Artykuł metodologiczny

Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

15K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56596

⸱

10 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego badania było oszacowanie in vitro wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu. Porównanie leków obniżających stężenie lipidów ujawniło różnice w ich działaniu w modulowaniu cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu.

Streszczenie

Leczenie pacjentów z dyslipidemią lekami obniżającymi poziom lipidów prowadzi do znacznego obniżenia poziomu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz niskiego do umiarkowanego poziomu wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) w osoczu. Jednak możliwa rola tych leków w zmianie morfologii i dystrybucji cząsteczek cholesterolu jest słabo poznana. W tym artykule opisano ocenę in vitro działania leków obniżających stężenie lipidów w modulowaniu cech morfologicznych cząstek cholesterolu metodą płytki nazębnej w połączeniu z obrazową cytometrią przepływową. Analizy obrazowe cząsteczek cholesterolu wykazały, że lowastatyna, symwastatyna, ezetymib i atorwastatyna indukują tworzenie zarówno globularnych, jak i liniowych cząstek w kształcie pasma, podczas gdy niacyna, fibraty, fluwastatyna i rosuwastatyna indukują tworzenie tylko cząstek o kształcie kulistym. Następnie oczyszczone cząsteczki lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i LDL inkubowane z tymi lekami wykazały zmiany w morfologii i teksturze obrazu subpopulacji cząstek cholesterolu. Ponadto badania przesiewowe 50 próbek surowicy wykazały obecność wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL w kształcie liniowym u osób z dyslipidemią (średnio 18,3%) w porównaniu z próbkami normalnymi w tym samym wieku (średnia 11,1%). Zaobserwowaliśmy również znaczne różnice w wpływie leków obniżających poziom lipidów na zmniejszenie tworzenia się cząstek cholesterolu LDL i HDL w próbkach surowicy. Odkrycia te wskazują, że leki obniżające poziom lipidów, oprócz działania hipolipidemicznego za pośrednictwem komórek, mogą bezpośrednio modulować morfologię cząstek cholesterolu poprzez nieenzymatyczny mechanizm działania. Wyniki tych wyników mogą pomóc w diagnostyce miażdżycy i przewidzieć optymalną terapię obniżającą stężenie lipidów.

Wprowadzenie

Liczne badania kliniczne wykazały korzystny wpływ leków obniżających poziom lipidów w obniżaniu poziomu cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w osoczu oraz niskim lub umiarkowanym poziomie wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL), co zapobiega zarówno pierwotnym, jak i wtórnym występowaniom niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą1,2,3,4,5. Statyny, grupa inhibitorów enzymu reduktazy HMG-CoA, blokują endogenną syntezę cholesterolu w wątrobie, co z kolei prowadzi do obniżenia poziomu krążącego cholesterolu LDL we krwi6,7. Podobnie, w obniżaniu poziomu lipidów niacyny pośredniczy jej bezpośrednie i niekonkurencyjne hamowanie acylotransferazy diacyloglicerolu hepatocytów-2, kluczowego enzymu wątrobowego biorącego udział w syntezie trójglicerydów8. Dla porównania, ezetymib zmniejsza stężenie LDL w osoczu poprzez ograniczenie wchłaniania egzogennego cholesterolu poprzez wiązanie się z białkiem Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) znajdującym się w komórkach nabłonka jelita cienkiego9. Fenofibrat, inny lek obniżający poziom lipidów, znacznie zmniejsza stężenie trójglicerydów w osoczu, a także umiarkowanie obniża poziom cholesterolu LDL poprzez szlak receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów10. Poza tym doniesiono, że kwas tłuszczowy omega-3 ma działanie przeciwmiażdżycowe ze względu na jego zdolność do obniżania poziomu LDL11.

Leki obniżające poziom lipidów, oprócz ich głównego wpływu na obniżenie poziomu cholesterolu LDL, mają szereg korzystnych efektów plejotropowych, w tym zwiększenie poziomu HDL, poprawę funkcji śródbłonka, zmniejszenie stanu zapalnego i hamowanie agregacji płytek krwi12,13,14. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych leków w zwiększaniu stężenia cząsteczek cholesterolu HDL i modyfikowaniu ich cech strukturalnych nie jest w pełni poznany. Ponieważ leki te są powszechnie przepisywane w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą (CVD), konieczne jest dalsze badanie ich możliwej roli w określaniu cech morfologicznych i rozmieszczenia cząsteczek lipidów. Lipidom ludzkiego osocza składa się z około 600 różnych lipidów i 22 różnych typów molekularnych cholesterolów, które są obecne w różnych rozmiarach, kształtach, gęstościach i składach15,16,17. Metody analityczne, takie jak ultrawirowanie, NMR i gradientowa elektroforeza żelowa, są wykorzystywane do charakteryzowania cząstek LDL i HDL oraz ich podfrakcji18,19. Zastosowanie tych metod ogranicza się jednak do badań mających na celu określenie wpływu leków na modulację morfologii i składania cząsteczek lipidowych. Tablica płytek opartych na cytometrze przepływowym jest funkcjonalnym testem biochemicznym opracowanym do wykrywania i wizualizacji cząstek lipidów i płytek amyloidowych pochodzących z surowicy20. Opisane w niniejszej pracy zalety metody obrazowania in vitro umożliwiają identyfikację działania leków modulujących stężenie lipidów w zmianie morfologii i rozmieszczenia cząsteczek cholesterolu w próbkach buforowych i surowicy.

