Artykuł metodologiczny

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

DOI:

10.3791/56600

⸱

21 grudnia 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę oznaczania indywidualnych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) w utrwalonych bakteriach do użycia w eksperymentach z hybrydyzacją jednocząsteczkowej fluorescencji in situ (smFISH) u E. coli. smFISH pozwala na pomiar zmienności między komórkami w liczbie kopii mRNA genów będących przedmiotem zainteresowania, a także subkomórkowej lokalizacji transkryptów. Główne etapy to utrwalenie hodowli komórek bakteryjnych, przepuszczalność błon komórkowych i hybrydyzacja docelowych transkryptów z zestawami dostępnych na rynku krótkich, znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych. smFISH może umożliwić obrazowanie transkryptów wielu genów w tej samej komórce, z ograniczeniami wynikającymi z nakładania się widm między różnymi markerami fluorescencyjnymi. Po wykonaniu opisanego poniżej protokołu, komórki można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopu sprzężonego z kamerą odpowiednią do fluorescencji o niskiej intensywności. Obrazy te, wraz z konturami komórek uzyskanymi w wyniku segmentacji ramek kontrastu fazowego lub barwienia błony komórkowej, umożliwiają obliczenie rozkładu liczby kopii mRNA w próbce komórek przy użyciu oprogramowania typu open source lub napisanego na zamówienie. Opisana tutaj metoda znakowania może być również stosowana do transkryptów obrazu za pomocą stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (STORM).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stochastyczność jest podstawowym i nieuniknionym aspektem ekspresji genów i prowadzi do niejednorodności komórka-komórka1, zarówno na poziomie transkryptów, jak i białek2,3. Kwantyfikacja zmienności między komórkami w dobrze zdefiniowanych warunkach daje unikalne spojrzenie na podstawowe procesy leżące u podstaw ekspresji genów i jej regulacji. Jednym z ważnych źródeł heterogeniczności komórka-komórka u bakterii zachodzi na poziomie transkrypcji. Numery transkryptów różnią się nie tylko ze względu na stochastyczność transkrypcji, ale także ze względu na procesy potranskrypcyjne, takie jak regulacja przez małe RNA i RNAazy2. Jednym ze sposobów bezpośredniego dostępu do tej niejednorodności w sposób ilościowy jest fluorescencyjne znakowanie poszczególnych transkryptów danego genu w smFISH. Metodologia ta pozwala na detekcję i subkomórkową lokalizację poszczególnych cząsteczek RNA w stałych, pojedynczych komórkach bakteryjnych4. mRNA są hybrydyzowane z zestawem znakowanych fluorescencyjnie ~20 oligonukleotydów o długości zasady, które są zaprojektowane do selektywnego wiązania się z interesującymi transkryptami5,6. Wielokrotne znakowanie zapewnia detekcję powyżej fluorescencji tła, a poszczególne cząsteczki mRNA pojawiają się jako plamki o ograniczonej dyfrakcji pod mikroskopem fluorescencyjnym7 (patrz Rysunek 1). Istnieją inne podejścia do znakowania cząsteczek mRNA, w których komplementarne sondy oligomerowe przenoszą sprzężone hapteny (np. biotynę lub digoksygeninę), które są wykrywane za pomocą wtórnych technik reporterowych znakowanych fluorescencyjnie8.

Istnieją inne metody, które dostarczają ilościowych informacji o transkryptach, oprócz smFISH. Niektóre, takie jak Northern blot lub ilościowy PCR, sondują masę, a zatem nie mogą mierzyć ani liczby kopii mRNA, ani ich pozycji w poszczególnych komórkach. W związku z tym metody te nie są odpowiednie do ilościowego określania zmienności między komórkami. Opracowano niedawną technikę opartą na obrazie, która pozwala na ilościowe określenie zarówno liczby kopii RNA w komórkach, jak i ich lokalizacji wewnątrzkomórkowej, zwaną multipleksowaną fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (MERFISH). MERFISH opiera się na przypisaniu unikalnego kodu kreskowego składającego się ze zdefiniowanej kombinacji z ustalonej liczby znakowanych fluorescencyjnie sond oligonukleotydowych. Te kody kreskowe są odczytywane w sekwencyjnych rundach pomiarów smFISH, z fotowybielaniem po każdej rundzie hybrydyzacji, zwiększając w ten sposób przepustowość o dwa rzędy wielkości9,10. Technika ta wymaga zautomatyzowanego systemu obsługi płynów i odpowiedniego zaprojektowania zestawu sond.

