Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

DOI:

10.3791/56604

⸱

4 lutego 2018

 , 
1UPSUTER, Institute of Bioengineering (IBI), School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka są w dynamicznym stanie syntezy i degradacji, a ich okresy półtrwania mogą być dostosowywane w różnych okolicznościach. Jednak najczęściej stosowane podejścia do określania okresu półtrwania białek są albo ograniczone do średnich populacji z komórek poddanych lizie, albo wymagają stosowania inhibitorów syntezy białek. Protokół ten opisuje metodę pomiaru okresów półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu białek fuzyjnych SNAP-tag w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią poklatkową. Każde interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP może być kowalencyjnie związane przez fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek barwnik, który jest sprzężony z pochodną benzyloguaniny, a rozpad znakowanej populacji białka może być monitorowany po wypłukaniu pozostałego barwnika. Późniejsze śledzenie komórek i kwantyfikacja zintegrowanej intensywności fluorescencji w czasie skutkuje wykładniczą krzywą rozpadu dla każdej śledzonej komórki, co pozwala na określenie szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach poprzez dopasowanie krzywej. Metoda ta pozwala na oszacowanie niejednorodności okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek, której nie można łatwo ocenić innymi metodami. Przedstawione tutaj podejście ma zastosowanie do każdego typu hodowanych komórek adherentnych, w których dochodzi do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, połączonego ze znacznikiem SNAP. W tym artykule wykorzystujemy mysie embrionalne komórki macierzyste (ES) hodowane na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych E-kadheryną, aby zilustrować, w jaki sposób można określić tempo degradacji pojedynczych komórek białek o szerokim zakresie okresów półtrwania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dobrze wiadomo, że białka komórkowe podlegają intensywnej rotacji, a tempo syntezy i degradacji jest specyficzne dla każdego białka i podlega regulacji fizjologicznej. Tradycyjnie, tempo degradacji białek mierzono za pomocą metod masowych, takich jak analiza pościgu impulsów radioaktywnych, lub z udziałem inhibitorów syntezy białek, takich jak cykloheksymid1. Niedawno ustanowiono znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu ze spektrometrią mas w celu ilościowego określenia obrotu białek w skali globalnej2. Metody te są jednak ograniczone przez uśrednianie populacji, w związku z czym informacje o zmienności między komórkami są tracone. Ponadto nie można zidentyfikować przejściowych zmian w degradacji białek, które są niezsynchronizowane w całej populacji komórek.

Alternatywnie, okresy półtrwania białek mogą być również określane za pomocą metod opartych na fluorescencji, które często mają tę zaletę, że zapewniają rozdzielczość pojedynczej komórki. Na przykład, fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (paGFP) zostało użyte do określenia okresu półtrwania Oct4 u wczesnych ssaków embryo3. Inną metodą monitorowania rozpadu białek w żywych komórkach jest użycie znacznika SNAP w połączeniu z fluorescencyjnym obrazowaniem poklatkowym. Znacznik SNAP jest zmutowaną wersją enzymu naprawy DNA klasy O6-alkiloguaniny DNA-alkilotransferazy (AGT), która specyficznie reaguje z pochodnymi benzylguaniny (BG), które mogą być sprzężone z sondami molekularnymi4,5,6. W związku z tym każde białko fuzyjne SNAP-tag może być nieodwracalnie znakowane fluorescencyjnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem. Znakowanie impulsowe białka będącego przedmiotem zainteresowania połączonego ze znacznikiem SNAP, a następnie wypłukanie resztkowego barwnika, pozwala na monitorowanie degradacji znakowanej populacji białka, a tym samym na określenie okresu półtrwania białka. Znaczniki SNAP są z powodzeniem stosowane do znakowania białek metodą pulse-chase oraz do określania okresów półtrwania białek w przylegających hodowlach komórkowych oraz in vivo5,7,8,9. Na rynku dostępna jest szeroka gama podłoży SNAP-tag pokrywających powszechnie stosowane widma fluorescencyjne, co umożliwia wybór optymalnego barwnika do każdego konkretnego zastosowania. W ten sposób znaczniki SNAP mogą być również używane do obrazowania wielokolorowego w połączeniu z innymi fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi lub barwnikami. Barwniki nieprzepuszczalne dla komórek nadają się do znakowania białek na uwięzi błonowej, podczas gdy barwniki przepuszczalne dla komórek mają zastosowanie do monitorowania zarówno białek wewnątrzkomórkowych, jak i związanych z błoną. Co więcej, niektóre z tych sond prawie nie wykazują podstawowej fluorescencji i zaczynają emitować silny sygnał fluorescencyjny dopiero po związaniu się z SNAP-tag10.

