Artykuł metodologiczny

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

DOI:

10.3791/56589

⸱

8 stycznia 2018

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), normalne i nowotworowe komórki nabłonkowe ściśle komunikują się z komórkami krwiotwórczymi i niekrwiotwórczymi, co znacznie wpływa na normalną homeostazę tkanek i wynik choroby. W raku piersi makrofagi związane z nowotworem (TAM) odgrywają kluczową rolę w progresji choroby, przerzutach i nawrocie; Dlatego zrozumienie mechanizmów chemoprzyciągania monocytów do mikrośrodowiska guza i ich interakcji z komórkami nowotworowymi jest ważne dla kontrolowania choroby. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis trójwymiarowego (3D) systemu kohodowli ludzkich komórek raka piersi (BrC) i ludzkich monocytów. Komórki BrC wytwarzały wysokie podstawowe poziomy regulowanej aktywacji, normalnej ekspresji i wydzielania limfocytów T (RANTES), białka chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (G-CSF), podczas gdy w kohodowli z monocytami cytokiny prozapalne Interleukina (IL)-1 beta (IL-1β) i IL-8 zostały wzbogacone o metaloproteinazy macierzy (MMP)-1, MMP-2 i MMP-10. To mikrośrodowisko zrębu guza sprzyjało oporności na anoikis w strukturach podobnych do MCF-10A 3D acini, chemoprzyciąganiu monocytów i inwazji agresywnych komórek BrC. Przedstawione tutaj protokoły stanowią przystępną cenowo alternatywę dla badania komunikacji wewnątrz guza i są przykładem ogromnego potencjału, jaki zapewniają systemy komórkowe 3D in vitro do badania specyficznych cech biologii guza związanych z agresją guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia nowotworów jest o wiele bardziej skomplikowana, niż wcześniej sądzono. Coraz więcej dowodów pokazuje, że komórki nowotworowe to coś więcej niż zwykła masa niekontrolowanych rozchodzących się komórek; Wydaje się raczej, że różne komórki nowotworowe pełnią różne funkcje, wykazując wysoką organizację i hierarchię w obrębie nowotworu1. Komórki nowotworowe są również w ścisłej komunikacji z komórkami nieprzekształconymi: makrofagi, fibroblasty, limfocyty, adipocyty, komórki śródbłonka i inne komórki są zanurzone w białkach rusztowania i polisacharydach, które tworzą ECM. Między przekształconymi i nieprzekształconymi komórkami oraz z ECM ustanawiane są liczne bezpośrednie i pośrednie interakcje, które wywierają silny wpływ na wynik choroby2,3. W konkretnym przypadku BrC szczególnie ważne jest przeanalizowanie komunikacji komórek BrC z TAM, biorąc pod uwagę, że stwierdzono, że TAM odgrywają kluczową rolę w ewolucji guza, zwiększając ryzyko przerzutów i nawrotu choroby4,5.

Aby przeanalizować interakcje wewnątrznowotworowe i ich możliwe wyniki, opracowano nowe podejścia 3D in vitro oparte na użyciu ekstraktów ECM, które zapewniają znacznie bardziej złożone mikrośrodowisko, bliższe rzeczywistości biologii nowotworu, w porównaniu do konwencjonalnych jednowarstwowych hodowli komórkowych, w których komórki rosną przyczepione do plastiku. Petersen i Bissell6 dostarczyli pierwszy model niezłośliwych i złośliwych komórek nabłonka sutka hodowanych na błonie podstawnej bogatej w lamininę i jako pierwsi opisali struktury organotypowe 3D, które odróżniają niezłośliwe ludzkie komórki nabłonkowe piersi od ich złośliwych odpowiedników. Dziesięć lat później model opracowany przez Debnatha, Muthuswamy'ego i Brugge7,8,9 dostarczył cennego narzędzia do wyjaśnienia szlaków biologicznych naruszonych podczas złośliwej transformacji gruczołów acini, takich jak powstawanie dużych acini w wyniku niekontrolowanej proliferacji, delokalizacja białek połączeń ścisłych jako dowód upośledzonej polaryzacji komórek oraz utrata światła acini w wyniku oporności komórek do anoikis, rodzaju zaprogramowanej śmierci komórki, która zachodzi w komórkach zależnych od zakotwiczenia, gdy odłączają się od otaczającego ECM. Modele Sameni, Jedeszko i Sloane skupiły się na obrazowaniu aktywności proteolitycznej komórek, która jest ściśle związana z inwazyjnością, kolejną kluczową cechą nowotworu złośliwego10,11,12. Modele te opierają się na matrycach białkowych zmieszanych z różnymi substratami białkowymi wygaszanymi fluorescencją (DQ-żelatyna, DQ-kolagen I i DQ-kolagen IV), w których sygnały fluorescencyjne wskazują na proteolityczną degradację kolagenu. Modele 3D są również wykorzystywane do badania właściwości komórek macierzystych zarówno komórek nietransformowanych, jak i nowotworowych, w których agregaty komórkowe, zwane również sferoidami, mogą być hodowane w zawiesinie lub w białkach podobnych do ECM, badając mechanizmy różnicowania komórek, asymetryczny podział komórek, przyleganie między komórkami i ruchliwość komórek13,14. Testy inwazji umożliwiają badanie wewnętrznej agresywności guza i identyfikację cząsteczek, które służą jako chemoatraktanty podczas procesu inwazyjnego15. Ogólnie rzecz biorąc, modele 3D stanowią przystępną cenowo dywersyfikację hodowli komórkowych in vitro, która lepiej odzwierciedla normalną i onkogenną morfogenezę tkanek.

