Artykuł metodologiczny

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

DOI:

10.3791/56585

⸱

3 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security, Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology, Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science, Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) jest powszechnym patogenem przenoszonym przez żywność, który przyczynia się do dużej części problemów zdrowia publicznego na całym świecie, znacząco wpływając na wskaźnik śmiertelności i zachorowalności ludzi. Konwencjonalne metody wykrywania V. parahaemolyticus, takie jak metody oparte na hodowlach, testy immunologiczne i metody molekularne, wymagają skomplikowanej obsługi próbki i są czasochłonne, żmudne i kosztowne. Ostatnio bioczujniki okazały się obiecującą i kompleksową metodą wykrywania, której zaletą jest szybkie wykrywanie, opłacalność i praktyczność. Badania te koncentrują się na opracowaniu szybkiej metody wykrywania V. parahaemolyticus o wysokiej selektywności i czułości z wykorzystaniem zasad hybrydyzacji DNA. W pracy scharakteryzowano zsyntetyzowane nanocząstki złota stabilizowane kwasem polimlekowym (PLA-AuNPs) za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej (UV-Vis), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją polową (FESEM) i woltamperometrii cyklicznej (CV). Przeprowadziliśmy również dalsze testy stabilności, czułości i odtwarzalności PLA-AuNPs. Stwierdziliśmy, że PLA-AuNP utworzyły solidną strukturę stabilizowanych nanocząstek w roztworze wodnym. Zaobserwowaliśmy również, że czułość poprawiła się w wyniku mniejszej wartości rezystancji przenoszenia ładunku (Rct) i zwiększenia powierzchni czynnej (0,41cm2). Opracowanie naszego biosensora DNA opierało się na modyfikacji elektrody węglowej z sitodrukiem (SPCE) z PLA-AuNPs i wykorzystaniu błękitu metylenowego (MB) jako wskaźnika redoks. Oceniliśmy zdarzenia unieruchomienia i hybrydyzacji za pomocą woltamperometrii impulsowej różnicowej (DPV). Odkryliśmy, że komplementarne, niekomplementarne i niedopasowane oligonukleotydy zostały specjalnie rozróżnione przez wytworzony biosensor. Wykazano również niezawodnie czułe wykrywanie w badaniach reaktywności krzyżowej przeciwko różnym patogenom przenoszonym przez żywność oraz w identyfikacji V. parahaemolyticus w świeżych sercówkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główny temat publicznej i naukowej debaty w ostatnich latach, zatrucia pokarmowe są głównie związane z 3 czynnikami: mikroorganizmami1, chemikaliami2, oraz pasożytami3. Skażona żywność może powodować poważne konsekwencje zdrowotne u ludzi, zwłaszcza w grupie podwyższonego ryzyka, czyli osób o słabym układzie odpornościowym, osób starszych, kobiet w ciąży, niemowląt i małych dzieci4. Z ponad milionem przypadków ostrej biegunki występujących rocznie u dzieci poniżej 5 roku życia w Afryce, Azji i Ameryce Łacińskiej, zatrucia pokarmowe są główną chorobą globalną5,6, a Światowa Organizacja Zdrowia ustaliła mikroorganizmy jako najważniejszy czynnik7. Vibrio parahaemolyticus wyróżnia się wśród najbardziej rozpoznawalnych zjadliwych szczepów. Zwykle spotykana w środowiskach przybrzeżnych, ujściowych i morskich8, jest to bakteria Gram-ujemna, która staje się aktywna w środowiskach o wysokiej zawartości soli i powoduje poważne zapalenie żołądka i jelit u ludzi, gdy jest spożywana w nieodpowiednio ugotowanych, niewłaściwie traktowanych lub surowych produktach morskich9. Dodatkowo, istniejące schorzenia u niektórych osób sprawiają, że są one podatne na infekcje ran, posocznicę lub infekcje ucha wynikające z V. parahaemolyticus10. Czynniki wirulencji hemolizyn V. parahaemolyticus dzielą się na dwa typy, które przyczyniają się do patogenezy choroby: termostabilną bezpośrednią hemolizynę (TDH) kodowaną przez geny tdh i hemolizynę związaną z TDH kodowaną przez geny trh11. Markery wirulencji (geny tdh i trh) V. parahaemolyticus znajdują się głównie w próbkach klinicznych, a nie w próbkach środowiskowych.