Połączenie wielokrotnego znakowania fluorescencyjnego poszczególnych transkryptów, wraz z nowatorskimi technikami super-rozdzielczości, takimi jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)11, umożliwia dziesięciokrotny wzrost rozdzielczości w subkomórkowej lokalizacji transkryptów. W STORM odpowiednia kombinacja sond fluorescencyjnych i bufora obrazowania pozwala na wielokrotne cykle emisji fluorescencji na cząsteczkę sondy (mruganie). STORM może być również używany do obrazowania transkryptomu E. coli i obserwacji organizacji przestrzennej RNA w całym genomie, poprzez jednoczesne znakowanie wszystkich interesujących transkryptów12.

Wszystkie opisane powyżej metody jednokomórkowe opierają się na obrazowaniu transkryptów w stałych komórkach. W związku z tym nie dostarczają żadnych informacji na temat właściwości kinetycznych transkryptów w komórkach. Aby śledzić transkrypty w żywych komórkach13, mRNA mogą być znakowane przez fuzję interesującego genu z szeregiem miejsc wiązania. Te ostatnie są następnie rozpoznawane przez białko wiążące RNA, takie jak białko płaszcza bakteriofaga MS2, które jest połączone z białkiem fluorescencyjnym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP)10,14,15.

Tutaj opisujemy metodę znakowania poszczególnych mRNA za pomocą zestawu fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do użycia w eksperymentach smFISH, w szczególności w E. coli. Ponadto pokazujemy, że ten sam schemat etykietowania może być stosowany do pomiarów STORM z niewielkimi modyfikacjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konstrukcja sondy

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje dostępne na rynku sondy oligonukleotydowe już oznaczone fluoroforami. Sondy składają się z zestawu określonych sekwencji komplementarnych do docelowego mRNA, przy czym każda sonda jest sprzężona z pojedynczą cząsteczką fluorescencyjną. Alternatywnie możliwe jest dołączenie markerów fluorescencyjnych do sond, jak opisano w innym miejscu5,16.

  1. Projektowanie sond smFISH przy użyciu algorytmu Probe Designer16 opracowanego przez Arjuna Raja (van Oudenaarden Lab, Massachusetts Institute of Technology); sekwencje sond smFISH użytych w tym manuskrypcie są wymienione w tabeli materiałów.
    UWAGA: Minimalna liczba sond w zestawie dla wykrywalnego sygnału to ~30. Dokładna liczba może się różnić w zależności od interesującego genu, szczególnie jeśli mierzone są bardzo krótkie transkrypty.
  2. Wybierz barwnik, który pasuje do układu optycznego (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie barwnika Cy3 lub optycznie równoważnego barwnika o niskiej podatności na fotowybielanie. Kandydatem do podwójnego znakowania jest Cy5 lub optycznie równoważny barwnik (patrz tabela materiałów). Odpowiednie barwniki do obrazowania STORM znakowanego mRNA charakteryzują się zdolnością do wielokrotnych cykli emisji fluorescencji. Niektóre barwniki smFISH mogą być używane do obrazowania STORM (patrz tabela materiałów). Aby zobrazować dwa (lub więcej) transkrypty odpowiadające różnym genom w tej samej komórce, należy wybrać sondy oligonukleotydowe sprzężone z barwnikami, których widma w niewielkim stopniu lub wcale się pokrywają.

2. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Ważne jest, aby próbki były wolne od RNAz, używając materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz, takich jak filtrowane końcówki do pipet i probówki, oraz aby utrzymywać czyste środowisko pracy. W celu uniknięcia degradacji docelowych transkryptów, wszystkie odczynniki używane po utrwaleniu komórek muszą być wolne od nukleaz (patrz tabela materiałów) lub ditylopirowęglanów (DEPC) i sterylizowane.