Ten protokół opisuje, jak mierzyć tempo degradacji różnych interesujących białek w pojedynczych komórkach za pomocą znacznika SNAP. Tutaj stosujemy tę metodę do mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) hodowanych na E-kadherynie, ale powinno być możliwe zastosowanie jej z dowolnym przylegającym typem hodowanych komórek. Pokazujemy, że znakowanie impulsowe białek fuzyjnych SNAP-tag, a następnie fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe pozwala na określenie okresów półtrwania różnych białek w pojedynczej komórce i zapewnia oszacowanie zmienności między komórkami okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: W tym badaniu użyto linii komórkowej E14 ES. Jednak protokół ten ma bezpośrednie zastosowanie do każdej innej mysiej linii komórkowej ES wyrażającej interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP, albo przez znakowanie endogennego białka, albo przez użycie nadekspresji. W przykładach przedstawionych w sekcji wyników wykorzystano indukowane doksycykliną linie komórkowe fuzyjne SNAP-tag (znacznik SNAP połączony z następującymi białkami: Nanog, Oct4, Srsf11 lub z białkami fluorescencyjnymi mOrange2 i sfGFP i umieszczony pod kontrolą promotora indukowanego doksycykliną. Zobacz11 po więcej informacji na temat plazmidów używanych do generowania indukowanych doksycykliną linii komórkowych fuzji SNAP-tag). System indukowany doksycykliną może być szczególnie przydatny, ponieważ pozwala na ścisłą kontrolę czasu i intensywności ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zaleca się umieszczenie znacznika SNAP na końcu C, ponieważ zmiana sekwencji aminokwasów N-końcowych z większym prawdopodobieństwem zmieni okres półtrwania białka docelowego (reguła N-końca12).

1. Powlekanie E-kadheryną i wysiewanie komórek

  1. Wygeneruj linię komórkową ES wyrażającą interesujące białko połączone z SNAP-tag4.
  2. Pokryj 100 mm szalki do hodowli komórkowych 4 ml 0,1% żelatyny (rozcieńczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez Ca2+/Mg2+) przez 1 godzinę. Usuń żelatynę i pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę. Zużyć natychmiast lub przechowuj powlekane naczynia do 2 miesięcy.
  3. Hoduj linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania w pożywce do hodowli komórek ES (Glasgow Minimum Essential Media, uzupełniona 10% surowicą bydlęcą kwalifikowaną przez komórki ES, 2 mM pirogronian sodu, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 100 μM 2-merkaptoetanolu, czynnik hamujący białaczkę (LIF), 3 μM CHIR99021 i 0,8 μM PD184352) na naczyniach pokrytych żelatyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni, aż do osiągnięcia konfluencji 10 - 20 mln komórek w naczyniu.
    Uwaga: W tym przypadku LIF został wytworzony przez przejściową transfekcję komórek HEK 293T, a następnie zbieranie i filtrowanie supernatantu. Każda partia LIF została przetestowana pod kątem jej potencjału do utrzymania pluripotencji, ale nie określono stężeń. Jednak rekombinowany LIF jest również dostępny na rynku, a stężenie powszechnie stosowane w hodowli mysich komórek ES wynosi 1000 jednostek/ml13.
  4. Pokryj 96-dołkową płytkę odpowiednią do obrazowania 30 μl rekombinowanego białka chimery E-kadheryny Fc myszy (E-cad-Fc) na basenik (5 ng/μL, rozcieńczony w PBS z Ca2+/Mg2+. Stosować zapasy o stężeniach 100 ng/μl, przechowywane w temperaturze -80 °C). Należy unikać intensywnego pipetowania, ponieważ E-cad-Fc jest bardzo delikatny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 h.
    Uwaga: W zależności od mikroskopu mogą być używane inne formaty.
  5. Odessać E-cad-Fc, przemyć raz 100 μl PBS z Ca2+/Mg2+ i dodać 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórek ES.
  6. Przemyj interesujące komórki 5 ml PBS bez Ca2+ / Mg2+. Odessać i dodać 2 ml Trypsyny-EDTA 0,25%. Inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać 4 ml pożywki do hodowli komórek ES, ponownie zawiesić i odwirować w temperaturze 1000 x g przez 4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml świeżej pożywki do hodowli komórek ES.
    Uwaga: PBS bez Ca2 + / Mg2 + powinien być używany do mycia komórek przed trypsynizacją w celu usunięcia jonów Ca2+, które są niezbędne do adhezji komórek. Natomiast do rozcieńczania i powlekania E-cad-Fc (krok 1.4) należy użyć PBS z Ca2+/Mg2+, ponieważ adhezja komórek ES do naczyń pokrytych E-cad-Fc jest zależna od Ca2+ < sup class="xref">14.
  7. Rozcieńczyć zawieszone komórki w stosunku 1:10 w 1 ml pożywki do hodowli komórek ES i policzyć, używając komory liczącej (załadować 10 μl dla komory o głębokości 0,1 mm).
  8. Wysiewaj 30 000 komórek/cm2 na płytce obrazowej pokrytej E-cad-Fc. Napełnij do 200 μl na studzienkę pożywką do hodowli komórek ES. W przypadku linii komórkowych indukowanych doksycykliną należy indukować odpowiednią dawką doksycykliny (wcześniej zoptymalizować dawkę i czas indukcji. Użyte tutaj linie komórkowe poddano działaniu doksycykliny w dawce 500 ng/ml na 24 godziny przed obrazowaniem). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i kontynuować znakowanie impulsowe i obrazowanie 24 godziny po wysiewie komórek.

