Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza miceli amfifilowych peptydów ukierunkowanych na monocyty do obrazowania miażdżycy

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56625

⸱

17 listopada 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę obejmującą syntezę i charakterystykę miceli amfifilowych peptydów ukierunkowanych na monocyty oraz odpowiednie testy do testowania biokompatybilności i zdolności miceli do wiązania się z monocytami.

Streszczenie

Miażdżyca jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do chorób układu krążenia, główną przyczyną zgonów na całym świecie, która pochłania 17,3 miliona istnień rocznie. Miażdżyca jest również główną przyczyną nagłej śmierci i zawału mięśnia sercowego, wywołanego przez niestabilne blaszki, które pękają i zamykają naczynie krwionośne bez ostrzeżenia. Obecne metody obrazowania nie są w stanie odróżnić stabilnych i niestabilnych blaszek, które pękają. Peptydowe micele amfifilów (PAM) mogą przezwyciężyć tę wadę, ponieważ można je modyfikować za pomocą różnych ugrupowań celujących, które wiążą się specyficznie z chorą tkanką. Wykazano, że monocyty są wczesnymi markerami miażdżycy, podczas gdy duże nagromadzenie monocytów wiąże się z blaszkami miażdżycowymi podatnymi na pękanie. W związku z tym nanocząstki, które mogą celować w monocyty, mogą być wykorzystywane do rozróżniania różnych etapów miażdżycy. W tym celu w niniejszym artykule opisujemy protokół przygotowania PAM ukierunkowanych na monocyty (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAM). MCP-1 PAM są samoorganizujące się w procesie syntezy w łagodnych warunkach, tworząc nanocząstki o średnicy 15 nm z prawie neutralnym ładunkiem powierzchniowym. W warunkach in vitro stwierdzono, że PAM są biokompatybilne i mają wysokie powinowactwo do wiązania monocytów. Opisane tu metody dają nadzieję na szeroki zakres zastosowań w miażdżycy, a także innych chorobach zapalnych.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie z około 17,3 milionami zgonów na całym świecie1. Do chorób sercowo-naczyniowych przyczynia się miażdżyca, stan, w którym blaszki miażdżycowe gromadzą się w tętnicach, hamując w ten sposób przepływ krwi i tlenu do komórek ciała2,3. Postęp miażdżycy polega na pogrubieniu i stwardnieniu tętnic w wyniku reakcji zapalnej, nieregularnego metabolizmu lipidów i gromadzenia się blaszki miażdżycowej, co prowadzi do pęknięcia blaszki miażdżycowej i zawału mięśnia sercowego4,5. Komórki śródbłonka wyrażają cytokiny i cząsteczki adhezyjne, które obejmują MCP-1, który wiąże się z receptorem chemokiny C-C (CCR2) znajdującym się na powierzchni monocytów6,7,8. Utleniony cholesterol przekształca monocyty w makrofagi na wczesnym etapie tworzenia blaszki miażdżycowej, co wzmacnia odpowiedź zapalną w regionie i prowadzi do uszkodzenia tkanek oraz tworzenia niestabilnych lub wrażliwych blaszek miażdżycowych9,10.

Tradycyjnie, miażdżyca tętnic jest oceniana poprzez ocenę zwężenia światła za pomocą obrazowania anatomicznego za pomocą angiografii lub ultradźwięków11,12. Jednak metody te mogą określić tylko poważne zwężenie ściany tętnicy, a nie wczesny etap miażdżycy, ponieważ początkowy wzrost blaszki miażdżycowej powoduje przebudowę tętnicy w celu utrzymania wielkości tętnicy i szybkości przepływu krwi12,13,14. Dlatego angiogramy nie reprezentują częstości występowania miażdżycy. Ponadto nieinwazyjne techniki obrazowania, takie jak tomografia emisyjna pojedynczych fotonów, pozytonowa tomografia emisyjna i rezonans magnetyczny, zostały ostatnio wykorzystane do scharakteryzowania morfologii blaszki miażdżycowej, ponieważ mogą dostarczyć wstępnych szczegółów i charakterystyki blaszek. Jednak te modalności są często ograniczone przez brak czułości, rozdzielczości przestrzennej lub wymagają użycia promieniowania jonizującego, co sprawia, że progresja obrazowania płytki miażdżycowej na różnych etapach jest znacznie trudniejsza15,16,17. Do opracowania pozostaje jeszcze system obrazowania, który identyfikowałby blaszki miażdżycowe w różnych stadiach miażdżycy.

