Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.
Artykuł metodologiczny
Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wprowadzenie
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) jest głównym organizmem modelowym do podstawowych i stosowanych badań w biologii roślin1,2,3. Chociaż standardowe warunki wzrostu rzodkiewnika są dobrze znane4, wpływ sterylizacji nasion na żywotność nasion nie został rygorystycznie przetestowany. Pożywka stała w płytkach lub pudełkach jest rutynowo stosowana w celu ułatwienia wzrostu siewek rzodkiewnika w wielu zastosowaniach eksperymentalnych, takich jak identyfikacja homozygotycznych mutantów letalnych w segregującej populacji, obserwacja fenotypów pędów i korzeni we wczesnych stadiach, izolacja tkanki wolnej od patogenów, pobieranie dużych ilości tkanki siewki, wybór transformantów lub roślin odpornych na leki oraz ocena kiełkowania1, 2,3,4. Nasiona zebrane z roślin uprawianych w szklarni lub komorze wzrostowej są czasami zanieczyszczone mikroorganizmami i kurzem. Wzrost siewek rzodkiewnika na różnych rodzajach sterylnych pożywek wymaga wcześniejszej sterylizacji nasion w celu usunięcia zanieczyszczeń mikrobiologicznych, takich jak grzyby i bakterie obecne na powierzchni nasion. Stosowanie skutecznego reżimu sterylizacji nasion ma kluczowe znaczenie dla równowagi między wysokim kiełkowaniem, minimalnym zanieczyszczeniem i energicznym wzrostem roślin.
Dwie najczęstsze metody sterylizacji nasion Arabidopsis opierają się na komercyjnym wybielaczu (faza ciekła) i chlorze gazowym (faza parowa). Zastosowano różne procedury zarówno do sterylizacji w fazie ciekłej1,4,5,6,7,8,9,10 oraz sterylizacja nasion Arabidopsis w fazie gazowej8,10,11,12,13,14,15,16. Jednakże, chociaż procedury te były skuteczne w przeprowadzaniu sterylizacji nasion wykorzystanych genotypów, nie zgłoszono szczegółowej analizy wpływu różnych zabiegów sterylizacji na nasiona o różnych genotypach. W związku z tym konieczna jest optymalizacja tych procedur sterylizacji w celu określenia warunków, w których skuteczna sterylizacja łączy się z wysoką zdolnością kiełkowania.
Centrum Zasobów Biologicznych Arabidopsis (ABRC) ma wyjątkową pozycję, aby a) testować żywotność nasion różnych genotypów w kolekcji i b) korzystać z procedur kontroli jakości stosowanych wewnętrznie i w odpowiedzi na opinie użytkowników na temat kiełkowania nasion. Celem przedstawionych eksperymentów było określenie wpływu różnych metod sterylizacji na kiełkowanie nasion szeregu genotypów rzodkiewnika. Zoptymalizowane procedury sterylizacji, które skutkują wysoką zdolnością kiełkowania nasion przy zachowaniu minimalnego zanieczyszczenia patogenami, są prezentowane zarówno w przypadku sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym.
Protokół
1. Przygotowanie pożywki Murashige i Skooga (MS) 1x
- Do zlewki zawierającej 0,8 L wody destylowanej dodać 4,31 g mieszaniny soli bazowych MS, 10 g sacharozy oraz 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i wymieszać do rozpuszczenia. Sprawdzić i skorygować pH do wartości 5,7 przy użyciu 1 M wodorotlenku potasu (KOH). Dopełnić wodą destylowaną do objętości 1 L.
- Podzielić pożywkę do dwóch butelek o pojemności 1 L, po 500 mL do każdej. Do każdej butelki dodać 5 g agaru. Pozostawić korki lekko poluzowane.
- Autoklawować przez 20 min w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi, umieszczając w butelce mieszadło magnetyczne.
- Po autoklawowaniu umieścić butelki na mieszadle magnetycznym przy niskich obrotach i pozwolić pożywce MS ostygnąć do 45-50 °C (do momentu, aż butelkę będzie można trzymać gołymi rękami).
- Od tego kroku wszystkie kolejne czynności należy wykonywać w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Do każdej butelki dodać 500 µL roztworu witamin Gamborg'a i wymieszać pożywkę MS, aby równomiernie rozprowadzić roztwór witamin.
- Wlać do szalek tyle pożywki, aby pokryła około połowę głębokości szalki.
- Pozostawić szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez około 1 h, aby agar mógł stężeć.
Uwaga: Jeśli szalki nie będą użyte natychmiast, należy je owinąć folią i przechowywać w temperaturze 4 °C (w lodówce). Przykryte szalki, pudełka lub probówki ze stężałym agarem można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C w szczelnym pojemniku.
