Artykuł metodologiczny

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

DOI:

10.3791/56587

⸱

17 października 2017

 ,  ,  ,  , 
1Arabidopsis Biological Resource Center, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) jest głównym organizmem modelowym do podstawowych i stosowanych badań w biologii roślin1,2,3. Chociaż standardowe warunki wzrostu rzodkiewnika są dobrze znane4, wpływ sterylizacji nasion na żywotność nasion nie został rygorystycznie przetestowany. Pożywka stała w płytkach lub pudełkach jest rutynowo stosowana w celu ułatwienia wzrostu siewek rzodkiewnika w wielu zastosowaniach eksperymentalnych, takich jak identyfikacja homozygotycznych mutantów letalnych w segregującej populacji, obserwacja fenotypów pędów i korzeni we wczesnych stadiach, izolacja tkanki wolnej od patogenów, pobieranie dużych ilości tkanki siewki, wybór transformantów lub roślin odpornych na leki oraz ocena kiełkowania1, 2,3,4. Nasiona zebrane z roślin uprawianych w szklarni lub komorze wzrostowej są czasami zanieczyszczone mikroorganizmami i kurzem. Wzrost siewek rzodkiewnika na różnych rodzajach sterylnych pożywek wymaga wcześniejszej sterylizacji nasion w celu usunięcia zanieczyszczeń mikrobiologicznych, takich jak grzyby i bakterie obecne na powierzchni nasion. Stosowanie skutecznego reżimu sterylizacji nasion ma kluczowe znaczenie dla równowagi między wysokim kiełkowaniem, minimalnym zanieczyszczeniem i energicznym wzrostem roślin.

Dwie najczęstsze metody sterylizacji nasion Arabidopsis opierają się na komercyjnym wybielaczu (faza ciekła) i chlorze gazowym (faza parowa). Zastosowano różne procedury zarówno do sterylizacji w fazie ciekłej1,4,5,6,7,8,9,10 oraz sterylizacja nasion Arabidopsis w fazie gazowej8,10,11,12,13,14,15,16. Jednakże, chociaż procedury te były skuteczne w przeprowadzaniu sterylizacji nasion wykorzystanych genotypów, nie zgłoszono szczegółowej analizy wpływu różnych zabiegów sterylizacji na nasiona o różnych genotypach. W związku z tym konieczna jest optymalizacja tych procedur sterylizacji w celu określenia warunków, w których skuteczna sterylizacja łączy się z wysoką zdolnością kiełkowania.

Centrum Zasobów Biologicznych Arabidopsis (ABRC) ma wyjątkową pozycję, aby a) testować żywotność nasion różnych genotypów w kolekcji i b) korzystać z procedur kontroli jakości stosowanych wewnętrznie i w odpowiedzi na opinie użytkowników na temat kiełkowania nasion. Celem przedstawionych eksperymentów było określenie wpływu różnych metod sterylizacji na kiełkowanie nasion szeregu genotypów rzodkiewnika. Zoptymalizowane procedury sterylizacji, które skutkują wysoką zdolnością kiełkowania nasion przy zachowaniu minimalnego zanieczyszczenia patogenami, są prezentowane zarówno w przypadku sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie 1x Murashige i Skoog (MS) podłoża

  1. Dodać 4,31 g mieszaniny soli podstawowej MS, 10 g sacharozy i 0,5 g kwasu 2-(N-Morfolino) etanosulfonowego (MES) do zlewki zawierającej 0,8 l wody destylowanej i mieszać do rozpuszczenia. Sprawdź i dostosuj pH do 5,7 za pomocą 1 M wodorotlenku potasu (KOH). Dodaj wodę destylowaną, aby uzyskać 1 l.
  2. Podziel podłoże na dwie butelki o pojemności 1 l, każda o pojemności 500 ml każda. Dodaj 5 g agaru do każdej butelki. Trzymaj pokrywę luźną.
  3. Autoklaw przez 20 minut w temperaturze 121 °C, 15 psi z magnetycznym mieszadłem w butelce.
  4. Po sterylizacji w autoklawie umieścić butelki na płytce mieszającej z małą prędkością i pozostawić pożywkę MS do ostygnięcia do 45-50 °C (do momentu, gdy butelkę będzie można trzymać gołymi rękami).
  5. Zaczynając od tego kroku, wykonaj wszystkie kroki w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Dodaj 500 μl roztworu witaminowego Gamborg do każdej butelki i wymieszaj pożywkę MS, aby równomiernie rozprowadzić roztwór witaminy.
  6. Wlej tyle podłoża do talerzy, aby pokryć około połowy głębokości płyty.
  7. Pozostaw płytki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, aby agar zastygł.
    Uwaga: Jeśli talerze nie mają być używane od razu, zawiń je w folię i przechowuj w temperaturze 4 °C (temperatura lodówki). Przykryte płytki, pudełka lub probówki ze zestalonym agarem można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C w hermetycznym pojemniku.