2. Etykietowanie impulsowe znacznika SNAP

Uwaga: Do eksperymentów z rozpadem białek kluczowe jest użycie odpowiedniego stężenia barwnika SNAP. Stężenie powinno być wystarczająco wysokie, aby dać jasny sygnał na początku filmu poklatkowego, ponieważ fluorescencja będzie się zmniejszać z czasem. Jednak stosowanie zbyt wysokich stężeń barwnika może spowodować, że resztki barwnika pozostaną w pożywce lub w komórkach nawet po umyciu. Wolny barwnik może następnie wiązać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w trakcie filmu, co zniekształci krzywą rozpadu. Obserwowany sygnał fluorescencji będzie zależał od właściwości barwnika, użytej linii komórkowej, a także poziomu ekspresji odpowiedniego białka. Dlatego tak ważne jest, aby zoptymalizować stężenie barwnika poprzez testowanie różnych rozcieńczeń, począwszy od rozcieńczenia sugerowanego przez producenta do obrazowania żywych komórek. Do tego badania użyto dalekiego czerwonego podłoża fluorescencyjnego. Optymalne stężenie 12 nM określono dla linii komórkowych z nadekspresją indukowaną doksycykliną.

  1. Rozcieńczyć barwnik SNAP do odpowiedniego stężenia we wstępnie podgrzanej pożywce do hodowli komórek ES. Za pomocą pipety delikatnie usuń pożywkę z komórek uprzednio umieszczonych na płytce 96-dołkowej i dodaj 50 μl rozcieńczonego barwnika SNAP na dołek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Odessać rozcieńczony barwnik pipetą i przemyć 3x 200 μL wstępnie podgrzanego PBS (bez Ca2+/Mg2+). Dodać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych ES i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Powtórz poprzednie kroki prania jeszcze dwa razy.
    Uwaga: Ważne jest dokładne mycie w celu usunięcia niezwiązanego barwnika. Powtarzające się etapy mycia PBS usuwają resztki barwnika zewnątrzkomórkowego z pożywki, podczas gdy 15-minutowa inkubacja zapewnia solidne znakowanie białek fuzyjnych SNAP-tag przed rozpoczęciem eksperymentu obrazowania. Etapy mycia należy jednak wykonywać poprzez delikatne pipetowanie i nie używać automatycznego aspiratora, ponieważ komórki wysiane na E-cad-Fc mają tendencję do łatwego odrywania się.
  4. Dodać 200 μl podłoża do obrazowania. Aby zmniejszyć tło fluorescencji, należy użyć pożywki wolnej od czerwieni fenolowej (uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej kwalifikowanej przez komórki ES, 2 mM pirogronianu sodu, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 100 μM 2-merkaptoetanolu, LIF, 3 μM CHIR99021 i 0,8 μM PD184352).

