Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Podsumowanie

W manuskrypcie opisujemy użycie testu reporterowego fluorescencji na bazie drożdży do identyfikacji składników komórkowych zaangażowanych w procesy transportu i zabijania podjednostki cytotoksycznej A toksyny roślinnej rycyny (RTA).

Streszczenie

Bakteryjne i roślinne toksyny A/B wykorzystują naturalne szlaki transportowe w komórkach eukariotycznych, aby dotrzeć do swojego wewnątrzkomórkowego celu w cytozolu i ostatecznie zabić. Takie toksyny A/B na ogół składają się z enzymatycznie aktywnej podjednostki A (np. toksyny rycynowej A (RTA)) i jednej lub więcej podjednostek B wiążących komórki, które są odpowiedzialne za wiązanie toksyny z określonymi receptorami na powierzchni komórki. Nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób toksyny A/B są zdolne do skutecznego odurzania komórek, pomogła naukowcom zrozumieć podstawowe mechanizmy komórkowe, takie jak endocytoza i wewnątrzkomórkowe sortowanie białek w wyższych komórkach eukariotycznych. Z medycznego punktu widzenia ważne jest również zidentyfikowanie głównych szlaków transportu toksyn w celu znalezienia odpowiednich rozwiązań terapeutycznych dla pacjentów lub ostatecznie opracowania terapeutycznych zastosowań opartych na toksynach w terapii raka.

Ponieważ analizy całego genomu transportu toksyn A/B w komórkach ssaków są skomplikowane, czasochłonne i kosztowne, przeprowadzono kilka badań nad transportem toksyny A/B w modelowym organizmie drożdży Saccharomyces cerevisiae. Pomimo tego, że są mniej złożone, podstawowe procesy komórkowe w drożdżach i wyższych komórkach eukariotycznych są podobne i bardzo często wyniki uzyskane w drożdżach można przenieść na sytuację ssaków.

Tutaj opisujemy szybki i łatwy w użyciu test reporterowy do analizy wewnątrzkomórkowego transportu RTA w drożdżach. Istotną zaletą nowego testu jest możliwość zbadania nie tylko retrotranslokacji RTA z retikulum endoplazmatycznego (ER) do cytozolu, ale także endocytozy i wstecznego transportu toksyn z błony komórkowej do ER. Test wykorzystuje plazmid reporterowy, który umożliwia pośredni pomiar toksyczności RTA poprzez emisję fluorescencyjną białka zielonej fluorescencji (GFP) po translacji in vivo. Ponieważ RTA skutecznie zapobiega inicjacji biosyntezy białek poprzez deprydację 28S rRNA, test ten umożliwia identyfikację białek komórek gospodarza zaangażowanych w wewnątrzkomórkowy transport RTA poprzez wykrywanie zmian w emisji fluorescencji.

Wprowadzenie

Pacjenci cierpiący na infekcje wywołane przez bakterie wytwarzające toksyny stanowią poważne obciążenie medyczne i finansowe dla każdego systemu opieki zdrowotnej, zwłaszcza że nadal w dużej mierze brakuje skutecznych metod leczenia. Aby opracować nowe strategie terapeutyczne, należy w pełni zrozumieć złożone mechanizmy zatrucia istotnymi z medycznego punktu widzenia toksynami A/B, takimi jak toksyna, toksyna Shiga lub rycyna, w oparciu o nowe, potężne testy, które muszą zostać wdrożone.

W ostatnich latach kilka badań próbowało analizować transport toksyn A/B w komórkach drożdży i ssaków przy użyciu czasochłonnych i kosztownych metod, takich jak znakowanie toksyn radioaktywnych^1,2 oraz podejścia przesiewowe oparte na siRNA³. W niektórych przypadkach transport toksyn został uwidoczniony in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po chemicznym i/lub genetycznym sprzężeniu poszczególnych podjednostek toksyny z fluoroforami, kropkami kwantowymi lub białkami fluorescencyjnymi^4,5. Niestety, takie modyfikacje często prowadzą do nieaktywnych i/lub zmienionych naturalnych właściwości toksyn. Innym eleganckim sposobem pośredniego odpowiadania na różnorodne pytania naukowe jest zastosowanie systemów reporterowych opartych na enzymach takich jak lacZ, lucyferazy lub białka fluorescencyjne (np. GFP lub Discosoma sp. czerwone białko fluorescencyjne (dsRed)).