2. Sterylizacja nasion Arabidopsis za pomocą wybielacza

  1. Przygotować tabliczki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. Autoklaw 100 ml wody destylowanej w tym samym czasie, co MS Media. Użyj tego później jako wody do płukania i do zawieszenia nasion, aby pomóc w poszyciu.
    Uwaga: W razie potrzeby na tym etapie można również autoklawować 0,8% mieszankę agaru (w/v) (np. phytagar). Mieszankę agaru można zastąpić wodą destylowaną podczas galwanowania (krok 2.5.3). Dodatkowa lepkość mieszanki agarowej ułatwia rozmieszczanie nasion na talerzu lub sadzenie w rzędach, jeśli to konieczne.
  2. Przygotuj 50% (v/v) roztwór wybielacza, który będzie używany do sterylizacji nasion. Aby rozcieńczyć wybielacz, dodaj 100 ml wybielacza do 100 ml wody destylowanej. Dodaj 50 μl detergentu Tween 20 do roztworu wybielacza.
    Uwaga: Przygotowany roztwór wybielacza można przechowywać do miesiąca, o ile jest otwierany tylko w sterylnych warunkach.
  3. Porcję 100 nasion do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Wysterylizuj nasiona za pomocą 50% roztworu wybielacza.
    1. W okapie z przepływem laminarnym dodaj 500 μl 50% roztworu wybielacza do probówki mikrowirówki zawierającej nasiona. Postukaj w dolną część tubki, aby zawiesić nasiona w roztworze wybielacza.
      Uwaga: Alternatywnie można użyć rotatora lub wytrząsarki platformowej, aby utrzymać nasiona w zawieszeniu.
  5. Wypłucz roztwór wybielacza z tubki.
    1. Po 10 minutach usunąć roztwór wybielacza z probówki mikrowirówki za pomocą pipety lub aspiratora wyposażonego w końcówkę do pipety na końcu.
    2. Do probówki dodać 500 μl sterylnej wody destylowanej. Zamknij probówkę i odwróć, aby wymieszać. Pozwól nasionom osiąść na dnie tuby. Gdy nasiona osiądą na dnie probówki, ostrożnie usuń roztwór wybielacza, pipetując. Powtórz ten proces płukania 6 razy.
    3. Dodaj 1 ml autoklawowanej wody destylowanej do probówki, aby zawiesić nasiona.
  6. Ułóż wysterylizowane nasiona na płytkach MS.
    1. W okapie z przepływem laminarnym oznacz dolną część tabliczki MS nazwą zapasów i aktualną datą.
    2. Wlej nasiona z probówki do mikrowirówki na płytkę MS. Rozsypać nasiona na płytce MS za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki pipety.
      Uwaga: Jeśli nasiona mają być wysiewane w rzędach, można użyć pipety z końcówką o pojemności 200 μl, aby indywidualnie umieścić nasiona w żądanych pozycjach. Aby poprawić przepływ nasion, koniec końcówki pipety można przyciąć nożyczkami o 3-5 mm. Wszelkie zagubione nasiona lub skupiska nasion można następnie przemieścić lub oddzielić za pomocą sterylnej jednorazowej pętli do zaszczepiania.
    3. Umieść płytkę MS z tyłu okapu z przepływem laminarnym przy pokrywie zamkniętej do połowy. Pozwól, aby nadmiar wody odparował z płytki MS.
    4. Umieść pokrywkę na talerzu MS. Uszczelnij płytkę MS, owijając ją mikroporowatą papierową taśmą chirurgiczną (patrz Tabela materiałów).

