Artykuł metodologiczny

Zróżnicowane działanie leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu morfologii cząstek cholesterolu

DOI:

10.3791/56596

⸱

10 listopada 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było oszacowanie in vitro wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu. Porównanie leków obniżających stężenie lipidów ujawniło różnice w ich działaniu w modulowaniu cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leczenie pacjentów z dyslipidemią lekami obniżającymi poziom lipidów prowadzi do znacznego obniżenia poziomu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) oraz niskiego do umiarkowanego poziomu wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) w osoczu. Jednak możliwa rola tych leków w zmianie morfologii i dystrybucji cząsteczek cholesterolu jest słabo poznana. W tym artykule opisano ocenę in vitro działania leków obniżających stężenie lipidów w modulowaniu cech morfologicznych cząstek cholesterolu metodą płytki nazębnej w połączeniu z obrazową cytometrią przepływową. Analizy obrazowe cząsteczek cholesterolu wykazały, że lowastatyna, symwastatyna, ezetymib i atorwastatyna indukują tworzenie zarówno globularnych, jak i liniowych cząstek w kształcie pasma, podczas gdy niacyna, fibraty, fluwastatyna i rosuwastatyna indukują tworzenie tylko cząstek o kształcie kulistym. Następnie oczyszczone cząsteczki lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i LDL inkubowane z tymi lekami wykazały zmiany w morfologii i teksturze obrazu subpopulacji cząstek cholesterolu. Ponadto badania przesiewowe 50 próbek surowicy wykazały obecność wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL w kształcie liniowym u osób z dyslipidemią (średnio 18,3%) w porównaniu z próbkami normalnymi w tym samym wieku (średnia 11,1%). Zaobserwowaliśmy również znaczne różnice w wpływie leków obniżających poziom lipidów na zmniejszenie tworzenia się cząstek cholesterolu LDL i HDL w próbkach surowicy. Odkrycia te wskazują, że leki obniżające poziom lipidów, oprócz działania hipolipidemicznego za pośrednictwem komórek, mogą bezpośrednio modulować morfologię cząstek cholesterolu poprzez nieenzymatyczny mechanizm działania. Wyniki tych wyników mogą pomóc w diagnostyce miażdżycy i przewidzieć optymalną terapię obniżającą stężenie lipidów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne badania kliniczne wykazały korzystny wpływ leków obniżających poziom lipidów w obniżaniu poziomu cholesterolu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w osoczu oraz niskim lub umiarkowanym poziomie wzrostu cholesterolu lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL), co zapobiega zarówno pierwotnym, jak i wtórnym występowaniom niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą1,2,3,4,5. Statyny, grupa inhibitorów enzymu reduktazy HMG-CoA, blokują endogenną syntezę cholesterolu w wątrobie, co z kolei prowadzi do obniżenia poziomu krążącego cholesterolu LDL we krwi6,7. Podobnie, w obniżaniu poziomu lipidów niacyny pośredniczy jej bezpośrednie i niekonkurencyjne hamowanie acylotransferazy diacyloglicerolu hepatocytów-2, kluczowego enzymu wątrobowego biorącego udział w syntezie trójglicerydów8. Dla porównania, ezetymib zmniejsza stężenie LDL w osoczu poprzez ograniczenie wchłaniania egzogennego cholesterolu poprzez wiązanie się z białkiem Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) znajdującym się w komórkach nabłonka jelita cienkiego9. Fenofibrat, inny lek obniżający poziom lipidów, znacznie zmniejsza stężenie trójglicerydów w osoczu, a także umiarkowanie obniża poziom cholesterolu LDL poprzez szlak receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów10. Poza tym doniesiono, że kwas tłuszczowy omega-3 ma działanie przeciwmiażdżycowe ze względu na jego zdolność do obniżania poziomu LDL11.

Leki obniżające poziom lipidów, oprócz ich głównego wpływu na obniżenie poziomu cholesterolu LDL, mają szereg korzystnych efektów plejotropowych, w tym zwiększenie poziomu HDL, poprawę funkcji śródbłonka, zmniejszenie stanu zapalnego i hamowanie agregacji płytek krwi12,13,14. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych leków w zwiększaniu stężenia cząsteczek cholesterolu HDL i modyfikowaniu ich cech strukturalnych nie jest w pełni poznany. Ponieważ leki te są powszechnie przepisywane w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych związanych z miażdżycą (CVD), konieczne jest dalsze badanie ich możliwej roli w określaniu cech morfologicznych i rozmieszczenia cząsteczek lipidów. Lipidom ludzkiego osocza składa się z około 600 różnych lipidów i 22 różnych typów molekularnych cholesterolów, które są obecne w różnych rozmiarach, kształtach, gęstościach i składach15,16,17. Metody analityczne, takie jak ultrawirowanie, NMR i gradientowa elektroforeza żelowa, są wykorzystywane do charakteryzowania cząstek LDL i HDL oraz ich podfrakcji18,19. Zastosowanie tych metod ogranicza się jednak do badań mających na celu określenie wpływu leków na modulację morfologii i składania cząsteczek lipidowych. Tablica płytek opartych na cytometrze przepływowym jest funkcjonalnym testem biochemicznym opracowanym do wykrywania i wizualizacji cząstek lipidów i płytek amyloidowych pochodzących z surowicy20. Opisane w niniejszej pracy zalety metody obrazowania in vitro umożliwiają identyfikację działania leków modulujących stężenie lipidów w zmianie morfologii i rozmieszczenia cząsteczek cholesterolu w próbkach buforowych i surowicy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie znakowanych fluorescencyjnie leków na cholesterol i lipidy

UWAGA: Znakowane fluorescencyjnie agregaty cholesterolu i statyny zostały przygotowane zgodnie z opisem w naszym poprzednim artykule21. Szczegółowe informacje na temat odczynników, cytometru przepływowego do obrazowania, analizatorów biochemicznych i oprogramowania do analizy danych wykorzystanych w tym badaniu można znaleźć w Tabeli materiałów.