Nanocząsteczki okazały się być nową platformą do celowania i diagnostyki in vivo płytki nazębnej18,19,20,21. W szczególności PAM są korzystne ze względu na ich różnorodność chemiczną i zdolność do przyjmowania różnych ugrupowań, składów, rozmiarów, kształtów i funkcjonalizacji powierzchni22. Amfifile peptydowe (PA) składają się z hydrofilowej, peptydowej "grupy czołowej" przyłączonej do hydrofobowego ogona, które są zazwyczaj lipidami; Ta amfifilowa struktura nadaje zdolności do samoorganizacji i pozwala na wielowartościowe wyświetlanie peptydów na powierzchni cząstki22,23,24. Grupy główne peptydów mogą wpływać na kształt cząstek poprzez fałdowanie i wiązania wodorowe między peptydami25. Wykazano, że peptydy, które zwijają się w wyniku interakcji β arkuszem, tworzą wydłużone micele, podczas gdy potwierdzenie α-helisowe może tworzyć zarówno sferyczne, jak i wydłużone micele22,23,24,25,26,27. Łączniki z glikolu polietylenowego (PEG), które osłaniają ładunek powierzchniowy peptydu, można umieścić między hydrofilowym peptydem a hydrofobowym ogonem PAM, zwiększając dostępność nanocząstki w krążeniu ogólnoustrojowym28,29,30,31. PAM są również korzystne, ponieważ są biokompatybilne i wykazano, że mają szeroki zakres zastosowań32,33. Rozpuszczalność miceli w wodzie daje przewagę nad innymi systemami opartymi na nanocząsteczkach, takimi jak niektóre nanocząstki polimerowe, które nie są rozpuszczalne w wodzie i muszą być zawieszone w solubilizatorach do wstrzykiwań34. Dodatkowo, zdolność do tworzenia PAM, które rozkładają się w odpowiedzi na określone bodźce, sprawia, że PAM są atrakcyjnym kandydatem do kontrolowanego wewnątrzkomórkowego dostarczania leków35.

Poprzez wiązanie się z receptorem CCR2 i gromadzenie się w łuku aorty, PAM zostały wcześniej opracowane do celowania w monocyty w celu monitorowania różnych etapów zmian miażdżycowych w aorcie9. U myszy ApoE-/- akumulacja monocytów wzrasta proporcjonalnie do progresji blaszki miażdżycowej36. Ponadto stwierdzono, że pacjenci z podatnymi na pękanie, późnymi stadiami blaszek zawierają większe ilości monocytów37. W związku z tym modyfikacja PAM w celu włączenia MCP-1 jest przydatna, ponieważ pozwala na większą swoistość celowania i różnicowanie między zmianami miażdżycowymi we wczesnym i późnym stadium. Te badania potwierdzające słuszność koncepcji potwierdziły również, że PAM są wystarczająco bezpieczne, aby można je było stosować przedklinicznie i są oczyszczane przez nerki38. Ponieważ monocyty i stany zapalne są charakterystyczne dla innych chorób, MCP-1 PAM mogą być wykorzystywane do zastosowań terapeutycznych i diagnostycznych w innych chorobach poza miażdżycą8,39,40,41.

Tutaj informujemy o produkcji wysoce skalowalnych i samoorganizujących się PAM MCP-1, które wykazały optymalny rozmiar cząstki, ładunek powierzchniowy i selektywne kierowanie do monocytów w celu poprawy zastosowań obrazowania w miażdżycy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przeczytaj kartę charakterystyki dla odczynników i przestrzegaj wszystkich chemicznych środków bezpieczeństwa wymaganych przez lokalną instytucję.