V. parahaemolyticus posiada zdolność do przetrwania w szerokim zakresie warunków, szybko reagując na zmiany środowiskowe12. Jego mechanizm proliferacji zwiększa jego potencjał zagrożenia, ponieważ jego toksyczność wzrasta równolegle z masą komórkową13. Co gorsza, zmiany klimatyczne stwarzają tym bakteriom warunki do przyspieszenia wzrostu ich populacji komórek14. Ze względu na wysoką częstotliwość, V. parahaemolyticus musi być monitorowany w całym łańcuchu dostaw żywności, szczególnie w handlu i produkcji owoców morza, ponieważ produkty te znajdują się tam, gdzie występują w ogromnych ilościach15,16 na całym świecie. Obecnie bakterie są identyfikowane i izolowane przy użyciu szeregu metod, w tym testów biochemicznych, wzbogacania i selektywnych pożywek17, enzymatycznego immunomagnetycznego testu sorbentowego (ELISA)18, elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE)19, testów aglutynacji lateksu i testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)20. Metody te zwykle wymagają wykwalifikowanego personelu, wyrafinowanych narzędzi i pracochłonnych technik, które nie dostarczają natychmiastowych informacji o skażeniu. To znacznie ogranicza prawdopodobieństwo szybkiego wykrycia szkodliwych zanieczyszczeń i zastosowań na miejscu. Narzędzia do szybkiego wykrywania pozostają wyjątkowym wyzwaniem.

Biosensing staje się obiecującą opcją do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność, ponieważ oferuje oszczędzającą czas, efektywną kosztowo, praktyczną metodę analizy w czasie rzeczywistym21,22,23,24. Jednakże, mimo że uzyskano wiele pozytywnych wyników wykrywania analitów w próbkach wzbogaconych i roztworze wzorcowym przy użyciu biosensorów, nadal brakuje badań zastosowanych do rzeczywistych próbek, zarówno w mieszaninach wodnych, jak i ekstraktach organicznych25. Ostatnio naukowcy coraz częściej przyglądają się bioczujnikom elektrochemicznym wykorzystującym bezpośrednie i/lub pośrednie wykrywanie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) ze względu na specyficzne wykrywanie celu komplementarnego poprzez zdarzenie hybrydyzacji26,27,28,29. Te unikalne podejścia są bardziej stabilne w porównaniu z biosensorami opartymi na enzymach, oferując tym samym obiecującą technologię miniaturyzacji i komercjalizacji. Celem opisywanego tutaj badania jest skonstruowanie szybkiego narzędzia, które może wykrywać V. parahaemolyticus z wysoką selektywnością, czułością i praktycznością, w oparciu o specyficzność sekwencji DNA podczas hybrydyzacji. Strategie identyfikacji obejmują połączenie nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym (PLA-AuNPs)30 i elektrod węglowych z sitodrukiem (SPCE) w obecności wskaźnika hybrydyzacji, błękitu metylenowego (MB). Potencjał opracowanego konstruktu detekcyjnego jest dalej badany przy użyciu bakterii, lizatu DNA i świeżych próbek sercówek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie chemiczne i biochemiczne odczynniki, które mają być użyte, powinny być klasy analitycznej i używane bez dalszego oczyszczania. Przygotuj wszystkie roztwory za pomocą sterylnej wody dejonizowanej. Całe szkło należy sterylizować w autoklawie przed sterylizacją.

Uwaga: Proszę stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa podczas wykonywania czynności laboratoryjnych, w tym stosowanie kontroli inżynieryjnych (dygestoria, schowek na rękawiczki) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).