3. Sterylizacja nasion rzodkiewnika za pomocą chloru gazowego

  1. Przygotować tabliczki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. Autoklaw 100 ml wody destylowanej w tym samym czasie, co pożywka MS; Zostanie to później wykorzystane do zawieszenia nasion, aby pomóc w poszyciu.
    Uwaga: W razie potrzeby na tym etapie można również autoklawować 0,8% mieszankę agaru (w/v) (np. phytagar). Mieszankę agaru można zastąpić wodą destylowaną podczas galwanowania (etap 3.6.2.). Dodatkowa lepkość mieszanki agarowej ułatwia rozmieszczanie nasion na talerzu lub sadzenie w rzędach, jeśli to konieczne.
  2. Przed rozpoczęciem sterylizacji należy obliczyć ilości wybielacza i kwasu solnego (HCl) potrzebne do wytworzenia chloru gazowego.
    1. Obliczyć ilość HCl potrzebną do wytworzenia 6,1% Cl2 wymaganego do sterylizacji.
    2. Użyj następującej formuły:
      figure-protocol-1
      o objętości 7 000 ml jako objętości pojemnika do sterylizacji i 6,1 jako %Cl2; objętość HCl oblicza się na 3 ml.
      Uwaga: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do przeprowadzania obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2 jest dostarczany jako tabela uzupełniająca 1.
  3. Porcję 100 nasion do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Zamknąć nakrętki każdej fiolki, umieścić fiolki w plastikowym stojaku i odłożyć na bok.
    Uwaga: W tym momencie nasiona mogą być przechowywane przez dłuższy czas, o ile są przechowywane w odpowiednich warunkach. Warunki przechowywania można znaleźć w sekcji 3.3.2 protokołu autorstwa Rivero i współpracowników4. Można również stosować format płytki 96-dołkowej.
  4. Przygotuj materiały niezbędne do wykonania sterylizacji chlorem gazowym.
    1. Pozyskać wybielacz i HCl z miejsc ich przechowywania.
    2. Wyciąć pasek dużej folii parafinowej (patrz tabela materiałów), aby użyć go w kroku 3.5.3. w celu uszczelnienia pojemnika do sterylizacji.
    3. Umieść plastikowy pojemnik z pokrywką, w którym odbędzie się sterylizacja, w dygestorium. Otwórz nakrętki na wszystkich fiolkach z nasionami i umieść cały stojak na nasiona w plastikowym pojemniku.
  5. Przeprowadzić sterylizację chlorem gazowym w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Pracuj osobno z wybielaczem i kwasem. Nie pozostawiaj żadnej butelki niezakorkowanej, aby zmniejszyć ryzyko rozlania. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego. Jeśli wybielacz lub kwas rozpryskują się na rękawice, zmień rękawice przed przystąpieniem do kontaktu z innymi materiałami. Zawsze zdejmuj rękawice z dygestorium na wypadek zanieczyszczenia wybielaczem lub kwasem.
    1. Umieść zlewkę o pojemności 250 ml w pojemniku i dodaj 100 ml wybielacza.
      Uwaga: Reakcja między HCl a wybielaczem wymaga co najmniej 22 objętości nadmiaru wybielacza. W wyniku reakcji HCl i wybielacza uwalnia się gaz Cl2 z chlorkiem sodu (NaCl) i wodą jako produktami ubocznymi. Użycie dużego nadmiaru wybielacza pozwala na zużycie dodatkowego HCl w okresie wentylacji, co zmniejsza ilość wodorowęglanu sodu (NaHCO3) potrzebnego do zneutralizowania roztworu do usunięcia.
      Uwaga: Zlewka powinna mieć co najmniej dwukrotnie większą objętość płynu niż wybielacz + HCl. Zapobiega to wydostawaniu się rozprysków ze zlewki podczas następnego kroku, które mogą uszkodzić nasiona, wybielać ubrania lub poparzyć odsłoniętą skórę.
    2. Dodać 3 ml HCl do zlewki zawierającej wybielacz.
      Uwaga: W początkowej reakcji powstaną pęcherzyki, szczególnie przy stężeniach gazów wyższych niż 6,1%. Na tym etapie niezbędny jest fartuch laboratoryjny z długimi rękawami.
    3. Zamknij pojemnik do sterylizacji i natychmiast zamknij go folią parafinową.
    4. Monitoruj pojemnik do sterylizacji w czasie sterylizacji, aby zapewnić akumulację gazu; nagromadzenie chloru gazowego powinno być widoczne jako słaba żółta mgiełka wewnątrz pojemnika.
      Ostrzeżenie: Okresowo sprawdzaj pojemnik do sterylizacji, aby upewnić się, że ciśnienie wewnątrz nie oderwało pokrywki lub folii parafinowej. Jeśli pokrywka została odczepiona lub folia parafinowa poluzowała się, zamknij pokrywkę i ostrożnie owiń pojemnik dodatkową warstwą folii parafinowej.
    5. Po 1 godzinnym okresie sterylizacji otwórz pojemnik, usuwając folię parafinową i otwierając pokrywkę w jednym rogu. Pozostawić pojemnik do odpowietrzenia przez 3 godziny, aby zakończyć reakcję i wyeliminować chlor gazowy.
    6. Zamknij nakrętki wszystkich probówek do mikrowirówek w stojaku na nasiona.
      Uwaga: Wysterylizowane nasiona można przechowywać do czasu poszycia, o ile są przechowywane w suchym stanie.
    7. Wyjmij ruszt na nasiona i umieść go w okapie z przepływem laminarnym.
    8. Neutralizacja reakcji chloru gazowego
      1. Powoli dodawać 1,5 g proszku NaHCO3 do zlewki zawierającej roztwór wybielacza/HCl i mieszać szklaną pałeczką, aby rozpuścić NaHCO3 w roztworze. Kontynuuj dodawanie NaHCO3, aż pęcherzyki dwutlenku węgla (CO2) przestaną się tworzyć.
        Uwaga: Dodawaj powoli, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej, w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego.
      2. Zbadać pH roztworu za pomocą pasków pH lub pH-metru. W razie potrzeby dodać więcej NaHCO3, aż pH roztworu stanie się neutralne (pH 7,0). W tym momencie roztwór można wyjąć z dygestorium i zutylizować zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji.
        Ostrzeżenie: Jeśli podczas utylizacji zostanie zauważony JAKIKOLWIEK zapach, roztwór należy natychmiast wrzucić z powrotem do dygestoria.
  6. Ułóż wysterylizowane nasiona na płytkach MS.
    1. W okapie z przepływem laminarnym oznacz dolną część tabliczki MS nazwą zapasów i aktualną datą.
    2. Dodaj 500 μl wysterylizowanej wody destylowanej do każdej probówki mikrowirówkowej, aby zawiesić nasiona. Wlej nasiona na płytkę MS i równomiernie rozprowadź nasiona na płytce za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do zaszczepiania lub sterylnej końcówki pipety.
    3. Umieść płytkę MS z tyłu okapu z przepływem laminarnym przy pokrywie zamkniętej do połowy. Pozwól, aby nadmiar wody odparował z płytki MS.
    4. Umieść pokrywkę na talerzu MS. Uszczelnij płytkę MS, owijając ją mikroporowatą papierową taśmą chirurgiczną.