2. Sterylizacja nasion Arabidopsis za pomocą wybielacza
- Przygotować płytki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. W tym samym czasie co pożywkę MS, wysterylizować w autoklawie 100 mL wody destylowanej. Wykorzystać ją później jako wodę do płukania oraz do zawieszenia nasion w celu ułatwienia ich wysiewu.
Uwaga: Jeśli jest to pożądane, w tym kroku można również wysterylizować w autoklawie mieszaninę agaru 0,8% (w/v) (np. phytagar). Podczas wysiewu (Krok 2.5.3.) mieszaninę agaru można zastosować zamiast wody destylowanej. Wyższa lepkość mieszaniny agaru ułatwia rozmieszczenie nasion na płytce lub sadzenie ich w rzędach, jeśli jest to konieczne. - Przygotować 50% (v/v) roztwór wybielacza do sterylizacji nasion. Aby rozcieńczyć wybielacz, dodać 100 mL wybielacza do 100 mL wody destylowanej. Do roztworu wybielacza dodać 50 µL detergentu Tween 20.
Uwaga: Przygotowany roztwór wybielacza można przechowywać do miesiąca, pod warunkiem, że jest otwierany wyłącznie w warunkach sterylnych. - Odważyć 100 nasion do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
- Zsterylizować nasiona za pomocą 50% roztworu wybielacza.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 500 µL 50% roztworu wybielacza do probówki do mikrocentryfugi zawierającej nasiona. Opukać dno probówki, aby zawiesić nasiona w roztworze wybielacza.
Uwaga: Alternatywnie można użyć rotatora lub wytrząsarki platformowej, aby utrzymać nasiona w zawiesinie.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 500 µL 50% roztworu wybielacza do probówki do mikrocentryfugi zawierającej nasiona. Opukać dno probówki, aby zawiesić nasiona w roztworze wybielacza.
- Wypłukać roztwór wybielacza z probówki.
- Po 10 min usunąć roztwór wybielacza z probówki do mikrocentryfugi za pomocą pipety lub aspiratora z założonym końcówką do pipety.
- Dodać do probówki 500 µL sterylnej wody destylowanej. Zamknąć probówkę i odwrócić w celu wymieszania. Pozostawić nasiona do osadzenia się na dnie probówki. Gdy nasiona opadną na dno, ostrożnie usunąć roztwór wybielacza za pomocą pipety. Powtórzyć ten proces płukania 6 razy.
- Dodać do probówki 1 mL wysterylizowanej w autoklawie wody destylowanej, aby zawiesić nasiona.
- Wysiać zsterylizowane nasiona na płytki MS.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisać dno płytki MS, podając nazwę materiału i bieżącą datę.
- Przenieść nasiona z probówki do mikrocentryfugi na płytkę MS. Rozłożyć nasiona na płytce MS za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do szczepień lub sterylnej końcówki do pipety.
Uwaga: Jeśli nasiona mają być wysiane w rzędach, można użyć pipety z końcówką 200 µL, aby indywidualnie umieszczać nasiona w pożądanych pozycjach. Aby poprawić przepływ nasion, koniec końcówki pipety można przyciąć o 3-5 mm za pomocą nożyczek. Źle rozmieszczone nasiona lub ich skupiska można następnie przesunąć lub rozdzielić za pomocą sterylnej jednorazowej pętli do szczepień. - Umieścić płytkę MS z tyłu komory z laminarnym przepływem powietrza z częściowo zamkniętą pokrywką. Pozostawić nadmiar wody do odparowania z płytki MS.
- Nałożyć pokrywkę na płytkę MS. Uszczelnić płytkę MS, owijając ją mikroporową chirurgiczną taśmą papierową (patrz Tabela Materiałów).
3. Sterylizacja nasion Arabidopsis za pomocą chloru w postaci gazowej
- Przygotować płytki MS zgodnie z sekcją 1 protokołu. Jednocześnie z pożywką MS wysterylizować w autoklawie 100 mL wody destylowanej; zostanie ona wykorzystana później do zawieszenia nasion w celu ułatwienia wysiewu.
Uwaga: W razie potrzeby w tym kroku można również wysterylizować w autoklawie mieszankę agaru 0,8% (w/v) (np. phytagar). Mieszankę agaru można zastosować zamiast wody destylowanej podczas wysiewu (Krok 3.6.2.). Większa lepkość mieszanki agaru ułatwia rozmieszczenie nasion na płytce lub sadzenie ich w rzędach, jeśli jest to konieczne. - Przed rozpoczęciem sterylizacji obliczyć ilości wybielacza i kwasu solnego (HCl) niezbędne do wytworzenia chloru gazowego.
- Obliczyć ilość HCl potrzebną do wytworzenia 6,1% Cl2 wymaganego do sterylizacji.
- Użyć następującego wzoru:
przyjmując 7 000 mL jako objętość pojemnika do sterylizacji oraz 6,1 jako %Cl2; obliczona objętość HCl wynosi 3 mL.