1. Wytwarzanie i charakterystyka zmodyfikowanej elektrody przy użyciu PLA-AuNPs

  1. Otrzymywanie i charakterystyka PLA-AuNPs
    1. Szybko dodaj 10 ml roztworu cytrynianu sodu (38,8 mM) do 100 ml wrzącego wodnego roztworu kwasu chloroaurowego (1 mM) i schłodzić go do temperatury otoczenia. Obserwuj zmiany koloru w przygotowanym roztworze AuNPs, który zaczyna się jako żółty, zmienia się w czarniawy, a kończy na ciemnej rubinowej czerwieni.
    2. Umieść granulki PLA w formie ze stali nierdzewnej do procesu topienia i podgrzej je w temperaturze 190 °C przez 10 minut. Postępuj zgodnie z procedurą prasowania: umieść je pod ciśnieniem 2,2 MPa na 1 minutę w ramach przygotowania arkusza PLA. Arkusz PLA będzie gotowy do użycia po schłodzeniu przez około 3 godziny.
    3. Energicznie mieszając, rozpuść 0,68 mg arkuszy PLA w 5 ml chloroformu w temperaturze pokojowej. Wymieszać rozpuszczony PLA z 10 ml wcześniej przygotowanego roztworu AuNPs i jednorodnie wymieszać w temperaturze pokojowej. Jednorodne mieszaniny można następnie oznaczyć jako PLA-AuNP i scharakteryzować za pomocą UV-Vis, XRD, TEM i FESEM z EDX.
  2. Przygotowanie i charakterystyka modyfikowanej elektrody węglowej z sitodrukiem
    UWAGA: SPCE zastosowany w tym badaniu składa się z układu trzech elektrod: przeciwelektrody, węglowej elektrody roboczej i elektrody referencyjnej Ag/AgCl.
    1. Szybko odpipetować 25 μl jednorodnego roztworu PLA-AuNPs na SPCE, a następnie wysuszyć na powietrzu przez 24 godziny przed użyciem.
    2. Elektrochemicznie scharakteryzować zmodyfikowane elektrody, SPCE/PLA-AuNPs, w żelazocyjanku potasu (K3[Fe(CN)6]3-/4-) w celu pomiaru powierzchni czynnej, elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, powtarzalności, odtwarzalności i stabilności30.

2. Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA

  1. Przygotowanie sondy
    Uwaga: Sekwencje sondy ssDNA i komplementarnego DNA zostały wybrane na podstawie informacji z bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI).
    1. Zakup syntetycznych oligonukleotydów (20-merowa sonda ssDNA, 20-merowa komplementarna sonda, 20-merowa niedopasowana DNA i 21-merowa niekomplementarna DNA) w postaci liofilizowanego proszku z komercyjnych laboratoriów, w oparciu o następujące sekwencje:
      tiolowana sonda ssDNA: 5′- / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      komplementarne DNA: 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      niedopasowane DNA z jedną zasadą: 5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      niedopasowane DNA z trzema zasadami: 5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      niekomplementarne DNA: 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
    2. Przygotować roztwory podstawowe wszystkich oligonukleotydów (100 μM) przy użyciu sterylnego roztworu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), podzielonego na porcje analityczne. Przechowywać w temperaturze -4 °C, a następnie odpowiednio rozcieńczyć tuż przed użyciem.
  2. Optymalizacja unieruchomienia i hybrydyzacji
    Uwaga: Do tego badania użyto SPCE zmodyfikowanego za pomocą PLA-AuNPs, oznaczonego jako SPCE/PLA-AuNPs, a do immobilizacji i hybrydyzacji DNA zastosowano metodę odlewania kroplowego.
    1. Najpierw unieruchomij 25 μl tiolowanej sondy ssDNA na SPCE/PLA-AuNPs, a następnie wysusz ją na powietrzu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym zostanie ostatecznie oznaczona jako SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Określ optymalizację warunków unieruchomienia za pomocą trzech czynników: stężenia ssDNA (w zakresie od 0,2 do 1,4 μM), czasu (w zakresie od 30 do 210 min) i temperatury (w zakresie od 25 do 75 °C).
    2. Pobrać pipetą 25 μl komplementarnego DNA na powierzchnię SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA, aby przeprowadzić zdarzenie hybrydyzacji, po którym można je ostatecznie oznaczyć jako SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Określ optymalizację warunków hybrydyzacji za pomocą dwóch czynników: czasu (w zakresie od 5 do 30 minut) i temperatury (w zakresie od 25 do 75 °C).
    3. Zanurz unieruchomione i zhybrydyzowane elektrody w 20 μM MB na 30 minut. Usuń niespecyficznie zaadsorbowane DNA i nadmiar MB, przemywając 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), a następnie spłukując wodą dejonizowaną. Zmierz prąd szczytowy redukcji MB za pomocą techniki DPV. Wykonać pomiar DPV przy użyciu 0,1 M PBS (pH 7) bez wskaźnika.
  3. Charakterystyka wytworzonego biosensora DNA
    1. Zanurzyć SPCE/PLA-AuNPs w 20 μM MB na 30 minut, przemyć 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), a następnie spłukać wodą dejonizowaną przed pomiarem. Postępuj zgodnie z podobną procedurą dla wszystkich interakcji, w tym DNA sondy, komplementarnego DNA, niedopasowanego DNA i niekomplementarnych próbek DNA.
    2. Zmierz redukcję elektrochemiczną.
      UWAGA: Zmierzyliśmy DPV za pomocą komercyjnie wyprodukowanego Autolabu z oprogramowaniem interfejsu.
      Pomiary DPV redukcji elektrochemicznej MB wykonane przy potencjale w zakresie od -0,5 V do 0,25 V, z potencjałem krokowym 0,005 V, amplitudą modulacji 0,05 V i szybkością skanowania 7,73 mVs-1 w 0,1 M PBS (pH 7), bez wskaźnika. Dalej badano selektywność, czułość, odtwarzalność i stabilność termiczną wytworzonego biosensora DNA. Przedstawione wyniki przedstawiono w postaci pomiarów wartości średniej w trzech powtórzeniach.