  1. Rozpuścić socylitowany cholesterol znakowany fluorescencyjnie (1 mg, Ex/Em = 495 nm/507 nm) w proszku w 1 ml 100% alkoholu.
  2. Odwirować próbkę przez 3 minuty przy 2,040 x g i użyć supernatantów zawierających rozpuszczalne agregaty cholesterolu znakowane fluorescencyjnie w teście płytki pamieńkowej.
  3. Do przygotowania leków należy indywidualnie rozpuścić proszki (2 mg) symwastatyny, lowastatyny, atorwastatyny, ezetymibu i kwasów tłuszczowych omega-3 w 1 ml 100% alkoholu.
  4. Po odwirowaniu przez 3 minuty przy 2,040 x g, użyć supernatantów zawierających leki w teście.
  5. Podobnie, rozpuścić pojedynczo proszki (2 mg) fluwastatyny, rosuwastatyny, niacyny i fibratu w 1 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy 2 mg / ml.
  6. Po odwirowaniu przez 3 minuty przy 2 040 x g, użyć supernatantów zawierających leki w teście płytki rozsiewaczowej.

2. Test tablicy nazębnej do badania powstawania cząstek cholesterolu in vitro

  1. Użyj analizatora biochemicznego-1 (patrz Tabela materiałów), aby skonfigurować test tablicy płytki nazębnej pod kątem tworzenia się cząstek cholesterolu. Przeprowadzić test na okrągłodennej, 96-dołkowej płytce o niskiej wiązalności białka, używając odczynników przygotowanych w sekcji 1. Utrzymać końcową objętość reakcyjną w każdym studzience na poziomie 200 μl i przeprowadzić wszystkie testy w trzech egzemplarzach.
    1. Najpierw załaduj 194,5 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki.
    2. Do każdej studzienki dodać 2,5 μl (5 μg) każdego roztworu leku obniżającego poziom lipidów i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1, aby równomiernie wymieszać lek z roztworem. Do ujemnych próbek kontrolnych nie dodaje się żadnego leku.
    3. Na koniec dodać 2 μl (2 μg) znakowanego fluorescencyjnie roztworu agregatu cholesterolu do każdej studzienki i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
    4. Inkubować płytkę na wytrząsarce laboratoryjnej przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
    5. Po inkubacji uzyskaj obrazy cząstek za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej.

3. Przechwytywanie obrazów cząsteczek cholesterolu za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej

  1. Otwórz szablon akwizycji danych, aby załadować poprawne ustawienia instrumentu. Kliknij "Plik", a następnie wybierz "Otwórz szablon..." i wybierz plik szablonu.
  2. Kliknij "Flush, Lock, Load", aby przygotować przyrząd do ładowania próbki.
  3. Gdy otworzy się okno dialogowe "Załaduj próbkę", kliknij "OK", aby załadować 50 μl próbek z każdego dołka przygotowanego w sekcji 2 do obrazowego cytometru przepływowego.
  4. Kliknij "Uruchom|Setup", aby wyświetlić cząstki w obszarze obrazowania w czasie rzeczywistym.
  5. Gdy cząstki w obszarze obrazowania są dobrze ostre, kliknij "Uruchom|Acquire", aby uzyskać obrazy każdego obiektu jednocześnie w sposób wysokoprzepustowy dla ciemnego pola (rozpraszanie boczne/SSC), jasnego pola (BF), zielonej fluorescencji i żółtej fluorescencji.
  6. Powtórz kroki 3.2 - 3.5, aby uzyskać 5 000 - 10 000 cząstek z każdej próbki.
  7. Analizuj wszystkie surowe pliki obrazów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu określenia intensywności fluorescencji obiektu i zmian morfologicznych.
    1. Kliknij przycisk "Narzędzia" u góry oprogramowania do analizy obrazu, a następnie wybierz "Pliki danych wsadowych" z menu rozwijanego, co otworzy okno "Partie".
    2. W oknie "Partie" kliknij przycisk "Dodaj partię", co otworzy okno "Zdefiniuj partię".
    3. W oknie "Zdefiniuj wsad" kliknij przycisk "Dodaj pliki" i wybierz surowe pliki obrazów, kliknij przycisk "Szablon" i wybierz odpowiedni plik szablonu analizy danych, a następnie wybierz "OK" i "Prześlij partie", aby rozpocząć przetwarzanie i analizę plików obrazów raw.

4. Test płytki nazębnej oparty na ocenie wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki cholesterolu

  1. Jak opisano w kroku 2.1, wykonaj test tworzenia cząstek cholesterolu przy użyciu oczyszczonych lipoprotein/cząstek VLDL, LDL i HDL. Wykonaj test tablicy płytki nazębnej na 96-dołkowej płytce.
    1. Najpierw załaduj wszystkie studzienki PBS; użyj 200 μl końcowej objętości dla każdej studzienki.
  2. W celu kontroli ujemnej dodaj 4 μg białek/cząstek VLDL, LDL lub HDL indywidualnie do każdej studzienki bez leków i potrząsaj płytką przez 30 sekund.
    1. W celu zbadania działania leku obniżającego poziom lipidów, dodaj 4 μg białek/cząstek VLDL, LDL lub HDL indywidualnie do każdego dołka i potrząsaj płytką przez 30 sekund.
    2. W przypadku studzienek z dodatkiem 4 μg VLDL, LDL lub HDL, dodaj 2,5 μl (5 μg) roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub niacyny i potrząsaj płytką przez 30 s, umieszczając ją w analizatorze biochemicznym-1.
    3. Na koniec dodać 2 μl (2 μg) znakowanego fluorescencyjnie roztworu agregatu cholesterolu do wszystkich studzienek i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
  3. Inkubować płytkę przez 2 godziny w wytrząsarce laboratoryjnej ustawionej na 37 °C i 200 obr./min.
  4. Pobrać próbki za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej, wykonując kroki 3.1 - 3.5.
  5. Analizuj pliki obrazów RAW za pomocą oprogramowania do analizy obrazów zgodnie z opisem w kroku 3.7.
  6. W szablonie analizy należy użyć poniższego schematu bramkowania w celu identyfikacji subpopulacji cząstek cholesterolu.
    1. Na wykresie liczby pikseli nasyconych w kanale zielonym (oś x) i liczby pikseli nasyconych w kanale ciemnego pola (oś y) odrzuć obiekty z co najmniej jednym nasyconym pikselem w dowolnym kanale.
    2. Wykreśl obiekty/cząstki bez nasyconych pikseli, używając intensywności kanału zielonego (oś x) i intensywności SSC (oś y): obiekty wpadają w jeden z trzech regionów (VLDL, LDL, HDL) w oparciu o ich kanał zielony i intensywność SSC.
      UWAGA: Bramki te zostały stworzone na podstawie danych wygenerowanych z eksperymentów kontrolnych przeprowadzonych przy użyciu oczyszczonych cząstek/białek VLDL, LDL i HDL bez leku.
  7. Aby określić działanie leku obniżającego poziom lipidów dla każdej próbki, należy obliczyć całkowite stężenie cząstek lipoprotein, a także procent każdej subpopulacji (VLDL, LDL, HDL), jak opisano w kroku 6.5.
    1. Obliczyć stężenia cząstek (cząstki/ml), stosując następujące równanie:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Regiony bramkowania VLDL, LDL i HDL na fluorescencyjnym wykresie kropkowym wykrywają ~ 80% swoich odpowiednich subpopulacji, a pozostałe ~ 20% cząstek nakłada się na inne regiony bramkowania.