Zaprojektowaliśmy system 3D do wspólnej hodowli komórek oparty na wyżej wymienionych modelach7,10,11, używając zarówno ludzkich komercyjnych linii komórkowych BrC o znanym potencjale agresywnym (typy luminalne i potrójnie ujemne), jak i komórek pierwotnych eksplantowanych od pacjentów z BrC. Najpierw opracowaliśmy model, w którym nieagresywne (MCF-7) lub agresywne (MDA-MB-231) komórki BrC były hodowane wspólnie z monocytami U937 w systemie 3D opartym na ekstrakcie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME), który umożliwiał bezpośrednie interakcje komórka-komórka. Te kokultury wykorzystano do określenia, w jaki sposób komunikacja między tymi dwiema liniami komórkowymi wpłynęła na transkrypcję zestawu genów związanych z agresywnym zachowaniem raka. Zaobserwowano znaczny wzrost transkryptu cyklooksygenazy-2 (COX-2), który zbiegł się ze zwiększoną produkcją jednego z jej produktów, prostaglandyny E2 (PGE2), co podkreśliło rolę stanu zapalnego w progresji raka. Zaobserwowano również zwiększoną transkrypcję MMP, która korelowała z większą proteolizą kolagenu, gdy agresywne komórki MDA-MB-231 były hodowane wspólnie z monocytami U937 w kulturach zawierających DQ-Collagen IV. Warto zauważyć, że nasze kohodowle nie potwierdziły założenia, że mechanizmy interakcji komórka-komórka są potrzebne do degradacji kolagenu. Sugerowało to raczej, że komunikacja między dwiema liniami komórkowymi była pośredniczona przez wydzielane cząsteczki. Co więcej, supernatanty zebrane z tych testów kokulturowych zawierały rozpuszczalne czynniki, które deorganizowały ziarniaki gruczołowe utworzone przez nieprzekształcone komórki MCF-10A13. Stwierdzono, że agresywne i pierwotne komórki BrC wydzielały podwyższony poziom cząsteczek chemotaktycznych monocytów MCP-1, GM-CSF i RANTES. W związku z tym nakreśliliśmy hodowlę 3D, w której komórki zostały oddzielone we wkładkach do hodowli komórkowych, aby zapobiec interakcjom komórka-komórka. Kultury te wykorzystano do rozwiązania problemu pośredniej komunikacji między komórkami BrC a monocytami. Do tych testów wykorzystano nieagresywne i agresywne komercyjne linie komórkowe BrC i pierwotne komórki BrC oraz trzy różne typy ludzkich monocytów: komercyjne komórki U937 i THP-1 oraz pierwotne monocyty (PM) wyizolowane z krwi obwodowej zdrowych dawców (wszystkie monocyty były używane w stanie nieaktywowanym). Zaobserwowano, że zwiększone stężenia cytokin zapalnych IL-1β i IL-8 są wzbogacone w kokulturze. Podobnie stwierdzono, że MMP-1, MMP-2 i MMP-10 były również zwiększone w kokulturach komórek BrC i monocytów, wzmacniając w ten sposób wcześniejsze ustalenia14. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono przebieg procesu izolacji i testowania pierwotnych komórek BrC w kulturach 3D punkt po punkcie wraz z reprezentatywnymi wynikami. Praca ta stanowi dobry przykład ogromnego potencjału, jaki dają systemy komórkowe 3D in vitro do badania określonych aspektów biologii nowotworu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki od pacjentów z BrC zostały pobrane z banku tkanek Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Badanie to zostało zatwierdzone przez komisje naukowe, etyczne i rewizyjne ds. bezpieczeństwa biologicznego Szpitala Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética en Investigación i Comité de Bioseguridad. Wszyscy pacjenci zostali włączeni prospektywnie i zostali poinformowani o charakterze badania: chętni do udziału podpisali pisemną świadomą zgodę przed pobraniem próbki i byli leczeni zgodnie z wytycznymi etycznymi i najlepszą praktyką kliniczną instytucji. Tożsamość uczestników została zanonimizowana na czas trwania badania. U pacjentów włączonych do badania rozpoznano inwazyjnego raka przewodowego stopnia histologicznego 2. stopnia i II stopnia klinicznego, bez wcześniejszego leczenia neoadjuwantowego przed resekcją tkanki. Wszyscy pacjenci byli płci żeńskiej w wieku średnio 56,8 lat (zakres od 42 do 75 lat)14.