Protokół

1. Przygotowanie cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie oraz leków obniżających poziom lipidów

UWAGA: Cholesterol znakowany fluorescencyjnie, agregaty oraz statyny przygotowano zgodnie z opisem w naszym poprzednim artykule21. Szczegółowe informacje na temat odczynników, cytometru przepływowego z obrazowaniem, analizatorów chemicznych oraz oprogramowania do analizy danych wykorzystanych w niniejszym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

  1. Rozpuścić liofilizowany proszek cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie (1 mg, Ex/Em = 495 nm/507 nm) w 1 mL 100% alkoholu.
  2. Wirować próbkę przez 3 min przy 2,040 x g i wykorzystać nadosady zawierające rozpuszczalne agregaty cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie w teście matrycy blaszek miażdżycowych.
  3. W celu przygotowania leków, rozpuścić oddzielnie proszki (2 mg) symwastatyny, lowastatyny, atorwastatyny, ezetymibu oraz kwasów tłuszczowych omega-3 w 1 ml 100% alkoholu.
  4. Po wirowaniu przez 3 min przy 2,040 x g wykorzystać nadosady zawierające leki w teście.
  5. Analogicznie, rozpuścić oddzielnie proszki (2 mg) fluwastatyny, rozuwastatyny, niacyny i fibratu w 1 mL wody dejonizowanej, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 2 mg/mL.
  6. Po wirowaniu przez 3 min przy 2,040 x g wykorzystać nadosady zawierające leki w teście matrycy blaszek miażdżycowych.

2. Test macierzy plackowej do badania formowania cząsteczek cholesterolu in vitro

  1. Użyć analizatora chemicznego-1 (patrz Tabela materiałów) do przygotowania testu z macierzą placków w celu badania tworzenia się cząsteczek cholesterolu. Test należy przeprowadzić w 96-dołkowej płytce o okrągłych dnach i niskim wiązaniu białek, wykorzystując odczynniki przygotowane w Sekcji 1. Końcową objętość reakcji w każdym dołku należy utrzymać na poziomie 200 µL i przeprowadzić wszystkie pomiary w trzech powtórzeniach.
    1. Najpierw do każdego dołka należy nalać 194,5 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
    2. Do każdego dołka należy dodać 2,5 µL (5 µg) roztworu każdego z leków obniżających poziom lipidów, a następnie wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na platformie reakcyjnej analizatora chemicznego-1, aby równomiernie wymieszać lek w roztworze. Do próbek kontrolnych negatywnych nie dodaje się leku.
    3. Na koniec do każdego dołka należy dodać 2 µL (2 µg) roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na platformie reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
    4. Płytkę należy inkubować na wytrząsarce laboratoryjnej przez 2 h w temperaturze 37 °C i przy 200 rpm.
    5. Po inkubacji należy pozyskać obrazy cząsteczek za pomocą przepływowej cytometrii obrazowej.

3. Przechwytywanie obrazów cząsteczek cholesterolu z użyciem cytometrii przepływowej z obrazowaniem

  1. Otwórz szablon akwizycji danych, aby załadować odpowiednie ustawienia instrumentu. Kliknij „File”, następnie wybierz „Open Template…” i wskaż plik szablonu.
  2. Kliknij „Flush, Lock, Load”, aby przygotować instrument do załadunku próbek.
  3. Po pojawieniu się okna dialogowego „Load Sample” kliknij „OK”, aby załadować do cytometru przepływowego z obrazowaniem 50 µL próbek z każdej studni przygotowanej w sekcji 2.
  4. Kliknij „Run|Setup”, aby w czasie rzeczywistym wyświetlić cząstki w obszarze obrazowania.
  5. Gdy cząstki w obszarze obrazowania będą dobrze ostro ustawione, kliknij „Run|Acquire”, aby w trybie wysokoprzepustowym jednocześnie pozyskać obrazy każdego obiektu w ciemnym polu (rozproszenie boczne/SSC), jasnym polu (BF), fluorescencji zielonej i fluorescencji żółtej.
  6. Powtórz kroki 3.2 – 3.5, aby pozyskać od 5 000 do 10 000 cząstek z każdej próbki.
  7. Przeanalizuj wszystkie surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu określenia intensywności fluorescencji obiektów oraz zmienności morfologicznej.
    1. Kliknij przycisk „Tools” u góry oprogramowania do analizy obrazu, a następnie wybierz z menu rozwijanego opcję „Batch Data Files”, co otworzy okno „Batches”.
    2. W oknie „Batches” kliknij przycisk „Add Batch”, co otworzy okno „Define a Batch”.
    3. W oknie „Define a Batch” kliknij przycisk „Add Files” i wybierz surowe pliki obrazów, kliknij przycisk „Template” i wybierz odpowiedni plik szablonu analizy danych, a następnie wybierz „OK” i „Submit Batches”, aby rozpocząć przetwarzanie i analizę surowych plików obrazów.