Uwaga: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do wykonywania obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2 dostępny jest jako Tabela uzupełniająca 1.
- Odważyć 100 nasion do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL. Zamknąć nakrętki każdej probówki, umieścić probówki w plastikowym statywie i odstawić.
Uwaga: Nasiona można w tym momencie przechowywać przez dłuższy czas, pod warunkiem zachowania odpowiednich warunków. Warunki przechowywania opisano w sekcji 3.3.2 protokołu Rivero i współpracowników4. Można również zastosować format płytki 96-dołkowej. - Przygotować materiały niezbędne do przeprowadzenia sterylizacji chlorem gazowym.
- Pobrać wybielacz i HCl z miejsc ich przechowywania.
- Odciąć pas szerokiej folii parafinowej (patrz Tabela materiałów), aby w kroku 3.5.3. uszczelnić pojemnik do sterylizacji.
- Umieścić plastikowy pojemnik z pokrywką, w którym odbędzie się sterylizacja, wewnątrz dygestorium. Otworzyć nakrętki wszystkich probówek z nasionami i umieścić cały statyw z nasionami w plastikowym pojemniku.
- Przeprowadzić sterylizację chlorem gazowym w temperaturze pokojowej.
Ostrzeżenie: Pracować z wybielaczem i kwasem osobno. Nie zostawiać otwartych butelek, aby zminimalizować ryzyko rozlania. Stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. Jeśli wybielacz lub kwas pryśnie na rękawice, należy je zmienić przed kontaktem z innymi materiałami. Zawsze zdejmować rękawice w dygestorium w przypadku zanieczyszczenia wybielaczem lub kwasem.- Umieścić zlew 250 mL wewnątrz pojemnika i dodać 100 mL wybielacza.
Uwaga: Reakcja między HCl a wybielaczem wymaga co najmniej 22-krotnego nadmiaru wybielacza. W wyniku reakcji HCl i wybielacz zostaną zużyte, uwalniając gaz Cl2, a produktami ubocznymi będą chlorek sodu (NaCl) i woda. Zastosowanie dużego nadmiaru wybielacza pozwala na zużycie dodatkowego HCl podczas okresu wietrzenia, co zmniejsza ilość wodorowęglanu sodu (NaHCO3) potrzebnego do neutralizacji roztworu przed utylizacją.
Ostrzeżenie: Pojemność zlewu powinna być co najmniej dwukrotnie większa niż całkowita objętość cieczy (wybielacz + HCl). Zapobiega to rozpryskom poza zlew w następnym kroku, które mogłyby uszkodzić nasiona, odbarwić ubrania lub poparzyć odsłoniętą skórę. - Dodać 3 mL HCl do zlewu zawierającego wybielacz.
Ostrzeżenie: Początkowa reakcja spowoduje powstawanie pęcherzyków, szczególnie przy stężeniach gazu wyższych niż 6,1%. W tym kroku niezbędny jest fartuch laboratoryjny z długimi rękawami. - Zamknąć pojemnik do sterylizacji i natychmiast uszczelnić go folią parafinową.
- Monitorować pojemnik podczas sterylizacji, aby upewnić się, że gaz się gromadzi; akumulacja chloru gazowego powinna być widoczna jako słaba żółta mgiełka wewnątrz pojemnika.
Ostrzeżenie: Okresowo sprawdzać pojemnik, aby upewnić się, że ciśnienie wewnątrz nie spowodowało odskoczenia pokrywki lub poluzowania folii parafinowej. Jeśli pokrywka odskoczyła lub folia parafinowa się poluzowała, zamknąć pokrywkę i ostrożnie owinąć pojemnik dodatkową warstwą folii parafinowej. - Po 1-godzinnym okresie sterylizacji otworzyć pojemnik, usuwając folię parafinową i lekko uchylając pokrywkę w jednym rogu. Pozostawić pojemnik do wietrzenia przez 3 h, aby reakcja dobiegła końca i gazowy chlor został usunięty.
- Zamknąć nakrętki wszystkich probówek do mikrocentryfugi w statywie.
Uwaga: Sterylne nasiona można przechowywać do czasu wysiewu, pod warunkiem przechowywania ich w suchych warunkach. - Wyjąć statyw z nasionami i umieścić go w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Zneutralizować produkty reakcji chloru gazowego
- Powoli dodawać 1,5 g proszku NaHCO3 do zlewu zawierającego roztwór wybielacza/HCl i mieszać szklaną rurką, aby rozpuścić NaHCO3 w roztworze. Kontynuować dodawanie NaHCO3, aż przestaną tworzyć się pęcherzyki gazu dwutlenku węgla (CO2).