4. Wzrost rzodkiewnika na płytkach SM

  1. Umieść talerze z pokrywką na wierzchu na trzy dni w temperaturze 4 °C i wilgotności otoczenia.
    Uwaga: Ten proces nazywa się stratyfikacją i służy do synchronizacji kiełkowania poszczególnych nasion.
  2. Przenieś płytki do środowiska wzrostu.
    1. Utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C i natężenie światła na poziomie 120 - 150 μmol/m2s przy 16 h światłach / 8 godzinach ciemnego fotoperiodu. Umieść talerze płasko w środowisku uprawy z pokrywką na górze, tak aby korzenie wrosły w podłoże.
  3. Pozwól sadzonkom na talerzach rosnąć przez 8 dni.
    Uwaga: 8-dniowy okres uprawy pozwala na kiełkowanie późno kiełkujących nasion. Talerze można naciąć wcześniej niż 8 dni, jeśli wszystkie nasiona wykiełkowały.
  4. Oceń szybkość kiełkowania.
    1. Zapisz liczbę nasion, które wykiełkowały i które nie wykiełkowały. Oblicz szybkość kiełkowania, dzieląc liczbę wykiełkowanych nasion przez całkowitą liczbę nasion na talerzu.
      Uwaga: Kiełkowanie liczy się, gdy korzonek wystaje poza okrywę nasienną i widoczne są dwa liścienie.
    2. Policz również liczbę nasion dotkniętych pleśnią, aby określić skuteczność warunków sterylizacji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasiona rzodkiewnika zebrane z otwartego pola, szklarni lub komory wzrostu są czasami zanieczyszczone różnymi mikroorganizmami, takimi jak grzyby i bakterie1,4. W związku z tym kiełkowanie nasion na sterylnych podłożach może być szczególnie trudne ze względu na zanieczyszczenie płytek, zwłaszcza gdy podaż nasion jest ograniczona. Zoptymalizowany protokół sterylizacji zarówno wybielaczem, jak i chlorem gazowym, którego wyniki przedstawiono poniżej, minimalizuje ten problem i zachowuje żywotność nasion wymaganych do zastosowań o wysokiej przepustowości.