4. Ocena wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki cholesterolu z wykorzystaniem testu macierzy placków

  1. Zgodnie z opisem w kroku 2.1, przeprowadź test formowania cząsteczek cholesterolu przy użyciu oczyszczonych lipoprotein/cząsteczek VLDL, LDL i HDL. Przeprowadź test macierzy blaszek w płytce 96-dołkowej.
    1. Najpierw napełnij wszystkie dołki PBS; użyj objętości końcowej 200 µL dla każdego dołka.
  2. Jako kontrolę negatywną dodaj do każdego dołka oddzielnie 4 µg białek/cząsteczek VLDL, LDL lub HDL bez dodatku leków i wstrząśnij płytką przez 30 s.
    1. Aby zbadać efekt leku obniżającego poziom lipidów, dodaj do każdego dołka oddzielnie 4 µg białek/cząsteczek VLDL, LDL lub HDL i wstrząśnij płytką przez 30 s.
    2. Do dołków, do których dodano 4 µg VLDL, LDL lub HDL, dodaj 2,5 µL (5 µg) roztworu ezetymibu, lowastatyny, simwastatyny lub kwasu nikotynowego i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją w analizatorze chemicznym-1.
    3. Na koniec dodaj do wszystkich dołków 2 µL (2 µg) roztworu agregatu cholesterolu znakowanego fluorescencyjnie i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
  3. Inkubuj płytkę przez 2 h w wytrząsarce laboratoryjnej ustawionej na 37 °C i 200 rpm.
  4. Pobierz próbki za pomocą obrazującej cytometrii przepływowej zgodnie z krokami 3.1 – 3.5.
  5. Przeanalizuj surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jak opisano w kroku 3.7.
  6. W szablonie analizy zastosuj następujący schemat bramkowania w celu identyfikacji subpopulacji cząsteczek cholesterolu.
    1. Na wykresie liczby pikseli nasyconych w kanale zielonym (oś x) i liczby pikseli nasyconych w kanale ciemnego pola (oś y) odrzuć obiekty posiadające jeden lub więcej pikseli nasyconych w którymkolwiek z kanałów.
    2. Przedstaw obiekty/cząsteczki bez pikseli nasyconych, używając intensywności kanału zielonego (oś x) i intensywności SSC (oś y): obiekty zostaną podzielone na jeden z trzech obszarów (VLDL, LDL, HDL) na podstawie intensywności kanału zielonego i SSC.
      UWAGA: Bramki te zostały utworzone na podstawie danych uzyskanych z eksperymentów kontrolnych przeprowadzonych z użyciem oczyszczonych cząsteczek/białek VLDL, LDL i HDL bez dodatku leku.
  7. Aby określić efekt leku obniżającego poziom lipidów dla każdej próbki, oblicz całkowite stężenia cząsteczek lipoprotein oraz procentowy udział każdej subpopulacji (VLDL, LDL, HDL), zgodnie z opisem w kroku 6.5.
    1. Oblicz stężenia cząsteczek (cząsteczek/mL), korzystając z następującego równania:
      Wzór na stężenie cząsteczek, [Particle] = liczba cząsteczek/(szybkość przepływu próbki×czas akwizycji).
      UWAGA: Obszary bramkowania VLDL, LDL i HDL na wykresie kropkowym fluorescencji wykrywają ~ 80% ich odpowiednich subpopulacji, a pozostałe ~ 20% cząsteczek nakłada się na inne obszary bramkowania.

5. Pomiar stężeń lipidów w próbkach surowicy

  1. W celu oznaczenia stężeń LDL, HDL, cholesterolu i triglicerydów za pomocą analizatora chemicznego-2, należy wykorzystać próbki surowicy pobrane od zdrowych osób oraz osób z dyslipidemią w tej samej grupie wiekowej.
  2. Nieprawidłowe stężenie LDL, HDL, cholesterolu i triglicerydów należy zdefiniować jako stężenie wykraczające poza górne i dolne wartości referencyjne w próbkach surowicy.
  3. Należy zastosować standardowe wartości referencyjne zalecane przez producenta odczynników: cholesterol (4 - 200 mg/dL), HDL (3.0 - 65 mg/dL), LDL (4 - 100 mg/dL) oraz triglicerydy (9 - 200 mg/dL).
  4. Próbki surowicy o wartościach nieprawidłowych, czyli poniżej dolnej lub powyżej górnej wartości referencyjnej dla cholesterolu i triglicerydów, należy wytypować i wykorzystać do przesiewu w obecności i przy braku leków obniżających poziom lipidów.

6. Analiza wpływu leków na tworzenie cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy

  1. Użyj analizatora chemicznego-1 do przygotowania testu matrycy blaszek dla tworzenia cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy. Test należy przeprowadzić w 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie i niskim wiązaniu białek. Zastosuj końcową objętość reakcji 200 µL/dołek i wykonaj wszystkie analizy w trzech powtórzeniach.
  2. Przygotuj płytkę, dozując odczynniki etapowo.
    1. Przygotuj dołki kontrolne.
    2. Do każdego dołka wprowadź 193 µL PBS.
    3. Dodaj 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na dołek) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego.
    4. Do każdego dołka dodaj 2 µL (2 µg) roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
  3. Przygotuj dołki z lekami.
    1. Do każdego dołka wprowadź 191 µL PBS.
    2. Dodaj 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na dołek) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
    3. Do wszystkich dołków, z wyjątkiem dołków kontroli negatywnej, dodaj 2 µL roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub kwasu nikotynowego (4 µg). Dodaj tylko jeden lek na dołek i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
    4. Do każdego dołka dodaj 2 µL roztworu agregatów cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie (2 µg) i wstrząśnij płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora chemicznego-1.
  4. Leki należy dozować dopiero po wypełnieniu wszystkich dołków (kontrolnych i traktowanych lekami) odpowiednimi próbkami surowicy, a cholesterol znakowany fluorescencyjnie dodać na koniec tego etapu.
  5. Inkubuj płytkę przez 2 h w wytrząsarku laboratoryjnym ustawionym na 37 °C i 200 rpm.
  6. Nabyj próbki za pomocą obrazującego cytometru przepływowego zgodnie z ustawieniami opisanymi w krokach 3.1 - 3.6.
  7. Użyj oprogramowania do analizy obrazów w celu przetwarzania wsadowego wszystkich plików obrazów przy użyciu tego samego szablonu, który opisano w kroku 3.7.
    1. Przeprowadź analizę danych, wyznaczając bramki na wykresie zgodnie z opisem w krokach 4.5 i 4.6.
  8. Aby określić efekt/odpowiedź leku obniżającego poziom lipidów (niski, umiarkowany i wysoki) dla każdej próbki, oblicz całkowite stężenie cząsteczek lipoprotein oraz procent całkowitej liczby cząsteczek tworzących subpopulacje VLDL, LDL i HDL.
  9. Przedstaw populacje VLDL, LDL i HDL na histogramie obrazu obiektu w jasnym polu, gdzie od długości odjęto szerokość (długość - szerokość), a następnie przypisz je do regionów globularnych lub liniowych: obiekty o wartości (długość - szerokość) ≤2 µm trafiają do regionu globularnego w celu obliczenia procentu cząsteczek o kształcie globularnym i liniowym.
  10. Porównaj procent cząsteczek cholesterolu LDL i HDL o kształcie globularnym i liniowym zidentyfikowanych dla każdej próbki surowicy inkubowanej z każdym lekiem i bez niego. spośród wartości uzyskanych w trzech powtórzeniach dla każdej próbki surowicy, przyjmij procent cząsteczek LDL i HDL o kształcie globularnym i liniowym mieszczący się w zakresie SD ±2 w celu określenia efektu leku.