5. Pomiar stężenia lipidów w próbkach surowicy

  1. Do oznaczania stężeń LDL, HDL, cholesterolu i trójglicerydów za pomocą analizatora chemicznego-2 należy użyć próbek surowicy uzyskanych od osób normalnych i z dyslipidemią w tym samym wieku.
  2. Zdefiniuj nieprawidłowe stężenie LDL, HDL, cholesterolu i trójglicerydów na podstawie ich stężenia zidentyfikowanego poza górnymi i dolnymi wartościami odniesienia w próbkach surowicy.
  3. Postępuj zgodnie z normalną wartością referencyjną zalecaną przez producenta odczynnika: cholesterol (4 - 200 mg / dl), HDL (3,0 - 65 mg / dl), LDL (4 - 100 mg / dl) i trójglicerydy (9 - 200 mg / dl).
  4. Zidentyfikuj próbki surowicy, które mają nieprawidłową wartość poniżej dolnej wartości referencyjnej lub powyżej wyższej wartości odniesienia dla cholesterolu i trójglicerydów, i użyj ich do badań przesiewowych w obecności i bez leków obniżających poziom lipidów.

6. Analiza wpływu leków na powstawanie cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy

  1. Użyj analizatora biochemicznego-1, aby skonfigurować test tablicy płytkowej pod kątem tworzenia się cząstek cholesterolu w próbkach surowicy. Wykonaj test na okrągłej dnie 96-dołkowej płytce o niskiej zawartości białka. Użyć końcowej objętości reakcyjnej 200 μl/basenik i wykonać wszystkie testy w trzech egzemplarzach.
  2. Przygotuj płytkę, ładując odczynniki w sposób stopniowy.
    1. Przygotuj studzienki kontrolne.
    2. Załaduj 193 μl PBS do każdej studzienki.
    3. Dodać 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na studzienkę) i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biologicznego.
    4. Dodać 2 μl (2 μg) znakowanego fluorescencyjnie roztworu agregatu cholesterolu do każdej studzienki i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
  3. Przygotuj studnie z lekami.
    1. Załaduj 191 μl PBS do każdej studzienki.
    2. Dodać 2,5% (v/v) surowicy pacjenta (tylko jedna próbka surowicy na studzienkę) i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
    3. Dodać 2 μl roztworu ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny lub niacyny (4 μg) do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej. Dodaj tylko jeden lek na studzienkę i potrząsaj płytką przez 30 sekund, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
    4. Dodać 2 μl znakowanego fluorescencyjnie roztworu zbiorczego cholesterolu (2 μg) do każdej studzienki i wstrząsać płytką przez 30 s, umieszczając ją na płytce reakcyjnej analizatora biochemicznego-1.
  4. Załaduj leki dopiero po załadowaniu wszystkich studzienek (kontrolnych i poddanych działaniu leków) odpowiednich próbek surowicy, a na końcu tego kroku dodaj cholesterol znakowany fluorescencyjnie.
  5. Inkubować płytkę przez 2 godziny w wytrząsarce laboratoryjnej ustawionej na 37 °C i 200 obr./min.
  6. Pobrać próbki za pomocą obrazowego cytometru przepływowego zgodnie z ustawieniami opisanymi w krokach 3.1 - 3.6.
  7. Użyj oprogramowania do analizy obrazów do przetwarzania wsadowego wszystkich plików obrazów przy użyciu tego samego szablonu, jak opisano w krokach 3.7.
    1. Przeprowadzić analizę danych, rysując bramki na powierzchni zgodnie z opisem w krokach 4.5 i 4.6.
  8. Aby określić efekt/odpowiedź na lek obniżający poziom lipidów (niski, umiarkowany i wysoki) dla każdej próbki, należy obliczyć całkowite stężenie cząstek lipoprotein, a także procent całkowitych cząstek składających się z subpopulacji VLDL, LDL i HDL.
  9. Wykreśl populacje VLDL, LDL i HDL na histogramie obrazu jasnego pola obiektu, szerokość odjętą od długości (długość - szerokość) i przejdź do obszarów kulistych lub liniowych: obiekty o (długość - szerokość) ≤2 μm wpadają w obszar kulisty w celu obliczenia procentu cząstek o kształcie kulistym i liniowym.
  10. Porównaj procent cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w kształcie kulistym i liniowym zidentyfikowanych dla każdej próbki surowicy inkubowanej z każdym lekiem i bez niego. Spośród potrójnych wartości uzyskanych dla każdej próbki surowicy, zaakceptuj procent cząstek LDL i HDL w kształcie kulistym i liniowym, które mieszczą się w zakresie SD ±2 w celu określenia działania leku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test płytki nazębnej oparty na analizie wpływu leków obniżających poziom lipidów na tworzenie się cząsteczek cholesterolu:

W celu oceny wpływu statyn na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu, fluorescencyjne agregaty cholesterolu były indywidualnie inkubowane z lowastatyną, symwastatyną, atorwastatyną, rosuwastatyną i fluwastatyną w buforze. Wszystkie te próbki zostały pobrane przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej w celu uchwycenia obrazów cząstek cholesterolu do analizy morfologicznej, jak pokazano na Rysunek 1 i Rysunek 2. Co ciekawe, analiza wpływu leku na tworzenie się cząsteczek cholesterolu w buforze wykazała, że lowastatyna, symwastatyna i atorwastatyna indukują tworzenie się niejednorodnej populacji cząsteczek cholesterolu o różnych rozmiarach i kształtach, Rysunek 3a-c. I odwrotnie, cząsteczki cholesterolu powstałe w obecności rosuwastatyny, fluwastatyny i kontroli ujemnej (bez leku) były jednorodne pod względem kształtu i morfologii, jak pokazano na Rysunek 3d-f. Ponadto zaobserwowano, że lowastatyna, symwastatyna i atorwastatyna indukowały tworzenie się cząsteczek cholesterolu wykazujących morfologię zarówno globularną, jak i liniową, podczas gdy rosuwastatyna i fluwastatyna indukowały tworzenie cząstek cholesterolu o morfologii tylko globularnej. Wpływ statyn na indukowanie tworzenia nici liniowych stwierdzono w rzędzie 16% dla lowastatyny, 2% dla symwastatyny i 0,2% dla atorwastatyny.