W tym manuskrypcie opisany jest prosty protokół, który identyfikuje składniki komórkowe niezbędne do wewnątrzkomórkowego transportu pozakomórkowego RTA u S. cerevisiae. W ten sposób plazmid reporterowy fluorescencji zawierający N-końcowy sygnał importu ER, po którym następuje GFP, działa jako czujnik biosyntezy białek, który pośrednio mierzy hamowanie translacji białek za pośrednictwem RTA przez emisję fluorescencji GFP po translacji in vivo⁶. W przypadku, gdy endocytoza RTA i/lub transport wewnątrzkomórkowy są negatywnie (lub pozytywnie) dotknięte w określonym mutancie delecji drożdży w porównaniu z typem dzikim, można to wykryć poprzez wzrost (lub spadek) emisji fluorescencji GFP⁶.

Do tej pory wszystkie metody analizujące transport RTA w komórkach drożdży ograniczały się do procesu retrotranslokacji RTA z ER-do cytozolu. W takim sztucznym systemie RTA zawierający sygnał importu ER jest wyrażany z indukowalnego promotora, co skutkuje samobójczym fenotypem^1,7. Chociaż w konfiguracji eksperymentalnej opisanej w tym manuskrypcie brakuje również podjednostki B wiążącej komórki, a zatem nie reprezentuje ona w pełni naturalnej sytuacji zatrucia holotoksyną rycyny⁸, transport toksyny z błony komórkowej przez aparat Golgiego do ER może być ściśle naśladowany w tym nowatorskim teście. Co ciekawe, wstępne wyniki uzyskane w badaniu pilotażowym wskazują, że szlaki przemytu wykorzystywane przez RTA wykazują uderzające podobieństwa do drogi zatrucia holotoksyną rycyny.

Podsumowując, opisana metoda może być użyta do określenia specyficznej roli wybranych białek komórkowych w endocytozie RTA i transporcie drożdży. Co więcej, ten eksperymentalny układ można łatwo dostosować do innych toksyn inaktywujących rybosomy wytwarzanych i wydzielanych z różnych gatunków drożdży i bakterii, takich jak zymocyna lub toksyna Shiga.

Protokół

UWAGA: Przegląd ogólnego eksperymentalnego przepływu pracy jest przedstawiony w Rysunek 1.

Uwaga: RTA jest wysoce toksyczny dla ludzi. Wymagane jest zezwolenie laboratorium bezpieczeństwa S2 (odpowiednik poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2). Prosimy o noszenie rękawiczek podczas całego eksperymentu.

1. Heterologiczna ekspresja RTA oznaczonego przez His-taga w Escherichia coli

1. Przekształć komórki E. coli z ekspresją plazmidu pET24-RTA_(His)6 lub pustym wektorem pET24a⁽⁺⁾ przy użyciu standardowych protokołów elektroporacji^9,10. Komórki zawierające pusty plazmid służą jako kontrola ujemna.
2. Po wybraniu dodatnich klonów na płytkach LB zawierających kanamycynę (100 μg/ml), należy zaszczepić komórki zawierające plazmid ekspresji RTA lub pusty wektor w pożywce 5 ml LB_kan (pożywka LB ze 100 μg/ml kanamycyny) i inkubować w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 24 godziny.
3. Uzupełnić 1 l LB_{kan pożywką} 5 ml kultury wstępnej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 220 obr./min, aż komórki osiągną OD₆₀₀ 0,8-1,0 (około 3-4 h). Następnie obniżyć temperaturę hodowli do 28 °C i przygotować 1 M roztworu podstawowego izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w_H2O.
4. Indukować ekspresję RTA E. coli poprzez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM.
5. Po 3,5 h w temperaturze 28 °C i 220 obr./min, zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g i 4 °C przez 10 min, przepłukać osad dwukrotnie 5 ml buforu wiążącego (500 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,4) w temperaturze 10 000 x g i 4 °C przez 10 min, i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu wiążącego.
   UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wstrzymany, a komórki mogą być przechowywane w temperaturze 80 °C przez kilka dni.