Ostrzeżenie: Dodawać powoli, aby zapobiec rozpryskom. Stosować odpowiednie ŚOI, w tym rękawice i fartuch laboratoryjny. - Sprawdzić pH roztworu za pomocą pasków wskaźnikowych pH lub pH-metru. W razie potrzeby dodać więcej NaHCO3, aż pH roztworu stanie się neutralne (pH 7,0). W tym momencie roztwór można wyjąć z dygestorium i zutylizować zgodnie z obowiązującymi wytycznymi dotyczącymi utylizacji.
Ostrzeżenie: Jeśli podczas utylizacji pojawi się JAKIKOLWIEK zapach, roztwór należy natychmiast zwrócić do dygestorium.
- Powoli dodawać 1,5 g proszku NaHCO3 do zlewu zawierającego roztwór wybielacza/HCl i mieszać szklaną rurką, aby rozpuścić NaHCO3 w roztworze. Kontynuować dodawanie NaHCO3, aż przestaną tworzyć się pęcherzyki gazu dwutlenku węgla (CO2).
- Umieścić zlew 250 mL wewnątrz pojemnika i dodać 100 mL wybielacza.
- Wysiać sterylne nasiona na płytki MS.
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza opisać dno płytki MS, podając nazwę linii i aktualną datę.
- Do każdej probówki do mikrocentryfugi dodać 500 µL sterylnej wody destylowanej, aby zawiesić nasiona. Wylać nasiona na płytkę MS i rozprowadzić je równomiernie po całej płytce za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli do szczepień lub sterylnego końcówki do pipety.
- Umieścić płytkę MS z tyłu komory z laminarnym przepływem powietrza z częściowo przymkniętą pokrywką. Pozostawić nadmiar wody do odparowania z płytki MS.
- Nałożyć pokrywkę na płytkę MS. Uszczelnić płytkę MS, owijając ją mikroporową chirurgiczną taśmą papierową.
4. Wzrost Arabidopsis na płytkach MS
- Przechowywać płytki z zamkniętymi pokrywami przez trzy dni w temperaturze 4 ˚C i przy wilgotności otoczenia.
Uwaga: Proces ten nazywa się stratyfikacją i służy do synchronizacji kiełkowania poszczególnych nasion. - Przenieść płytki do środowiska wzrostu.
- Utrzymywać temperaturę na poziomie 23 °C i natężenie światła w zakresie 120 - 150 µmol/m2s przy fotoperiodzie 16 h światła/ 8 h ciemności. Umieścić płytki płasko w środowisku wzrostu z pokrywą na górze, tak aby korzenie rosły w głąb podłoża.
- Pozostawić siewki na płytkach do wzrostu na 8 dni.
Uwaga: Ośmiodniowy okres wzrostu pozwala na wykiełkowanie nasion kiełkujących później. Płytki można ocenić wcześniej niż po 8 dniach, jeśli wszystkie nasiona już wykiełkowały. - Ocenić wskaźniki kiełkowania.
- Zarejestrować liczbę nasion, które wykiełkowały oraz tych, które nie wykiełkowały. Obliczyć wskaźnik kiełkowania, dzieląc liczbę nasion, które wykiełkowały, przez całkowitą liczbę nasion na płytce.
Uwaga: Kiełkowanie uznaje się za dokonane, gdy korzeń zakiełkowy przebił się przez łupinę nasiona i widoczne są dwie liście pierwsze. - Należy również policzyć liczbę nasion zainfekowanych pleśnią, aby określić skuteczność warunków sterylizacji.
- Zarejestrować liczbę nasion, które wykiełkowały oraz tych, które nie wykiełkowały. Obliczyć wskaźnik kiełkowania, dzieląc liczbę nasion, które wykiełkowały, przez całkowitą liczbę nasion na płytce.
Wyniki
Nasiona Arabidopsis pobierane z otwartego pola, szklarni lub komory wzrostowej są czasami zanieczyszczone różnymi mikroorganizmami, takimi jak grzyby i bakterie1,4. W związku z tym kiełkowanie nasion na sterylnych pożywkach może być szczególnie trudne ze względu na zanieczyszczenie płytek, zwłaszcza gdy zasoby nasion są ograniczone. Zoptymalizowany protokół sterylizacji zarówno podchlorynem sodu, jak i chlorem w postaci gazowej, którego wyniki przedstawiono poniżej, minimalizuje ten problem i zachowuje żywotność nasion niezbędną do zastosowań wysokoprzepustowych.
Wpływ sterylizacji wybielaczem na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0
Wybielacz jest najczęściej stosowanym środkiem do sterylizacji nasion u wielu gatunków roślin. Optymalne stężenie środka sterylizującego oraz czas ekspozycji różnią się w zależności od gatunku. W celu sterylizacji nasion Arabidopsis zastosowano szereg protokołów z użyciem wybielacza1,4,5,6,7,8,9,10. Przetestowano cztery różne stężenia wybielacza przy pięciu różnych okresach ekspozycji, a wyniki przedstawiono na Rysunku 1. Zabiegi zastosowano na nasionach typu dzikiego Columbia (Col-0). Wpływ stężenia wybielacza na kiełkowanie nasion Col-0 różnił się w zależności od czasu sterylizacji, co wykazała istotna interakcja między stężeniem wybielacza a czasem sterylizacji (Rysunek 1, P < 0,001, ANOVA – analiza wariancji).