Aby dokładniej ocenić wpływ leków obniżających poziom lipidów na tworzenie cząstek, znakowane fluorescencyjnie agregaty cholesterolu były indywidualnie inkubowane z ezetymibem, fibratem, niacyną i kwasem tłuszczowym omega-3. Jak zaobserwowano w przypadku statyn, leki te indukowały tworzenie się cząsteczek cholesterolu o niejednorodnych rozmiarach i kształtach, jak pokazano na Rysunek 4a-d. Wśród nich ezetymib indukował tworzenie się cząsteczek cholesterolu wykazujących zarówno morfologię pasma globularnego, jak i liniowego, podczas gdy fibrat, niacyna i kwasy tłuszczowe omega-3 indukowały tworzenie się tylko cząsteczek cholesterolu w kształcie kulistym. W związku z tym wpływ leków na tworzenie cząstek cholesterolu w kształcie nici liniowej był rzędu 3% dla ezetymibu, 0% dla fibratu, 0% dla niacyny i 0% dla kwasów tłuszczowych omega-3.

Analiza morfologiczna wykazała, że każda cząsteczka cholesterolu w kształcie kulistej lub liniowej nici składa się z wielu mniejszych cząsteczek połączonych ze sobą. Zidentyfikowane rozmiary fluorescencyjnych dodatnich cząstek cholesterolu kulistego mieszczą się w zakresie ~2 - 30 μm2, podczas gdy rozmiary cząstek o kształcie liniowym mieszczą się w zakresie ~2 - 60 μm2.

Analiza wpływu leków obniżających poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki VLDL i LDL:

Aby dokładniej zbadać powstawanie cząsteczek cholesterolu w obecności lipoprotein, znakowane fluorescencyjnie agregaty cholesterolu były indywidualnie inkubowane z oczyszczonymi białkami/cząsteczkami VLDL, LDL i HDL. Wyniki pokazały, w porównaniu z inkubacją z cząstkami LDL i HDL, że agregaty cholesterolu inkubowane z białkami VLDL powodowały tworzenie większej liczby cząsteczek cholesterolu, Rysunek 5. Ponadto w populacjach VLDL zaobserwowano dwie główne frakcje cząstek cholesterolu, co sugeruje ich częściową transformację we frakcję LDL podczas inkubacji z fluorescencyjnie znakowanymi agregatami cholesterolu. Analiza obrazu cząstek wykazała obecność zarówno cząstek kulistych (~97%), jak i liniowych (~3%) w populacjach VLDL, LDL i HDL. Zakresy wielkości cząstek kulistych wynoszą ~2 - 30 μm2, podczas gdy zakresy wielkości cząstek liniowych wynoszą ~2 - 60 μm2.

W celu zbadania wpływu leku obniżającego poziom lipidów na oczyszczone cząsteczki, cząsteczki VLDL i LDL były indywidualnie inkubowane z ezetymibem, lowastatyną, symwastatyną i niacyną. W rezultacie, w porównaniu z eksperymentami kontrolnymi bez leku, wpływ leku obserwowany na tworzenie cząstek VLDL był większy w przypadku ezetymibu, symwastatyny, lowastatyny i niacyny. Cząsteczki LDL inkubowane z lekami wykazywały główną pojedynczą frakcję, a wpływ leku na tworzenie cząstek był wyższy w przypadku ezetymibu, symwastatyny, lowastatyny i niacyny, Ryc. 6.

Warianty działania leków obniżających poziom lipidów w zmianie rozkładu cząsteczek cholesterolu w próbkach surowicy:

Poprzednie eksperymenty przeprowadzono w roztworze buforowym z oczyszczonymi lipoproteinami w celu oceny działania leku. W związku z tym w kolejnym kroku zbadano skuteczność leków obniżających poziom lipidów w tworzeniu cząstek cholesterolu przy użyciu 50 próbek surowicy pobranych od 25 osób z dyslipidemią i 25 osób zdrowych w tym samym wieku. Odpowiedź na lek w każdej próbce surowicy mierzono na podstawie zmian w profilu tworzenia się cząsteczek cholesterolu w obecności i bez leków. W teście macierzy płytkowej każda próbka surowicy została przebadana pod kątem leków ezetymib, lowastatyny, symwastatyny i niacyny. Wyniki ujawniły rozbieżności między tymi lekami w modulowaniu dystrybucji cząstek VLDL, LDL i HDL w próbkach surowicy, w szczególności ich wpływ na redukcję LDL i zwiększenie tworzenia cząsteczek cholesterolu HDL. Trzej przedstawiciele próbek surowicy dyslipidemii, wykazujący unikalne odpowiedzi na leki obniżające poziom lipidów, pokazano na Rycina 7.

Identyfikacja wpływu leku na modulację morfologii cząsteczek cholesterolu LDL i HDL pochodzących z surowicy:

Analiza fenotypu cząstek cholesterolu pochodzących z surowicy ujawniła obecność zarówno nici liniowych, jak i subpopulacji VLDL, LDL i HDL w kształcie kulistym, potwierdzając tym samym podobną morfologię zidentyfikowaną w eksperymentach przeprowadzonych zarówno w buforze, jak i z oczyszczonymi cząstkami lipoprotein, jak pokazano w Rysunek 8. Jednak rozkład subpopulacji cząstek cholesterolu o kulistym i liniowym kształcie znacznie różnił się wśród osób z dyslipidemią i zdrowych osób w tym samym wieku. Warto zauważyć, że testy kontrolne przeprowadzone bez leków wykazały różnice w rozmieszczeniu cząstek cholesterolu LDL w kształcie nici liniowej między dyslipidemią (średnia 2,0%) a normalnymi próbkami surowicy w dopasowanym wieku (średnio 1,3%). Podobnie podwyższony poziom cząstek cholesterolu HDL w kształcie pasma liniowego obserwowano w próbkach dyslipidemii (średnio 18,3%) w porównaniu z próbkami surowicy dopasowanymi pod względem wieku (średnio 11,1%). W korelacji, testy przeprowadzone w obecności leków w próbkach surowicy dyslipidemii wykazały znaczące zmniejszenie tworzenia się cząsteczek cholesterolu HDL w kształcie liniowym dla symwastatyny (średnio 8,3%), ezetymibu (średnio 11,5%), lowastatyny (średnio 11,7%) i brak redukcji niacyny (średnio 18,3%). Ponadto zaobserwowano zmniejszenie tworzenia cząstek cholesterolu LDL o kształcie liniowym w próbkach surowicy dyslipidemii podczas inkubacji z lekami przedstawionymi w Tabeli 1.