  1. dla smFISH
    1. Przygotować 1x PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, roztwór o stężeniu buforu fosforanowego 0,01 M i stężeniu chlorku sodu 0,154 M, (pH 7,4)). Rozcieńczyć 10x PBS bez RNaz (patrz tabela materiałów) w wodzie wolnej od nukleaz (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:10 v/v.
      1. Alternatywnie przygotuj 1x PBS poddanych działaniu DEPC.
    2. Przygotować wolne od RNaz 2x SSC (bufor solno-cytrynianowy solanu, 0,3 M NaCl w 0,03 M cytrynianu sodu, (pH 7,0)). Rozcieńczyć 20x SSC bez RNaz (patrz tabela materiałów) w wodzie wolnej od nukleaz w stosunku 1:10 v/v.
      1. Alternatywnie, przygotuj 2x SSC poddane obróbce DEPC.
  2. Roztwór podstawowy sondy oligonukleotydowej.
    1. Ponownie rozpuścić wysuszoną mieszaninę sondy oligonukleotydowej w 200 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), aby utworzyć zapas sondy o wielkości 25 μM. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko wiruj i odwiruj.
    2. Aby uniknąć zamarznięcia i rozmrożenia probówki z roztworem podstawowym, należy wykonać kilka porcji roztworu podstawowego, odpowiadających ilości, która ma być użyta w jednej serii doświadczalnej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C lub niższej i chronić przed światłem.
      UWAGA: Zestaw sond o długości 5 nmol może zapewnić do 250 reakcji hybrydyzacji.
  3. Bufor hybrydyzacyjny (za Skinnerem i wsp.7 ):
    1. Dodaj 5 ml wody wolnej od nukleaz do 50 ml polipropylenowej probówki ze stożkowym dnem. Dodaj 1 g siarczanu dekstranu do wody i rozpuść go przez energiczne wirowanie. Wymieszaj zawartość w wytrząsarce orbitalnej, aż znikną bąbelki (~30 min).
    2. Dodać do roztworu 3,530 μl dejonizowanego formamidu, 10 mg tRNA E. coli, 1 ml 20x SSC, 100 μL 200 mM kompleksu wanadylo-rybonukleozydowego i 40 μL 50 mg/ml BSA. Doprowadzić końcową objętość do 10 ml przez dodanie wody uzdatnionej DEPC lub wody wolnej od nukleaz i mieszać roztwór, aż stanie się jednorodny.
      UWAGA: Aby uniknąć zamarzania i rozmrażania roztworu, należy wykonać kilka porcji roztworu podstawowego, odpowiadających ilości, która ma być użyta w jednej serii doświadczalnej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Przed otwarciem butelki należy pozostawić formamid do temperatury pokojowej. W celu zmniejszenia tła zaleca się kalibrację optymalnego stężenia formamidu (stosunek 10 - 40% v/v).
      ostrożność: OSTRZEŻENIE! Formamid jest wysoce toksyczny i jest znanym teratogenem. Unikać kontaktu z oczami lub skórą, wdychania lub połknięcia. Trzymaj go pod wyciągiem, mając na sobie fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne.
    3. Wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Przechowywać w porcjach i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
  4. Przygotować bufor utrwalający (4,6% formaldehydu w 1x PBS), dodając 37% formaldehydu (v/v) do 1x PBS (patrz 2.1.1) w stosunku 1:8 v/v i wir.
    UWAGA: OSTRZEŻENIE! Formaldehyd jest wysoce toksyczny i znany jako czynnik rakotwórczy. Trzymaj go pod wyciągiem, mając na sobie fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne.
  5. Przygotować bufor do przemywania dla smFISH (20% formamidu w 2x SSC), dodając dejonizowany formamid do 2x SSC (patrz 2.1.2) w stosunku 1:4 v/v i wirować.
  6. Przygotuj bufor obrazowania dla smFISH, dodając 5 mM cysteaminy i zmiataczy tlenu (7 μM oksydazy glukozowej, 56 nM katalazy i 10% glukozy (w/v)) do buforu płuczącego (20% formamidu w 2x SSC)
  7. dla STORM
    1. Przygotować bufor A, dodając 50 mM Tris-HCl i 10 mM NaCl do wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Przechowywać w RT przez lata.
    2. Przygotuj bufor B, dodając 50 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl i 10% w/v glukozy do wody wolnej od nukleaz.
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do roku.
    3. Przygotować bufor MEA, rozpuszczając 77 mg cysteaminy w 1 ml buforu A (daje 1 M roztwór).
      UWAGA: Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    4. Przygotować bufor Gloxy, dodając 8 440 AU (dowolne jednostki) oksydazy glukozowej i 70 200 AU katalazy do 1 ml buforu A.
      UWAGA: Tworzy 50x roztwór podstawowy, można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    5. Przygotuj bufor obrazowania dla STORM, dodając 50 mM bufora MEA i 1x bufor Gloxy do bufora B.
      UWAGA: Bufor obrazowania dla STORM składa się z 5 mM cysteaminy, zmiataczy tlenu (7 μM oksydazy glukozowej i 56 nM katalazy) w 50 mM Tris z 10 mM NaCl i 10% glukozy przy pH 8,0. Przygotować tuż przed obrazowaniem, można go przechowywać i używać w RT przez około 2 godziny.