W eksperymentach z czasem sterylizacji od 5 do 10 min, zabiegi ze wszystkimi stężeniami wybielacza doprowadziły do równie wysokiego wskaźnika kiełkowania nasion Col-0 (Rysunek 1). Wysokie wskaźniki kiełkowania zaobserwowano również dla stężeń wybielacza domowego 40% i 50% dla wszystkich czasów sterylizacji. Zabiegi z użyciem 80% i 100% wybielacza przez okres dłuższy niż 10 min spowodowały znaczny spadek wskaźnika kiełkowania w porównaniu z krótszymi czasami moczenia (P < 0,01, ANOVA). Ponadto, w przypadku obu zabiegów wybielaczem 80% i 100% przez 20 min, kiełkowanie było znacznie zmniejszone w porównaniu z odpowiadającymi im zabiegami wybielaczem 40% i 50% (P < 0,001, ANOVA).
Nasiona wykazywały różny stopień wybielenia i pomarszczenia przy zastosowaniu wysokich stężeń wybielacza przez 15 min lub dłużej. Oprócz stosunkowo wysokiej śmiertelności nasion (do 32%), nasiona wykiełkowane po sterylizacji w tych warunkach często wykazywały wady wzrostu, objawiające się brakiem rozprostowania i wydłużenia liścic oraz podkotyledonów, co prowadziło do zahamowania rozwoju. Większość prób (14 z 20) była całkowicie wolna od pleśni, co przełożyło się na średni ogólny poziom pleśni wynoszący 0,21% ± 0,003 (Tabela 1).
Obóbkę z zastosowaniem 50% wybielacza i czasem namaczania wynoszącym 10 min wybrano jako optymalny reżim sterylizacji, ponieważ łączył on wysoki procent kiełkowania z dobrą inhibicją wzrostu patogenów powierzchniowych. Wybrano tę metodę w celu przetestowania wpływu sterylizacji wybielaczem na różne linie mutantów, zgodnie z opisem poniżej.
Wpływ sterylizacji chlorem gazowym na kiełkowanie nasion Col-0
Aby zoptymalizować warunki sterylizacji chlorem gazowym, użyto trzech różnych stężeń chloru gazowego do sterylizacji nasion Col-0 przez dwa okresy czasu (Tabela 2). Stężenie gazu obliczono na podstawie objętości stężonego HCl oraz objętości pojemnika do sterylizacji, korzystając z następującego równania:
Równanie to zostało wyprowadzone przy użyciu prawa gazów doskonałych, przy założeniu stężenia 12,3 M HCl, temperatury 23 °C oraz standardowego ciśnienia atmosferycznego wynoszącego 101,3 kPa.
Wykazano, że wpływ stężenia chloru w fazie gazowej na kiełkowanie nasion Col-0 zależy od czasu sterylizacji, co wskazuje istotna interakcja między czynnikami czasu i stężenia (Rycina 2A, P < 0,01, ANOVA). Stężenie gazowego chloru nie miało istotnego wpływu na kiełkowanie nasion Col-0 poddanych 1-godzinnej sterylizacji. Przy tym czasie sterylizacji wszystkie stężenia chloru w fazie gazowej promowały podobnie wysokie poziomy kiełkowania, powyżej 85% (P > 0,05, ANOVA). Z drugiej strony, 3-godzinna sterylizacja spowodowała istotny spadek wskaźnika kiełkowania dla najwyższego stężenia chloru w fazie gazowej w porównaniu do dwóch niższych stężeń gazu (P < 0,05, ANOVA). Wyniki te wskazują, że traktowanie nasion Arabidopsis dowolnym z badanych stężeń chloru w fazie gazowej przez 1 h lub stężeniami gazu poniżej 16,5% przez 3 h jest równie skuteczne w zachowaniu żywotności nasion, ponieważ wskaźniki kiełkowania zawsze przekraczały 82%. Jednakże sterylizacja nasion przez 3 h przy stężeniu gazu 16,5% była szkodliwa dla kiełkowania nasion.
Występowanie pleśni zależało również od stężenia gazu i czasu ekspozycji. Wzrost pleśni został skutecznie zahamowany przy stosunkowo wysokich stężeniach chloru 6,1% i 16,5% podczas 1-godzinnej obróbki oraz przy wszystkich stężeniach gazu w przypadku 3 h (Rysunek 2B).