1. Przygotowanie MCP-1 PAM

  1. Przygotowanie peptydu MCP-1
    1. Odważyć 0,25 mmol Fmoc-L-Lys(Boc)-Wang w naczyniu reakcyjnym (RV). Opłucz bok RV 5 ml dimetyloforamidu (DMF) w dygestoriach chemicznych.
    2. Załaduj RV do automatycznego laboratoryjnego syntezatora peptydów. Załadować paczkowane fiolki z aminokwasami, N'-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C', od C do N-końca. Dołącz pustą fiolkę na końcu, aby wykonać ostatni etap deochrony.
      UWAGA: Zaszyfrowany peptyd z sekwencją, N'-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C', może być również syntetyzowany przy użyciu tego samego protokołu.
    3. Po zakończeniu syntezy przenieś peptydy na żywicy z RV do fiolki scyntylacyjnej z 2-3 ml metanolu, aż wszystkie żywice zostaną przeniesione. Po opadnięciu żywicy na dno usuń supernatant metanolu i odparuj pozostałą część do wyschnięcia. Suszyć próżniowo przez dodatkowe 2 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotować 12 ml roztworu do rozszczepiania zawierającego kwas trifluoroctowy (TFA):etaneditiol:woda:triizopropylosilan o proporcji 94:2,5:2,5:1 obj. w dygestoriach chemicznych. Zamieszaj roztwór do łupliwości, aby upewnić się, że jest równomiernie wymieszany.
      UWAGA: Ponieważ triizopropylosilan i etaneditiool są wrażliwe na powietrze, argon należy przedmuchnąć fiolki z triizopropylosililanem i etaneditiolem przez 1 minutę przed ich ponownym włożeniem.
    5. Umieść naczynie do syntezy (SV) na wytrząsarce ramienia, zaciskając w pobliżu dolnej połowy SV. Przenieść żywicę peptydową do SV za pomocą 2 ml roztworu rozszczepiającego, aż wszystkie żywice peptydowe zostaną przeniesione.
    6. Umyj boki SV 3 ml roztworu do rozszczepiania. Zamknij nakrętkę SV i potrząsaj z prędkością 300 oscylacji/min przez 4 godziny.
    7. Odważyć pustą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml. Nagraj masę.
    8. Po 4 godzinach odcedzić rozszczepiony roztwór peptydu z SV do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Spłucz SV kilka razy pozostałym roztworem do rozszczepienia.
    9. Odparować rozszczepiony roztwór peptydu z azotem, aż w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 4 ml.
    10. Dodać 36 ml lodowatego eteru do roztworu z rozszczepionymi peptydami.
    11. Mieszaj roztwór, aż stanie się całkowicie biały lub żółty. Odwirować przy 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować supernatant.
    12. Do probówki dodać 40 ml lodowatego eteru. Ponownie zawirować i wykonać sonikację. Powtórz proces wirowania. Zdekantować supernatant.
    13. Wysuszyć surowe granulki PA azotem gazowym, przepłukując je aż do widocznego odparowania eteru.
    14. Dodaj 20 ml podwójnie destylowanej wody, wiruj i sonikuj, aż peptyd całkowicie rozpuści się w roztworze.
    15. Zamrozić roztwór i liofilizować do wyschnięcia.
    16. Po wysuszeniu peptydu odważyć masę probówki wirówkowej zawierającej surowy peptyd. Rozpuść surowy peptyd w wodzie o stężeniu 5 mg/ml.
    17. Rozpuścić 25 mg surowego peptydu MCP-1 w 5 ml podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać całkowite stężenie 5 mg/ml. Oczyść surowy peptyd MCP-1 za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) przy użyciu 0,1% TFA w wodzie (rozpuszczalnik A) i 0,1% TFA w acetonitrylu (rozpuszczalnik B) jako faz ruchomych na kolumnie C8 z odwróconymi fazami. Wstrzyknąć 5 ml peptydu do HPLC.