Wpływ sterylizacji wybielaczem na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0

Wybielacz jest najczęściej używanym środkiem do sterylizacji nasion u wielu gatunków roślin. Optymalne stężenie środka sterylizującego i czas ekspozycji różnią się w zależności od gatunku. Zastosowano szereg protokołów wykorzystujących wybielacz do sterylizacji nasion Arabidopsis1,4,5,6,7,8,9,10. Przetestowano cztery różne stężenia wybielacza z pięcioma różnymi okresami ekspozycji, a wyniki przedstawiono w Rysunek 1. Zabiegi zastosowano na nasionach Columbia typu dzikiego (Col-0). Wpływ stężenia wybielacza na kiełkowanie nasion Col-0 różnił się w zależności od czasu sterylizacji, o czym świadczy istotna interakcja między stężeniem wybielacza a czasem sterylizacji (Rysunek 1, P < 0,001, ANOVA - Analiza wariancji).

W eksperymentach z czasem sterylizacji między 5 a 10 minut, zabiegi wszystkimi stężeniami wybielacza dały równie wysoki wskaźnik kiełkowania nasion Col-0 (Rysunek 1). Wysokie wskaźniki kiełkowania zaobserwowano również dla stężeń wybielacza domowego wynoszących 40% i 50% dla wszystkich czasów sterylizacji. Zabiegi z użyciem 80% i 100% wybielacza przez okres dłuższy niż 10 minut spowodowały znaczny spadek zdolności kiełkowania w porównaniu z krótszym czasem namaczania (P < 0,01, ANOVA). Co więcej, zarówno w przypadku 80%, jak i 100% wybielania przez 20 minut, kiełkowanie było znacznie zmniejszone w porównaniu z odpowiednimi zabiegami wybielania 40% i 50% (P < 0,001, ANOVA).

Nasiona wykazywały różne poziomy bielenia i wysychania przy użyciu wysokich stężeń wybielacza przez 15 minut lub dłużej. Oprócz stosunkowo wysokiej (do 32%) śmiertelności nasion, kiełkujące nasiona wysterylizowane w tych warunkach często wykazywały wady wzrostu, co przejawiało się w niezdolności do rozwijania się i wydłużania liścieni i hipokotylów, co skutkowało zatrzymaniem rozwoju. Większość zabiegów (14 z 20) była całkowicie wolna od pleśni, co spowodowało, że ogólny średni poziom pleśni wynosił 0,21% ± 0,003 (Tabela 1).

Zabieg z użyciem 50% wybielacza i czasem namaczania wynoszącym 10 minut został wybrany jako najlepszy reżim sterylizacji, ponieważ łączył wysoki procent kiełkowania z dobrym hamowaniem wzrostu patogenów powierzchniowych. Zabieg ten został wybrany w celu przetestowania wpływu sterylizacji wybielacza na różne linie mutantów, jak opisano poniżej.

Wpływ sterylizacji chlorem gazowym na kiełkowanie nasion Col-0

Aby zoptymalizować warunki sterylizacji chlorem gazowym, użyto trzech różnych stężeń chloru gazowego do sterylizacji nasion Col-0 przez dwa okresy czasu (Tabela 2). Stężenie gazu obliczono na podstawie objętości stężonego HCl i objętości pojemnika do sterylizacji przy użyciu następującego równania:

figure-results-1

To równanie zostało wyprowadzone przy użyciu prawa gazu doskonałego przy założeniu 12,3 M HCl, temperatury 23 °C i standardowego ciśnienia atmosferycznego 101,3 kPa.

Wykazano, że wpływ stężenia chloru gazowego na kiełkowanie nasion Col-0 zależy od czasu sterylizacji, na co wskazuje znacząca interakcja między czasem a czynnikami koncentracji (Rysunek 2A, P < 0.01, ANOVA). Stężenie chloru gazowego nie miało istotnego wpływu na kiełkowanie nasion Col-0 poddanych 1 godzinnej sterylizacji. Przy tym czasie sterylizacji wszystkie stężenia chloru gazowego sprzyjały podobnie wysokim poziomom kiełkowania, powyżej 85% (P > 0,05, ANOVA). Z drugiej strony, trwająca 3 godziny sterylizacja spowodowała znaczny spadek zdolności kiełkowania dla najwyższego stężenia chloru gazowego w porównaniu z dwoma niższymi stężeniami gazu (P < 0,05, ANOVA). Wyniki te wskazują, że zaprawianie nasion Arabidopsis dowolnym z badanych stężeń chloru gazowego przez 1 godzinę lub stężeniem gazu poniżej 16,5% przez 3 godziny jest równie skuteczne w zachowaniu żywotności nasion, ponieważ zdolność kiełkowania była zawsze większa niż 82%. Jednak sterylizacja nasion przez 3 godziny 16,5% gazem była szkodliwa dla kiełkowania nasion.