Wyniki

Analiza wpływu leków obniżających poziom lipidów na tworzenie cząsteczek cholesterolu oparta na teście macierzy placków:

Aby ocenić wpływ statyn na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu, fluorescencyjnie znakowane agregaty cholesterolu inkubowano oddzielnie z lowastatyną, simwastatyną, atorwastatyną, rosuwastatyną i fluwastatyną w buforze. Wszystkie te próbki analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem, aby zarejestrować obrazy cząsteczek cholesterolu do analizy morfologicznej, jak pokazano na Rysunku 1 oraz Rysunku 2. Co ciekawe, analiza wpływu leków na tworzenie cząsteczek cholesterolu w buforze wykazała, że lowastatyna, simwastatyna i atorwastatyna indukują tworzenie heterogennej populacji cząsteczek cholesterolu o zróżnicowanych rozmiarach i kształtach, Rysunek 3a-c. Z kolei cząsteczki cholesterolu utworzone w obecności rosuwastatyny, fluwastatyny oraz w kontroli negatywnej (bez leku) były jednorodne pod względem kształtu i morfologii, co pokazano na Rysunku 3d-f. Ponadto zaobserwowano, że lowastatyna, simwastatyna i atorwastatyna indukowały tworzenie cząsteczek cholesterolu wykazujących zarówno morfologię globularną, jak i liniowe pasma, podczas gdy rosuwastatyna i fluwastatyna indukowały tworzenie cząsteczek cholesterolu wyłącznie o morfologii globularnej. Stwierdzono, że wpływ statyn na indukcję tworzenia liniowych pasm wynosił odpowiednio 16% dla lowastatyny, 2% dla simwastatyny i 0,2% dla atorwastatyny.

Aby dalej ocenić wpływ leków hipolipemizujących na tworzenie się cząsteczek, agregaty cholesterolu znakowane fluorescencyjnie inkubowano oddzielnie z ezetimibem, fibratem, niacyną oraz kwasami tłuszczowymi omega-3. Podobnie jak w przypadku statyn, leki te indukowały tworzenie się cząsteczek cholesterolu o niejednorodnych rozmiarach i kształtach, co przedstawiono na Rysunku 4a-d. Wśród nich ezetimib indukował tworzenie się cząsteczek cholesterolu wykazujących zarówno morfologię globularną, jak i liniowe pasma, podczas gdy fibrat, niacyna i kwasy tłuszczowe omega-3 indukowały tworzenie wyłącznie globularnych cząsteczek cholesterolu. W konsekwencji wpływ leków na tworzenie się liniowych pasm cząsteczek cholesterolu wyniósł 3% dla ezetimibu, 0% dla fibratu, 0% dla niacyny oraz 0% dla kwasów tłuszczowych omega-3.

Analiza morfologiczna wykazała, że każda kulista lub liniowa cząsteczka cholesterolu składa się z wielu mniejszych, połączonych ze sobą cząsteczek. Rozmiary zidentyfikowanych fluorescencyjnie dodatnich kulistych cząsteczek cholesterolu mieszczą się w zakresie ~2 - 30 µm2, natomiast rozmiary cząsteczek o kształcie liniowym mieszczą się w zakresie ~2 - 60 µm2.

Analiza wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki VLDL i LDL:

Aby dokładniej zbadać tworzenie się cząsteczek cholesterolu w obecności lipoprotein, agregaty cholesterolu znakowane fluorescencyjnie inkubowano oddzielnie z oczyszczonymi białkami/cząsteczkami VLDL, LDL i HDL. Wyniki wykazały, że w porównaniu z inkubacją z cząsteczkami LDL i HDL, agregaty cholesterolu inkubowane z białkami VLDL spowodowały powstanie większej liczby cząsteczek cholesterolu, Rycina 5. Ponadto w populacjach VLDL zaobserwowano dwie główne frakcje cząsteczek cholesterolu, co sugeruje ich częściową transformację we frakcję LDL podczas inkubacji z agregatami cholesterolu znakowanymi fluorescencyjnie. Analiza obrazu cząsteczek wykazała obecność cząsteczek zarówno o kształcie globularnym (~97%), jak i liniowym (~3%) w populacjach VLDL, LDL i HDL. Zakres wielkości cząsteczek globularnych wynosi ~2 - 30 µm2, natomiast zakres wielkości cząsteczek liniowych wynosi ~2 - 60 µm2.

W celu zbadania wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki, cząsteczki VLDL i LDL inkubowano oddzielnie z ezetimibem, lovastatyną, simvastatyną oraz kwasem nikotynowym. W rezultacie, w porównaniu z eksperymentami kontrolnymi bez udziału leków, efekt działania leków zaobserwowany w formowaniu cząsteczek VLDL był wyższy w przypadku ezetimibu, simvastatyny, lovastatyny i kwasu nikotynowego. Cząsteczki LDL inkubowane z lekami wykazały jedną główną frakcję, a efekt indukowany lekami w formowaniu cząsteczek był wyższy dla ezetimibu, simvastatyny, lovastatyny i kwasu nikotynowego, Rycina 6.

Zróżnicowanie efektów leków obniżających poziom lipidów w zmianie rozkładu cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy:

Poprzednie eksperymenty przeprowadzono w roztworze buforowym z oczyszczonymi lipoproteinami w celu oceny działania leku. W związku z tym, w kolejnym etapie zbadano skuteczność leków hipolipemizujących w hamowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu, wykorzystując 50 próbek surowicy pobranych od 25 osób z dyslipidemią oraz 25 zdrowych osób dobranych pod względem wieku. Odpowiedź na lek w każdej próbce surowicy mierzono na podstawie zmian w profilu tworzenia cząsteczek cholesterolu w obecności i braku leków. W teście plaque array każda próbka surowicy była badana pod kątem działania ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny i kwasu nikotynowego. Wyniki wykazały różnice między tymi lekami w modulowaniu rozkładu cząsteczek VLDL, LDL i HDL w próbkach surowicy, w szczególności ich wpływ na redukcję LDL i zwiększenie tworzenia cząsteczek cholesterolu HDL. Trzy reprezentatywne próbki surowicy od osób z dyslipidemią, wykazujące unikalne reakcje na leki hipolipemizujące, przedstawiono na Ryc. 7.

