Artykuł metodologiczny

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

DOI:

10.3791/56626

⸱

22 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Verona, 2Ecology and Evolution, Research School of Biology, The Australian National University, 3Dipartimento di Agraria, SACEG, Università degli Studi di Sassari

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasyfikacja i nazewnictwo genów w rodzinie może znacząco przyczynić się do opisu różnorodności kodowanych białek i przewidywania funkcji rodziny na podstawie kilku cech, takich jak obecność motywów sekwencji lub szczególnych miejsc modyfikacji potranslacyjnej oraz profil ekspresji członków rodziny w różnych warunkach. W pracy opisano szczegółowy protokół charakterystyki rodziny genów. W tym przypadku procedura jest stosowana do charakterystyki Arabidopsis Tóxicos w rodzinie ligazy ubikwityny E3 Arabidopsis (ATL) E3 w winorośli. Metody te obejmują identyfikację członków rodziny w całym genomie, charakterystykę lokalizacji, struktury i duplikacji genów, analizę konserwatywnych motywów białkowych, przewidywanie lokalizacji białek i miejsc fosforylacji, a także profilowanie ekspresji genów w całej rodzinie w różnych zestawach danych. Taka procedura, która może zostać rozszerzona o dalsze analizy w zależności od celów doświadczalnych, może być zastosowana do dowolnej rodziny genów u dowolnego gatunku roślin, dla których dostępne są dane genomiczne, i dostarcza cennych informacji do identyfikacji interesujących kandydatów do badań funkcjonalnych, dając wgląd w molekularne mechanizmy adaptacji roślin do środowiska.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono wiele badań w dziedzinie genomiki winorośli. Winorośl jest uznaną rośliną uprawną o znaczeniu gospodarczym, która stała się modelem dla badań nad rozwojem owoców oraz nad reakcjami roślin drzewiastych na stresy biotyczne i abiotyczne. W tym kontekście, wydanie genomu odmiany Vitis vinifera PN40024 w 2007 roku1 i jego zaktualizowanej wersji w 2011 roku2 doprowadziło do szybkiej akumulacji danych na skalę "omiczną" i do wysypu badań o wysokiej przepustowości. Na podstawie opublikowanych danych sekwencyjnych można teraz przeprowadzić kompleksową analizę danej rodziny genów (na ogół składającej się z białek o wspólnych konserwatywnych motywach, podobieństwach strukturalnych i/lub funkcjonalnych oraz związkach ewolucyjnych) w celu odkrycia jej funkcji molekularnych, ewolucji i profili ekspresji genów. Analizy te mogą przyczynić się do zrozumienia, w jaki sposób rodziny genów kontrolują procesy fizjologiczne na poziomie całego genomu.

Wiele aspektów cyklu życia roślin jest regulowanych przez degradację kluczowych białek za pośrednictwem ubikwityny, które wymagają precyzyjnej rotacji, aby zapewnić regularne procesy komórkowe. Ważnymi składnikami procesu degradacji, w którym pośredniczy ubikwityna, są ligazy ubikwityny E3, które są odpowiedzialne za elastyczność systemu, dzięki rekrutacji określonych celów3. W związku z tym enzymy te reprezentują ogromną rodzinę genów, z około 1400 genami kodującymi ligazę E3 przewidywanymi w genomie Arabidopsis thaliana 4, przy czym każda ligaza ubikwityny E3 działa na rzecz ubikwitynacji określonych białek docelowych. Pomimo znaczenia ubikwitynacji specyficznej dla substratu w regulacji komórkowej u roślin, niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób szlak ubikwitynacji jest regulowany, a białka docelowe zostały zidentyfikowane tylko w kilku przypadkach. Rozszyfrowanie takiej specyficzności i mechanizmów regulacji opiera się przede wszystkim na identyfikacji i charakterystyce różnych składników systemu, w szczególności ligaz E3. Wśród ligaz ubikwityny podrodzina ATL charakteryzuje się 91 członkami zidentyfikowanymi u A. thaliana wykazującymi domenę palca RING-H25,6, niektóre z nich odgrywają rolę w obronie i reakcjach hormonalnych7.

Pierwszym kluczowym krokiem do zdefiniowania członków nowej rodziny genów jest precyzyjne zdefiniowanie cech rodziny, takich jak motywy konsensusu, kluczowe domeny i cechy sekwencji białek. Rzeczywiście, wiarygodne pobranie wszystkich członków rodziny genów na podstawie analizy BLAST wymaga pewnych obowiązkowych cech sekwencji, w szczególności domen białkowych odpowiedzialnych za funkcję/aktywność białka, służących jako sygnatura białka. Może to być ułatwione przez wcześniejszą charakterystykę tej samej rodziny genów u innych gatunków roślin lub osiągnięte poprzez analizę różnych genów przypuszczalnie należących do tej samej rodziny u różnych gatunków roślin, w celu wyizolowania wspólnych sekwencji. Członkowie rodziny mogą być następnie indywidualnie nazywani zgodnie ze wspólnymi zasadami ustalonymi przez międzynarodowe konsorcja dla danego gatunku roślin. Na przykład w przypadku winorośli taka procedura podlega zaleceniom Komitetu ds. Super-Nomenklatury ds. Adnotacji Genów Winogron (sNCGGa), ustanawiającym konstrukcję drzewa filogenetycznego obejmującego członków rodziny genów V. vinifera i A. thaliana, aby umożliwić adnotację genów na podstawie sekwencji nukleotydowych8.