Występowanie pleśni zależało również od stężenia gazu i czasu ekspozycji. Rozwój pleśni został skutecznie zahamowany przy stosunkowo wysokich stężeniach 6,1% i 16,5% chloru gazowego przez 1 godzinę leczenia i przy wszystkich stężeniach gazów przez 3 godziny (Rysunek 2B).

Na podstawie tych wyników, zabieg o stężeniu gazu 6,1% przez 1 godzinę (Tabela 2) został wybrany jako najlepszy warunek sterylizacji w fazie gazowej do przetestowania wpływu sterylizacji gazowej na różne linie mutantów, ponieważ łączył wysoki wskaźnik kiełkowania (85%) z bardzo niskim poziomem zanieczyszczenia pleśnią (0,02%).

Wpływ sterylizacji gazem wybielającym i chlorowym na nasiona o różnym potencjale kiełkowania

Analiza statystyczna wykazała, że reakcja kiełkowania na metody sterylizacji była zależna od potencjału kiełkowania linii (Rysunek 3A, P < 0.01, ANOVA). Ani wybielacz, ani sterylizacja chlorem gazowym nie zmniejszyły zdolności kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania (grupy 4 i 5). Żadne z tych zabiegów nie miało wpływu na i tak już niską zdolność kiełkowania w grupie o najniższym potencjale kiełkowania (Grupa 1). Natomiast sterylizacja chlorem gazowym spowodowała znaczne zmniejszenie o około 12-18% (P < 0,01, ANOVA) kiełkowania nasion o średnim potencjale kiełkowania (grupy 2 i 3). Sterylizacja wybielaczem zmniejszyła również szybkość kiełkowania o 13% w grupie 2, ale nie zmniejszyła szybkości kiełkowania w grupie 3. Chociaż nie było znaczącej różnicy w szybkości kiełkowania między wybielaczem a chlorem gazowym w żadnej grupie kiełkowania (Rysunek 3A, P > 0,442, ANOVA), nasiona sterylizowane przy użyciu wybielacza miały nieco wyższą zdolność kiełkowania niż nasiona sterylizowane gazem we wszystkich grupach kiełkowania.

Zabiegi sterylizacji znacząco zmieniły (P < 0,001, ANOVA) procent nasion dotkniętych pleśnią (Rysunek 3B). Zarówno sterylizacja chlorem gazowym, jak i wybielaczem spowodowały mniejszy wzrost pleśni (P < 0,05, ANOVA) w porównaniu z brakiem sterylizacji. Nie wykryto różnicy w poziomie pleśni między sterylizacją gazem a wybielaczem w żadnej grupie (Rysunek 3B, P > 0,4, ANOVA).

figure-results-2
Rycina 1: Wpływ stężenia wybielacza i czasu sterylizacji na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0. Wartości są średnimi SD uzyskanymi ± 5 niezależnych powtórzeń eksperymentu. *wskazuje na znaczące różnice w stosunku do 5-minutowego czasu namaczania dla różnych stężeń wybielacza (P < 0,01, ANOVA). #wskazuje na znaczące różnice 80% i 100% stężeń wybielacza w stosunku do 40% i 50% w okresie 20 minut (P < 0,01, ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2: Wpływ stężenia chloru gazowego i czasu sterylizacji na nasiona Arabidopsis Col-0. (A) Szybkość kiełkowania i (B) Poziom pleśni. Słupki błędów reprezentują średnie ± SD uzyskane z 5 biologicznych i 5 technicznych powtórzeń eksperymentu. Środki, które nie dzielą się literą, znacznie się różnią (P < 0.05, ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3: Wpływ sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na nasiona o różnym potencjale kiełkowania. (A) Szybkość kiełkowania i (B) Poziom pleśni. 100 linii T-DNA SALK sklasyfikowano w pięciu grupach zgodnie z ich potencjałem kiełkowania zdefiniowanym jako szybkość kiełkowania przy braku jakiegokolwiek środka sterylizującego. Grupy na podstawie szybkości kiełkowania były następujące: Grupa 1 (0-20%), Grupa 2 (21-50%), Grupa 3 (51-70%), Grupa 4 (71-90%) i Grupa 5 (91-100%). Linie zostały dobrane losowo, a ich potencjał kiełkowania nie zależał od genotypu. Wartości są średnimi ± SD uzyskanymi z trzech niezależnych powtórzeń eksperymentu. Litery ("a", "ab", "c" itd.) powyżej każdej wartości wskazują statystyczne grupowanie średnich kategorii. Środki, które nie dzielą się literą, znacznie się różnią (P < 0.05, ANOVA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział szt.
Czas sterylizacji (min)Stężenie wybielacza (%)
Rozdział 4050Rozdział 80100
50,00%0,00%0,00%2,13%
80,00%0,00%0,00%0,00%
100,00%0,50%0,00%0.36%
150,00%0,00%0,00%0.68%
200.19%0.28%0,00%0,00%