3. Utrwalenie próbki

  1. Hoduj komórki bakteryjne (np. E. coli MG1655) w wybranym pożywce wzrostowej (np. pożywce LB) przez noc w wytrząsarce orbitalnej przy 260 obr./min i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Aby określić tło spowodowane niespecyficznym wiązaniem sond, należy przeprowadzić pomiary w szczepie, w którym gen będący przedmiotem zainteresowania został usunięty, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami (patrz Δgalk w Rysunek 1 i ΔsodB w Rysunek 2).
  2. Rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:100 w świeżej pożywce i mierzyć jej gęstość optyczną (OD600) w spektrofotometrze co ~1 h, do wartości 0,2 - 0,4; powinna wystarczyć hodowla 4 ml.
    UWAGA: Jeśli wybrany mikroskop nie ma kontrastu fazowego lub kontrastu różnicowego interferencyjnego, błony zewnętrzne E. coli można oznaczyć lipofilowym markerem fluorescencyjnym 2 μM (patrz tabela materiałów), który należy dodać do zawiesiny bakteryjnej 20 minut przed utrwaleniem17. Utrwalenie i dalsze leczenie odbywa się w sposób opisany poniżej. Należy zachować ostrożność, aby wybrać marker fluorescencyjny o innym widmie emisyjnym, aby zminimalizować nakładanie się widma z zestawem znakowanych sond.
  3. Granulki przez odwirowanie przez 5 minut w temperaturze 4 500 g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant ze wszystkich probówek.
  4. Dodaj 1 ml 1x PBS do każdej probówki i ponownie zawieś osad, aby zminimalizować agregację między komórkami. Następnie dodaj 4 ml buforu utrwalającego i delikatnie odwiruj.
  5. Inkubować próbki w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 260 obr./min przez 30 minut w temperaturze 24 °C.
  6. Komórki osadu przez odwirowanie przez 10 min, 1 000 g, 4 °C. Usunąć supernatant. Dodaj 1 ml 1x PBS.
  7. Przenieść zawiesiny do mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,8 μl ze stożkowym dnem (patrz tabela materiałów) i powtórzyć krok 3.6 dwukrotnie.

4. Przepuszczalność próbki

  1. Usunąć supernatant bardzo ostrożnie. W razie potrzeby użyj pipet o małej objętości, aby usunąć cały płyn z osadu.
  2. Zawiesić w 300 μl wody uzdatnionej DEPC lub wodzie wolnej od nukleaz. Dodaj 350 μl wysokiej jakości etanolu absolutnego (99%) i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę. Dodaj kolejne 350 μl etanolu i ponownie wymieszaj, aby osiągnąć końcowe stężenie etanolu 70% (stosunek v/v).
    UWAGA: OSTRZEŻENIE! Etanol jest łatwopalny.
  3. Obracać próbkę za pomocą rotatora probówki z prędkością 20 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub w temperaturze 4 °C przez noc. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.

