spektrofotometrze.
UWAGA: Do eksperymentów z hodowlami komórkowymi należy dopuścić tylko preparaty, które dają czystość plazmidu o stosunku absorbancji 260/280 wynoszącym >1,8.
2. Hodowla komórek HEK293H
- Utrzymuj HEK293H komórek w wysokim poziomie glukozy (4,5 g/l) Zmodyfikowanym Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną. Przechowywać komórki w inkubatorze z płaszczem wodnym w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Hoduj komórki do gęstości 80 - 90%.
- Odessać pożywkę i przemyć raz roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca2+ i Mg2+.
- Pasażować przez dodanie 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Podzielić komórki w stosunku 1:15 na świeżym podłożu i umieścić nasiona w nowej kolbie T75, aby utrzymać trwałą hodowlę. Nie używaj komórek z więcej niż 25 przejściami.
3. pcDNA3.1/GLA i pcDNA3.1/GAA Transfekcja plazmidu i leczenie HEK293H
- 24 godziny przed transfekcją przemyć HEK293H komórki w kolbie do hodowli komórek T75 za pomocą PBS z Ca2+, Mg2+. Zbierz komórki z 0,05% trypsyną-EDTA, jak wspomniano powyżej, i wysiew 1,5 x 105 komórek w jamach 24-dołkowej płytki hodowlanej przy użyciu 500 μl pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS bez antybiotyków.
- Wykonaj protokół transfekcji zgodnie z instrukcją producenta. Zazwyczaj stosuje się mieszaninę 1 μg plazmidowego DNA i 2,5 μl odczynnika do transfekcji w 100 μl DMEM bez surowicy. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodawać kroplami do komórek.
- Po upływie 4 godzin w temperaturze 37 °C/5% CO2 usunąć pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 500 μl świeżego DMEM z 10% FBS/1% penicyliną/streptomycyną.
UWAGA: Na tym etapie do pożywki hodowlanej można dodać chlorowodorek 1-deoksygalaktonojirymycyny (DGJ) lub chlorowodorek 1-deoksynojirimycyny (DNJ) w razie potrzeby (użyć wodnego roztworu podstawowego o stężeniu 10 mM w celu uzyskania końcowego stężenia 20 μM DGJ i DNJ). Świeży DGJ lub DNJ dodawano 42 godziny po transfekcji plazmidu.
4. Pobieranie komórek i pomiar aktywności α-galaktozydazy A lub kwaśnej α-glukozydazy
- Pobieranie komórek
- W dniu zbiorów należy wyjąć komórki z inkubatora i zassać pożywkę. Ostrożnie umyj komórki 2 razy PBS z Ca2+ i Mg2+,
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ DGJ i DNJ są silnymi inhibitorami odpowiednio α-galaktozydazy i α-glukozydazy, a wszelkie pozostałości unieważniłyby test. - Dodaj 200 μl wody dejonizowanej bezpośrednio na komórki. Wypłukać komórki z płytki i przenieść je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
- W dniu zbiorów należy wyjąć komórki z inkubatora i zassać pożywkę. Ostrożnie umyj komórki 2 razy PBS z Ca2+ i Mg2+,
- Homogenizacja przez zamrażanie i rozmrażanie
- Umieść próbki w odpowiednim stojaku piankowym i wiruj przez 5 sekund, aby liza była bardziej wydajna. Próbki umieszczać na przemian w ciekłym azocie przez 10 s i w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej aż do zakończenia rozmrażania (5 min).
- Powtórzyć tę procedurę 5 razy, a następnie wirować próbki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g. Zachować supernatant i pipetę w nowej probówce reakcyjnej.
