Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Podsumowanie

W manuskrypcie opisujemy użycie testu reporterowego fluorescencji na bazie drożdży do identyfikacji składników komórkowych zaangażowanych w procesy transportu i zabijania podjednostki cytotoksycznej A toksyny roślinnej rycyny (RTA).

Streszczenie

Bakteryjne i roślinne toksyny A/B wykorzystują naturalne szlaki transportowe w komórkach eukariotycznych, aby dotrzeć do swojego wewnątrzkomórkowego celu w cytozolu i ostatecznie zabić. Takie toksyny A/B na ogół składają się z enzymatycznie aktywnej podjednostki A (np. toksyny rycynowej A (RTA)) i jednej lub więcej podjednostek B wiążących komórki, które są odpowiedzialne za wiązanie toksyny z określonymi receptorami na powierzchni komórki. Nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób toksyny A/B są zdolne do skutecznego odurzania komórek, pomogła naukowcom zrozumieć podstawowe mechanizmy komórkowe, takie jak endocytoza i wewnątrzkomórkowe sortowanie białek w wyższych komórkach eukariotycznych. Z medycznego punktu widzenia ważne jest również zidentyfikowanie głównych szlaków transportu toksyn w celu znalezienia odpowiednich rozwiązań terapeutycznych dla pacjentów lub ostatecznie opracowania terapeutycznych zastosowań opartych na toksynach w terapii raka.

Ponieważ analizy całego genomu transportu toksyn A/B w komórkach ssaków są skomplikowane, czasochłonne i kosztowne, przeprowadzono kilka badań nad transportem toksyny A/B w modelowym organizmie drożdży Saccharomyces cerevisiae. Pomimo tego, że są mniej złożone, podstawowe procesy komórkowe w drożdżach i wyższych komórkach eukariotycznych są podobne i bardzo często wyniki uzyskane w drożdżach można przenieść na sytuację ssaków.

Tutaj opisujemy szybki i łatwy w użyciu test reporterowy do analizy wewnątrzkomórkowego transportu RTA w drożdżach. Istotną zaletą nowego testu jest możliwość zbadania nie tylko retrotranslokacji RTA z retikulum endoplazmatycznego (ER) do cytozolu, ale także endocytozy i wstecznego transportu toksyn z błony komórkowej do ER. Test wykorzystuje plazmid reporterowy, który umożliwia pośredni pomiar toksyczności RTA poprzez emisję fluorescencyjną białka zielonej fluorescencji (GFP) po translacji in vivo. Ponieważ RTA skutecznie zapobiega inicjacji biosyntezy białek poprzez deprydację 28S rRNA, test ten umożliwia identyfikację białek komórek gospodarza zaangażowanych w wewnątrzkomórkowy transport RTA poprzez wykrywanie zmian w emisji fluorescencji.

Wprowadzenie

Pacjenci cierpiący na infekcje wywołane przez bakterie wytwarzające toksyny stanowią poważne obciążenie medyczne i finansowe dla każdego systemu opieki zdrowotnej, zwłaszcza że nadal w dużej mierze brakuje skutecznych metod leczenia. Aby opracować nowe strategie terapeutyczne, należy w pełni zrozumieć złożone mechanizmy zatrucia istotnymi z medycznego punktu widzenia toksynami A/B, takimi jak toksyna, toksyna Shiga lub rycyna, w oparciu o nowe, potężne testy, które muszą zostać wdrożone.

W ostatnich latach kilka badań próbowało analizować transport toksyn A/B w komórkach drożdży i ssaków przy użyciu czasochłonnych i kosztownych metod, takich jak znakowanie toksyn radioaktywnych^1,2 oraz podejścia przesiewowe oparte na siRNA³. W niektórych przypadkach transport toksyn został uwidoczniony in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po chemicznym i/lub genetycznym sprzężeniu poszczególnych podjednostek toksyny z fluoroforami, kropkami kwantowymi lub białkami fluorescencyjnymi^4,5. Niestety, takie modyfikacje często prowadzą do nieaktywnych i/lub zmienionych naturalnych właściwości toksyn. Innym eleganckim sposobem pośredniego odpowiadania na różnorodne pytania naukowe jest zastosowanie systemów reporterowych opartych na enzymach takich jak lacZ, lucyferazy lub białka fluorescencyjne (np. GFP lub Discosoma sp. czerwone białko fluorescencyjne (dsRed)).