Lokalizacja chromosomów członków rodziny i badanie duplikacji genów pozwalają na podkreślenie obecności genów duplikowanych w całym genomie lub tandemie. Takie informacje wydają się przydatne do rozwikłania przypuszczalnych funkcji genów, ponieważ mogą wykazywać funkcjonalną redundancję lub ujawniać różne sytuacje, np. brak funkcjonalizacji, neofunkcjonalizację lub subfunkcjonalizację9. Zarówno neo-, jak i subfunkcjonalizacja są ważnymi zdarzeniami, które tworzą nowość genetyczną, dostarczając nowych składników komórkowych do adaptacji roślin do zmieniającego się środowiska10. W szczególności duplikacje genów przodków i produkcja nowych genów były bardzo częste podczas ewolucji genomu winorośli, a nowo powstałe geny pochodzące z duplikacji proksymalnych i tandemowych w winorośli miały większe szanse na wytworzenie nowych funkcji11.

Kolejnym kluczowym czynnikiem w rozszyfrowywaniu funkcji rodziny genów jest profil transkryptomiczny. Dostępność publicznych baz danych dających dostęp do ogromnej ilości danych transkryptomicznych może być zatem wykorzystana do przypisania przypuszczalnych funkcji członkom rodziny genów za pomocą wielkoskalowych analiz ekspresji in silico. Rzeczywiście, specyficzna ekspresja niektórych genów w określonych organach roślinnych lub w odpowiedzi na pewne stresy może dać pewne wskazówki dotyczące przypuszczalnych ról odpowiednich białek w określonych warunkach i dać wsparcie dla hipotez o możliwej subfunkcjonalizacji zduplikowanych genów w odpowiedzi na różne wyzwania. W tym celu ważne jest, aby wziąć pod uwagę kilka zestawów danych: mogą to być już dostępne matryce ekspresji genów, takie jak atlas transkryptomiczny całego genomu organów winorośli i etapów rozwojowych12, lub mogą być budowane ad hoc poprzez pobieranie zbiorów danych transkryptomicznych dla poszczególnych gatunków roślin poddanych zdefiniowanym stresom. Co więcej, proste podejście wykorzystujące dwie matryce, jedną z danymi o podobieństwie parami, a drugą z parami współczynników koekspresji, można zastosować do oceny relacji między podobieństwem sekwencji a wzorcami ekspresji w rodzinie genów.

Celem tej pracy jest zapewnienie globalnego podejścia, definiowania struktury genów, zachowanych motywów białkowych, lokalizacji chromosomów, duplikacji genów i wzorców ekspresji, a także przewidywania lokalizacji białek i miejsc fosforylacji, aby osiągnąć wyczerpującą charakterystykę rodziny genów u roślin. Takie kompleksowe podejście zastosowano tutaj do charakterystyki rodziny ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli. Zgodnie z pojawiającą się rolą członków podrodziny ATL w regulacji kluczowych procesów komórkowych7, praca ta może pomóc w identyfikacji silnych kandydatów do badań funkcjonalnych i ostatecznie rozwikłać mechanizmy molekularne rządzące adaptacją tej ważnej rośliny do środowiska.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Identyfikacja domniemanego członka rodziny genów ATL