1. 3D Hodowle komórkowe

  1. Zasiew: 0,1 x 106 komórek MCF-10A lub pierwotnych komórek BrC w kolbach hodowlanych o średnicy 25 cm2 z pożywką hodowlaną DMEM/F12 uzupełnioną 5% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 100 ng/ml toksyny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 10 μg/ml insuliny i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Nasiona 0,1 x 106 komercyjnych komórek BrC, komórek MCF-7 i komórek MDA-MB-231 w kolbach hodowlanych o długości 75 cm2 z pożywką hodowlaną DMEM/F12 uzupełnioną 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonym 5% CO2 .
  2. Po 48 godzinach przepłukać monowarstwę komórek 10 ml sterylnego soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS). Trypsynizować monowarstwę komórki 3 ml roztworu 0,05% trypsyny i 0,48 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 200 μl odpowiedniej surowicy, aby zatrzymać trypsynizację i 7 ml pożywki bez suplementów. Zawiesić komórki przez pipetowanie i usunąć podwielokrotność 10 μl, aby zliczyć komórki w komorze Neubauera.
  3. W każdym studzience systemu szkiełek 8-dołkowych rozprowadzić 40 μl czystej ECME, a następnie przeprowadzić 30-minutową inkubację w temperaturze 37 °C.
  4. W każdym dołku umieścić 800 komórek zawieszonych w 400 μl DMEM/F12 (bez czerwieni fenolowej) uzupełnionych jak w kroku 1.1, ale z następującymi zmianami: dla pierwotnych komórek BrC i komórek MCF-10A dodać 4 ng/ml EGF i 2% ECME; dla MCF-7 i MDA-MB-231 dodać tylko 2% ECME.
  5. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 . Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin.
  6. Rejestruj zmiany morfologiczne komórek co 24 godziny przez 15 dni za pomocą mikroskopu optycznego. Aby przeanalizować morfologię pierwotnych komórek BrC, komórki MCF-10A i MDA-MB-231 są dobrymi referencyjnymi liniami komórkowymi dla przykładów odpowiednio uporządkowanego tworzenia zrazików i nieuporządkowanych agresywnych struktur podobnych do raka.
  7. Uzyskaj obrazy komórek w mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu 100x i 200x i porównaj morfologię komórki z referencyjnymi liniami komórkowymi MCF-10A i MDA-MB-231 (Rysunek 1).

2. Pozyskiwanie pierwotnych komórek rakowych z tkanki nowotworowej

Uwaga: Aby uzyskać komórki nabłonkowe nowotworu, użyj tkanki z wyciętych guzów pierwotnych od pacjentów z BrC, którzy nie byli wcześniej leczeni neoadjuwantowo; unikaj obszarów martwiczych i pracuj z minimum 0,5cm3 tkanki nowotworowej.

  1. Wypłucz tkankę nowotworową sterylnym 1x PBS i mechanicznie zdezagreguj ją skalpelem na fragmenty o wielkości 1-2 mm.
  2. Trawić tkankę w sterylnej szklanej fiolce o pojemności 20 ml z nakrętką przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) z 2 ml następującego roztworu: zmieszać 1 mg/ml kolagenazy typu I i 100 U/ml hialuronidazy w pożywce DMEM/F12 zawierającej 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, ciągle mieszając.
  3. Przefiltruj powstałą zawiesinę przez wysterylizowane kawałki tiulu, aby wyeliminować duże kawałki niestrawionej tkanki. Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez wysterylizowaną membranę o porach 100 μm.
  4. Osadzać komórki w 430 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przemyć je dwukrotnie sterylnym 1x PBS. Hodowla komórek pierwotnych w pożywce DMEM/F12 uzupełniona 5% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 100 ng/ml toksyny, 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 10 μg/ml insuliny i 20 ng/ml EGF. Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 .
  5. Upewnij się, że wyizolowane komórki są komórkami nabłonkowymi ze standardowym protokołem immunocytochemii14. Przetestuj trzy markery nabłonkowe: panel cytokeratyn (PanCK), mucynę-1 (Muc-1) i cząsteczkę adhezyjną komórek nabłonka (EpCAM).