Ponadto, testy przeprowadzone w obecności leków w próbkach surowicy kontrolnej dopasowanej do wieku wykazały znaczne zmniejszenie liniowego kształtu cząsteczek cholesterolu HDL w symwastatynie (średnio 5,0%), ezetymifie (średnio 8,2%), lowastatynie (średnio 8,7%) i niacynie (średnio 10,8%), jak pokazano w Tabeli 2. Zarówno dyslipidemia, jak i normalne próbki surowicy w dopasowanym wieku, wykazujące wywołane lekiem zmniejszenie cząstek cholesterolu LDL i HDL o kształcie liniowym, wykazały względny wzrost cząstek cholesterolu w kształcie kulistym (dane nie pokazane).

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram ilustrujący proces wizualizacji morfologii cząsteczek cholesterolu in vitro. a, b) Dodanie leku obniżającego stężenie lipidów w próbkach buforu lub surowicy. c) Dodanie do próbek agregatów rozpuszczalnego cholesterolu znakowanych fluorescencyjnie. d) Pobieranie otrzymanych próbek do analizy morfologicznej nierozpuszczalnych cząstek cholesterolu przy użyciu obrazowej cytometrii przepływowej. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja dwóch odrębnych morfologii cząstek cholesterolu za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej. (a) Cząstki są segregowane na populacje liniowe lub kuliste na podstawie analizy teksturalnej obrazów w jasnym polu. W szczególności wykres punktowy średniej jednorodności H (oś x) i średniej entropii H (oś y) zawiera dwa bramkowane obszary do wykrywania kulistych (czerwonych) i liniowych cząstek cholesterolu w kształcie pasma (niebieskiego). (b) Obrazy przedstawiające morfologię cząstek o kształcie kulistym zidentyfikowanych w populacji 1. (c) Obrazy cząstek w kształcie pasma liniowego zidentyfikowanych w populacji 2. d) Histogram przedstawiający rozkład wszystkich fluorescencyjnych dodatnich cząstek cholesterolu wykorzystany do określenia ich stężenia i subpopulacji. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Galerie zdjęć przedstawiające wpływ statyn na modulowanie powstawania cząsteczek cholesterolu. Jasne pole odnosi się do obszaru podobnego do FSC w konwencjonalnym cytometrze przepływowym. Kanał zielony odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 505 - 560 nm, a kanał żółty odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 560-595 nm. A-E) Galerie zdjęć przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu powstałych w obecności odpowiednio lowastatyny, symwastatyny, atorwastatyny, rosuwastatyny i fluwastatyny. f) Tworzenie się cząsteczek cholesterolu przy braku statyn (kontrola ujemna). Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Demonstracja zróżnicowanego wpływu leków obniżających poziom lipidów na modulowanie tworzenia cząsteczek cholesterolu. (a-d) Galerie zdjęć przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu powstałych w obecności odpowiednio ezetymibu, niacyny, fibratu i kwasu tłuszczowego omega-3. Kanał zielony odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 505 - 560 nm, a kanał żółty odnosi się do emisji fluorescencji wykrytej w zakresie 560-595 nm. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Analiza tworzenia się cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL przy braku leku. Wykresy punktowe: Oś X wyświetla widmo cząsteczek cholesterolu wykrytych w zielonym kanale fluorescencji (505 - 560 nm), a oś Y wyświetla rozproszenie boczne. Bramkowanie pokazuje obszary cząstek VLDL, LDL i HDL wykrytych na fluorescencyjnych wykresach kropkowych. a) Tworzenie się cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego VLDL. (b) Reprezentatywne obrazy cząstek VLDL. (c) Tworzenie się cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego LDL. (d) Reprezentatywne obrazy cząsteczek LDL. e) Tworzenie się cząsteczek cholesterolu w obecności oczyszczonego HDL. (f) Reprezentatywne obrazy cząstek HDL. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Wykazanie wpływu leków obniżających stężenie lipidów na oczyszczone cząsteczki cholesterolu VLDL i LDL. a) Cząstki VLDL bez leku. b) Cząstki VLDL inkubowane z ezetymibem. c) Cząstki VLDL inkubowane z lowastatyną. d) Cząstki VLDL inkubowane z symwastatyną. e) Cząstki VLDL inkubowane z niacyną. f) Cząsteczki LDL inkubowane bez leku. g) Cząsteczki LDL inkubowane z ezetymibem. h) Cząsteczki LDL inkubowane z lowastatyną. (i) Cząsteczki LDL inkubowane z symwastatyną. j) Cząsteczki LDL inkubowane z niacyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Fluorescencyjne wykresy punktowe pokazujące zróżnicowany wpływ leków obniżających