2. Oczyszczanie RTA oznaczonego przez Hisa za pomocą chromatografii powinowactwa

1. Sonizacja komórek na lodzie przy użyciu następującego protokołu: impuls 15 s (20 mikronów), przerwa 30 s. Powtórz ten krok pięć razy.
2. Odwirować lizat komórkowy przy 21 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut i przefiltrować supernatant za pomocą sterylnego systemu filtrów strzykawkowych (wielkość porów 0,2 μm).
   UWAGA: Granulki komórek w próbkach, które zostały poddane pomyślnej sonikacji, mają przezroczyste obwódki.
3. Użyj automatycznego systemu oczyszczania wyposażonego w kolumnę powinowactwa na bazie Ni²⁺ o pojemności 5 ml, aby oczyścić frakcję RTA znakowaną przez Hisa z sterylnie przefiltrowanego supernatantu E. coli. Ogólnie rzecz biorąc, należy użyć prędkości elucji 1 ml / min i schłodzić cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyn i utracie aktywności toksyn.
   UWAGA: Parametry skutecznego oczyszczania RTA są wymienione w Tabeli 1. Patrz także Becker i wsp. Więcej informacji⁹.
   1. Krótko zrównoważyć kolumnę powinowactwa z 20 ml buforu wiążącego, aby usunąć bufor magazynowy. Nanieść sterylnie przefiltrowany supernatant na kolumnę powinowactwa za pomocą strzykawki.
   2. Przepłukać kolumnę 25-35 ml buforu wiążącego w celu usunięcia niezwiązanych białek z kolumny. Etap prania należy wykonywać do momentu, gdy absorpcja promieniowania UV przy 280 nm będzie zbliżona do początkowej wartości promieniowania UV.
   3. Elutowa frakcja RTA związana w 20-35 ml buforu elucyjnego (500 mM imidazolu, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) i przechowywać próbkę na lodzie (Rysunek 2A i Rysunek 2B).
      UWAGA: Elucja frakcji RTA charakteryzuje się wzrostem absorpcji UV. Należy pamiętać, aby zbierać wyłącznie tę frakcję, aby zapobiec zanieczyszczeniu niespecyficznymi białkami związanymi.
   4. Użyj 20 μl eluowanych próbek, aby przeprowadzić barwienie Coomassie Blue¹¹ lub analizę Western blot^12,13 (Opcjonalnie). Użyj pierwszorzędowych przeciwciał anty-He (1:1,000) i drugorzędowych przeciwciał anty-mysich IgG-HRP (1:10,000) do wykrycia RTA i sprawdzenia czystości próbki (Rysunek 3).
   5. Odsalać eluowaną frakcję RTA na 5 ml kolumnie odsalającej i równoważyć próbkę w 0,8 M sorbitolu.
      1. Zastąp kolumnę powinowactwa systemu oczyszczania kolumną odsalającą i najpierw zrównoważ kolumnę z 20 ml 0,8 M sorbitolu.
      2. Nałożyć eluowaną frakcję RTA do kolumny za pomocą strzykawki. Przemyć kolumnę 100 ml 0,8 M sorbitolu i wymyć odsoloną frakcję RTA w probówce o pojemności 15 ml, gdy tylko absorpcja UV zacznie wzrastać (Rysunek 2C).
      3. Przechowywać eluowaną frakcję RTA w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Pobieranie próbek frakcji RTA należy natychmiast zatrzymać wraz ze wzrostem przewodności, aby uniknąć zanieczyszczenia solą. Parametry procedury odsalania są wymienione w tabeli 1.
4. Zagęścić eluowaną frakcję RTA w temperaturze 10 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30-180 minut za pomocą odciętej kolumny wirowej o masie 10 kDa do końcowej objętości 1-2 ml i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie.
   Uwaga: Nie zamrażaj próbki, ponieważ zamrożenie prowadzi do całkowitej utraty aktywności RTA.
5. Określ stężenie białka za pomocą konwencjonalnego zestawu do oznaczania białka. Stężenie białka powinno mieścić się w przedziale 1-1,5 mg/mL.
   UWAGA: RTA ma tendencję do wytrącania się, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie (>5 mg/ml).