Tabela 1: Poziom pleśni w nasionach Col-0 sterylizowanych wybielaczem.

szt. szt. szt. szt.
wybielacz HclGodzina % chloru gazowego (mol Cl2/mol gazu całkowitego)
(ml)(ml)h)
25112.1
25132.1
100316.1
100336.1
20091Rozdział 16,5
20093Rozdział 16,5

Tabela 2: Zabiegi sterylizacji gazem chlorem (Cl2) na nasionach Columbia typu dzikiego przy użyciu pojemnika o pojemności 7 litrów.

Tabela uzupełniająca 1: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do przeprowadzania obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas uprawy nasion Arabidopsis na sterylnych podłożach należy zastosować jakąś formę sterylizacji. Zarówno zabiegi sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym skutkują podobną szybkością kiełkowania i zahamowaniem rozwoju pleśni. Żadna z metod sterylizacji nie powoduje znacznego zmniejszenia zdolności kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania; jednak sterylizacja wybielaczem jest zalecana dla linii o niższym potencjale kiełkowania (20-70%), ze względu na niewielką, choć nieistotną, poprawę szybkości kiełkowania w porównaniu ze sterylizacją gazową (ryc. 3A).

Sterylizacja nasion Arabidopsis stężeniami wybielacza od 40-100% przez okres do 10 minut zapewnia zadowalający procent kiełkowania i skuteczne tłumienie pleśni. Chociaż stężenie wybielacza mniejsze niż 40% zapewnia odpowiednią sterylizację większości partii nasion, użycie stężenia 40% lub wyższego gwarantuje skuteczną sterylizację nawet mocno zanieczyszczonych partii nasion. Ważne jest, aby nie przekraczać 10 minut sterylizacji w przypadku stosowania wybielacza o stężeniu równym lub wyższym niż 80%, aby uniknąć wysokiej śmiertelności nasion i wad w rozwoju sadzonek.

Traktowanie nasion rzodkiewnika chlorem gazowym o stężeniu 6,1% lub 16,5% przez 1 godzinę skutkuje wysoką zdolnością kiełkowania i odpowiednią eliminacją pleśni. Niskie stężenie chloru gazowego (2,1%) może być z powodzeniem stosowane poprzez wydłużenie czasu sterylizacji do 3 godzin.

Gdy kilka linii wymaga sterylizacji, zaleca się sterylizację płynem w roztworze 50% wybielacza przez 10 minut. W przypadku większej liczby linii lepszym rozwiązaniem jest sterylizacja gazowa o stężeniu gazu 6,1% przez 1 godzinę, ponieważ wiele linii można szybko i łatwo sterylizować przy mniejszym nakładzie pracy.