poziom lipidów w modulowaniu tworzenia cząstek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w próbkach surowicy. W górnym rzędzie badanie przesiewowe surowicy 1 wykazujące niski poziom odpowiedzi na lek w zwiększaniu tworzenia cząstek HDL od 0 do 15%; środkowy rząd, badanie przesiewowe surowicy 2 wykazujące umiarkowany poziom odpowiedzi na lek w zwiększaniu od 16 do 50% cząstek HDL; Dolny rząd, badanie przesiewowe surowicy 3 wykazujące wyższy poziom odpowiedzi na lek w zwiększaniu od 51 do 100% cząsteczek HDL. (a), f, k) Próbki surowicy bez leków. (b, g, l) Próbki surowicy inkubowane z ezetymibem. (c, h, m) Próbki surowicy inkubowane z lowastatyną. (d, i, n) Próbki surowicy inkubowane z symwastatyną. (e, j, o) Próbki surowicy inkubowane z niacyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Galerie zdjęć przedstawiające morfologię cząsteczek cholesterolu zidentyfikowanych w próbce surowicy 1. Kanał zielony pokazuje obrazy emisji fluorescencji z cząstek; Rozpraszanie boczne (kanał cyjanowy) pokazuje obrazy wzbudzenia światła laserowego rozproszonego przez cząstki. (a) Kuliste i liniowe cząsteczki cholesterolu powstałe bez leku. (b), c, d, e) Cząsteczki cholesterolu powstające odpowiednio w obecności ezetymibu, lowastatyny, symwastatyny i niacyny. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jest w stanie uzyskać informacje od 2, pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jest w stanie osiągnąć wynik 2.0 pkt. pkt. pkt. czasu jest w stanie uzyskać informacje od 2, pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Identyfikator surowicyBez leku (Kontrola)Z EzetimibeZ lowastatynąZ SimvastatinZ niacyną
% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL
Zobacz materiał PNDS-011,7345,20,81Rozdział 18,10,61Rozdział 16.10,59Pytanie 13,9Klasa 2,2633,6
Zobacz materiał PNDS-02Z drugiej strony, 2,8635,9Pytanie 1,2630,9Pytanie 1,2722,70,73Rozdział 15,23,0337,7
PNDS-03Informacja o tym, że produkt leczniczy35,80,87Godzina 4,82Pytanie 1,02Rozdział 4.140,36Klasa 3,060,45Godzina 9,57
PNDS-04Godzina 2,5632,9Pytanie 1,1521,8Pytanie 1,12Rozdział 18,60,77Rozdział 17,2Rejon 3,3736,5
Zobacz materiał PNDS-050,42Pytanie 29,20,24Klasa 5,620,228,720,169,910,35Rozdział 22,2
PNDS-061.8Rozdział 28,10,4Rozdział 16,80,62150,42Godzina 9,27Pytanie 2,2838,4
Zobacz materiał PNDS-071.826,50,85Pytanie 10,5Pytanie 1,18Pytanie 19,90,62Godzina 7,32Pytanie 1,29Pytanie 23,4
Zobacz materiał PNDS-080,9822,80,86Godzina 7,281,55Rozdział 10.20,145,980,5913,3
Zobacz materiał PNDS-09Rejon 3,87Rozdział 22.11,98Godzina 9,56Wynik 1,87Rozdział 10.3Godzina 1,467,96Z drugiej strony, 2,86Godzina 9,88
Zobacz materiał PNDS-10Godzina 4,4621,9Godzina 2,57Rozdział 13,6Norma 4.04Rozdział 17.1Pytanie 2,28Pytanie 11,90,71Nr 25,7
PNDS-11Wynik 1,57Pytanie 19,2Pytanie 1,15Godzina 9,24Klasa 1,376,980,74Norma 5.03Klasa 1,3716
Zobacz materiał PNDS-12Pozycja 1,06Rozdział 16,70,66Godzina 4,380,7Z godziny 4,740,99Lokal mieszkalny 6,36Pytanie 1,14Norma 4,73
PNDS-13Godzina 4,85Rozdział 16,6Pytanie 1,2830,41.432,60,8Rozdział 16,6Norma 4.02Rozdział 31
Zobacz materiał PNDS-14Informacja o tym, że produkt leczniczy160,68Rozdział 15,40,64Rozdział 16,51,97Rozdział 10.2Wydanie orzeczenia 1,25Godzina 20.11
Zobacz materiał PNDS-151,5Pytanie 11,9Pytanie 1,1413,3Pytanie 1,21Pytanie 11,40,8Lokal mieszkalny 6,12Rejon 1,38Z dnia 4,59
Zobacz materiał PNDS-16Pytanie 1,82Rozdział 10.4Informacja o tym, że produkt leczniczyGodzina 9,59Pytanie 1,24Klasa 5,620,91Klasa 5,38Godzina 1,31Godzina 7,61
Zobacz materiał PNDS-17Godzina 1,05Rozdział 10.3Pytanie 1,02Rozdział 4.71,78Rozdział 15.10,937,81Pytanie 1,2713
Zobacz materiał PNDS-18Pytanie 1.118,760,54Rejon 3,680,61Pytanie 3,51Pytanie 1,01Norma 5.03Pytanie 1,02Klasa 6,69
Zobacz materiał PNDS-1918,520,75Godzina 6,670,765,860,91Godzina 8,36Pytanie 1,22Pytanie 11,9
Zobacz materiał PNDS-203,547,92Rejon 3,7812Lokal mieszkalny 3,56Klasa 5,81Pytanie 3,28Godzina 8,28Pytanie 3,44Rozdział 12.3
Zobacz materiał PNDS-211,88Godzina 7,692.12Pytanie 11,41,73Godzina 9,541,77Godzina 8,34Godzina 2,32Rozdział 16,7
Zobacz materiał PNDS-221,64Rozdział 7,170,35Klasa 5,750,56Rozdział 13,20,14Godzina 4,33Rozdział 1,23Rozdział 17,8
PNDS-231,54Lokal 6,27Wydanie orzeczenia 1,25Godzina 7,24Pytanie 1,02Lokal mieszkalny 6,120,733,58Rejon 1,42Klasa 6,69
Zobacz materiał PNDS-240,53Lokal 6,220,52Godzina 4,490,91Klasa 5,570,54Norma 4.010,65Pytanie 10,5
Zobacz materiał PNDS-25Wynik 2,975.11,59111,889Pytanie 1,036,54Stopień ten wynosi 2,61Rozdział 29,1