      UWAGA: Początkowa faza ruchoma składała się ze 100% rozpuszczalnika A o natężeniu przepływu 9,0 ml/min. Powoli zmniejsz rozpuszczalnik A do 30% w ciągu 27 minut i przytrzymaj w tej kompozycji przez 3 minuty. Przywróć gradient do 100% rozpuszczalnika A w ciągu 3 minut i przytrzymaj w tej kompozycji przez 1 minutę, aby uzyskać całkowity czas pracy 34 minut. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 55 °C. Do analizy należy użyć trybu źródła jonów dodatnich. Kwas mrówkowy może być stosowany zamiast TFA, jeśli TFA jest zbyt kwaśny dla kolumny HPLC. Zaleca się, aby prędkość narastania kompozycji rozpuszczalnika organicznego nie przekraczała 2%/min dla lepszej separacji.
    18. Analizuj każdą frakcję za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) dla oczekiwanego produktu m/z przy 2 890,
      UWAGA: Rozpuścić kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy w stężeniu 1 mg/ml w acetonitrylu/wodzie (50:50 obj.) jako roztwór matrycy. Umieścić 0,75 μl roztworu matrycy na płytce MALDI, a następnie 0,75 μl każdej frakcji. Przeprowadzić analizę przy użyciu dodatniego trybu jonów refleksyjnych w zakresie mas 500-5,000 Da.
    19. Połącz frakcje produktu, zdmuchnij acetonitryl, zamroź i liofilizuj oczyszczone peptydy do wyschnięcia.
  2. Przygotowanie MCP-1 PA
    1. Przygotować 1,1-molowy nadmiar 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] DSPE-PEG(2000)-maleimidu do peptydu w oddzielnych fiolkach scyntylacyjnych. Rozpuść oba związki w wodzie podwójnie destylowanej, aby uzyskać ~ 15 mg/ml. Sonikować przez 15 minut lub do momentu, gdy oba roztwory będą całkowicie klarowne.
      UWAGA: Dspe-PEG(2000)-Cy5 jest syntetyzowany przy użyciu tego samego protokołu z DSPE-PEG(2000)-aminą i N-hydroksysukcynimidem (NHS) funkcjonalizowanym estrem Cy5, z wyjątkiem kroku 1.2.3, gdzie pH roztworu dostosowuje się do 8,5.
    2. Dodać roztwór DSPE-PEG(2000)-maleimidu do roztworu peptydu. Wir i dźwięk.
    3. Dodawać kroplami 1 M NaOH (1 μl) jednorazowo, aż pH roztworu osiągnie 7.
    4. Roztwór czyszczący azotem przez 5 minut. Mieszaj roztwór przez noc.
    5. Zamrozić roztwór i liofilizować do wyschnięcia.
    6. Po wysuszeniu surowego produktu należy rozpuścić ciało stałe w wodzie o stężeniu 5 mg/ml.
    7. Oczyszczać za pomocą HPLC zgodnie z powyższym opisem.
      UWAGA: Niesprzężony peptyd i DSPE-PEG(2000) powinny eluować między 15-30% stężenia organicznego (vol%), podczas gdy koniugat DSPE-PEG(2000)-MCP-1 powinien eluować między 40-50% stężenia organicznego.
    8. Przeanalizuj każdą frakcję za pomocą spektrometrii mas MALDI dla odpowiadającej jej m/z. DSPE-PEG(2000)-MCP-1 powinien mieć szeroki pik m / z przy 5 760,
      UWAGA: Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy najlepiej stosować jako matrycę dla DSPE-PEG(2000)-MCP-1 z MALDI.
  3. Montaż PAM MCP-1
    1. Rozpuścić 1,75 mg MCP-1 PAs w 3 ml metanolu w fiolce 1-dram. Sonikować aż do całkowitego rozpuszczenia MCP-1 PA.
      UWAGA: Amfifile Cy5 mogą być włączane w stosunku molowym 10:90 MCP-1 PA do zastosowań obrazowych.
    2. Odparować metanol pod azotem ruchem okrężnym, jednocześnie spłukując pozostały metanol z boku fiolki, aż na dnie fiolki utworzy się jednolity film. Wysuszyć folię próżniowo przez noc.
    3. Uwodnić folię 3 ml wody lub soli fizjologicznej w postaci buforu fosforanowego (PBS), aby uzyskać 100 μM roztwór MCP-1 PAM. Delikatnie zmieszać i poddać sonikacji roztwór, aż będzie klarowny. Inkubować w temperaturze 80 °C przez 30 min.
      UWAGA: Wykazano, że podwyższona temperatura przyspiesza proces samoorganizacji i pozwala składnikowi peptydowemu utworzyć najbardziej stabilną strukturę drugorzędową, jednocześnie obniżając krytyczne stężenie miceli (CMC)42,43.
    4. Schłodzić powstałą dyspersję do temperatury pokojowej.