Identyfikacja wpływu leku na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu LDL i HDL pochodzących z surowicy:

Analiza fenotypowa cząsteczek cholesterolu pochodzących z surowicy wykazała obecność zarówno liniowych nici, jak i globularnych subpopulacji VLDL, LDL oraz HDL, co potwierdziło morfologię analogiczną do tej zidentyfikowanej w eksperymentach przeprowadzonych zarówno w buforze, jak i z oczyszczonymi cząsteczkami lipoprotein, co przedstawiono na Rysunku 8. Jednakże rozkład subpopulacji globularnych i liniowych cząsteczek cholesterolu znacząco różnił się pomiędzy osobami z dyslipidemią a grupą kontrolną dobraną pod względem wieku. Co istotne, analizy kontrolne przeprowadzone bez udziału leków wykazały różnice w rozkładzie liniowych cząsteczek cholesterolu LDL pomiędzy próbkami surowicy od osób z dyslipidemią (średnio 2,0%) a próbkami od osób zdrowych w tej samej grupie wiekowej (średnio 1,3%). Podobnie zaobserwowano zwiększony poziom liniowych cząsteczek cholesterolu HDL w próbkach od osób z dyslipidemią (średnio 18,3%) w porównaniu do próbek surowicy od osób zdrowych w tej samej grupie wiekowej (średnio 11,1%). Korelacyjnie, analizy przeprowadzone w obecności leków w próbkach surowicy od osób z dyslipidemią wykazały znaczną redukcję formowania liniowych cząsteczek cholesterolu HDL dla symwastatyny (średnio 8,3%), ezetymibu (średnio 11,5%), lowastatyny (średnio 11,7%) oraz brak redukcji dla kwasu nikotynowego (średnio 18,3%). Ponadto zaobserwowano spadek formowania liniowych cząsteczek cholesterolu LDL w próbkach surowicy od osób z dyslipidemią po inkubacji z lekami wymienionymi w Tabeli 1.

Ponadto testy wykonane w obecności leków w próbkach surowicy kontrolnej od osób w tym samym wieku wykazały znaczną redukcję liniowych cząsteczek cholesterolu HDL w przypadku symwastatyny (średnio 5,0%), ezetymibu (średnio 8,2%), lowastatyny (średnio 8,7%) i kwasu nikotynowego (średnio 10,8%), jak pokazano w Tabeli 2. Zarówno w próbkach z dyslipidemią, jak i w normalnych próbkach surowicy od osób w tym samym wieku, w których wystąpiła indukowana lekami redukcja liniowych cząsteczek cholesterolu LDL i HDL, zaobserwowano względny wzrost cząsteczek cholesterolu o kształcie globularnym (dane nie zostały przedstawione).