3. Izolowanie komórek PM od krwi obwodowej

  1. Pobrać około 40 ml krwi obwodowej od zdrowego ochotnika, rozcieńczyć krew w proporcji 1:3 sterylnym 1x PBS wolnym od endotoksyn i poddać ją separacji w gradinie gęstości.
  2. W stożkowej probówce umieścić 2 ml pożywki z polisacharozą i ditrizoesem sodu o gęstości 1,077 g/ml. Ostrożnie i powoli nałożyć 8 ml rozcieńczonej krwi. Wirować przez 30 minut, 765 x g przy wilgotności względnej. Użyć najmniejszej prędkości przyspieszania i zwalniania wirówki.
    nuta: Po odwirowaniu zostaną utworzone cztery warstwy od dołu do góry: osad czerwonych krwinek, warstwa pożywki gradientu gęstości, warstwa komórek jednojądrzastych (pojawia się jako drobny biały pierścień) i warstwa plazmy.
  3. Ostrożnie pobrać warstwę komórek jednojądrzastych z gradientu za pomocą sterylnej pipety Pasteura i przemyć je trzykrotnie 1x PBS, za każdym razem, a następnie wolniejsze wirowanie (430, 275 i 191 x g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Stosuj protokoły selekcji negatywnej, aby uniknąć aktywacji komórek. Przykładem takiego protokołu jest:
    1. Przemyć komórki jednojądrzaste raz buforowanym roztworem do przemywania (0,5% albuminy surowicy bydlęcej, 2 mM EDTA w 1x PBS). Policz komórki w komorze Neubauera i dostosuj je do gęstości 1 x 107 komórek/30 μl roztworu buforowego.
    2. Na każde 1 x 107 komórek dodać 10 μl odczynnika blokującego FcR i 10 μl koktajlu przeciwciał biotynowych monocytów, który zawiera anty-ludzkie CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123 i glikoforynę A (zawarte w zestawach komercyjnych).
    3. Wymieszać komórki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać dodatkowe 30 μl buforowanego roztworu do przemywania oraz 20 μl mikrogranulek antybiotyny (zawartych w zestawie); wymieszać komórki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Umyć komórki roztworem buforowym, odwirować przy 430 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 1,5 ml roztworu buforowego do separacji magnetycznej.
    5. Załadować zawiesinę komórek do wstępnie przepłukanej kolumny separacji magnetycznej i dodać 7 ml roztworu buforowego. Zebrać frakcję wzbogaconą w monocyty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, policzyć komórki, a jeśli nie są natychmiast hodowane, zamrozić monocyty o gęstości 2 x 106 komórek/1 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 50% FBS i 10% DMSO w temperaturze -80 °C.
      nuta: Unikaj używania monocytów po ponad 2 miesiącach zamrażania, ponieważ ich żywotność może być zagrożona.
  5. Utrzymuj kultury PM w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej 6% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 .
  6. Wykonuj każdy zestaw eksperymentów z wykorzystaniem PM od co najmniej dwóch różnych dawców niezależnie, ponieważ łączenie monocytów od różnych dawców może spowodować aktywację monocytów.