2. Charakterystyka MCP-1 PAM

  1. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) i potencjał zeta
    1. Umieść 100 μM MCP-1 PAM lub zaszyfrowanego PAM w kuwecie zgodnie z instrukcjami instrumentu DLS lub potencjału zeta.
      UWAGA: Kuwety potencjału DLS i zeta mogą się różnić w zależności od instrukcji instrumentu.
    2. Zrównoważyć przyrząd do temperatury pokojowej. Zmierz rozmiar i ładunek powierzchniowy PAM.
  2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Dodać 7 μl 50 μM MCP-1 PAM lub zaszyfrowanego PAM na siatkę TEM zawieszoną w samozamykającej się pęsetie na 5 minut. Odchować kroplę delikatną ściereczką zadaniową.
    2. Dodaj 7 μl wody, aby umyć ruszt. Odprowadzić kroplę.
    3. Dodać 7 μl 1% wag. kwasu fosfowolframowego przez 2 min. Odchować kroplę. Powtórz krok 2.2.2.
    4. Wysuszyć siatkę TEM przed analizą TEM.
  3. Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD)
    1. Włącz azot na 5-10 minut przed użyciem urządzenia.
    2. Umieścić 300 μl ślepej próby (wody lub PBS) w kuwecie.
    3. Zmierz widma przy długości fali 190-265 nm, długości ścieżki 0,2 mm z czasem integracji 1 s i szerokości pasma 1 nm w temperaturze pokojowej. Zbierz 3 repliki.
    4. Zmierzyć 100 μM peptydu MCP-1, MCP-1 PAM, zaszyfrowanego peptydu i zakodowanego PAM w tych samych warunkach, które opisano w kroku 2.3.3. Odejmij od pustego pola.
    5. Dopasuj dane za pomocą interpolacji liniowej widm bazowych polilizyny.
    6. Wyłącz instrument. Odczekaj 10 minut przed wyłączeniem azotu.