- Oznaczanie stężenia białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)
- Przygotować świeżą probówkę dla każdej próbki zawierającej 40 μl dejonizowanegoH2Oi dodać 10 μl próbki. Wymieszać roztwór, krótko wirując, i przenieść 10 μl do wnęki na płytce 96-dołkowej (każda próbka w trzech powtórzeniach). Rozcieńczyć roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml w dejonizowanymH2Ow następujący sposób, aby otrzymać krzywą wzorcową: 50 μlH2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Rozpocząć reakcję od dodania 200 μl odczynnika BCA (odczynnik A i odczynnik B zmieszane w stosunku 50:1) i inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 37 °C przy lekkim mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). Zmierzyć absorbancję przy 560 nm w czytniku płytek.
UWAGA: Próbki zazwyczaj zawierają od 1 do 1,5 μg białka na μl.
- Pomiar aktywności enzymatycznej za pomocą sztucznych substratów 4-metylolumbelliferylu (4-MUG)
- Rozcieńczyć obliczoną ilość każdej próbki i pipetować do świeżych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml w celu uzyskania 0,05 (dla α-galaktozydazy A) lub 0,5 (dla kwaśnej α-glukozydazy) μg roztworów białka/μl. Ponownie wirować próbki przez 5 s i odpipetować 10 μl tego rozcieńczenia do płytki 96-dołkowej (każda próbka w dwóch egzemplarzach).
- Rozpocznij reakcję od dodania 20 μl odpowiedniego roztworu substratu:
Dla α-galaktozydazy A: 2 mM 4-metylombleczryl-α-D-galaktopyranozyd (4-MU-gal) w 0,06 M buforze cytrynianu fosforanu, pH 4,7,
Dla kwaśnej α-glukozydazy: 2 mM 4-metylolumbelliferylu α-D-glukopiranozydu (4-MU-glu) w 0,025 M octanie sodu, pH 4,0. - Inkubować reakcje enzymatyczne przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 37 °C przy lekkim mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). Zakończyć reakcję przez dodanie 200 μl 1,0 M buforu glicynowo-NaOH o pH 10,5 .
- Przygotować krzywą wzorcową 4-metylolumbelliferonu (4-mu) z zapasu 0,01 mg/ml w następujący sposób:
100 μLH2O/ nie 4-MU; 80 μL H2O / 20 μL 4 mln j.; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O / 60 μL 4 MU; 20 μL H2O / 80 μL 4 mln μ; bez H2O/ 100 μL 4-MU, odmierzyć pipetą 10 μl każdego rozcieńczenia do płytki 96-dołkowej (w dwóch częściach) i dodać 200 μl 1,0 M buforu glicyny-NaOH do każdej studzienki w celu dostosowania objętości i pH. - Zmierz aktywność enzymu w czytniku fluorescencji wyposażonym w odpowiedni zestaw filtrów i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania dla czytnika fluorescencji.
UWAGA: Oba substraty 4-MUG są redukowane do 4-MU podczas ekspozycji na α-galaktozydazę A lub kwaśną α-glukozydazę. Uwolniony 4-MU jest fluorochromem, który można zmierzyć przy 360 i 465 nm jako długości fal wzbudzenia i emisji, odpowiednio, za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Procedura mutagenezy
Aby ocenić wydajność mutagenezy genu GLA, mutacje zaklasyfikowano do jednej z poniższych kategorii. To podejście do generowania mutacji wykazało, że około 66,5% mutacji GLA uzyskano w pierwszej próbie. Kolejne 25% udało się uzyskać po nieco zmodyfikowanej drugiej reakcji PCR.