Schemat modulacji lipidów w buforze i surowicy z fluorescencyjnymi agregatami cholesterolu oraz wynikami obrazowania.
Rycina 1: Schemat ilustrujący proces wizualizacji morfologii cząsteczek cholesterolu in vitro. (a, b) Dodanie leku hipolipemizującego do próbek w buforze lub surowicy. (c) Dodanie do próbek fluorescencyjnie znakowanych rozpuszczalnych agregatów cholesterolu. (d) Pobranie otrzymanych próbek do analizy morfologicznej nierozpuszczalnych cząsteczek cholesterolu przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres rozrzutu, analiza mikroskopowa i histogram populacji cząsteczek; badanie stosunku szerokości do wysokości i morfologii.
Rycina 2: Identyfikacja dwóch odrębnych morfologii cząsteczek cholesterolu przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem. (a) Cząsteczki są dzielone na populacje liniowe lub globularne na podstawie analizy tekstury obrazów w polu jasnym. W szczególności wykres kropkowy średniej homogeniczności H (oś x) i średniej entropii H (oś y) zawiera dwa obszary bramkowania służące do wykrywania globularnych (czerwonych) i liniowych, w kształcie nici (niebieskich) cząsteczek cholesterolu. (b) Obrazy przedstawiające morfologię cząsteczek o kształcie globularnym zidentyfikowanych w populacji 1. (c) Obrazy liniowych cząsteczek w kształcie nici zidentyfikowanych w populacji 2. (d) Histogram przedstawiający rozkład wszystkich fluorescencyjnie dodatnich cząsteczek cholesterolu wykorzystany do określenia ich stężenia i subpopulacji. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; pole jasne i kanały kolorystyczne; badanie lokalizacji markerów komórkowych.
Rycina 3: Galerie obrazów przedstawiające wpływ statyn na modulację tworzenia cząsteczek cholesterolu. Pole jasne odnosi się do obszaru analogicznego do FSC w konwencjonalnym cytometrze przepływowym. Kanał zielony odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 505 - 560 nm, a kanał żółty do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 560-595 nm. (a-e) Galerie obrazów przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu utworzonych odpowiednio w obecności lowastatyny, symwastatyny, atorwastatyny, rosuwastatyny i fluwastatyny. (f) Tworzenie cząsteczek cholesterolu w przypadku braku statyn (kontrola negatywna). Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej; kanały w polu jasnym, zielony i żółty do analizy komórkowej, skala 10μm.
Rysunek 4: Prezentacja różnicowego wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulację tworzenia się cząsteczek cholesterolu. (a-d) Galerie obrazów przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu utworzonych odpowiednio w obecności ezetymibu, niacyny, fibratów i kwasów tłuszczowych omega-3. Kanał zielony odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 505 - 560 nm, a kanał żółty do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 560-595 nm. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cytometryczna, separacja VLDL/LDL/HDL; zielona fluorescencja vs. rozproszenie boczne, obrazowanie komórek.
Rysunek 5: Analiza tworzenia cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w przypadku braku leku. Wykresy kropkowe: oś X przedstawia spektrum cząsteczek cholesterolu wykrytych w kanale zielonej fluorescencji (505 - 560 nm), a oś Y przedstawia rozproszenie boczne. Bramkowanie wskazuje obszary cząsteczek VLDL, LDL i HDL wykrytych na wykresach kropkowych fluorescencji. (a) Tworzenie cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego VLDL. (b) Reprezentatywne obrazy cząsteczek VLDL. (c) Tworzenie cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego LDL. (d) Reprezentatywne obrazy cząsteczek LDL. (e) Tworzenie cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego HDL. (f) Reprezentatywne obrazy cząsteczek HDL. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Klasyfikacja lipoprotein za pomocą cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu z fluorescencją dla detekcji VLDL, LDL i HDL.
Rysunek 6: Wykazanie wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki cholesterolu VLDL i LDL. (a) Cząsteczki VLDL bez leku. (b) Cząsteczki VLDL inkubowane z ezetymibem. (c) Cząsteczki VLDL inkubowane z lowastatyną. (d) Cząsteczki VLDL inkubowane z symwastatyną. (e) Cząsteczki VLDL inkubowane z kwasem nikotynowym. (f) Cząsteczki LDL inkubowane bez leku. (g) Cząsteczki LDL inkubowane z ezetymibem. (h) Cząsteczki LDL inkubowane z lowastatyną. (i) Cząsteczki LDL inkubowane z symwastatyną. (j) Cząsteczki LDL inkubowane z kwasem nikotynowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fluorescencja cząsteczek lipidowych; schemat przedstawia różnicowanie VLDL, LDL i HDL przy użyciu wykresów rozrzutu w cytometrii przepływowej.
Rycina 7: Wykresy kropkowe fluorescencji pokazujące zróżnicowany efekt leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w próbkach surowicy. Górny rząd, badanie surowicy 1 wykazujące niską odpowiedź na lek w zakresie wzrostu tworzenia cząsteczek HDL od 0 do 15%; środkowy rząd, badanie surowicy 2 wykazujące umiarkowaną odpowiedź na lek w zakresie wzrostu cząsteczek HDL od 16 do 50%; dolny rząd, badanie surowicy 3 wykazujące wysoką odpowiedź na lek w zakresie wzrostu cząsteczek HDL od 51 do 100%. (a, f, k) Próbki surowicy bez leków. (b, g, l) Próbki surowicy inkubowane z ezetimibem. (c, h, m) Próbki surowicy inkubowane z lowastatyną. (d, i, n) Próbki surowicy inkubowane z symwastatyną. (e, j, o) Próbki surowicy inkubowane z kwasem nikotynowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza morfologii komórek przy użyciu mikroskopii w świetle przechodzącym i fluorescencyjnej, schemat etapów komórkowych.
Rysunek 8: Galerie obrazów przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu zidentyfikowanych w próbce surowicy 1. Kanał zielony pokazuje obrazy emisji fluorescencji z cząsteczek; rozproszenie boczne (kanał cyjanowy) pokazuje obrazy światła lasera wzbudzającego rozproszonego przez cząsteczki. (a) Kuliste i liniowe cząsteczki cholesterolu powstałe bez udziału leku. (b, c, d, e) Cząsteczki cholesterolu powstałe odpowiednio w obecności ezetymibu, lowastatyny, simwastatyny i kwasu nikotynowego. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

ID surowicyBez leku (kontrola)Z ezetymibemZ zastosowaniem lowastatynyz zastosowaniem symwastatynyZ niacyną
% Liniowy, cząsteczki LDL% cząsteczek HDL liniowych% Liniowe, cząsteczki LDL% liniowy, cząsteczki HDL% liniowy, cząsteczki LDL% Liniowe, cząsteczki HDL% Liniowe, cząsteczki LDL% Liniowe, cząsteczki HDL% liniowy, cząsteczki LDL% Liniowy, cząsteczki HDL
PNDS-011.7345.20.8118.10.6116.10.5913.92.2633.6
PNDS-022.8635.91.2630.91.2722.70.7315.23.0337.7
PNDS-032.0435.80.874.821.024.140.363.060.459.57
PNDS-042.5632.91.1521.81.1218.60.7717.23.3736.5
PNDS-050.4229.20.245.620.228.720.169.910.3522.2
PNDS-061.828.10.416.80.62150.429.272.2838.4
PNDS-071.826.50.8510.51.1819.90.627.321.2923.4
PNDS-080.9822.80.867.281.5510.20.145.980.5913.3
PNDS-093.8722.11.989.561.8710.31.467.962.869.88
PNDS-104.4621.92.5713.64.0417.12.2811.90.7125.7
PNDS-111.5719.21.159.241.376.980.745.031.3716
PNDS-121.0616.70.664.380.74.740.996.361.144.73
PNDS-134.8516.61.2830.41.432.60.816.64.0231
PNDS-142.08160.6815.40.6416.51.9710.21.2520.11
PNDS-151.511.91.1413.31.2111.40.86.121.384.59
PNDS-161.8210.42.049.591.245.620.915.381.317.61
PNDS-171.0510.31.024.71.7815.10.937.811.2713
PNDS-181.118.760.543.680.613.511.015.031.026.69
PNDS-1918.520.756.670.765.860.918.361.2211.9
PNDS-203.547.923.78123.565.813.288.283.4412.3
PNDS-211.887.692.1211.41.739.541.778.342.3216.7
PNDS-221.647.170.355.750.5613.20.144.331.2317.8
PNDS-231.546.271.257.241.026.120.733.581.426.69
PNDS-240.536.220.524.490.915.570.544.010.6510.5
PNDS-252.975.11.59111.8891.036.542.6129.1

Tabela 1: Przesiewowe badanie próbek surowicy z dyslipidemią w teście plaque array wykazuje zróżnicowany efekt leków obniżających poziom lipidów. W porównaniu z kontrolami bez leku (kolumny 2, 3), próbki surowicy inkubowane z ezetimibem (kolumny 4, 5), lovastatyną (kolumny 6, 7), simvastatyną (kolumny 8, 9) oraz kwasem nikotynowym (kolumny 10, 11) wykazały zróżnicowanie w indukowaniu tworzenia liniowych cząsteczek cholesterolu LDL i HDL.