4. Ustanawianie kokultur 3D

  1. Współkultury 3D z interakcją pośrednią
    Uwaga:     Testy te należy wykonać na 24-dołkowych płaskodennych płytkach hodowlanych przy użyciu wkładek do hodowli komórek poliwęglanowych z membranami o wielkości porów 0,4 μm. W tym teście zarówno supernatanty, jak i komórki mogą być pobierane pod koniec eksperymentu.
    1. Hoduj 2 x 106 monocytów U937 i THP-1 w 10 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1% antybiotyku/antybiotyku przeciwgrzybiczego i hoduj świeże PM w uzupełnionej pożywce DMEM/F12 (jak wskazano wcześniej w kroku 3.5), w temperaturze 37 °C w nawilżonym środowisku 5% CO2 .
    2. Płytka 4 x 105 monocytów w 1 ml / studzienkę odpowiadającej im pożywki (uzupełnionej 2% ECME i 2% FBS dla monocytów U937 i THP-1 lub 2% ECME i 6% FBS dla PM).
    3. Umieścić wkładkę w każdym dołku i dodać 0,9 ml zawiesiny komórek 4 x 105 BrC do odpowiedniego podłoża (uzupełnionego 2% ECME i 2% FBS dla komercyjnych linii komórkowych lub 5% surowicy końskiej dla pierwotnych komórek BrC). Wymieniaj połowę wszystkich nośników co 48 godzin.
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 przez 5 dni i odzyskać supernatanty. Odzyskaj komórki przez trypsynizację, jeśli przeprowadzana jest późniejsza analiza.
    5. Uwzględnij kontrole poszczególnych kultur komórkowych za pomocą odpowiednich pożywek.
  2. Współkultury 3D z bezpośrednią interakcją
    1. Oznacz komórki BrC i monocyty różnymi barwnikami fluorescencyjnymi przed hodowlą komórkową, aby umożliwić niezależne sortowanie każdej linii komórkowej po hodowli w celu analizy mRNA i ekspresji białka. Stosuj dostępne w handlu pochodne kumaryny i rodaminy, które swobodnie przechodzą przez błonę komórkową żywych komórek. Ogólny protokół etykietowania jest następujący:
      1. Przygotować monowarstwę komórek BrC będących przedmiotem zainteresowania (2 × 10,6 komórek w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2) i zastąpić wzorcową pożywkę wystarczającą ilością wstępnie ogrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego (1:2 000 barwnika fluorescencyjnego w standardowej pożywce bazowej bez żadnego dodatku). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 . Odessać roztwór barwnika i delikatnie spłukać wystarczającą ilością 1x PBS. Odessać PBS i dodać pożywkę wzorcową.
      2. Trypsynizować monowarstwę komórki za pomocą 2 ml roztworu 0,05% trypsyny i 0,48 mM EDTA przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 200 μl FBS, aby zatrzymać trypsynizację i 7 ml odpowiedniej pożywki bez suplementów. Zawiesić komórki przez pipetowanie. Pobrać podwielokrotność 10 μl, aby policzyć komórki w komorze Neubauera. Kontynuuj protokół kohodowli po zliczeniu komórek.
      3. Osadzać komórki w dawce 430 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (wykonaj tę czynność najpierw, ponieważ monocyty rosną w zawiesinie). Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki 3 ml wstępnie podgrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego (1:2 000 barwnika fluorescencyjnego w standardowej pożywce bazowej bez dodatków). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 .
      4. Ponownie otocz komórki, wyrzuć roztwór roboczy barwnika i delikatnie ponownie zamieszaj z 5-7 ml 1x PBS. Ponownie zatopić osady, wyrzucić PBS i ponownie zawiesić komórki w 5-7 ml standardowej pożywki. Pobrać podwielokrotność 10 μl zawiesiny komórkowej, aby policzyć komórki w komorze Neubauera. Kontynuuj protokół kohodowli po zliczeniu komórek.
    2. Ustawić kokulturę w następujący sposób: rozprowadzić wystarczającą ilość ECME na dnie studzienki, aby utworzyć równą warstwę w każdym dołku 4-dołkowego systemu szkiełkowego. Płytka 20 μl zawiesiny jednokomórkowej zawierającej 5 ×10,5 znakowanych komórek BrC na studzienkę.
    3. Po 15-20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C dodać zawiesinę 2,5 x 105 znakowanych monocytów w 80 μl pożywki testowej (uzupełnionej 60% ECME).
    4. Pozostawić ECME do zestalenia się na 15-20 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 1 ml mieszaniny komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów w proporcji 1:1.
    6. Inkubuj kokultury w temperaturze 37 °C w nawilżonym środowisku o stężeniu 5% CO2 przez 24 godziny, 48 godzin lub 5 dni, aby śledzić zmiany w różnych punktach czasowych.
    7. Degradacja białek ECM w celu odzyskania komórek z hodowli. Odessać i odrzucić pożywkę, dodać 0,5 ml 1x PBS z 0,1% trypsyny i 0,25% EDTA i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji dodać 0,5 ml 1x PBS z 10% FBS, aby zneutralizować trypsynę, i ponownie zawiesić komórki przez energiczne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    8. Osadzać komórki w temperaturze 765 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml 1x PBS z 10% FBS. Powtórz ten krok raz.
    9. Zawiesinę komórek należy poddać sortowaniu komórek aktywowanemu fluorescencją (FACS) za pomocą odpowiedniego przyrządu. Upewnij się, że końcowe populacje są czyste w co najmniej 95%).
    10. Po posortowaniu umyj komórki sterylnym 1x PBS, granulem (430 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej) i ponownie zawieś w sterylnym 1x PBS. Komórki mogą być przetwarzane zgodnie z określonymi protokołami izolacji RNA lub analizy białek.
    11. Powtórz każdy test trzy razy, włączając hodowle 3D każdej pojedynczej linii komórkowej jako kontrole.
  3. Bezpośrednia interakcja kokultur 3D w celu oceny degradacji kolagenu
    1. Ustanowić kohodowle komórek 3D zgodnie z opisem w kroku 4.2, z dodatkowym krokiem polegającym na dodaniu 32,5 μg/ml kolagenu typu IV znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny do ECME. Końcowe stężenie kolagenu IV w ECME wynosi 0,5%. Hoduj kultury w 35-milimetrowym szkiełku nakrywkowym umieszczonym na szalce Petriego.
    2. Rozłóż warstwę 40 μl ECME na dnie szalki Petriego. Pozostawić ECME do zestalenia się w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 2,5 x 105 komórek BrC w 10 μl pożywki i pozwolić komórkom się uspokoić.
    4. Dodać zawiesinę 1,25 x 105 monocytów U937 w 40 μl pożywki testowej (uzupełnionej 60% DQ-Collagen IV znakowanego ECME).
    5. Pozostawić ECME do zestalenia się na 15-20 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Dodać 2 ml mieszaniny komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów w proporcji 1:1.
    7. Inkubować kokultury przez 5 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 . Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin.
    8. Przeanalizować emisję fluorescencji w konfokalnym mikroskopie skaningowym i zmierzyć zintegrowaną gęstość optyczną (IOD) na 50μm2 hodowli. Porównaj IOD z poszczególnymi kulturami i kulturą w czasie zero (Rysunek 2).