5. Hybrydyzacja

  1. Komórki osadu przez odwirowanie przez 7 min, 750 x g, 4 °C. Usunąć sklarowany sklarant.
  2. Dodać 1 ml 20% buforu do przemywania do próbek i pozostawić na kilka minut lub odpipetować do całkowitego rozpuszczenia osadu.
  3. Granulki osadzać przez odwirowywanie przez 7 minut, w temperaturze 750 x g, 4 °C.
  4. Usunąć supernatant bardzo delikatnie, pipetując. W razie potrzeby użyj pipet o małej objętości, aby usunąć cały płyn z granulki.
  5. Dodać roztwór podstawowy zestawu sondy oligonukleotydowej do podwielokrotności buforu hybrydyzacyjnego tak, aby końcowe stężenie oligonukleotydów wynosiło 250 nM; energicznie wirować.
    UWAGA: Można znakować jednocześnie dwa lub więcej różnych docelowych mRNA w tej samej komórce. Dodaj zestawy sond obu celów do bufora hybrydyzacji. Należy zachować ostrożność, aby wybrać barwniki o różnych widmach emisyjnych, aby zminimalizować nakładanie się widm (np. Cy3 i Cy5). Upewnij się, że próbki przeznaczone do obrazowania STORM są zhybrydyzowane za pomocą zestawu sond oligonukleotydowych sprzężonych z odpowiednim barwnikiem dla STORM (np. w tabeli materiałów).
  6. Zawiesić próbki (patrz krok 5.4) w 50 μl buforze hybrydyzacyjnym, który zawiera sondy oligonukleotydowe, unikając jednocześnie wytwarzania pęcherzyków (roztwór jest dość lepki).
  7. Pozostawić próbki na noc na gorącym bloku w temperaturze 30 °C w ciemności.
    UWAGA: Następnie próbki mogą być przechowywane przez okres do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.

6. Mycie

  1. Użyj jednej nowej probówki do mikrowirówki dla każdej próbki do zobrazowania. Dodać 1 ml buforu do mycia.
  2. Dodaj 10-15 μl z zhybrydyzowanych próbek do nowej probówki, która zawiera bufor do przemywania i mieszanie/wirowanie.
  3. Komórki osadu przez odwirowanie przez 7 min, 750 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
    UWAGA: Aby zredukować tło, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C.
  4. Przemyć jeszcze dwa razy (ponownie zawiesić w 1 ml buforu do płukania, odwirować i usunąć osad).
  5. Zawiesić w 25 μl buforu do płukania.
    UWAGA: W celu zmniejszenia fotowybielania można dodać do bufora płuczącego system oczyszczania tlenu (2.6) w celu poprawy stabilności barwnika w eksperymentach z fluorescencją pojedynczych cząsteczek6.

7. Przygotowanie próbek do obrazowania

UWAGA: Komórki muszą być unieruchomione, aby umożliwić prawidłowe obrazowanie pod mikroskopem fluorescencyjnym i kontrastowym fazowym. Poniższe metody mogą być wykorzystane do przygotowania próbek, w których można obrazować różne pola widzenia w różnych płaszczyznach ogniskowych.

  1. Preparat w żelu agarozowym
    1. Dodać 150 mg agarozy do 10 ml buforu 2x SSC. Nie dodawaj 2x SSC do agarozy, bo inaczej nie rozpuści się prawidłowo.
    2. Mikrofaluj przez 10-15 s za każdym razem, aż zaczną tworzyć się duże pęcherzyki. Odstawić do ostygnięcia na kilka minut.
    3. Umieść silikonową ramkę oddzielającą na szkiełku tak, aby środek prowadnicy pozostał odsłonięty.
    4. Umieść sztywny pierścień o szerokości 10 mm (1-2 mm grubości) na środku szkiełka i umieść w nim niewielką ilość żelu w celu uszczelnienia. Poczekaj kilka minut, aż stwardnieje.
    5. Dodaj więcej żelu, aż utworzy się wysoki kształt kopuły. Odczekaj 10 minut, aż stwardnieje i zdejmij pierścień (za pomocą cienkiej pęsety lub innej metody).
    6. Umieść ~10 μl przemytych komórek bakteryjnych (patrz 6.5) na żelu i uszczelnij szkiełkiem nakrywkowym #0.
  2. Przygotowanie próbki w komorze dla smFISH
    1. Alternatywnie (do kroku 7.1) przygotować próbki do obrazowania poprzez unieruchomienie umytych komórek bakteryjnych (patrz ppkt 6.5) na jednorazowych plastikowych szalkach Petriego pokrytych poli-D-lizyną ze szklanym dnem
      2. .
    2. Próbki należy inkubować w ciemności, w temperaturze pokojowej, przez noc przed wizualizacją, aby umożliwić przyleganie komórek do powierzchni. Przed wizualizacją przemyć raz buforem do płukania (.5); Utrzymuj próbkę mokrą za pomocą buforu do płukania (2.5) lub buforu do obrazowania dla smFISH (2.6).
  3. Przygotowanie próbki w komorze do badania STORM
    1. Przygotuj próbki do STORM do obrazowania na jednorazowych plastikowych szalkach Petriego pokrytych poli-D-lizyną ze szkła pokrytego poli-lizyną.
    2. Próbki należy inkubować w ciemności, w temperaturze pokojowej, przez noc. Przed wizualizacją przemyć raz buforem do płukania dla smFISH (2,5); i dodaj bufor obrazowania dla STORM (2.7.5).