3. Przemiana drożdży i usuwanie ściany komórkowej

1. Przekształć mutanty delecji drożdży typu dzikiego lub wyselekcjonowanego za pomocą plazmidu reporterowego GFP pRS315-K28_SP-GFP⁶ przy użyciu standardowych metod transformacji octanu litu¹⁴. Inkubuj komórki na płytkach glukozy z odpadaniem leucyny (d / o) (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% drożdżowej zasady azotowej (YNB) i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni w celu pozytywnej selekcji klonów.
2. Wybierz 3 różne klony drożdży z każdej płytki i zaszczep je w 100 ml pożywki rafinozowej z leucyną (2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) przy 220 obr./min i 30 °C do OD₆₀₀ = 1,0-2,0 (2-4 x 10⁷ komórek/ml).
   UWAGA: Wzrost komórek różnych szczepów delecji drożdży jest różny. Monitoruj OD₆₀₀ za pomocą spektrofotometru.
3. Aby obliczyć wartości OD₆₀₀, rozcieńczyć próbki do OD₆₀₀ = 0,1-0,3 (rozcieńczenia 1:5 do 1:10) i zmierzyć OD₆₀₀ w spektrofotometrze. Jako odniesienie należy użyć_H2Ouzupełnionego odpowiednią ilością leucyny d/o pożywki rafionowej. Na koniec ponownie zawiesić OD₆₀₀ = 125 w 5 ml sterylnej wody (5 x 10⁸ komórek/ml).
4. Odwirować komórki w temperaturze 25 °C przez 5 minut przy 10 000 x g, umyć komórki dwukrotnie 5 ml sterylnej wody i ponownie zawiesić komórki w 50 ml buforu sferoplastycznego (0,8 M sorbitolu, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl₂, 2 mM ditiotreitol (DTT) i 200 μg/ml enzymu litycznego).
5. Inkubować kulturę o objętości 50 ml przy 100 obr./min i w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Opcjonalnie: Monitorować tworzenie się sferoplastów co 15 minut za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Pod mikroskopem komórki powinny mieć ciemny, półprzezroczysty szary kolor. Jasne (ogniste) komórki są niedostatecznie trawione, podczas gdy duchy (bladoszare komórki z niewielką, jeśli w ogóle, strukturą wewnętrzną) są nadmiernie trawione.
6. Sprawdź skuteczność preparatu sferoplastowego dla każdej próbki.
   1. Po zakończeniu kroku 3.5 wymieszać 4 μl sferoplastyzowanej kultury o pojemności 50 ml z 496 μl buforu sferoplastowego (około 2 × 10⁶ sferoplastów) i wirować przez 10 minut przy 400 x g.
   2. Zawiesić osad w 10 ml destylowanym_H2O, wirować próbkę przez 30 s i rozlać 10 μl próbki na płytki z leucyną d/o glukozy (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny).
   3. Inkubować komórki przez 3 dni w temperaturze 30 °C. Policz całkowitą liczbę wyhodowanych kolonii komórek na płytce. Do oceny danych należy używać wyłącznie próbek o wydajności wyższej niż 98% (całkowita liczba kolonii komórek <40 kolonii/płytkę).
7. Odwirować komórki z kroku 3.5 w temperaturze 400 x g i 4 °C przez 10 minut i dwukrotnie przepłukać komórki 5 ml stabilizowanej pożywki rafinozowej leucyny d/o (0,8 M sorbitolu, 2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki drop-out bez leucyny). Zawiesić komórki w 5 ml stabilizowanej pożywki rafinozowej z leucyną d / o (1 x 10 8 komórek / ml) i bezpośrednio użyć komórek do pomiarów reporterowych GFP (sekcja 4).