5. Analiza supernatantów z 3D Kokultur z Interakcją Pośrednią

  1. Po 5 dniach kohodowli odzyskaj supernatanty zarówno z górnych, jak i dolnych przedziałów kokultur 3D oraz z indywidualnych kontrolnych kultur 3D. Dobrze wymieszać każdy sklarowany składnik osadu przez pipetowanie. Porcję i przechowywać supernatant w temperaturze -20°C do czasu użycia (do jednego miesiąca).
    nuta: Przechowywać supernatanty w temperaturze -80°C, jeśli przechowywanie ma trwać dłużej niż jeden miesiąc.
  2. Analizuj supernatanty za pomocą platform testowych multipleksowania, testów immunoenzymatycznych (ELISA) lub testów immunologicznych opartych na kulkach, zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta.
    nuta: Supernatanty mogą być również analizowane za pomocą Western blot lub zagęszczane przez specjalne filtry porów w celu uzyskania frakcji białkowych wzbogaconych o rozmiar do przeprowadzenia analizy zymografii16,17. Alternatywnie, należy użyć supernatantów jako kondycjonowanych pożywek do innych eksperymentów, jak opisano poniżej. Kondycjonowane podłoże jest zwykle uzyskiwane z 5-dniowej hodowli (Rysunek 3).

6. Charakterystyka wpływu supernatantów z pierwotnych komórek BrC na tworzenie Acini i strukturę Acini

  1. W każdym dołku systemu szkiełek z 8 dołkami rozprowadzić 40 μl bazy ECME i pozostawić do zestalenia przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Umieścić 800 komórek/basenik MCF-10A w 400 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM/F12, jak opisano w kroku 1.2.
  3. Dodać 400 μl kondycjonowanej pożywki lub uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM/F12 z 20 ng/ml ludzkiej rekombinowanej IL-1β.
  4. Umieść szkiełko komory w szklanej szalce Petriego zawierającej szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną 2 ml PBS, aby stworzyć środowisko wilgotności.
  5. Pożywkę/supernatant wymieniać co 48 godzin.
  6. Rejestruj tworzenie się gruczołów acini co 24 godziny przez 14 dni za pomocą mikroskopu optycznego.
  7. Po 14 dniach hodowli wybarwić acini 100 μL 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w stężeniu 100 nM w 1x PBS w celu obserwacji jąder komórkowych. Inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając. Płukać trzykrotnie 1x PBS przez 5 minut, za każdym razem ciągle mieszając w temperaturze suchej masy. Preparaty zamontować za pomocą podłoża montażowego przeznaczonego do barwienia fluorescencyjnego. Uszczelnić przezroczystym środkiem polerskim i chronić przed światłem w temperaturze 4 °C.
  8. Przeanalizuj acini za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonując obrazy poprzecznych stosów na różnych głębokościach acini (Rysunek 4A, B, C).
  9. Wizualizuj różne białka komórkowe w acini za pomocą odpowiednich protokołów barwienia. Na przykład E-kadheryna została wybarwiona w celu oceny adhezji między komórkami, polaryzacji komórek i/lub tworzenia światła18 (Rysunek 4D).

7. Testy migracji

Uwaga: Wykonaj testy migracji U937, THP-1 i świeżych PM na 24-dołkowych płytkach hodowlanych z płaskim dnem, używając wkładek do hodowli komórek poliwęglanowych z membranami o wielkości porów 8 μm. Wcześniej wykazano, że chemokiny GM-CSF, MCP-1 i RANTES zostały wykryte w wysokich stężeniach w indywidualnych kulturach 3D agresywnych linii komórkowych BrC. Zaproponowano, że cytokiny te mają kluczowe znaczenie dla przyciągania monocytów do miejsca guza pierwotnego; Zostało to przetestowane w testach migracji z wykorzystaniem cytokin jako chemoatraktantów.

  1. Kultura U937, THP-1 lub świeże PM zgodnie z opisem w kroku 4.1.1.
  2. Raz przepłukać każdą wkładkę 200 μl RPMI 1640 bez surowicy w celu nawodnienia membrany.
  3. Napełnić go 50 μl zimnego ECME, umieścić wkładki na 24-dołkowej płaskiej płytce hodowlanej i pozostawić ECME do polimeryzacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Dodaj 180 μl RPMI bez FBS do górnej komory płytki. Dodaj do dolnej komory bez bulgotania 800 μl RPMI uzupełnionego 100 ng / ml GM-CSF, MCP-1 lub RANTES jako chemoatraktantu. Użyj pożywki bez cytokin jako kontroli negatywnej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu uzyskania gradientu chemokin.
  5. Umieścić 1,5 x 105 każdego rodzaju monocytów w sterylnej probówce, przemyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS i odwirować przy 430 x g przez 5 minut w RT. Ponownie zawiesić monocyty w 20 μl RPMI bez FBS, umieścić je we wkładkach i bardzo ostrożnie homogenizować zawiesinę komórkową (końcowa objętość górnej komory to 200 μL).
  6. Pozwól, aby migracja komórek postępowała przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 .
    nuta: Ponieważ monocyty nie przylegają, komórki wędrowne zwykle znajdują się w pożywce dolnego przedziału.
  7. Usunąć wstawki, pobrać pożywkę i policzyć komórki po 2, 4, 6 i 24 godzinach za pomocą komory Neubauera lub cytometru przepływowego; alternatywnie, zwłaszcza jeśli w pożywce nie znaleziono żadnych komórek, uzyskać obrazy dolnej części wkładek za pomocą aparatu cyfrowego. Do analizy wykorzystywana jest średnia liczba komórek z 3 losowych pól (przy 100-krotnym powiększeniu) (Rysunek 5).