3. Walidacja wyprodukowanego biosensora DNA przy użyciu prawdziwych próbek

  1. Przygotowanie szczepów bakteryjnych
    1. Wybierz próbki bakterii na podstawie ich znacznego zanieczyszczenia owoców morza31,32 .
      UWAGA: V. parahaemolyticus jako szczepy referencyjne i 8 innych szczepów bakteryjnych (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus i Vibrio alginolyticus) powszechnego patogenu przenoszonego przez żywność wykorzystano do walidacji elektrochemicznego biosensora DNA w tym badaniu.
    2. Przeprowadzaj rutynową subkulturę szczepów bakteryjnych na odpowiednim agarze co dwa tygodnie, aby utrzymać ich żywotność, patrz Tabela 1 dla warunków hodowli.
    3. Utrzymuj długotrwałą konserwację szczepów bakteryjnych w odpowiednich bulionach zawierających 20% (v/v) glicerolu w temperaturze -80 °C, ponieważ glicerol chroni bakterie, zapobiegając tworzeniu się kryształków lodu, które mogą je uszkodzić podczas procesu zamrażania. Następnie zaszczepij pętlę zachowanej kultury komórek bakteryjnych w zapasach glicerolu do odpowiednich bulionów. Inkubuj buliony zgodnie z ich odpowiednim czasem wzrostu i temperaturą, gdy zajdzie potrzeba ożywienia bakterii.
    4. Określ ilość komórek V. parahaemolyticus za pomocą techniki płytki rozsiewającej33, standardowej i dobrze znanej metody liczenia mikroorganizmów pochodzących z serii rozcieńczeń.
      1. Kultura V. parahaemolyticus w bulionie sojowym z tryptykazy (TSB + 3% NaCl) w temperaturze 37 °C w stanie wstrząsania 140 obr./min. Następnie przenieś 1 ml kultury komórkowej bakterii do 9 ml TSB + 3% NaCl, aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 10-1.
    5. Powtórz ten krok dziewięć razy, aby uzyskać pełną serię o współczynniku rozcieńczenia do 10-10. Następnie rozprowadź 0,1 ml każdego czynnika rozcieńczenia (zaczynając od 10-1 do 10-10) na selektywnej płytce agarowej Vibrio w celu zliczenia kolonii. Inkubować płytki inkubowane w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
    6. Użyj licznika kolonii, aby policzyć poszczególne kolonie, a następnie przelicz wstecznie (policz jtk/odpipeowaną ilość x współczynnik rozcieńczenia), aby uzyskać jednostkę tworzącą kolonię na mililitr gęstości (CFU mL-1). Stężenie jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinach komórek bakteryjnych należy określić na podstawie wykresu kalibracyjnego CFU mL-1 w zależności od absorbancji.
  2. Przygotowanie testu PCR
    1. Ekstrakcja genomowego DNA po zmodyfikowanej procedurze lizy gotowanej34. Najpierw rozprowadź pojedynczy szczep bakterii na podłożu agarowym i zaszczep go w pożywce bulionowej, a następnie inkubuj go w stanie względnego wzrostu, w stanie wstrząsania 140 obr./min.
    2. Odpipetować 1 ml kultury bulionu do mikroprobówki wirówkowej. Odwirować to w temperaturze 4830 x g i 4 °C przez 1 minutę, aby uzyskać granulki. Użyj około 500 μL sterylnego buforu TE do ponownego zaparcia z granulką. Otrzymaną zawiesinę należy przetrzymywać przez 10 minut w temperaturze 98 ± 2 °C w bloku grzewczym i natychmiast schładzać w temperaturze -18 °C przez 10 minut w celu lizy komórek i uwolnienia DNA.
    3. Odwirować genomowe DNA w temperaturze 4830 x g i w temperaturze 4 °C przez 3 minuty w celu uzyskania klarownej zawiesiny i utrzymać supernatant w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Użyj pomiaru biofotometrem z absorpcją UV o długości fali 260 nm (jako kwasy nukleinowe pochłaniające długość fali światła), a także przy długości fali 280 nm (jako białka pochłaniające długość fali światła), aby określić stężenie i czystość wyekstrahowanego genomowego DNA, a następnie zidentyfikować wszystkie szczepy za pomocą standardowych testów biochemicznych35 i zweryfikować je za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA36. Na koniec należy denaturować genomowe DNA w temperaturze 92 °C przez 2 minuty i szybko schłodzić je w lodowatej wodzie przed zastosowaniem do bioczujnika.