8. Wizualizacja transkrypcji

  1. Komórki obrazowe z szerokokątnym mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Do modyfikacji STORM należy użyć ogniw oznaczonych barwnikiem zdolnym do wielu cykli emisji fluorescencji. Zobrazuj próbkę za pomocą systemu obrazowania 3D o wysokiej rozdzielczości (np. patrz tabela materiałów).
  2. Użyj (zalecanej) soczewki obiektywowej 60-100x N.A >1.3 z kontrastem fazowym w oleju z silnym źródłem światła, takim jak lampa rtęciowa lub metalohalogenkowa; Zalecane są również źródła światła oparte na diodach LED.
  3. Użyj standardowej chłodzonej kamery CCD, idealnie zoptymalizowanej pod kątem obrazowania przy słabym oświetleniu, a nie szybkości (używamy kamery o rozmiarze piksela 16 μm) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Użycie chłodzonej kamery EMCCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami) Kamera CCD jest niezbędna do zmniejszenia szumu termicznego, który uniemożliwia wykrycie, szczególnie pojedynczych cząsteczek.
  4. Stosować zestawy filtrów odpowiednie do wybranych fluoroforów.
  5. Aby prawidłowo określić granice komórek, należy uzyskać obrazy różnych pól widzenia w każdej próbce za pomocą optyki z kontrastem fazowym lub poprzez fluorescencyjne znakowanie zewnętrznej błony komórkowej. Rejestruj obrazy w różnych płaszczyznach ogniskowych (z-stack) dla wszystkich kanałów (zwykle wykonuje się 13 warstw oddzielonych od siebie 250 nm).
    UWAGA: Zmotoryzowany stolik mikroskopu i zestawy filtrów powinny być sterowane przez komercyjne (patrz tabela materiałów) lub wewnętrzne oprogramowanie, które może rejestrować sekwencję obrazów w sekwencji.

9. Analiza danych

  1. Przekonwertuj stosy obrazów na odpowiedni format do analizy danych.
  2. Oszacuj liczbę kopii docelowego mRNA na podstawie całkowitej intensywności ognisk fluorescencyjnych w komórce, a nie na podstawie zliczania dyskretnych "plamek", jak w innych obecnie dostępnych protokołach.
  3. Przeprowadzaj analizę obrazu za pomocą oprogramowania typu open source18 lub za pomocą niestandardowego programu. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obrazowania i analizy danych, zobacz Skinner i wsp.7