Tabela 1: Badania przesiewowe próbek surowicy dyslipidemii w teście płytki wskazują na zróżnicowany efekt leków obniżających poziom lipidów. W porównaniu z grupą kontrolną bez leku (kolumny 2, 3), próbki surowicy inkubowane z ezetymibem (kolumny 4, 5), lowastatyną (kolumny 6, 7), symwastatyną (kolumny 8, 9) i niacyną (kolumny 10, 11) wykazywały różnice w indukowaniu liniowego tworzenia cząstek cholesterolu LDL i HDL.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jest w stanie osiągnąć wynik 2.0 pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. mm pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Identyfikator surowicyBez lekuZ EzetimibeZ lowastatynąZ SimvastatinZ niacyną
% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL% Cząstki liniowe LDL% Cząstki liniowe, HDL
PNAN-01Godzina 2,0526,80,62Pytanie 11,90,56Rozdział 16,90,52Godzina 9,281.4Pytanie 11,9
PNAN-02Godzina 1,3526,31,6821,8Z drugiej strony, 59Norma 23,60,796,92Klasa 2.1629,7
PNAN-032.424,90,537,540,57Rozdział 13,80,55Klasa 5,82Pytanie 1.7Norma 4,71
PNAN-041,9921,51,54Godzina 9,451,56Godzina 8,250,313,74Z drugiej strony, 8820,8
PNAN-051,77Rozdział 18,8Rejon 1,496.03Rejon 1,65Rozdział 5.50,54Norma 4,67Rozdział 1.2Klasa 8,19
PNAN-06Pytanie 1,12Rozdział 15,20,67Godzina 4,42Godzina 2,6813,30,5Godzina 2,371,54Rozdział 16.3
PNAN-07Pytanie 1,0314,40,79Klasa 6,83Godzina 1,457,910,67Norma 5,36Wynik 1,5712
PNAN-080,98Rozdział 14,30,88Godzina 4,48cyfra arabska7,10,19Godzina 2,66Pytanie 1,02Rozdział 18,1
PNAN-09Godzina 2,85Rozdział 14,11,95Rozdział 12,6Godzina 2,34Rozdział 12,50,7Lokal 6,241,84Rozdział 18,7
PNAN10Pytanie 1,01Rozdział 10.40,85.070,51Pozycja 5.90,876,5Pytanie 1,63Rozdział 10,9
PNAN-110,92Rozdział 12.40,219,940,29Rejon 3,310,296,520,58Rozdział 10.4
PNAN-120,6Pytanie 10,50,56Klasa 5,78Pozycja 1,06Z godziny 4,740,4Klasa 3,320,91Rozdział 11,8
PNAN-13Wydanie orzeczenia 1,25Rozdział 10.30,45Rejon 3,790,67Lokal 6,530,27Pytanie 3,170,8Godzina 6,28
PNAN-14Pytanie 1,039,86Pytanie 1,12Godzina 8,51Godzina 1,056,910,6Klasa 5,94Godzina 1,05Godzina 8,14
PNAN-15Pytanie 2,28Rozdział 8.11,93Rozdział 10.42.148,861,56Godzina 6,84Godzina 2,31Godzina 8,61
PNAN-161,98Godzina 7,690,45Godzina 4,361Klasa 5,460,27Klasa 2,890,49Rozdział 4.12
PNAN-171,726,720,75Rozdział 14,80,74Godzina 9,260,49Klasa 5,581,98Rozdział 12,8
PNAN-18Godzina 2,45Godzina 6,380,85Rozdział 16,80,89Rozdział 14,20,58Pozycja 5.91.820,6
PNAN-191,67Klasa 5.120,588,630,655,70,648,81,88Informacja o tym, że produkt leczniczy
PNAN-20Pytanie 1,17Godzina 4,410,857,770,91Godzina 6,430,69Godzina 5,08Pytanie 1,21Lokal mieszkalny 6,12
PNAN-210,31Rozdział 4.180,48Ocena z dnia 6,950,19Godzina 5.090,152.10,295,93
PNAN-220,77Norma 4.02Pytanie 1,24Godzina 7,410,61Norma 5.020,29Rejon 3,490,423,98
PNAN-230,4Wydanie orzeczenia 1,250,75Godzina 6,250,88Klasa 5,910,9Norma 5,060,826,71
PNAN-240,451.10,63Rozdział 2.50,55Klasa 5,320,94.30,713,5
PNAN-250,3610,732.40,665.10,8240,73.4

Tabela 2: Badania przesiewowe próbek surowicy kontrolnej dopasowanej do wieku w teście płytki nazębnej pokazują zróżnicowany efekt leków obniżających poziom lipidów. W porównaniu z grupą kontrolną bez leku (kolumny 2, 3), próbki surowicy inkubowane z ezetymibem (kolumny 4, 5), lowastatyną (kolumny 6, 7), symwastatyną (kolumny 8, 9) i niacyną (kolumny 10, 11) wykazywały różnice w indukowaniu liniowego tworzenia cząstek cholesterolu LDL i HDL.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, rozmieszczenie i właściwości funkcjonalne cząsteczek cholesterolu VLDL, LDL i HDL w krążeniu krwi są głównie determinowane przez czynniki metaboliczne, genetyczne, epidemiologiczne, komórkowe i osocza22,23. W niniejszym badaniu badanie wpływu leków modyfikujących lipidy w buforze wykazało, że wysoce lipofilne leki, takie jak ezetymib, lowastatyna, symwastatyna i atorwastatyna, indukowały wyższy poziom złożoności morfologii cząstek cholesterolu w porównaniu z efektem niższego poziomu obserwowanym w przypadku wysoce hydrofilowych leków z rozuwastatyną i fluwastatyną. Wyniki te są dobrze zgodne z naszym poprzednim badaniem opisującym nieenzymatyczny wpływ statyn na modulowanie tworzenia cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w próbkach buforu i surowicy21. W związku z tym wyniki niniejszego badania ujawniły nieenzymatyczny mechanizm działania leków zawierających ezetymib, niacynę, fibrat i kwasy tłuszczowe omega-3, które mogą odgrywać bezpośrednią rolę w modulowaniu tworzenia cząsteczek cholesterolu. Możliwe jest, że interakcje między lekami a agregatami cholesterolu prowadzą do składania się cząstek cholesterolu o dużych rozmiarach od 2 do 60μm2, wykazujących morfologię pasm kulistych i liniowych.

Poza tym wyniki uzyskane przy użyciu oczyszczonych cząstek lipoprotein sugerują interakcje między agregatami cholesterolu a czynnikami osocza, w tym białkami VLDL, LDL i HDL, które mogą zmieniać skład i właściwości morfologiczne cząstek cholesterolu. Wyniki leczenia farmakologicznego z udziałem oczyszczonych cząstek lipoprotein wykazały wyższy poziom wpływu leku na tworzenie cząstek VLDL w porównaniu z ich wpływem obserwowanym na tworzenie cząstek cholesterolu LDL. Jako proleki stosowano lowastatynę, symwastatynę i ezetymib, a ich dawki w testach mogą być wyższe od stężeń fizjologicznych.