Na podstawie tych wyników wybrano stężenie gazu 6,1% przez 1 h (Tabela 2) jako optymalny warunek sterylizacji w fazie gazowej do zbadania wpływu sterylizacji gazowej na różne linie mutantów, ponieważ pozwalało ono na uzyskanie wysokiego wskaźnika kiełkowania (85%) przy bardzo niskim poziomie zanieczyszczenia pleśnią (0,02%).
Wpływ sterylizacji podchlorynem sodu i chlorem gazowym na nasiona o różnym potencjale kiełkowania
Analiza statystyczna wykazała, że reakcja kiełkowania na metody sterylizacji była zależna od potencjału kiełkowania linii (Rycina 3A, P < 0,01, ANOVA). Ani sterylizacja wybielaczem, ani gazem chlorowym nie obniżyły wskaźnika kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania (Grupy 4 i 5). Żadna z metod nie wpłynęła na i tak niską zdolność kiełkowania w grupie o najniższym potencjale kiełkowania (Grupa 1). W przeciwieństwie do tego, sterylizacja gazem chlorowym spowodowała istotne zmniejszenie o około 12-18% (P < 0,01, ANOVA) kiełkowania nasion o pośrednim potencjale kiełkowania (Grupy 2 i 3). Sterylizacja wybielaczem również obniżyła wskaźnik kiełkowania o 13% w Grupie 2, ale nie wpłynęła na wskaźnik kiełkowania w Grupie 3. Chociaż w żadnej grupie kiełkowania nie stwierdzono istotnej różnicy we wskaźniku kiełkowania między sterylizacją wybielaczem a gazem chlorowym (Rycina 3A, P > 0,442, ANOVA), nasiona sterylizowane wybielaczem wykazywały nieco wyższy wskaźnik kiełkowania niż nasiona sterylizowane gazowo we wszystkich grupach kiełkowania.
Zabiegi sterylizacyjne znacząco zmieniły (P < 0,001, ANOVA) odsetek nasion dotkniętych pleśnią (Rysunek 3B). Zarówno sterylizacja chlorem gazowym, jak i wybielaczem, skutkowała mniejszym wzrostem pleśni (P < 0,05, ANOVA) w porównaniu do braku sterylizacji. W żadnej z grup nie stwierdzono różnic w poziomie pleśni między sterylizacją gazową a wybielaczem (Rysunek 3B, P > 0,4, ANOVA).
Rysunek 1: Wpływ stężenia wybielacza i czasu sterylizacji na kiełkowanie nasion Arabidopsis Col-0. Wartości przedstawiają średnie ± SD uzyskane z 5 niezależnych powtórzeń eksperymentu. *oznacza istotne różnice w stosunku do 5 min czasu moczenia dla zakresu stężeń wybielacza (P < 0,01, ANOVA). #oznacza istotne różnice dla stężeń wybielacza 80% i 100% w stosunku do 40% i 50% dla czasu 20 min (P < 0,01, ANOVA). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 2: Wpływ stężenia chloru i czasu sterylizacji na nasiona Arabidopsis Col-0. (A) Wskaźnik kiełkowania oraz (B) Poziom pleśni. Słupki błędów reprezentują średnie ± SD uzyskane z 5 powtórzeń biologicznych i 5 powtórzeń technicznych eksperymentu. Średnie, które nie dzielą tej samej litery, różnią się istotnie (P < 0,05, ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Wpływ sterylizacji wybielaczem i chlorem w postaci gazowej na nasiona o różnym potencjale kiełkowania. (A) Odsetek kiełkowania i (B) Poziom zapleśnienia. 100 linii SALK T-DNA podzielono na pięć grup zgodnie z ich potencjałem kiełkowania, zdefiniowanym jako odsetek kiełkowania w przypadku braku jakiegokolwiek środka sterylizującego. Grupy oparte na odsetku kiełkowania były następujące: Grupa 1 (0-20%), Grupa 2 (21-50%), Grupa 3 (51-70%), Grupa 4 (71-90%) oraz Grupa 5 (91-100%). Linie wybrano losowo, a ich potencjał kiełkowania nie zależał od genotypu. Wartości stanowią średnie ± SD uzyskane z trzech niezależnych powtórzeń eksperymentu. Litery („a”, „ab”, „c” itd.) nad każdą wartością wskazują statystyczne zgrupowania średnich kategorii. Średnie, które nie dzielą wspólnej litery, różnią się istotnie (P < 0,05, ANOVA). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Czas sterylizacji (min) | Stężenie wybielacza (%) | |||
| 40 | 50 | 80 | 100 | |
| 5 | 0.00% | 0.00% | 0.00% | 2.13% |
| 8 | 0.00% | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| 10 | 0.00% | 0.50% | 0.00% | 0.36% |
| 15 | 0.00% | 0.00% | 0.00% | 0.68% |
| 20 | 0.19% | 0.28% | 0.00% | 0.00% |
Tabela 1: Poziom zapleśnienia nasion Col-0 sterylizowanych wybielaczem.