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy pomiary smFISH transkryptów galK i sodB w komórkach E. coli. Transkrypty zhybrydyzowano z zestawem specyficznych sekwencji komplementarnych do sekwencji docelowej, przy czym każda sonda była sprzężona z pojedynczą cząsteczką fluorescencyjną (patrz tabela materiałów). Obrazy fluorescencji i kontrastu fazowego szczepu MG1655 E. coli typu dzikiego (WT) lub JW0740 (kolekcja Keio) 19 szczep z delecją galK (ΔgalK) były wystawi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym laboratorium zmierzyliśmy liczbę transkryptów różnych genów w komórkach E. coli za pomocą metody smFISH2. Krótko mówiąc, procedura ta składa się z następujących etapów: utrwalanie komórek, przepuszczalność błon w celu umożliwienia penetracji sondy, hybrydyzacja sondy i obrazowanie próbki przy użyciu standardowego mikroskopu fluorescencyjnego. Procedura ta opiera się na wcześniej opublikowanych z pewnymi modyfikacjami 6,7,16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez 514415 grantu Izraelskiej Fundacji Naukowej (dla J.S.) oraz 2016707 grantu BSF-NSF (MCB) (dla J.S.). Podziękowano również za wsparcie ze strony Katedry Profesorskiej im. Zygfryda i Irmy Ullmanów (dla J.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól sodowa siarczanu dekstranuSigma-AldrichD8906
Czysty etanol, 99.5%, odczynnik ACS, absolutnyMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
Dwuwodorowęglan (DEPC)Sigma-AldrichD5758
RNaz 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
RNaz 10X PBSLife Technologies/AmbionBufor AM9625
TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) BioUltra, do biologii molekularnejSigma-Aldrich93283
woda wolna od nukleazThermo Fisher Scientific10977035
Roztwór formaldehydu do biologii molekularnej, 36,5-38% w wodzieSigma-AldrichF8775
Dejonizowany formamid, wolny od nukleazThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
E. coli tRNA (kwas rybonukleinowy, transfer typu xx z escherichia)Sigma-AldrichR1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)Thermo Fisher Scientific/AmbionAM2616
Kompleks wanadylo-rybonukleozydowy, VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
Poli-L-LizynaSigmaP4707
Cysteamina i tlenSigma-Aldrich30070
Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger, typ VII, 50KUSigma-AldrichG2133
KatalazaSigma-AldrichC40
D-glukozaSigma-AldrichG8270
D-fukozaSigma-AldrichF8150
Vybrant DiO Znakowanie komórek Żywotność roztworu TechnologieV2286
Agaroza, odczynnik o niskiej temperaturze topnieniaSigma-AldrichA9414
Samoprzylepny izolator silikonowy o średnicy 24-2 mm x głębokości 1,8 mm JTR24R-A2-2,0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
szklane dno pokryte poli-D-lizyną Naczynia hodowlane ze szklanym dnemMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
Rękawice do badań bezpudrowych nitrylowych Super lifeSupermaxTC-N-9889
Markowa taśma do inkubatora sterylizacyjnegoSigma-AldrichBR61750
Probówki do mikrowirówek (1,8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
Okrągłe probówki polipropylenowe Falcon (14 ml)BD Biosciences352059
Wirówka ze stożkowym dnem polipropylen probówki (50 ml)Corning430828
Pipety serologiczne (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
Pipety serologiczne (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
Pipety serologiczne (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
Kuwety spektrofotometruSarstedt67.742
Końcówki do pipet bez RNaz 0,2 - 20 μ lFroggaBioFT20
Końcówki do pipet bez RNaz 10 - 200 μ lAxigene/corningTF-200
bez RNaz 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
Końcówki do pipet bez RNaz 100 - 1000 μ lSorenson14200
Strzykawka jednorazowa 10 ml igła G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
Minisart 0,2 um Filtr strzykawkowySartorius16534 K
Instrumenty Nikon mikroskop typu A olejek immersyjny A, 8ccNikonMXA20233
Szkiełka mikroskopowe 76 x26, 3 "x1"x1 mmThermo Fisher Scientific421-004ET
#0 szkiełko nakrywkowe 24x60Thermo Fisher Scientific/Menzel
M.R.CTOU-50
Gorący blokM.R.C
VortexFried Electric CompanyG-560-E
MikrowirówkaEppendorf5427R
Eppendorf5810R
Przenośny Pipet-Aid XP2, kontroler pipetDrummond Scientific Company4-000-501-I
Spektrofotometr OD600 do tempa wzrostu bakterii DiluPhotometerMidsciOD600-10
iXon X3 Kamera EMCCDAndorDU-897E-CS0-#BV
Mikroskop Eclipse TiNikonMEA53100
CFI plan apochromat DM 100X olej obiektyw lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
Zestaw filtrów (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
Zestaw filtrów (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
Nis-elements AR auto reaserch oprogramowanieNikonMQS31000
STORM mikroskopVutaraSR-200
NA 1.2 obiektyw Olympus
SRX oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazuVutara
Evolve 512 EMCCDFotometria
Stellaris® Sondy FISH, test niestandardowy z CAL Fluor® Red 590 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Sekwencja sondy dla mRNA galK:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatggtgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaatcaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagtagtgtt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacgggggggac
gtccaggggatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagggttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctcttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
Stellaris® Sondy FISH, niestandardowe testy z Quaser Fluor® Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Sekwencja dla mRNA sodB:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatggtgttggcaaa
ctgaatggtgtggggcag
caccaatcaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagtagtgtt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacgggggggac
gtccaggggatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagggttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctcttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa powiedział:
Bez Bez Końcówki do pipet Wytrząsarka orbitalna BNBB024060A0

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
  2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
  3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
  4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
  5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
  7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
  8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
  9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
  10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
  11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
  13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
  14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
  15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
  16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
  17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
  18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
  19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
  20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
  21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

Powiązane artykuły