Kategoria 1: PCR mutagenezy zakończył się sukcesem przy pierwszej próbie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany w niniejszym dokumencie protokół dostarcza wiarygodnych wyników oceny uszkodzeń enzymów w dziedzicznych lizosomalnych chorobach metabolizmu. Niniejszy manuskrypt jest poprawką do protokołu opublikowanegowcześniej 15. Najważniejsze modyfikacje obejmują rygorystyczność (tj. w procesie przygotowania konstruktu wektora mutanta), standaryzację protokołu hodowli komórkowej (tj. HEK293H warunki utrzymania i transfekcji komórek) oraz dużą liczbę powtórzeń eksperymentalnych (co na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują Mandy Loebert i Tinie Czajce za doskonałe wsparcie techniczne. Dziękujemy Florze Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) za pomoc w edycji językowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiał | |||
| QuikChange II XL Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.d.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-CTA, CGA, CAT TGA, TGT, CCA, GAC, CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC ACC AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.d.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-obr.: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Niemcy | b.a.Trypton | |
| Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | 8952.1 | ||
| Ekstrakt drożdżowy | Merck, Darmstadt, Niemcy | 103,753 | |
| Chlorek sodu | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,064,041,000 | |
| Chlorek potasu | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glukoza jednowodna | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,083,422,500 | |
| Wodorotlenek sodu | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,064,980,500 | |
| Glicyna | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | 3908.2 | |
| Kwas cytrynowy | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | X863.3 | |
| Wodorofosforan disodowy | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,065,860,500 | |
| Octan sodu | Merck, Darmstadt, Niemcy | 1,062,640,050 | |
| Lodowaty kwas octowy | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | X969.2 | |
| LB Średni | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Niemcy | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Niemcy | 12245 | |
| HEK293H linia komórkowa | Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy | 11631-017 | |
| Dulbecco´ s Zmodyfikowany Orzeł Średni | Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy | 31966-047 | |
| HyClone płodowa surowica bydlęca | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicylina/streptomycyna | Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy | 15140-122 | |
| Standardowe kolby do hodowli komórkowych CELLSTAR, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hanower, Niemcy | 82050-854 | |
| Płytki do hodowli komórkowych (24 dołki) | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | 831,836 | |
| Płytka 96-dołkowa Cellstar | Greiner bio one, Frickenhausen, Niemcy | 655185 | |
| probówki reakcyjne SafeSeal, 1,5mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy | 11668-019 | |
| Chlorowodorek 1-deoksygalaktonojirimycyny | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | D9641 | |
| Chlorowodorek 1-deoksygalaktonojirimycyny | Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada | D236500 | |
| 1-deoksynojirimycyny | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | D9305 | |
| PBS Dulbecco bez wapnia, bez Magnesium | Biochrom, Berlin, Niemcy | L 1825 | |
| Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa | Thermo Scientific, Brunszwik, Niemcy | 25300054 | |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | Thermo Scientific, Brunszwik, Niemcy | 23225 | |
| 4-metylumbiliron | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galaktopiranozyd | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Monachium, Niemcy | M9766 | |
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| >Equipment | |||
| inkubator typ T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Niemcy | n.d.Luminous | |
| Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Niemcy | P265.1 | |
| 3130 xl Analizator genetyczny | Applied Biosystems, Darmstadt, Niemcy | n.a.GFL-3032 | |
| wytrząsarka bakteryjna | GFL, Burgwedel, Niemcy | Wirówka b.a.Avanti | |
| J-25 | Beckman/Coulter, Krefeld, Niemcy | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro Spektrofotometr | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Wielka Brytania | n.a. | |
| Binder, Tuttlingen, Niemcy | n.a.Mikser | ||
| dotykowy Vortex Genie 1 | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a.Z | |
| 233 MK-2 wirówka mikrorurkowa z chłodzeniem | Hermle, Tuttlingen, Niemcy | n.a.LaboStar | |
| urządzenie do wody ultraczystej | Siemens, Berlin, Niemcy | n.a.Thermo | |
| Shaker PST-60HL-4 wytrząsarka orbitalna | Biosan, Ryga, Łotwa | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, Szwajcaria | n.a.HI | |
| 223 Mikroprocesorowy pH-metr | HANNA Instruments, Arvore, Portugalia | n.a.CASY | |
| br/> Licznik komórek + system analizatora Model TT | Innovatis AG,/Zug, Szwajcaria | ||
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| >Software | |||
| Magellan oprogramowanie do analizy danych v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, Szwajcaria | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, Kalifornia; USA | n.d.Microsoft | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | b.d. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.d. = nie dotyczy |
Bibliografia
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331(2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092(2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632(2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