W tym manuskrypcie opisany jest prosty protokół, który identyfikuje składniki komórkowe niezbędne do wewnątrzkomórkowego transportu pozakomórkowego RTA u S. cerevisiae. W ten sposób plazmid reporterowy fluorescencji zawierający N-końcowy sygnał importu ER, po którym następuje GFP, działa jako czujnik biosyntezy białek, który pośrednio mierzy hamowanie translacji białek za pośrednictwem RTA przez emisję fluorescencji GFP po translacji in vivo⁶. W przypadku, gdy endocytoza RTA i/lub transport wewnątrzkomórkowy są negatywnie (lub pozytywnie) dotknięte w określonym mutancie delecji drożdży w porównaniu z typem dzikim, można to wykryć poprzez wzrost (lub spadek) emisji fluorescencji GFP⁶.

Do tej pory wszystkie metody analizujące transport RTA w komórkach drożdży ograniczały się do procesu retrotranslokacji RTA z ER-do cytozolu. W takim sztucznym systemie RTA zawierający sygnał importu ER jest wyrażany z indukowalnego promotora, co skutkuje samobójczym fenotypem^1,7. Chociaż w konfiguracji eksperymentalnej opisanej w tym manuskrypcie brakuje również podjednostki B wiążącej komórki, a zatem nie reprezentuje ona w pełni naturalnej sytuacji zatrucia holotoksyną rycyny⁸, transport toksyny z błony komórkowej przez aparat Golgiego do ER może być ściśle naśladowany w tym nowatorskim teście. Co ciekawe, wstępne wyniki uzyskane w badaniu pilotażowym wskazują, że szlaki przemytu wykorzystywane przez RTA wykazują uderzające podobieństwa do drogi zatrucia holotoksyną rycyny.

Podsumowując, opisana metoda może być użyta do określenia specyficznej roli wybranych białek komórkowych w endocytozie RTA i transporcie drożdży. Co więcej, ten eksperymentalny układ można łatwo dostosować do innych toksyn inaktywujących rybosomy wytwarzanych i wydzielanych z różnych gatunków drożdży i bakterii, takich jak zymocyna lub toksyna Shiga.

Protokół

UWAGA: Przegląd ogólnego schematu doświadczalnego przedstawiono na Rysunku 1.

Uwaga: RTA jest wysoce toksyczny dla ludzi. Wymagane jest zezwolenie laboratoryjne S2 (odpowiednik poziomu biosafety level 2). Prosimy o noszenie rękawiczek przez cały czas trwania eksperymentu.

1. Heterologiczna ekspresja białka RTA z tagiem His w Escherichia coli

1. Przeprowadź transformację komórek E. coli plazmidem ekspresyjnym pET24-RTA_(His)6 lub pustym wektorem pET24a⁽⁺⁾, stosując standardowe protokoły elektroporacji^9,10. Komórki zawierające pusty plazmid służą jako kontrola negatywna.
2. Po wyselekcjonowaniu pozytywnych klonów na płytkach LB z kanamycyną (10 µg/mL), zaszczep komórki zawierające plazmid ekspresyjny RTA lub pusty wektor w 5 mL pożywki LB_kan (pożywka LB z 100 µg/mL kanamycyny) i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 20 rpm przez 24 h.
3. Do 1 L pożywki LB_kan dodaj 5 mL prekultury i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przy 20 rpm, aż osiągną OD₆₀ na poziomie 0,8-1,0 (około 3-4 h). Następnie obniż temperaturę hodowli do 28 °C i przygotuj 1 M roztwór zapasowy izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w H₂O.
4. Indukuj ekspresję RTA w E. coli poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 1 mM.
5. Po 3,5 h w temperaturze 28 °C przy 20 rpm, zbierz komórki przez wirowanie przy 10 0 x g i 4 °C przez 10 min, przemyj osad dwukrotnie 5 mL buforu wiążącego (50 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,4) przy 10 00 x g i 4 °C przez 10 min, a następnie resuspenduj osad w 5 mL buforu wiążącego.
   UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, a komórki można przechowywać w temperaturze 80 °C przez kilka dni.