3. Mikroskopia poklatkowa

  1. Użyj mikroskopu odpowiedniego do obrazowania na żywo, umożliwiającego kontrolowanie temperatury i CO2 . Przed użyciem ustawić temperaturę na 37 °C, a CO2 do 5% i pozostawić do zrównoważenia przez 1 - 2 godziny.
  2. Umieść płytkę w mikroskopie i znajdź miejsca odpowiednie do obrazowania. Wybierz miejsca, w których komórki są równomiernie rozmieszczone, ale niezbyt gęste, ponieważ ułatwi to analizę. Dostosuj liczbę zaznaczonych plamek do liczby komórek wymaganych do analizy. W tym badaniu zarejestrowano 3 - 5 plamek na linię komórkową.
  3. Wybierz cel. Obiektyw 20X jest odpowiedni do rozmiaru komórek ES.
  4. Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanałów fluorescencyjnych, które mają być nagrywane. Dostosuj moc lasera i ekspozycję do intensywności sygnału fluorescencji z interesujących komórek. Upewnij się, że uzyskałeś silny sygnał początkowy, ponieważ będzie się on zmniejszał w trakcie trwania filmu, ale unikaj mocy lasera wyższej niż 30%, aby zminimalizować fototoksyczność i fotowybielanie. Do badań wykorzystano filtr wzbudzenia 632/22 nm (długość fali/pasmoprzepust), filtr emisyjny 679/34 nm (długość fali/pasmoprzepust), moc lasera 10% i czas naświetlania 100 ms.
  5. Wybierz interwały obrazowania i czas trwania eksperymentu poklatkowego. W przypadku białek o przewidywanym okresie półtrwania wynoszącym 2 - 20 godzin należy wybrać czasy pobierania 12 - 24 godziny w odstępach czasowych 15 minut. W przypadku białek o krótszym czasie życia należy skrócić odstępy i czasy pozyskiwania, w przypadku białek o dłuższym życiu odpowiednio wzrosnąć.
  6. Rozpocznij obrazowanie.