8. Testy inwazji

Uwaga: Wykonaj testy inwazyjne komórek BrC na 24-dołkowych płytkach hodowlanych z płaskim dnem, używając wkładek do hodowli komórek poliwęglanowych z membranami o wielkości porów 8 μm. W naszych oryginalnych badaniach IL-8 była jedną z cytokin wzbogaconych w supernatanty kokultur 3D komórek BrC / monocytów. Sprawdzono, czy cytokina ta brała udział w inwazji linii komórkowych BrC.

  1. Rozwiń komórki BrC w kolbach o długości 75 cm2. MCF-7, T47D, HS578T i MDA-MB-231 zgodnie z opisem w kroku 1.2 (ale bez ECME) oraz pierwotne komórki BrC zgodnie z opisem w kroku 2.4.
  2. Przemyć raz każdą wkładkę do hodowli komórek z poliwęglanową membraną z 8 μm porami 200 μl pożywki bez surowicy (użyta pożywka zależy od badanej linii komórkowej) w celu uwodnienia błony.
  3. Wypełnić wkładkę 50 μl zimnego ECME (rozcieńczenie 1:4 ECME: zimna pożywka bez FBS), umieścić wkładki w 24-dołkowej płaskodennej płytce hodowlanej i pozostawić ECME do polimeryzacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Po polimeryzacji ECME dodać 180 μl odpowiedniego podłoża komórkowego bez FBS. Przez szczeliny we wkładce dodać 800 μl nośnika bez FBS. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu uzyskania gradientu IL-8.
    nuta: Unikaj tworzenia bąbelków w mediach. Stosowane pożywki są bez FBS, ale uzupełnione 100 ng / ml IL-8 jako chemoatraktantu lub czyste podłoża bez FBS, jako kontrola negatywna.
  5. Uzyskaj w sumie 6 x 105 komórek każdej linii komórkowej w następujący sposób:
    1. Odrzucić supernatanty, przepłukać raz 10 ml 1x PBS i dodać 2 ml 0,05% trypsyny/0,48 mM EDTA przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w celu odłączenia komórek. Dodać 4 ml dodatku, aby zatrzymać reakcję trypsyny i energicznie zawiesić przez pipetowanie.
  6. Pobrać 10 μl podwielokrotności zawiesiny komórek, aby policzyć komórki w komorze Neubauera. Pobrać objętość zawiesiny komórek zawierającej 6 x 105 komórek. Wirować przy 430 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i przepłukać komórki w 1 ml 1x PBS. Powtórz płukanie jeszcze raz.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 20 μl odpowiednich pożywek bez FBS i umieścić we wkładkach zawierających 180 μl odpowiednich pożywek bez FBS. Ostrożnie homogenizować zawiesinę komórkową przez pipetowanie.
  8. Pozwól, aby inwazja komórek postępowała przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO2 .
  9. Po 48 godzinach wyjąć wkładkę, wyrzucić supernatant i bardzo dokładnie przepłukać wkładkę 200 μl 1x PBS. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką usuń nadmiar PBS.
    nuta: Komórki inwazyjne są zwykle przyczepione po drugiej stronie wkładki, tak jak w tym przypadku, gdy komórki przylegają.
  10. Utrwalić komórki, umieszczając wkładkę w dołku z 24-dołkową płaską płytką hodowlaną zawierającą 1 ml / studzienkę 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przepłucz wkładki raz 1x PBS.
  11. Wybarwić komórki, umieszczając wkładkę w dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej z płaskim dnem zawierającej 1 ml / studzienkę 1x PBS z 0,2% fioletem krystalicznym przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie, za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, usuń całe ECME z górnej części membrany, która zawiera komórki, które nie migrowały, i spłucz bardzo ostrożnie wodą destylowaną, aby uniknąć eliminacji utrwalonych komórek inwazyjnych.
  12. Policz atakujące komórki, obserwując dolną stronę wkładki pod odwróconym mikroskopem. Używana jest średnia liczba komórek z 3 losowych pól (przy 100-krotnym powiększeniu). W przypadkach, gdy komórki zaatakowały jako klastry i trudno je policzyć pojedynczo, uzyskaj obrazy z 3 losowych pól (przy 100-krotnym powiększeniu) za pomocą aparatu cyfrowego. Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i użyj IOD do ilościowego określenia inwazji komórek (Rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza morfologiczna komórek BrC w hodowlach 3D:

Morfologia pierwotnych komórek BrC rosnących w kulturach 3D o niskiej i wysokiej gęstości była badana przez 5 dni. W ciągu pierwszych 48 godzin komórki przylegają do ECME i utrzymują niską gęstość. W tym momencie można wyraźnie zauważyć, że komórki mają wydłużony kształt wrzecionowaty, niektóre z dwoma lub więcej długimi projekcjami cytoplazmatycznymi i bez widoc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nabłonkowe rosną w konformacji przestrzennej 3D, a ich interakcja z białkami ECM ma kluczowe znaczenie dla homeostazy tkanek. Wiele badań nad rakiem opierało się na komórkach hodowanych w monowarstwach (2D) i chociaż miały one kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu aspektów powstawania i progresji guza, monowarstwy nie podsumowują cech, które ECM narzuca komórkom, na przykład: ograniczenie proliferacji, przeżycie komórek zależne od adhezji, polaryzacja wierzchołkowo-boczna, przebudowa ECM, różnicowanie komórek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Projekt nr 233061 dla Ezequiela M. Fuentes-Panana oraz przez Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numer projektu HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA jest doktorantką w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i otrzymała stypendium 231663 CONACYT. E-S NA, dziękuje również za wsparcie finansowe udzielone przez Meksykański Instytut Zabezpieczenia Społecznego (IMSS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
U937Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC CRL-1593.2Linia komórek monocytowych/chłoniak histiocytarny 
THP-1Kolekcja Kultur Typu Amerykańskiego ATCC TIB-202Monocytowa linia komórkowa/ostra białaczka monocytowa 
MCF-10AKolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC CRL-10317Nietransformowana linia komórek piersi
MCF-7Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC HTB-22Linia komórkowa raka piersi
T47DKolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC HTB-133Linia komórkowa raka piersi
HS578TKolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC HTB-126Linia komórkowa raka piersi
MDA-MB-231Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC HTB-26Linia komórkowa raka piersi
RPMI 1640 średniaGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM Wysoka zawartość glukozy GIBCO BRL Life Technologies11964-0924,5 g/L
glukozy DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
Antybiotyk/Antybiotyk PrzeciwgrzybiczeGIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/ml penicylina, 100 &mikro; g/ml streptomycyny oraz 0,25 &mikro; g/mL
Fungizone Płodowa surowica bydlęcaGIBCO BRL Life Technologies16000-044
Surowica końska GIBCO BRL Life Technologies16050114
0,05% Trypsyna-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGIBCO BRL Life Technologies20012-027
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeproTechAF-100-15 (1,00 mg)
InsulinaSIGMA-ALDRICHI1882-100MG
HydrokortyzonSIGMA-ALDRICHH088-5G
Toksyna Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237mięsak myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), ekstrakt z macierzy zewnątrzkomórkowej, Przechowywać w temperaturze -20° C do użycia w temperaturze 4° C
GM-CSFPeproTech300-03
MCP-1PeproTech300-04
RANTESPeproTech300-06
IL-8PeproTech200-08
IL-1βPeproTech200-01B
Hycel Kryształowo-fioletowyMé xico541
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICHP6148
Przepuszczalne wsporniki (wkładki) TranswellCorningInc3422Średnica 6,5 mm, 8 i mikro; m wielkość porów/płytki 24-dołkowe 
Przepuszczalne wsporniki (wkłady)Thermofisher Scientific140620średnica 6,5 mm, 0,4 i mikro; m wielkość porów/płytki 24-dołkowe 
Zestaw do izolacji monocytów II Human Miltenyi Biotec130-091-153
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
Zestaw paneli magnetycznych z ludzką cytokiną / chemokiną 96-dołkowy test płytkiEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix z oprogramowaniem xPonent (laserowe fluorescencyjne oprzyrządowanie do testów analitycznych)Luminex Corporation40-072
Szkiełko studzienne Lab-Tek z pokrywą (8 dobrze)Nalge Nunc International177402
Szklane dno mikrostudzienka 35mm petri  naczyniaMatTek Corp.P35G-1.5-14-C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20(2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505(2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205(2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87(2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18(2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15(2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163(2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21(2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79(2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komunikacja monocyt w z rakiem piersi3D system kokulturymodelowanie mikro rodowiska guzaanaliza sekrecji cytokintest inwazji kom rkowejpomiar oporno ci na anoikisobrazowanie z u yciem mikroskopii konfokalnejfluorescencyjne znakowanie kom rekprotok degradacji macierzy zewn trzkom rkowej

Powiązane artykuły