2. Oczyszczanie RTA z tagiem His za pomocą chromatografii powinowactwa

1. Poddać komórki sonikacji na lodzie zgodnie z następującym protokołem: impuls 15 s (20 mikronów), przerwa 30 s. Powtórzyć ten krok pięć razy.
2. Wirować lizat komórkowy przy 21 0 x g i 4 °C przez 15 min, a następnie przefiltrować nadsącz za pomocą sterylnego systemu filtracji strzykawkowej (rozmiar porów 0,2 µm).
   UWAGA: Osady komórkowe z poprawnie sonikowanych próbek mają przezroczyste brzegi.
3. Użyć zautomatyzowanego systemu oczyszczania wyposażonego w kolumnę powinowactwa opartą na Ni²⁺ o pojemności 5 mL w celu oczyszczenia frakcji RTA z znacznikiem His z przefiltrowanego sterylnie nadsączu E. coli. Generalnie należy stosować prędkość elucji 1 mL/min i chłodzić cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyny oraz utracie jej aktywności.
   UWAGA: Parametry efektywnego oczyszczania RTA wymieniono w Tabeli 1. Więcej informacji znajduje się w pracy Beckera et al⁹.
   1. W skrócie: wyrównać kolumnę powinowactwa 20 mL buforu wiążącego, aby usunąć bufor do przechowywania. Nadsącz przefiltrowany sterylnie nanieść na kolumnę powinowactwa za pomocą strzykawki.
   2. Przemyć kolumnę 25-35 mL buforu wiążącego, aby usunąć z niej niewiążące się białka. Etap przemywania prowadzić do momentu, gdy absorbancja UV przy 280 nm zbliży się do początkowej wartości UV.
   3. Eluować związaną frakcję RTA w 20-35 mL buforu elucyjnego (50 mM imidazolu, 50 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) i przechowywać próbkę na lodzie (Rysunek 2A i Rysunek 2B).
      UWAGA: Elucja frakcji RTA objawia się wzrostem absorpcji UV. Należy zbierać wyłącznie tę frakcję, aby uniknąć zanieczyszczenia niespecyficznie związanymi białkami.
   4. Wykorzystać 20 µL eluatów do przeprowadzenia barwienia błękitem Coomassie¹ lub analizy Western blot^12,13 (opcjonalnie). Użyć przeciwciał pierwszorzędowych anty-His (1:1 0) oraz przeciwciał drugorzędowych anty-mouse-IgG-HRP (1:10 0) w celu wykrycia RTA i weryfikacji czystości próbki (Rysunek 3).
   5. Odsolić eluowaną frakcję RTA na kolumnie odsalającej 5 mL i wyrównać próbkę w 0,8 M sorbitolu.
      1. Zastąpić kolumnę powinowactwa w systemie oczyszczania kolumną odsalającą, a następnie wyrównać kolumnę 20 mL 0,8 M sorbitolu.
      2. Nanieść eluowaną frakcję RTA na kolumnę za pomocą strzykawki. Przemyć kolumnę 10 mL 0,8 M sorbitolu i eluować odsoloną frakcję RTA do probówki 15 mL, gdy tylko absorpcja UV zacznie rosnąć (Rysunek 2C).
      3. Przechowywać eluowaną frakcję RTA w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Natychmiast przerwać pobieranie frakcji RTA po wzroście przewodności, aby uniknąć zanieczyszczenia solą. Parametry procedury odsalania wymieniono w Tabeli 1.
4. Skoncentrować eluowaną frakcję RTA przy 10 0 x g i 4 °C przez 30-180 min przy użyciu kolumny wirówkowej z granicą odcięcia 10 kDa do końcowej objętości 1-2 mL i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.
   Uwaga: Nie zamrażać próbki, ponieważ mrożenie prowadzi do całkowitej utraty aktywności RTA.
5. Wyznaczyć stężenie białka za pomocą konwencjonalnego zestawu do oznaczania białek. Stężenie białka powinno mieścić się w zakresie 1-1,5 mg/mL.
   UWAGA: RTA ma tendencję do wytrącania się, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie (>5 mg/mL).