3. Analiza in vitro MCP-1 PAM

  1. Biokompatybilność in vitro
    1. Hodowla i ekspansja mysich monocytów WEHI 274.1 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną-streptomycyną i 0,05 mM 2-merkaptoetanolem w 37 °C poniżej 5% CO2 do pasażu 5,
      UWAGA: WEHI 274.1 to ogniwa zawiesinowe. Podczas hodowli pożywkę należy uzupełniać co 2-3 dni.
    2. Pipetować monocyty w pożywce do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odessać starą pożywkę i ponownie zawiesić w 10 ml świeżej pożywki w probówce wirówkowej. Mieszaj powoli, aż komórki zostaną równomiernie rozłożone w pożywce. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru.
    4. Rozcieńczyć komórki tak, aby na 90 μl pożywki na studzienkę przypadało 4 000 monocytów. Dodać 90 μl komórek do studzienek 96-dołkowej płytki. Inkubować przez 24 godziny
      UWAGA: Unikaj używania dołków na zewnętrznej krawędzi płyty, aby uniknąć różnic w parowaniu i zmianach termicznych w płycie. Napełnij zewnętrzne studzienki 100 μl PBS.
    5. Rozpuść 0,15 μmol peptydu MCP-1, MCP-1 PAM, zaszyfrowanego peptydu lub zaszyfrowanego PAM w 150 μl PBS w oddzielnych, wysterylizowanych probówkach do mikrowirówek. Przeprowadzić rozcieńczanie seryjne, aby uzyskać 65 μl z 1, 10 i 100 μM każdej próbki.
    6. Dodać 10 μl PBS każdego stężenia do studzienek zawierających WEHI 274.1 (całkowita objętość: 100 μl na studzienkę, 6 linii, łącznie 96 studzienek). Inkubować przez 72 godziny.
    7. Dodać 10 μl (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium) (MTS) do każdego dołka. Inkubować przez 1 godzinę.
    8. Analizować absorbancję za pomocą czytnika płytek przy długości fali 490 nm lub w oparciu o instrukcje producenta.
  2. Wiązanie miceli in vitro
    1. Wysiewaj 500 000 monocytów w każdym dołku 6-dołkowej płytki w 2 ml pożywki zawierającej 100 μM znakowanego Cy5 MCP-1 PAM (stosunek molowy 10:90 DSPE-PEG(2000)-Cy5 i MCP-1 PA). Inkubować przez 1 godzinę.
    2. Zebrać WEHI 274.1 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać pożywkę.
    3. Ponownie zawiesić i umyć komórki w 2 ml PBS. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać PBS. Powtórz proces mycia z 2 ml PBS. Zassać PBS.
    4. Dodaj 2 ml zimnego 4% paraformaldehydu, aby utrwalić komórki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Odpipetować utrwalone komórki na sterylne szklane szkiełko nakrywkowe w studzienkach na płytce 6-dołkowej. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    6. Usuń paraformaldehyd. Umyj i spłucz raz 2 ml PBS. Zawiesić za pomocą 1 ml PB
      UWAGA: Podczas płukania należy unikać uszkadzania komórek na szkiełku nakrywkowym.
    7. Umieścić 10 μl 90% glicerolu w PBS na szkiełku podstawowym (PBS). Użyj igły i pęsety, aby podnieść szkiełko nakrywkowe. Osusz krawędź szkiełka nakrywkowego. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku zadrukowanym do dołu.
    8. Delikatnie uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci. Umieść w lodówce, aż będzie gotowy do obrazowania.
    9. Użyć konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) zainstalowanego z laserami dla Cy5 przywzbudzeniu λ = 650 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przygotowanie PAM MCP-1
Motyw wiążący CCR2 (pozostałości 13-35) białka MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] lub peptyd randomizowany (scrambled) [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] zmodyfikowano poprzez dodanie reszty cysteiny na N-końcu. Peptyd MCP-1 zsyntezowano metodą syntezy na fazie stałej z wykorzystaniem grup ochronnych Fmoc przy użyciu automatycznego syntezatora peptydów. Surowy peptyd oczyszczono metodą odwróconej fazy HPLC na kolumnie C8 w temperaturze 50 °C, stosując 0,1% ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MCP-1 PAM to obiecująca platforma obrazowania molekularnego, składająca się z hydrofilowego peptydu celującego i hydrofobowego ogona, który napędza samoorganizującą się naturę nanocząstki. Ta micela ukierunkowana na monocyty może być przygotowana przez proste etapy syntezy i oczyszczania peptydu MCP-1 i DSPE-PEG(2000)-MCP-1. PAM mają wiele korzystnych cech dla obrazowania molekularnego in vivo, takich jak ich samoorganizacja w łagodnych warunkach, wewnętrzna biodegradowalność oraz różnorodność strukturalna i che...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie finansowe ze strony Uniwersytetu Południowej Kalifornii, Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI), R00HL124279, Eli and Edythe Broad Innovation Award oraz L.K. Whittier Foundation Non-Cancer Translational Research Award przyznanego EJC. Autorzy dziękują Centrum Mikroskopii Elektronowej i Mikroanalizy, Centrum Doskonałości w NanoBiofizyce, Centrum Doskonałości Charakterystyki Molekularnej oraz Centrum Obrazowania Translacyjnego na Uniwersytecie Południowej Kalifornii za pomoc w konfiguracji instrumentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-etanedithiolVWRE0032do syntezy peptydów