    4. Dalej potwierdź obecność V. parahaemolyticus za pomocą PCR w celu celowania w gen toxR. Wykonaj tę procedurę w termocyklerze, używając pary starterów (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' i 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Zoptymalizuj amplifikację PCR w całkowitej objętości reakcji 25 μl składającej się ze sterylnej wody (15,5 μl), buforu (5 μl), startera (1 μl, 10 μM), mieszaniny dNTP (1 μl), matrycy DNA (2 μl) i polimerazy DNA Taq (0,2 μl, 10x).
    5. Dobrze wymieszaj składniki i ułóż amplifikację PCR sekwencji docelowej w termocyklerze zaprogramowanym na 30 cykli amplifikacji. W naszym badaniu każdy cykl składał się z trzyetapowych reakcji, tj. początkowej denaturacji (94 °C, 3 min), po której następuje 30 cykli denaturacji (94 °C, 1 min), wyżarzania (63 °C, 1,5 min) i przedłużania (72 °C, 1,5 min), a następnie końcowego przedłużenia (72 °C, 7 min).
    6. Określ amplifikowane produkty i ich rozmiary za pomocą elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym. Przechwytywanie obrazów żelu za pomocą komercyjnie produkowanego systemu dokumentacji żelu.
  3. Przygotowanie próbek sercówek
    1. Uzyskać świeże próbki.
      UWAGA: Nasze świeże sercówki (Anadara granosa) zostały uzyskane z mokrego targu w Serdang w Selangor i szybko przywiezione do laboratorium w chłodziarce do lodu w celu analizy. Próbki należy podzielić na 2 grupy, a mianowicie grupę poddaną działaniu środka i grupę niepoddaną działaniu środka, zakładając, że sercówki były zbierane równomiernie od początku zbioru do momentu umieszczenia ich w chłodni.
    2. Sercówki w grupie poddanej działaniu substancji należy wstępnie potraktować, przechowując je w temperaturze -20 °C przez 24 godziny, a następnie wystawić na działanie światła UV w temperaturze 20 °C przez 4 godziny przed ekstrakcją DNA.
      UWAGA: Temperatura zamarzania i ekspozycja na promieniowanie UV stosowane w grupie kontrolowanej zabija lub przynajmniej ogranicza naturalnie gromadzący się V. parahaemolyticus w sercówkach. Nie należy stosować wyższego reżimu pasteryzacji wynoszącego 70 °C, ponieważ celem warunków kontrolowanych w tym badaniu jest naśladowanie rzeczywistej sytuacji świeżych sercówek. W międzyczasie analizuj próbki bezpośrednio z grupy niepoddanej działaniu substancji bez żadnej obróbki wstępnej, gdy tylko dotrą do laboratorium.
    3. Subkultura szczepu V. parahaemolyticus ATCC 17802 w TSB (3% NaCl). Oznaczyć poziom żywotnych komórek w inokulum poprzez posiew odpowiednich rozcieńczeń TSB (3% NaCl) na CA w celu uzyskania inokulum 104 CFU mL-1 V. parahaemolyticus. Umyj każdą sercówkę w wodzie destylowanej i wyszoruj ją z brudu przed użyciem sterylnych kleszczy w komorze z przepływem laminarnym w celu usunięcia tkanek z muszli.
    4. Homogenizować około 10 g próbek tkanek sercówki za pomocą homogenizatora w 90 ml sterylnego TSB (3% NaCl) przez 60 s. Dodać znaną ilość V. parahaemolyticus do 9 ml homogenizowanego bulionu z próbki dla próbek wzbogaconych. Próbki bez wzbogaceń należy stosować jako kontrolę negatywną. Oszacuj liczbę komórek V. parahaemolyticus wzbogaconych o próbki sercówki, posiewając 0,1 ml próbek na CA, a następnie pipetując 1 ml próbek do probówki mikrowirówkowej w celu ekstrakcji próbki DNA, która ma być wykorzystana w teście biosensorycznym i PCR.
    5. Wyodrębnij genomowe DNA V. parahaemolyticus z próbek wzbogaconych i niewzbogaconych zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą lizy gotowanej36. Na koniec określ stężenie i czystość DNA za pomocą pomiaru biofotometrem z absorpcją UV o długości fali 260 nm (jako kwasy nukleinowe pochłaniające długość fali światła), a także przy długości fali 280 nm (jako białka pochłaniające długość fali światła).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powstawanie AuNPs zostało ujawnione poprzez zmianę koloru roztworu wodnego z obecnym cytrynianem sodu. Spowodowało to zmianę koloru z jasnożółtego na głęboki rubinowy. Wytwarzanie PLA-AuNP zostało potwierdzone na podstawie widm UV-vis (Rysunek 1), gdzie stwierdzono wzrost piku powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) przy około 540 nm. Powstawanie i istnienie PLA-AuNPs zostało wskazane w zakresach długości fal 500-600 nm, w zależności od wielkości cząstek