3. Transformacja drożdży i usuwanie ściany komórkowej

1. Wykonaj transformację szczepu dzikiego lub wybranych mutantów delecyjnych drożdży plazmidem reporterowym GFP pRS315-K28_SP-GFP⁶ przy użyciu standardowych metod transformacji octanem litu¹⁴. Inkubuj komórki na płytkach z glukozą z brakiem leucyny (d/o) (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% Yeast Nitrogen Base (YNB) i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni w celu selekcji pozytywnych klonów.
2. Wyselekcjonuj 3 różne klony drożdży z każdej płytki i zaszczep je w 10 mL pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) przy 20 rpm i 30 °C do osiągnięcia OD₆₀ = 1,0-2,0 (2-4 x 10⁷ komórek/mL).
   UWAGA: Tempo wzrostu różnych szczepów delecyjnych drożdży jest zróżnicowane. Monitoruj OD₆₀ za pomocą spektrofotometru.
3. Aby obliczyć wartości OD₆₀ , rozcieńcz próbki do OD₆₀ = 0,1-0,3 (rozcieńczenia od 1:5 do 1:10) i zmierz OD₆₀₀ w spektrofotometrze. Jako referencję zastosuj H₂O uzupełnioną o odpowiadającą ilość pożywki z rafinozą z brakiem leucyny. Na koniec resuspenduj OD₆₀ = 125 w 5 mL sterylnej wody (5 x 10⁸ komórek/mL).
4. Odwiruj komórki w temperaturze 25 °C przez 5 min przy 10 0 x g, przemyj komórki dwukrotnie 5 mL sterylnej wody i resuspenduj komórki w 50 mL buforu do sferoplastowania (0,8 M sorbitolu, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl₂, 2 mM ditiotreitolu (DTT) i 20 µg/mL enzymu litycznego).
5. Inkubuj 50 mL hodowli przy 10 rpm i 30 °C przez 90 min. Opcjonalnie: Monitoruj tworzenie sferoplastów co 15 min za pomocą mikroskopii kontrastowej. Pod mikroskopem komórki powinny mieć ciemny, półprzezroczysty szary kolor. Komórki jasne (refrakcyjne) są niedostatecznie strawione, natomiast „duchy” (blado szare komórki z niewielką lub żadną strukturą wewnętrzną) są nadmiernie strawione.
6. Sprawdź wydajność preparatyki sferoplastów dla każdej próbki.
   1. Po zakończeniu kroku 3.5 zmieszaj 4 µL sferoplastowanej hodowli 50 mL z 496 µL buforu do sferoplastowania (około 2 × 10⁶ sferoplastów) i odwiruj przez 10 min przy 40 x g.
   2. Resuspenduj osad w 10 mL destylowanej H₂O, wymieszaj próbkę na wortexie przez 30 s i wysiej 10 µL próbki na płytki z glukozą z brakiem leucyny (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny).
   3. Inkubuj komórki przez 3 dni w temperaturze 30 °C. Policz całkowitą liczbę wyrośniętych kolonii komórkowych na płytce. Do ewaluacji danych wykorzystaj tylko próbki o wydajności wyższej niż 98% (całkowita liczba kolonii komórkowych <40 kolonii/płytkę).
7. Odwiruj komórki z kroku 3.5 przy 40 x g i 4 °C przez 10 min i przemyj komórki dwukrotnie 5 mL stabilizowanej pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (0,8 M sorbitolu, 2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny). Resuspenduj komórki w 5 mL stabilizowanej pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (1 x 10⁸ komórek/mL) i użyj ich bezpośrednio do pomiarów w teście reporterowym GFP (Sekcja 4).