| Wybielacz | HCl | Czas | % chloru w fazie gazowej (mol Cl2/mol całkowitej ilości gazu) |
| (ml) | (ml) | (h) | |
| 25 | 1 | 1 | 2.1 |
| 25 | 1 | 3 | 2.1 |
| 100 | 3 | 1 | 6.1 |
| 100 | 3 | 3 | 6.1 |
| 200 | 9 | 1 | 16.5 |
| 200 | 9 | 3 | 16.5 |
Tabela 2: Sterylizacja nasion dzikiego typu Columbia gazem chlorem (Cl2) z wykorzystaniem pojemnika o pojemności 7 L.
Tabela uzupełniająca 1: Arkusz kalkulacyjny zaprogramowany do obliczeń dla różnych objętości pojemnika i %Cl2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Podczas uprawy nasion Arabidopsis na sterylnych podłożach należy zastosować jakąś formę sterylizacji. Zarówno zabiegi sterylizacji wybielaczem, jak i chlorem gazowym skutkują podobną szybkością kiełkowania i zahamowaniem rozwoju pleśni. Żadna z metod sterylizacji nie powoduje znacznego zmniejszenia zdolności kiełkowania nasion o wysokim potencjale kiełkowania; jednak sterylizacja wybielaczem jest zalecana dla linii o niższym potencjale kiełkowania (20-70%), ze względu na niewielką, choć nieistotną, poprawę szybkości kiełkowania w porównaniu ze sterylizacją gazową (ryc. 3A).
Sterylizacja nasion Arabidopsis stężeniami wybielacza od 40-100% przez okres do 10 minut zapewnia zadowalający procent kiełkowania i skuteczne tłumienie pleśni. Chociaż stężenie wybielacza mniejsze niż 40% zapewnia odpowiednią sterylizację większości partii nasion, użycie stężenia 40% lub wyższego gwarantuje skuteczną sterylizację nawet mocno zanieczyszczonych partii nasion. Ważne jest, aby nie przekraczać 10 minut sterylizacji w przypadku stosowania wybielacza o stężeniu równym lub wyższym niż 80%, aby uniknąć wysokiej śmiertelności nasion i wad w rozwoju sadzonek.
Traktowanie nasion rzodkiewnika chlorem gazowym o stężeniu 6,1% lub 16,5% przez 1 godzinę skutkuje wysoką zdolnością kiełkowania i odpowiednią eliminacją pleśni. Niskie stężenie chloru gazowego (2,1%) może być z powodzeniem stosowane poprzez wydłużenie czasu sterylizacji do 3 godzin.
Gdy kilka linii wymaga sterylizacji, zaleca się sterylizację płynem w roztworze 50% wybielacza przez 10 minut. W przypadku większej liczby linii lepszym rozwiązaniem jest sterylizacja gazowa o stężeniu gazu 6,1% przez 1 godzinę, ponieważ wiele linii można szybko i łatwo sterylizować przy mniejszym nakładzie pracy.
Nasze wyniki zapewniają ustandaryzowane warunki sterylizacji zarówno dużej liczby nasion o różnych genotypach, jak i nasion o niższym potencjale kiełkowania. Jedynym ograniczeniem tych technik sterylizacji jest to, że nie można ich stosować do nasion, których zdolność kiełkowania jest mniejsza niż 20% ze względu na dużą śmiertelność nasion. Alternatywne metody, takie jak sonikacja17, w celu zwiększenia szybkości kiełkowania przy braku sterylizacji, mogą być korzystne w takich przypadkach.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Gauri Datta za pomoc w przygotowaniu materiałów eksperymentalnych. Jesteśmy również wdzięczni Bettinie Wittler i Jamesowi Mannowi za krytyczną recenzję rękopisu. Prace te były wspierane przez granty NSF DBI-1049341 i MCB-1143813.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,65 ml Probówki do mikrowirówek | GeneMate | C-3260-5 | Probówka, w której umieszcza się nasiona Arabidopsis thaliana w celu przeprowadzenia sterylizacji |
| 1,7 ml Probówka do mikrowirówek | GeneMate | C-3262-1 | Probówka, w której umieszcza się nasiona Arabidopsis thaliana w celu przeprowadzenia sterylizacji |
| Plastikowy pojemnik o pojemności 7 L | Sistema | 1016265438 | Pojemnik, w którym przeprowadzana |
| jest sterylizacja gazowaSkoncentrowany HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania chloru gazowego |
| Jednorazowa sterylna pętla do zaszczepiania | Fisher Scientific | 22-363-603 | Pętla służy do rozprowadzania lub umieszczania nasion Arabidopsis na płytkach MS |
| Gamborg' s roztwór witaminowy | Sigma-Aldrich | G1019 | Roztwór witaminowy stosowany w procesie wytwarzania pożywek dla stwardnienia rozsianego |
| Wybielacz domowy | Clorox | Regular-Bleach | Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania chloru gazowego i płynnego |
| sterylizacji Hydrat MES | Sigma-Aldrich | M2933 | Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania MS media |
| Taśma chirurgiczna Micropore | 3M | 1530-1 | Mikroporowata taśma chirurgiczna papierowa stosowana do uszczelniania płytek MS |
| Murashige i Skoog mieszanina soli bazalnej (MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania mediów MS |
| Parafilm M | Bemis Company | #PM996 | Folia parafinowa stosowana do uszczelniania pojemnika sterylizacyjnego |
| szalka Petriego 100 X 15 mm | Fisher Scientific FB0875713 | szalki Petriego, do których wlewa się pożywkę MS w celu hodowli Paski wskaźnikowe pH Arabidopsis thaliana | |
| Whatman | 2613991 | Służy do sprawdzania pH zneutralizowanego roztworu chloru i wodorowęglanu sodu | |
| Fitoagar | Fisher Scientific | 50-255-212 | Służy do wspomagania zawieszenia nasion Arabidopsis w procesie posiewu nasion |
| Wodorowęglan | soduSigma-Aldrich | S5761 | Substancja chemiczna stosowana w procesie neutralizacji reakcji chloru gazowego |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S0389 | Substancja chemiczna stosowana w procesie wytwarzania pożywki MS |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | Substancja chemiczna stosowana w procesie sterylizacji płynnej |
| Arabidopsis thaliana nasiona | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | CS70000 (Col-0) | Nasiona Arabidopsis typu dzikiego |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_037606C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_041402C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_059101C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_063470C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_072048C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_072240C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081989C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_084124C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_085049C | Nasiona Arabidopsis użyte w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_089717C | nasiona Arabidopsis użyte w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_107354C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część |
| nasion Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110111C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111322C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113109C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114702C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_114872C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_115657C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_116803C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 1 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_039445C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_039782C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_043037C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_045828C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_048556C | nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) wykorzystane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_049514C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_049725C | nasiona Arabidopsis użyte w testach jako część |