4. Przetwarzanie i analiza obrazu

  1. Zbierz pozyskane obrazy jako stos w formacie tiff. Do dalszego przetwarzania i analizy należy użyć oprogramowania FIJI software15. Jeśli dane poklatkowe nie są zbierane jako stos przez oprogramowanie mikroskopu, otwórz wszystkie klatki eksperymentu poklatkowego w oprogramowaniu (klikając Plik | Otwórz... lub przeciągnij i upuść odpowiednie pliki na pasek narzędzi) i kliknij Obraz | Stosy | Obrazy do ułożenia w stos.
  2. Użyj funkcji odejmowania tła, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów w stosie. Aby to zrobić, kliknij przycisk Proces | Odejmij tło. Wybierz promień toczącej się kuli w wyskakującym okienku. Użyj promienia, który jest co najmniej równy rozmiarowi obrazowanych komórek. Aby zastosować odejmowanie tła do wszystkich komórek w stosie, wybierz opcję Tak w oknie podręcznym Stos procesów.
  3. Wybierz interesującą komórkę i narysuj wokół niej obszar zainteresowania (ROI) za pomocą paska narzędzi. W przypadku sygnałów jądrowych użyj wyboru Owal, klikając najpierw odpowiednią zakładkę na pasku narzędzi, a następnie klikając jądro zainteresowania i dostosowując owal wokół niego. W przypadku sygnałów cytoplazmatycznych lub bardzo gęstych regionów użyj wyboru odręcznego, aby móc dokładnie śledzić kontury komórek. Unikaj dołączania zbyt dużych obszarów tła, nawet jeśli nie jest konieczne dokładne podążanie za konturami komórek ze względu na późniejsze odjęcie wszystkich pikseli tła (kroki 4.8 - 4.9).
  4. Dodaj obszar zainteresowania do menedżera ROI, klikając Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji | Dodaj lub naciskając T na klawiaturze.
  5. Przejdź do następnej klatki, przesuwając kartę w oknie stosu lub naciskając shift + < na klawiaturze, a następnie powtórz poprzednie czynności. Podążaj za interesującą komórką przez cały czas trwania filmu i dodaj ROI każdej klatki do menedżera ROI. Zapisz ostateczny zestaw zwrotu z inwestycji dla każdej śledzonej komórki, klikając Więcej | Zapisz... w menedżerze ROI.
    Uwaga: Po podziałach komórkowych śledź obie komórki potomne oddzielnie i zsumuj ich zintegrowane intensywności po odjęciu tła (patrz kroki 4.6 - 4.9), aby uwzględnić rozcieńczenie białka podczas podziału komórki. Zapisz zestawy ROI dla obu komórek potomnych.
  6. Gdy interesująca komórka jest śledzona przez cały film, kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać wartości średniej intensywności i obszaru ROI. Skopiuj uzyskane wartości do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego i oblicz surową zintegrowaną intensywność komórki dla każdego punktu czasowego w następujący sposób:
    figure-protocol-1
    gdzie średniac jest średnią intensywnością, a obszar C jest obszarem odpowiadającego mu zwrotu z inwestycji.
  7. Aby oszacować tło lokalne, dodaj zwrot akcji w pobliżu komórki zainteresowania dla każdego przedziału czasu. Unikaj dołączania jakiegokolwiek sygnału fluorescencji komórkowej. Użyj okrągłego zwrotu z inwestycji, który jest mniej więcej wielkości komórki i odpowiednio go przesuń lub zmniejsz w razie potrzeby, np. jeśli sąsiednie komórki przeszkadzają. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem z ustawionym zwrotem z inwestycji w sieć komórkową, aby uzyskać zestaw ROI w tle i skopiuj zmierzone wartości intensywności do arkusza kalkulacyjnego.
  8. Aby uzyskać skorygowaną przez tło wartość zintegrowanej intensywności komórki, najpierw oblicz zintegrowaną intensywność tła dla każdego punktu czasowego:
    figure-protocol-2
    gdzie średniaBG jest średnim natężeniem sygnału tła, a obszarC jest obszarem ROI otaczającym komórkę. Nie używaj obszaru tła ROI, chyba że oba obszary mają ten sam rozmiar.
  9. Oblicz końcową zintegrowaną intensywność komórki odjętą od tła dla każdego punktu czasowego:
    figure-protocol-3
  10. Aby znormalizować krzywe rozpadu pojedynczej komórki, podziel wartość intensywności każdego punktu czasowego przez wartość intensywności pierwszego punktu czasowego.
    Uwaga: Dopasowywanie krzywej (patrz krok 4.11) można przeprowadzić na każdej pojedynczej komórce lub na średniej populacji. Normalizacja jest wymagana, jeśli obliczana jest średnia oparta na populacji, aby uniknąć błędów wynikających z różnych intensywności fluorescencji między komórkami. Normalizacja zapewnia zatem, że każda komórka przyczynia się z taką samą wagą do końcowej krzywej rozpadu. Ponadto normalizacja może być przydatna do wizualizacji rozpadów pojedynczych komórek niezależnie od ich bezwzględnej intensywności fluorescencji (patrz rysunki 3A-3C). Jeśli jednak określa się tylko okresy półtrwania pojedynczej komórki, a dane nie są uśredniane, etap normalizacji można pominąć, a dopasowanie krzywej można przeprowadzić bezpośrednio na danych surowych.
  11. Aby oszacować okres półtrwania białka, użyj narzędzia do dopasowywania krzywych. W tym badaniu użyto zestawu narzędzi do dopasowywania krzywych MATLAB 3.4.1, który domyślnie znajduje się w sekcji Aplikacje interfejsu użytkownika MATLAB. Zaimportuj wartości intensywności i czasu fluorescencji z elektronicznego arkusza kalkulacyjnego do MATLAB, klikając kartę Importuj dane. Otwórz przybornik do dopasowywania krzywych i wybierz punkty czasowe oraz dane zaniku fluorescencji na karcie Dane X i Dane Y. Wybierz Równanie niestandardowe na karcie dopasowania krzywej i wprowadź równanie dla rozkładu wykładniczego:
    figure-protocol-4
    gdzie f(t) jest intensywnością fluorescencji w danym punkcie czasowym, a intensywnością początkową, a b szybkością zanikania. Na karcie Opcje dopasowania wybierz wartość 0 dla dolnej granicy zarówno a, jak i b. Szacowane wartości dla a i b pojawią się w oknie wyników. Obliczyć okres półtrwania w następujący sposób:
    figure-protocol-5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół dostarcza oszacowania zmienności między komórkami w okresie półtrwania dla dowolnego białka połączonego ze znacznikiem SNAP. Zastosowanie rekombinowanej E-kadheryny-Fc do powlekania płytki obrazowej pozwala na rozdzielczość pojedynczych komórek w komórkach ES, które w przeciwnym razie rosną w koloniach. Pojedyncze komórki mogą być śledzone oddzielnie przez cały czas trwania filmu ( Rysunek 1A).