4. Pomiar testowy reporterowy GFP na płytkach 96-dołkowych

1. Wysiewać sferoplasty komórek drożdży otrzymane w kroku 3.7 na płytki 96-dołkowe (200 μl/dołek).
2. Dodać 70 μl stabilizowanej pożywki rafinozowej z leucyny d / o zawierającej kontrolę ujemną (eluat oczyszczonego lizatu komórkowego o powinowactwie do Ni²⁺ z komórek E. coli indukowanych przez IPTG, wykazujących ekspresję pustego wektora) lub oczyszczonego RTA w końcowym stężeniu RTA 5 μM (odpowiadającym 160 g/l RTA) do każdego dołka.
3. Natychmiast dodać 30 μl stabilizowanego roztworu galaktozy (30% galaktozy, 0,8 M sorbitolu) w celu wywołania ekspresji GFP, a następnie rozpocząć pomiar.
   UWAGA: Wykonaj co najmniej 3 kontrpróby techniczne na eksperyment i 3 kontrpróby biologiczne na szczep drożdży.
4. Po zakończeniu przygotowania próbki (kroki 4.1-4.3) umieścić 96-dołkową płytkę w czytniku fluorescencyjnym i rozpocząć pomiar. Należy użyć zestawu filtrów 475/509 nm wymaganych do detekcji fluorescencji GFP. Pomiary należy wykonywać w temperaturze 30 °C, przy prędkości 120 obr./min i średnicy wytrząsania 1 mm w oknie czasowym 20 godzin (odstępy między pomiarami 10 min).
   UWAGA: Zestaw filtrów GFP jest zwykle dostępny we wszystkich systemach czytników. Temperatura, okno czasowe, interwały pomiarowe i stężenie RTA mogą być dostosowane do własnych potrzeb. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4.
5. Opcjonalnie: Stosowanie dodatkowych kontroli wewnętrznych w pomiarze w celu kontroli jakości. Przygotować kontrolę ujemną, dodając 30 μl stabilizowanej leucyny d/o rafinozy zamiast 30% galaktozy (bez indukcji GFP). Dodatkowo dodać 70 μl 0,8 M roztworu G418 stabilizowanego sorbitolem (300 μg/ml). Inhibitor translacji białek G418 służy jako pozytywna kontrola hamowania białek, ponieważ zapobiega ekspresji GFP w drożdżach.
6. Oblicz względną fluorescencję GFP w procentach dla punktu czasowego 20 godzin zgodnie z następującym równaniem (patrz Rysunek 4A): Gdzie NC jest kontrolą ujemną
   1. Alternatywnie, należy wyznaczyć względną fluorescencję GFP dla każdego punktu pomiarowego (w tym przypadku 10 minut, patrz również krok 4.4) za pomocą powyższego równania. Jak pokazano w Rysunek 4B, utwórz wykres, osuszając intensywność fluorescencji GFP (oś y) w czasie (oś x).

Wyniki

Ogólny przebieg protokołu opisanego w tym manuskrypcie jest zilustrowany w Rysunek 1, z grubsza podsumowując poszczególne kroki do udanego oczyszczania RTA i późniejszego eksperymentu z testem reporterowym GFP. Bardziej szczegółowy opis każdego kroku można znaleźć w protokole. Rysunek 2 ilustruje oczekiwany wynik udanego oczyszczania RTA za pomocą chromatografii powinowactwa (Rysunek 2A) i kontroli p...

Dyskusja

Podczas wykonywania powyższego protokołu zalecamy następujące sugestie, aby osiągnąć pomyślny wynik eksperymentu.

W przypadku ekspresji białek heterologicznych ważne jest, aby nie przekraczać stężenia IPTG wynoszącego 1 mM. Stężenia IPTG >1 mM hamują indukowaną przez promotor ekspresję RTA i prowadzą do obniżenia wydajności toksyn. Ponadto komórki nie powinny być hodowane w temperaturach wyższych niż 28 °C, aby zapobiec tworzeniu się ciał inkluzyjnych, nieefektywnemu fałdowaniu i inaktywacji t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczepy bakteryjne i drożdżowe
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 delecja mutanty	Dharmacon	YSC1054	cała kolekcja
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Plazmidy używane w tym protokole
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
Zymolyaza 20T	USBio	Z1000.250	enzym lityczny do ściany komórkowej usuwanie
Pożywki bulionowej LB	Thermo Scientific 10855021		15 g agar został dodany do produkcji płytek
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Siarczan amonu	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Dodatki do mieszanek drożdżowych bez leucyny	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-rafinoza	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galaktoza	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE linijka wstępnie barwiona	Fermentas	26616	drabinka białkowa używana do analizy zachodniej
Nazwa	Company	Numer katalogowy	>Komentarze
Materiał do oczyszczania RTA, odsalania i pomiarów czytnikowych
Spektrofotometr Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		stary model, dostępne inne modele
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	stary model, już niedostępny
& Auml; KTAPurifier	Thermo Scientific 28406266		Produkt został wycofany i wymieniony
Kolumna HisTRAP HP	GE Healthcare	17-5248-02
Kolumna odsalająca HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Filtr sterylny Midisart	Sartorius	16534K	0,2 i mikro; m Zestaw
oznaczania białek BCA	Pierce	23225
Zestaw do oznaczania 660 nm	Thermo Scientific	22660
96-dołkowe płytki	Thermo Scientific	260860
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Przeciwciała (opcjonalnie)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	przeciwciało pierwszorzędowe; rozcieńczenie 1:1,000
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	, rozcieńczenie 1:10,000