Co ciekawe, badania przesiewowe próbek surowicy wykazały różnice w wpływie leku na zmianę profili tworzenia cząstek cholesterolu VLDL, LDL i HDL, w szczególności ich wpływ na tworzenie się cząstek LDL i HDL o kształcie liniowym. Leki te indukowały zmniejszenie tworzenia się cząsteczek cholesterolu LDL i HDL w kształcie liniowym zarówno w dyslipidemii, jak i w normalnych próbkach surowicy dopasowanych do wieku. Obserwowane działanie leku na zmniejszenie powstawania cząstek o kształcie liniowym było większe w przypadku symwastatyny, ezetymibu, lowastatyny i niacyny. Identyfikacja cząstek cholesterolu o morfologii pasm kulistych i liniowych w próbkach surowicy prawidłowej i dyslipidemii sugeruje, że cząstki o podobnej morfologii mogą tworzyć się w warunkach in vivo. Wcześniejsze badania wykazały obecność kryształów cholesterolu przypominających dysk i igły w blaszkach miażdżycowych w modelach myszy ludzkich i ApoE-/- i LDLR-/- 24,25,26,27,28.

Cząsteczki HDL krążące we krwi występują jako niejednorodna mieszanina, a poziom małych i dużych cząstek HDL wraz z aktywnością funkcjonalną są ważnymi czynnikami wywierającymi ich działanie kardioprotekcyjne poprzez odwrotny szlak transportu cholesterolu29,30. Ostatnie badania podkreśliły znaczenie identyfikacji podfrakcji cząstek cholesterolu HDL w celu wyjaśnienia ich roli w wielu funkcjach biologicznych, takich jak wypływ cholesterolu, działanie przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe iprzeciwutleniające. Ponadto w wielu badaniach wykazano wpływ terapii obniżającej stężenie lipidów na zwiększenie niskiego do umiarkowanego poziomu HDL w osoczu 1,5,21. W związku z tym wyniki tego badania dostarczają nowych informacji na temat cech morfologicznych cząsteczek cholesterolu. Warto zauważyć, że wykrycie wyższego poziomu cząstek cholesterolu HDL o kształcie liniowym w próbkach surowicy osób z dyslipidemią sugeruje, że mogą one być wiarygodnym biomarkerem zarówno do diagnozy, jak i oceny efektów leków modyfikujących lipidy u pacjentów. Konieczne są jednak dalsze badania z wykorzystaniem dużych próbek klinicznych, aby lepiej zrozumieć cząsteczki cholesterolu o odrębnej morfologii i ich związek z chorobami układu krążenia.

W teście tablicy płytkowej do badania wpływu leku na gromadzenie się cząstek cholesterolu użyliśmy 2 μg znakowanych fluorescencyjnie agregatów cholesterolu i 5 μg każdego leku, ponieważ: (1) leki kompetycyjnie wiążą się zarówno z cholesterolem znakowanym fluorescencyjnie, jak i endogennymi lipidami obecnymi w próbkach surowicy; (2) Z każdej próbki uzyskaliśmy od 5 000 do 10 000 cząsteczek cholesterolu, które są łączone w duże rozmiary i kształty w zakresie od ~ 2 - 60 μ2; (3) zaobserwowaliśmy duże różnice w odpowiedzi na leki wśród próbek surowicy inkubowanych z lekami (dawki od 300 ng do 5 μg) i ~1 - 5% z nich inkubowanych z wysokimi dawkami nie wykazało wykrywalnych zmian w profilu tworzenia cząstek cholesterolu; oraz (4) interakcja między agregatami cholesterolu a lekami obniżającymi poziom lipidów odbywa się za pośrednictwem procesu nieenzymatycznego. W związku z tym stężenia odczynników użytych w teście mogą być wyższe niż ich poziom fizjologiczny.

Podsumowując, z powodzeniem wykazaliśmy zalety opisanej w tym badaniu metody obrazowania in vitro w celu określenia wpływu szerokiego spektrum leków obniżających stężenie lipidów na modulację morfologii i składu cząsteczek cholesterolu. Podejście polegające na wizualizacji i ilościowym określeniu morfologii cząstek lipidowych za pomocą konstelacji algorytmów analizy obrazu może pomóc zarówno w diagnostyce miażdżycy, jak i w ocenie wyników terapii obniżającej stężenie lipidów u pacjentów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Madasamy otrzymał wsparcie w postaci grantu od firmy Plaxgen, Inc. i ma konkurencyjny interes finansowy. Pozostali autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu badawczego Plaxgen przyznanego SM (PLX-1008). Dziękujemy Instytutowi Badawczemu Fundacji Badań Medycznych Palo Alto za pobranie próbek surowicy od osób cierpiących na miażdżycę na podstawie zgody IRB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TopFluor fluorescencyjny cholesterolAvanti Polar lipidymagazyn 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
symwastatyna (pro-lek)Cayman Chemicalssklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
lowastatyna (pro-lek)Cayman Chemicalssklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
rosuwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
atorwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
fluwastatynaCayman Chemicalssklep 100 i mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
ezetymib (pro-lek)Cayman Chemicalsstore 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
NiacynaMilliporeSigmasklep 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° Fibrat C
MilliporeSigmasklep 100 &mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
kwas tłuszczowy omega-3MilliporeSigmastore 100 & mikro; l podwielokrotności przy -20 ° C
oczyszczone białka/cząstki VLDLLee Bio
oczyszczone białka/cząsteczki LDLLee Bio
oczyszczone białka/cząsteczki HDLLee Bio
Human dopasowane do wieku serumDx Biosamples
Ludzka surowica miażdżycowaBioserve
Ludzka normalna surowicaStanforda Zestaw
Roche Diangostics
Zestaw odczynników do pomiaru HDLRoche Diangostics
Pomiar cholesterolu całkowitegoRoche Diangostics
Obrazowanie Amnis Cytometr przepływowyOprogramowanie do analizy obrazu Amnis Inc
IDEAS AnalizatorAmnis Inc-1
, ChemWel 2902Analizator biochemiczny technologii
, Intergra 400Roche Diangostics
odczynników do pomiaru LDL w centrum krwi 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania Roche Diangostics chemiczny Awarness-2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
  2. Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
  3. Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
  4. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
  5. Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
  6. Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
  7. Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
  8. Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
  9. Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
  10. Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
  11. Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118(2016).
  12. Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
  13. Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
  14. McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
  15. Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
  16. Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
  17. Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
  18. Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
  19. Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
  20. Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
  21. Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
  22. Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
  23. Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
  24. Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
  25. Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
  26. Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
  27. Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
  28. Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
  29. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
  30. Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
  31. Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda macierzy blaszekcytometria przep ywowa z obrazowaniemanaliza morfologicznapr bki surowicydiagnostyka mia d ycydzia anie lek wtworzenie si cz stekanaliza obrazu

Powiązane artykuły