Aby określić okres półtrwania białka dla każdej pojed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym krokiem przy użyciu znacznika SNAP do monitorowania rozpadu białek jest upewnienie się, że po umyciu w pożywce lub w komórkach nie pozostały żadne resztki niezwiązanego barwnika, ponieważ w przeciwnym razie może on związać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w dalszej części eksperymentu, a tym samym pogorszyć krzywą rozpadu. Osiąga się to z jednej strony poprzez staranne wykonanie wszystkich opisanych kroków prania. Z drugiej strony, stężenie barwnika powinno być utrzymywane na jak najniższym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z mikroskopią poklatkową przeprowadzono w Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Dziękujemy Marcowi Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) za filmowanie i montaż filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
ES linia komórkowa wyrażająca interesujące białko fuzyjne SNAP-tag-
Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych poddanych działaniu TCCorning353003
96 Well,/przezroczysty, płytka poddana kulturze tkankowejCorning353219
Ulepszona przez Neubauera komora licząca, 0,1 mmInkubator CO2 Marienfeld-superior640030
PanasonicMCO-170AICUV-PE
5804 REppendorf5804000528
InCell Analyzer System obrazowania komórek 2200 GEHealthcare Life Sciences29027886
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Glasgow Minimum Essential MediumSigma-AldrichG5154
Surowica bydlęca dla płodu, kwalifikowana do embyonicznych komórek macierzystychThermoFisher16141-079
Roztwór pirogronianu soduSigma-Aldrich113-24-6
Minimalne niezbędne medium  Aminokwasy endogenneThermoFisher11140-035
Penicylina-StreptomycynaBioConcept4-01F00H
L-Glutamina 200mMThermoFisher25030-024
2-merkaptoetanolSigma-Aldrich63689-25ML-F
Czynnik hamujący białaczkę--Wytwarzany w laboratorium przez przejściową transfekcję komórek HEK-293T, a następnie zbieranie i filtrowanie supernatantu.
CHIR99021 (Inhibitor GSK-3 XVI)Merck Millipore361559
Roztwór trypsyny EDTA 0,25%Sigma-AldrichT4049
Rekombinowane białko chimery E-kadheryny Fc E-kadheryny Fc& D systems748-EC-050
Hyclate doksycyklinySigma-AldrichD9891
SNAP-Cell 647-SiRNew England BioLabsS9102S
FluoroBrite DMEMThermoFisherA18967-01
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
FIJI--Oprogramowanie do analizy obrazów typu open source
MATLAB R2014aMathworks-Microsoft
ExcelMicrosoft-
Wirówka PD 0325901 Sigma-Aldrich 391210-10-9 Żelatyna ze skóry bydlęcej Sigma-Aldrich 9000-70-8 Dulbecco's PBS 10x skoncentrowany BioConcept 3-05K00-I PBS firmy Dulbecco bez Ca++/Mg++BioConcept 3-05F29-I R

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
  2. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  3. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
  4. Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
  5. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  6. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
  7. Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
  8. Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
  9. Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
  10. Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).
  11. Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
  12. Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
  13. Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).
  14. Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
  17. Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
  18. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
  19. Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
  20. Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
  21. Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
  22. Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
  23. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
  24. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Okres p trwania bia kafuzja z SNAP Tagmikroskopia time lapseobrazowanie fluorescencyjneanaliza pojedynczych kom rekembrionalne kom rki macierzyste myszydopasowywanie krzywychintensywno fluorescencjioptymalizacja barwnika SNAP

Powiązane artykuły