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowymi krokami w ramach pomyślnego rozwoju tego typu biosensora elektrochemicznego są dobór odpowiednich elementów rozpoznawania biologicznego dla przetwornika (w tym przypadku kwasu nukleinowego lub DNA); chemiczne podejście do konstruowania warstwy detekcyjnej przetwornika; materiał transdukcyjny; optymalizacja immobilizacji i hybrydyzacji DNA; oraz walidacja opracowanego biosensora z wykorzystaniem rzeczywistych próbek.

Kluczem do pomyślnego opracowania czułego i selektywnego elektroche...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Universiti Putra Malaysia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoetan Kwas tetraoctowyPromegaE5134
Dwuzasadowy fosforan sodu Sigma-AldrichS9763
Wodorofosforan disodowySigma-Aldrich255793
Etanol Sigma-Aldrich16368
Trójwodny chlorek złota (III)Sigma-Aldrich520918
Kwas solnyMerck100317
Błękit metylenowySigma-AldrichM44907
Jednozasadowy fosforan sodu, monohydratSigma-AldrichS3522
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-AldrichP5119
Żywica poli(kwasu mlekowego), klasa handlowa 4042DNatureWorks4042D
Chlorek potasuR& M Chemicals59435
Diwodorofosforan potasuSigma-AldrichP9791
Heksacyjanożelazian potasu IIIR& M Chemicals208019
Octan sodu sól bezwodnaSigma-AldrichS2889
Chlorek soduSigma-AldrichS9888
Cytrynian trisodowySigma-AldrichS1804
Tris(hydroksymetylo)aminometanFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix z podwójnym barwnikiemNorgen Biotek28240
Żel agarozowyMerck101236
Bolton AgarMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Woda wolna od nukleazThermo ScientificR0581
Agar błękit metylenowy eozyny Merck101347
GelRedBiotium41001
GlicerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Ładowanie barwnika 100 pz Drabinka DNAPromegaG2101
Ładowanie barwnika 1kb Drabinka DNAPromegaG5711
Chlorek magnezuPromega91176
Agar polimyksynowy z żółtkiem jaja mannitoluMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Bulion odżywczyMerck105443
polimeraza TaqMerck71003
Tryptykaza Rosół sojowyMerck105459
Tryptykaza Agar sojowyMerck105458
Bolton Bulion Merck 100079

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R. Foodborne Diseases. Cliver, D. O., Riemann, H. P. , Academic Press. 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805(2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41(2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A. Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton. 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923(2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , John Wiley & Sons Inc. (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., et al. AIP Conference Proceedings. Murad, A., et al. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie Vibrio parahaemolyticusz ote nanocz steczki z kwasu polimlekowegositodrukowa elektroda w glowawoltamperometria impulsowa r nicowawska nik redoks b kitu metylenowegozasada hybrydyzacji DNAanaliza patogen w przenoszonych przez ywnoaktywna powierzchnia w a ciwaop r przeniesienia adunku

Powiązane artykuły