4. Pomiar testu reporterowego GFP w płytkach 96-dołkowych

1. Przenieś sferoplasty komórek drożdży otrzymane w kroku 3.7 do płytek 96-dołkowych (200 µL/well).
2. Dodaj 70 µL podłoże z ustabilizowaną leucyną bez rafinozy zawierające kontrolę negatywną (eluat z Ni²⁺-oczyszczony metodą powinowactwa lizat komórkowy z indukowanych IPTG E. coli komórki wykazujące ekspresję pustego wektora) lub oczyszczone RTA w końcowym stężeniu RTA wynoszącym 5 µM (odpowiadające stężeniu 160 g/L RTA) w każdej dołku.
3. Niezwłocznie dodać 30 µL stabilizowany roztwór galaktozy (30% galaktozy, 0,8 M sorbitolu) w celu indukcji ekspresji GFP i następnego rozpoczęcia pomiaru.
   UWAGA: Należy przeprowadzić co najmniej 3 powtórzenia techniczne dla każdego eksperymentu oraz 3 powtórzenia biologiczne dla każdego szczepu drożdży.
4. Po zakończeniu przygotowania próbek (kroki 4.1-4.3), umieść płytkę 96-dołkową w czytniku fluorescencji i rozpocznij pomiar. Użyj zestawu filtrów 475/509 nm wymaganego do detekcji fluorescencji GFP. Wykonaj pomiary przy 30 °Cprzy 120 obr./min i średnicy wstrząsania 1 mm w oknie czasowym 20 h (interwały pomiarowe co 10 min).
   UWAGA: Zestaw filtrów GFP jest zazwyczaj dostępny we wszystkich systemach odczytu. Temperaturę, okno czasowe, odstępy między pomiarami oraz stężenie RTA można dostosować do własnych potrzeb. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 4.
5. Opcjonalnie: W celu kontroli jakości w pomiarze można zastosować dodatkowe kontrole wewnętrzne. Kontrolę negatywną przygotowuje się poprzez dodanie 30 µL stabilizowane pożywka leucynowa d/o z rafinozą zamiast 30% galaktozy (brak indukcji GFP). Dodatkowo dodać 70 µL roztworu G418 stabilizowanego 0,8 M sorbitolem (300 µg/mL). Inhibitor translacji białek G418 służy jako kontrola pozytywna hamowania syntezy białek, ponieważ zapobiega on ekspresji GFP w drożdżach.
6. Oblicz względną fluorescencję GFP w procentach dla punktu czasowego 20 h zgodnie z poniższym równaniem (patrz Rysunek 4A):     gdzie NC to kontrola negatywna
   1. Alternatywnie, wyznacz względną fluorescencję GFP dla każdego punktu pomiarowego (w tym przypadku co 10 min, patrz również krok 4.4), korzystając z powyższego równania. Jak pokazano w Rycina 4Bstworzyć wykres, nanosząc natężenia fluorescencji GFP (oś y) w funkcji czasu (oś x).

Wyniki

Ogólny przebieg protokołu opisanego w niniejszej pracy przedstawiono na Rysunku 1, co w przybliżeniu podsumowuje poszczególne etapy skutecznego oczyszczania RTA oraz następujący po nim eksperyment z wykorzystaniem testu reporterowego GFP. Bardziej szczegółowy opis każdego z etapów znajduje się w protokole. Rysunek 2 ilustruje oczekiwany wynik skutecznego oczyszczania RTA za pomocą chromatografii powinowactwa (

Dyskusja

Podczas wykonywania powyższego protokołu zalecamy następujące sugestie, aby osiągnąć pomyślny wynik eksperymentu.

W przypadku ekspresji białek heterologicznych ważne jest, aby nie przekraczać stężenia IPTG wynoszącego 1 mM. Stężenia IPTG >1 mM hamują indukowaną przez promotor ekspresję RTA i prowadzą do obniżenia wydajności toksyn. Ponadto komórki nie powinny być hodowane w temperaturach wyższych niż 28 °C, aby zapobiec tworzeniu się ciał inkluzyjnych, nieefektywnemu fałdowaniu i inaktywacji t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczepy bakteryjne i drożdżowe
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 delecja mutanty	Dharmacon	YSC1054	cała kolekcja
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Plazmidy używane w tym protokole
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
Zymolyaza 20T	USBio	Z1000.250	enzym lityczny do ściany komórkowej usuwanie
Pożywki bulionowej LB	Thermo Scientific 10855021		15 g agar został dodany do produkcji płytek
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Siarczan amonu	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Dodatki do mieszanek drożdżowych bez leucyny	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-rafinoza	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galaktoza	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE linijka wstępnie barwiona	Fermentas	26616	drabinka białkowa używana do analizy zachodniej
Nazwa	Company	Numer katalogowy	>Komentarze
Materiał do oczyszczania RTA, odsalania i pomiarów czytnikowych
Spektrofotometr Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		stary model, dostępne inne modele
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	stary model, już niedostępny
& Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific 28406266		Produkt został wycofany i wymieniony
Kolumna HisTRAP HP	GE Healthcare	17-5248-02
Kolumna odsalająca HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Filtr sterylny Midisart	Sartorius	16534K	0,2 i mikro; m Zestaw
oznaczania białek BCA	Pierce	23225
Zestaw do oznaczania 660 nm	Thermo Scientific	22660
96-dołkowe płytki	Thermo Scientific	260860
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Przeciwciała (opcjonalnie)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	przeciwciało pierwszorzędowe; rozcieńczenie 1:1,000
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	, rozcieńczenie 1:10,000

11811031 do Przeciwciało drugorzędowe