Identyfikator surowicyBez lekuz ezetymibemZ zastosowaniem lowastatynyz zastosowaniem symwastatynyZ dodatkiem niacyny
% Liniowy, cząsteczki LDL% Liniowe, cząsteczki HDL% liniowy, cząsteczki LDL% Liniowy, cząsteczki HDL% Liniowy, cząsteczki LDL% Liniowy, cząsteczki HDL% Liniowy, cząsteczki LDL% Liniowy, cząsteczki HDL% Liniowy, cząsteczki LDL% liniowy, cząsteczki HDL
PNAN-012.0526.80.6211.90.5616.90.529.281.411.9
PNAN-021.3526.31.6821.82.5923.60.796.922.1629.7
PNAN-032.424.90.537.540.5713.80.555.821.74.71
PNAN-041.9921.51.549.451.568.250.313.742.8820.8
PNAN-051.7718.81.496.031.655.50.544.671.28.19
PNAN-061.1215.20.674.422.6813.30.52.371.5416.3
PNAN-071.0314.40.796.831.457.910.675.361.5712
PNAN-080.9814.30.884.4827.10.192.661.0218.1
PNAN-092.8514.11.9512.62.3412.50.76.241.8418.7
PNAN101.0110.40.85.070.515.90.876.51.6310.9
PNAN-110.9212.40.219.940.293.310.296.520.5810.4
PNAN-120.610.50.565.781.064.740.43.320.9111.8
PNAN-131.2510.30.453.790.676.530.273.170.86.28
PNAN-141.039.861.128.511.056.910.65.941.058.14
PNAN-152.288.11.9310.42.148.861.566.842.318.61
PNAN-161.987.690.454.3615.460.272.890.494.12
PNAN-171.726.720.7514.80.749.260.495.581.9812.8
PNAN-182.456.380.8516.80.8914.20.585.91.820.6
PNAN-191.675.120.588.630.655.70.648.81.882.08
PNAN-201.174.410.857.770.916.430.695.081.216.12
PNAN-210.314.180.486.950.195.090.152.10.295.93
PNAN-220.774.021.247.410.615.020.293.490.423.98
PNAN-230.41.250.756.250.885.910.95.060.826.71
PNAN-240.451.10.632.50.555.320.94.30.713.5
PNAN-250.3610.732.40.665.10.8240.73.4

Tabela 2: Przesiewowe badanie próbek surowicy kontrolnej dopasowanych pod względem wieku w teście macierzy blaszek wykazuje różnicujący wpływ leków obniżających poziom lipidów. W porównaniu z kontrolami bez leku (kolumny 2, 3), próbki surowicy inkubowane z ezetymibem (kolumny 4, 5), lowastatyną (kolumny 6, 7), symwastatyną (kolumny 8, 9) oraz kwasem nikotynowym (kolumny 10, 11) wykazały różnice w indukowaniu tworzenia liniowych cząsteczek cholesterolu LDL i HDL.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, rozmieszczenie i właściwości funkcjonalne cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w krążeniu krwi są głównie determinowane przez czynniki metaboliczne, genetyczne, epidemiologiczne, komórkowe i osocza22,23. W niniejszym badaniu badanie wpływu leków modyfikujących lipidy w buforze wykazało, że wysoce lipofilne leki, takie jak ezetymib, lowastatyna, symwastatyna i atorwastatyna, indukowały wyższy poziom złożoności morfologii cząstek cholesterolu w porównaniu z efektem niższego poziomu obserwowanym w przypadku wysoce hydrofilowych leków z rozuwastatyną i fluwastatyną. Wyniki te są dobrze zgodne z naszym poprzednim badaniem opisującym nieenzymatyczny wpływ statyn na modulowanie tworzenia cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w próbkach buforu i surowicy21. W związku z tym wyniki niniejszego badania ujawniły nieenzymatyczny mechanizm działania leków zawierających ezetymib, niacynę, fibrat i kwasy tłuszczowe omega-3, które mogą odgrywać bezpośrednią rolę w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu. Możliwe jest, że interakcje między lekami a agregatami cholesterolu prowadzą do składania się cząstek cholesterolu o dużych rozmiarach od 2 do 60μm2, wykazujących morfologię pasm kulistych i liniowych.

Poza tym wyniki uzyskane przy użyciu oczyszczonych cząstek lipoprotein sugerują interakcje między agregatami cholesterolu a czynnikami osocza, w tym białkami VLDL, LDL i HDL, które mogą zmieniać skład i właściwości morfologiczne cząstek cholesterolu. Wyniki leczenia farmakologicznego z udziałem oczyszczonych cząstek lipoprotein wykazały wyższy poziom wpływu leku na tworzenie cząstek VLDL w porównaniu z ich wpływem obserwowanym na tworzenie cząstek cholesterolu LDL. Jako proleki stosowano lowastatynę, symwastatynę i ezetymib, a ich dawki w testach mogą być wyższe od stężeń fizjologicznych.

Co ciekawe, badania przesiewowe próbek surowicy wykazały różnice w wpływie leku na zmianę profili tworzenia cząstek cholesterolu VLDL, LDL i HDL, w szczególności ich wpływ na tworzenie się cząstek LDL i HDL o kształcie liniowym. Leki te indukowały zmniejszenie tworzenia się cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w kształcie liniowym zarówno w dyslipidemii, jak i w normalnych próbkach surowicy dopasowanych do wieku. Obserwowane działanie leku na zmniejszenie powstawania cząstek o kształcie liniowym było większe w przypadku symwastatyny, ezetymibu, lowastatyny i niacyny. Identyfikacja cząstek cholesterolu o morfologii pasm kulistych i liniowych w próbkach surowicy prawidłowej i dyslipidemii sugeruje, że cząstki o podobnej morfologii mogą tworzyć się w warunkach in vivo. Wcześniejsze badania wykazały obecność kryształów cholesterolu przypominających dysk i igły w blaszkach miażdżycowych w modelach myszy ludzkich i ApoE-/- i LDLR-/- 24,25,26,27,28.