| grupy 2 nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_080816C | nasiona Arabidopsis użyte w testach jako część |
| grupy 2 nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081176C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część nasion |
| Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_081770C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_082262C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_082289C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_082702C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_083630C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_084635C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085337C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085656C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_093049C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_103332C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_105336C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_105704C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_106388C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_109575C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110580C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110617C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_111424C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_111584C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_112097C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113339C | nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) używane w testach jako część grupy 2 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_115837C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 2 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_019535C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_026478C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_046565C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część nasion |
| Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_049258C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_049339C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_056307C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081292C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_081597C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_083488C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110573C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_112793C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_113658C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113904C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114673C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_114709C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_115455C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 3 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_013186C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_018261C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_062509C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_080639C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_088586C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_096651C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_106900C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110131C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111051C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_111245C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_113223C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_121391C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_125097C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_201905C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana | ) ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_210001C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 4 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_000662C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_029335C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_047760C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_071275C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_080530C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_103881C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_110864C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_120294C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_124390C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_132808C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_137036C | nasiona Arabidopsis używane do testowania jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_139519C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR | www.arabidopsis.org SALK_140643C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie przez TAIR www.arabidopsis.org | SALK_142288C | nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona | Arabidopsis thalianaUkład ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_143304C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_147597C | nasiona rzodkiewnika (Arabidopsis) wykorzystywane w testach jako część grupy 5 |
| nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_209076C | nasiona rzodkiewnika używane w testach jako część grupy 5 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamówienie za pośrednictwem TAIR www.arabidopsis.org | SALK_081081C | Nasiona Arabidopsis używane w testach jako część grup 5 i 1 |
| Nasiona Arabidopsis thaliana | ABRC; zamów przez TAIR | www.arabidopsis.org SALK_107487C | nasiona Arabidopsis używane do testów jako część grup 5 i 2 |
Bibliografia
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).
- Yamada, K., et al. Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. 302 (5646), 842-846 (2003).
- Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes. Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).
- Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins. PLoS One. 8 (9), e73291(2013).
- Podar, D. Plant growth and cultivation. Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).
- Xu, W., et al. An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 3, 1273(2013).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, (1998).
- Cederholm, H. M., Benfey, P. N. Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development. New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).
- Ye, G. N., et al. Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation. Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).
- Kuromori, T., et al. A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis. Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).
- Fiers, M., et al. The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway. Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).
- Stepanova, A. N., Alonso, J. M. PCR-based screening for insertional mutants. Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).
- O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).
- López-Ribera, I., Vicient, C. M. Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds. Plant Methods. 13 (31), (2017).
Przedruki i uprawnienia