Nasze wyniki zapewniają ustandaryzowane warunki sterylizacji zarówno dużej liczby nasion o różnych genotypach, jak i nasion o niższym potencjale kiełkowania. Jedynym ograniczeniem tych technik sterylizacji jest to, że nie można ich stosować do nasion, których zdolność kiełkowania jest mniejsza niż 20% ze względu na dużą śmiertelność nasion. Alternatywne metody, takie jak sonikacja17, w celu zwiększenia szybkości kiełkowania przy braku sterylizacji, mogą być korzystne w takich przypadkach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Gauri Datta za pomoc w przygotowaniu materiałów eksperymentalnych. Jesteśmy również wdzięczni Bettinie Wittler i Jamesowi Mannowi za krytyczną recenzję rękopisu. Prace te były wspierane przez granty NSF DBI-1049341 i MCB-1143813.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,65 ml Probówki do mikrowirówekGeneMateC-3260-5Probówka, w której umieszcza się nasiona Arabidopsis thaliana w celu przeprowadzenia sterylizacji
1,7 ml Probówka do mikrowirówekGeneMateC-3262-1Probówka, w której umieszcza się nasiona Arabidopsis thaliana w celu przeprowadzenia sterylizacji
Plastikowy pojemnik o pojemności 7 LSistema1016265438Pojemnik, w którym przeprowadzana
jest sterylizacja gazowaSkoncentrowany HClSigma-Aldrich320331Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania chloru gazowego
Jednorazowa sterylna pętla do zaszczepianiaFisher Scientific22-363-603Pętla służy do rozprowadzania lub umieszczania nasion Arabidopsis na płytkach MS
Gamborg' s roztwór witaminowySigma-AldrichG1019Roztwór witaminowy stosowany w procesie wytwarzania pożywek dla stwardnienia rozsianego
Wybielacz domowyCloroxRegular-BleachSubstancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania chloru gazowego i płynnego
sterylizacji Hydrat MESSigma-AldrichM2933Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania MS media
Taśma chirurgiczna Micropore3M1530-1Mikroporowata taśma chirurgiczna papierowa stosowana do uszczelniania płytek MS
Murashige i Skoog mieszanina soli bazalnej (MS)Sigma-AldrichM5524Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania mediów MS
Parafilm MBemis Company#PM996Folia parafinowa stosowana do uszczelniania pojemnika sterylizacyjnego
szalka Petriego 100 X 15 mm Fisher Scientific FB0875713szalki Petriego, do których wlewa się pożywkę MS w celu hodowli Paski wskaźnikowe pH Arabidopsis thaliana
Whatman2613991Służy do sprawdzania pH zneutralizowanego roztworu chloru i wodorowęglanu sodu
FitoagarFisher Scientific50-255-212Służy do wspomagania zawieszenia nasion Arabidopsis w procesie posiewu nasion
WodorowęglansoduSigma-AldrichS5761Substancja chemiczna stosowana w procesie neutralizacji reakcji chloru gazowego
SacharozaSigma-AldrichS0389Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania pożywki MS
Tween 20Fisher BioReagentsBP337-100Substancja chemiczna stosowana w procesie sterylizacji płynnej
Arabidopsis thaliana nasionaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgCS70000 (Col-0)Nasiona Arabidopsis typu dzikiego 
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_037606Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_041402Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_059101CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_063470Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_072048Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_072240Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081989Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_084124Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_085049CNasiona Arabidopsis użyte w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_089717Cnasiona Arabidopsis użyte w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_107354CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część
nasion Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110111Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111322Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113109Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114702Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_114872Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_115657Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_116803Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_039445CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_039782Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_043037Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_045828Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_048556Cnasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) wykorzystane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049514Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_049725Cnasiona Arabidopsis użyte w testach jako część
grupy 2 nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_080816Cnasiona Arabidopsis użyte w testach jako część
grupy 2 nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081176CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część nasion
Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_081770Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082262CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
NasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082289Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_082702Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_083630Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_084635Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085337Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085656CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_093049Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_103332Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_105336Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_105704Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_106388Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_109575Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110580Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110617CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_111424Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_111584Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_112097Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113339Cnasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) używane w testach jako część grupy 2
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_115837Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_019535Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_026478Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_046565CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część nasion
Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_049258Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_049339Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_056307Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081292Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_081597Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_083488Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110573Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_112793CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_113658Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113904Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114673Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_114709Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_115455Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_013186Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_018261Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_062509CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_080639Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_088586Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_096651Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_106900Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110131Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111051Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_111245Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_113223CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_121391Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_125097Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_201905Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_210001Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_000662Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_029335Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_047760Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_071275CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_080530Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_103881Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_110864Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_120294Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_124390Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_132808Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_137036Cnasiona Arabidopsis używane do testowania jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_139519CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIRwww.arabidopsis.org SALK_140643Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.orgSALK_142288Cnasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5
nasionaArabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_143304Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5
nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana)ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_147597Cnasiona rzodkiewnika (Arabidopsis) wykorzystywane w testach jako część grupy 5
nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_209076Cnasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.orgSALK_081081CNasiona Arabidopsis używane w testach jako część grup 5 i 1
Nasiona Arabidopsis thalianaABRC; zamów przez TAIRwww.arabidopsis.org SALK_107487Cnasiona Arabidopsis używane do testów jako część grup 5 i 2
grupy 1 Grupy 2 grupy 3

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).
  2. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
  3. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
  4. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).
  5. Yamada, K., et al. Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. 302 (5646), 842-846 (2003).
  6. Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes. Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).
  7. Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins. PLoS One. 8 (9), e73291(2013).
  8. Podar, D. Plant growth and cultivation. Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).
  9. Xu, W., et al. An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 3, 1273(2013).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (1998).
  11. Cederholm, H. M., Benfey, P. N. Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development. New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).
  12. Ye, G. N., et al. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).
  13. Kuromori, T., et al. A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).
  14. Fiers, M., et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway. Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).
  15. Stepanova, A. N., Alonso, J. M. PCR-based screening for insertional mutants. Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).
  16. O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).
  17. López-Ribera, I., Vicient, C. M. Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds. Plant Methods. 13 (31), (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Arabidopsis Seed SterilizationBleach SolutionChlorine GasSeed Germination RateMicrobial ContaminationLaminar Flow HoodFume HoodSterile Distilled WaterMS PlateSeed Stratification

Powiązane artykuły