10 ml jednorazowe pipety serologiczneVWR89130-898do hodowli komórkowych
15 ml probówki wirówkowe, polipropylenVWR89401-566do różnych zastosowań
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy, 99%Fisher ScientificAC165200050do jednorazowego MALDI
25 ml pipety serologiczneVWR89130-900do hodowli komórkowych
2-merkaptoetanol, 50mM ThermoFisher Scientific31350010do hodowli komórkowych
Jednorazowe pipety serologiczne 5 mlVWR89130-896do hodowli komórkowych
50 ml probówki wirówkoweVWR89039-658do różnych zastosowań
Kolba hodowlana 75 cm2Fisher Scientific13-680-65do hodowli komórkowych
75 ml naczynie reakcyjneProtein Technologies3000005do syntezy peptydów
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowejVWR40101-346do testu MTS
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ScientificA998SK-4do oczyszczania HPLC
Szkło borokrzemianowe, 1 dramVWR66011-041do syntezy PAM
Pipeta ze szkła borokrzemianowego, długie końcówkiVWR14673-043do różnych zastosowań
Szkiełko nakrywkowe, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bdo mikroskopii konfokalnej
Cy5 aminaAbcamab146463do koniugacji peptydów
Eter dietylowy, klasa ACSFisher ScientificE138-1do wytrącania peptydów
Jednorazowe strzykawki, 20 mlFisher Scientific14-817-54do oczyszczania HPLC
Hemocytometr z podwójnym neubaueremVWR63510-13do zliczania komórek
DSPE-PEG(2000) aminaAvanti880128Pdo koniugacji peptydów
DSPE-PEG(2000) maleimidAvanti880126Pdo koniugacji peptydów
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kdo koniugacji z Cy5
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle średnio-wysoki poziom glukozySigma AldrichD5796-500MLdo hodowli komórkowych
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznieThermoFisher Scientific10438026do hodowli komórkowych
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ado syntezy
peptydówFmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ido syntezy peptydów
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ldo syntezy peptydów
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Fdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBdo syntezy peptydów
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vdo syntezy peptydów
Żywica Fmoc-Lys(Boc)-wang, 100-200 meshNovabiochem856013do syntezy peptydów
Kwas mrówkowy, optima klasy LC/MSFisher ScientificA117-50do oczyszczania HPLC
GlicerolVWRM152-1Ldo mikroskopii konfokalnej
Ręczny licznik kontrolnyFisher ScientificS90189do liczenia komórek
Mieszadła magnetyczne, w kształcie jajkaVWR58949-006do koniugacji peptydów
Metanol, certyfikat ACSFisher ScientificA412-4do syntezy PAM
Zestaw do testu kolorymetrycznego proliferacji komórek MTSVWR10191-104do testu MTS
N,N-dimetyloformamid, stopień sekwencjonowaniaFisher ScientificBP1160-4do syntezy peptydów
N-metylorfolinaTechnologie białkoweS-1L-NMMdo syntezy peptydów
ParaformaldehydFisher ScientificAC416780250do utrwalania komórek
PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010049do różnych zastosowań
Penicylina/streptomycyna, 10 000 U/mlThermoFisher Scientific15140122do hodowli komórkowych
Naczynie do syntezy peptydów, 25 ml& nbsp;Fisher ScientificCG186011do syntezy peptydów
Kwas fosfowolframowy Fisher ScientificA248-25do TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLdo syntezy peptydów
Szkiełko mikroskopowe ze szkła zwykłego 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3do mikroskopii konfokalnej
Zbiorniki na odczynniki, sterylne VWR95128093do hodowli komórkowych
Pęseta samozamykającaTedPella515TEM TEM
TedPella01814Fdo
TEM Kwas trifluorooctowy Fisher ScientificBP618-500do rozszczepiania peptydów i oczyszczania HPLC
TriizopropylosilanVWRTCT1533-5mldo rozszczepiania peptydów
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061do liczenia komórek
Pęseta, ogólnego przeznaczenia ząbkowanaVWR231-SA-SEdo mikroskopii konfokalnej
WEHI-274.1ATCCATCC  CRL-1679mysi monocyt
automatyczny laboratoryjny syntezator peptydówProtein TechnologiesPS3 Laboratoryjny syntezator peptydów
kwas alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowy, 99%Sigma Aldrich476870-2Gdla MALDI
do folii nośnej i

Bibliografia

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie mia d ycypeptyd MCP 1oczyszczanie metod HPLCdynamiczne rozpraszanie wiat amikroskopia konfokalnaocena biokompatybilno cisynteza nanocz stekwi zanie tioeterowe
Synteza miceli amfifilowych peptydów ukierunkowanych na monocyty do obrazowania miażdżycy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.