Cząsteczki HDL krążące we krwi występują jako niejednorodna mieszanina, a poziom małych i dużych cząstek HDL wraz z aktywnością funkcjonalną są ważnymi czynnikami wywierającymi ich działanie kardioprotekcyjne poprzez odwrotny szlak transportu cholesterolu29,30. Ostatnie badania podkreśliły znaczenie identyfikacji podfrakcji cząstek cholesterolu HDL w celu wyjaśnienia ich roli w wielu funkcjach biologicznych, takich jak wypływ cholesterolu, działanie przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe iprzeciwutleniające. Ponadto w wielu badaniach wykazano wpływ terapii obniżającej stężenie lipidów na zwiększenie niskiego do umiarkowanego poziomu HDL w osoczu 1,5,21. W związku z tym wyniki tego badania dostarczają nowych informacji na temat cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu. Warto zauważyć, że wykrycie wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL o kształcie liniowym w próbkach surowicy osób z dyslipidemią sugeruje, że mogą one być wiarygodnym biomarkerem zarówno do diagnozy, jak i oceny efektów leków modyfikujących lipidy u pacjentów. Konieczne są jednak dalsze badania z wykorzystaniem dużych próbek klinicznych, aby lepiej zrozumieć cząsteczki cholesterolu o odrębnej morfologii i ich związek z chorobami układu krążenia.

W teście tablicy płytkowej do badania wpływu leku na gromadzenie się cząstek cholesterolu użyliśmy 2 μg znakowanych fluorescencyjnie agregatów cholesterolu i 5 μg każdego leku, ponieważ: (1) leki kompetycyjnie wiążą się zarówno z cholesterolem znakowanym fluorescencyjnie, jak i endogennymi lipidami obecnymi w próbkach surowicy; (2) Z każdej próbki uzyskaliśmy od 5 000 do 10 000 cząsteczek cholesterolu, które są łączone w duże rozmiary i kształty w zakresie od ~ 2 - 60 μ2; (3) zaobserwowaliśmy duże różnice w odpowiedzi na leki wśród próbek surowicy inkubowanych z lekami (dawki od 300 ng do 5 μg) i ~1 - 5% z nich inkubowanych z wysokimi dawkami nie wykazało wykrywalnych zmian w profilu tworzenia cząstek cholesterolu; oraz (4) interakcja między agregatami cholesterolu a lekami obniżającymi poziom lipidów odbywa się za pośrednictwem procesu nieenzymatycznego. W związku z tym stężenia odczynników użytych w teście mogą być wyższe niż ich poziom fizjologiczny.

Podsumowując, z powodzeniem wykazaliśmy zalety opisanej w tym badaniu metody obrazowania in vitro w celu określenia wpływu szerokiego spektrum leków obniżających stężenie lipidów na modulację morfologii i składu cząsteczek cholesterolu. Podejście polegające na wizualizacji i ilościowym określeniu morfologii cząstek lipidowych za pomocą konstelacji algorytmów analizy obrazu może pomóc zarówno w diagnostyce miażdżycy, jak i w ocenie wyników terapii obniżającej stężenie lipidów u pacjentów.

Oświadczenia

Dr Madasamy otrzymał wsparcie w postaci grantu od firmy Plaxgen, Inc. i ma konkurencyjny interes finansowy. Pozostali autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu badawczego Plaxgen przyznanego SM (PLX-1008). Dziękujemy Instytutowi Badawczemu Fundacji Badań Medycznych Palo Alto za pobranie próbek surowicy od osób cierpiących na miażdżycę na podstawie zgody IRB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TopFluor fluorescencyjny cholesterolAvanti Polar lipidymagazyn 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
symwastatyna (pro-lek)Cayman Chemicalssklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
lowastatyna (pro-lek)Cayman Chemicalssklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
rosuwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
atorwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
fluwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
ezetymib (pro-lek)Cayman Chemicalsstore 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
NiacynaMilliporeSigmasklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° Fibrat C
MilliporeSigmasklep 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
kwas tłuszczowy omega-3MilliporeSigmastore 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
oczyszczone białka/cząstki VLDLLee Bio
oczyszczone białka/cząsteczki LDLLee Bio
oczyszczone białka/cząsteczki HDLLee Bio
Human dopasowane do wieku serumDx Biosamples
Ludzka surowica miażdżycowaBioserve
Ludzka normalna surowicaStanforda Zestaw
Roche Diangostics
Zestaw odczynników do pomiaru HDLRoche Diangostics
Pomiar cholesterolu całkowitegoRoche Diangostics
Obrazowanie Amnis Cytometr przepływowyOprogramowanie do analizy obrazu Amnis Inc
IDEAS AnalizatorAmnis Inc-1
, ChemWel 2902Analizator biochemiczny technologii
, Intergra 400Roche Diangostics
odczynników do pomiaru LDL w centrum krwi 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania Roche Diangostics chemiczny Awarness-2

Bibliografia

  1. Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
  2. Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
  3. Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
  4. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
  5. Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
  6. Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
  7. Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
  8. Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
  9. Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
  10. Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
  11. Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118(2016).
  12. Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
  13. Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
  14. McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
  15. Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
  16. Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
  17. Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
  18. Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
  19. Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
  20. Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
  21. Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
  22. Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
  23. Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
  24. Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
  25. Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
  26. Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
  27. Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
  28. Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
  29. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
  30. Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
  31. Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metoda macierzy blaszekcytometria przepływowa z obrazowaniemanaliza morfologicznapróbki surowicydiagnostyka miażdżycydziałanie lekówtworzenie się cząstekanaliza obrazu
Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.