  1. Wersja internetowa PSI-BLAST
    1. Otwórz stronę internetową BLAST13 i kliknij na sekcję białkową BLAST.
    2. W polu "Wprowadź sekwencję zapytania" wprowadź sekwencję aminokwasową białka (tutaj VIT_05s0077g01970), która będzie używana jako sonda do identyfikacji pozostałych członków rodziny.
      UWAGA: Należy użyć dobrego reprezentatywnego białka (białka wykazującego wszystkie ważne cechy, które charakteryzują rodzinę).
    3. W polu "Wybierz zestaw wyszukiwania" należy wybrać bazę danych "Białko referencyjne" (refseq_protein) oraz interesujący nas organizm (V. vinifera - taxid:29760).
    4. W polu "Wybór programu" wybierz algorytm PSI-BLAST i kliknij przycisk BLAST, aby uruchomić analizę.
      UWAGA: Klikając na "Parametry algorytmu" można dostosować niektóre zaawansowane parametry (Max sekwencje docelowe, macierz scoringu, próg PSI-BLAST itp.).
    5. Pierwsza runda BLAST pobiera wszystkie sekwencje wyświetlające odpowiednie dopasowania z zapytaniem (wartość e powyżej wybranego progu - domyślnie 0,005; 0,001 w tym eksperymencie). Odznacz wszystkie wpisy, które wyraźnie nie należą do badanej rodziny, klikając na zaznaczenie w kolumnie "wybierz dla PSI-BLAST" i uruchom drugą iterację PSI-BLAST, klikając przycisk BLAST, jak w kroku 1.1.4.
    6. Nowo zidentyfikowane sekwencje są podświetlone na żółto. Usuń zaznaczenie ewidentnie błędnie pobranych działań i odkryj dalsze iteracje zgodnie z opisem w kroku 1.1.5.
    7. Kontynuuj iteracje, aż algorytm nie znajdzie żadnego odpowiedniego wpisu lub osiągnie zbieżność (nie zostaną znalezione żadne nowe wpisy). Pobierz listę domniemanych członków rodziny genów w celu dalszych analiz. Wizualnie sprawdź pobrane trafienia w każdej iteracji, aby uniknąć obecności wyników fałszywie dodatnich.
  2. Wersja samodzielna PSI-BLAST
    1. Pobierz samodzielną wersję BLAST, klikając przycisk "pobierz BLAST" na stronie domowej BLAST13.
      UWAGA: Samodzielne oprogramowanie BLAST jest wersją interfejsu internetowego opisanego wcześniej w wierszu poleceń. Umożliwia wykonanie wyszukiwania PSI-BLAST na niestandardowej lokalnej lub zdalnej bazie danych. Co więcej, umożliwia wyszukiwanie za pomocą predefiniowanej macierzy wyników specyficznej dla pozycji (PSSM).

2. Ręczna inspekcja członków rodziny zidentyfikowanych przez PSI-BLAST

  1. Wielokrotne wyrównanie
    1. Zbierz sekwencje aminokwasowe wcześniej zidentyfikowane w pliku w formacie FASTA i prześlij je do MEGA software14, aby kontynuować wielokrotne wyrównanie.
    2. Otwórz oprogramowanie MEGA, kliknij przycisk "Wyrównaj", kliknij "Edytuj/Zbuduj wyrównanie", kliknij "Utwórz nowe wyrównanie", kliknij "Białko".
    3. Kliknij "Edytuj" z menu wyrównania i "Wstaw sekwencję z pliku". Wyszukaj utworzony wcześniej plik FASTA i potwierdź przesłanie wszystkich badanych sekwencji.
    4. Kliknij "Wyrównanie" z menu wyrównania i "Wyrównaj według mięśni". Użyj parametrów domyślnych, kliknij przycisk "Oblicz" i poczekaj na zakończenie wielokrotnego wyrównania.
    5. Sprawdź wzrokowo wielokrotne wyrównanie, aby wykluczyć nieprawidłowo przewidywanych członków rodziny. Kanoniczny motyw CxxC(13x)PxCxHxxHxxCxxxW(7x)CxxCW (w szczególności obecność reszty proliny przed trzecią cysteiną) jest kluczową cechą wymaganą do zdefiniowania członków rodziny ATL.
  2. Analiza konkretnego LOGO
    1. Prześlij ostateczną listę członków rodziny (96 sekwencji winorośli spełnia wymagania, aby zostać uznanym za ATL) do Multiple Em for Motif Elicitation (MEME)15, aby zdefiniować zachowane motywy w całej rodzinie.
    2. Na stronie głównej MEME kliknij przycisk "MEME" i wypełnij "Formularz przesyłania danych", podając szczegółowe informacje dotyczące interesującej nas rodziny.
    3. Użyj analizy MEME, aby potwierdzić obecność dwóch oczekiwanych motywów w rodzinie ATL winorośli, tj. motywów RING-H2 i GLD.
  3. Alternatywnie, wykonaj kroki 2.1 i 2.2 jednocześnie, korzystając z pakietu oprogramowania bioinformatycznego (patrz Spis materiałów).
    1. Prześlij plik FASTA (patrz krok 2.1.1) do pakietu. Wybierz z menu "Plik", a następnie "Importuj" i kliknij "Z pliku". Przeglądaj plik FASTA i kliknij "Otwórz".
    2. Zaznacz wszystkie zaimportowane sekwencje na liście i kliknij przycisk "Wyrównaj/Zmontuj" na pasku narzędzi, a następnie kliknij "Wielokrotne wyrównanie parami". Wybierz "Wyrównanie mięśni" i kliknij "OK", aby uruchomić wyrównanie przy użyciu parametrów domyślnych.
    3. Aby zobrazować LOGO wyrównania, kliknij na "Wykresy" → "opcje" i wybierz "Logo sekwencji".

3. Analiza parametrów fizycznych białek i domen

  1. Ze względu na to, że określenie różnych parametrów fizycznych badanych członków rodziny jest ważne, aby mieć kompleksowy opis rodziny, prześlij listę członków rodziny do określonych narzędzi internetowych.
    1. Dla punktu izoelektrycznego (pI) i masy cząsteczkowej (kDa) użyj narzędzia ProtParam16 na stronie Expasy z domyślnymi parametrami.
    2. W przypadku lokalizacji subkomórkowej białek użyj różnych narzędzi, aby uzyskać bardziej wiarygodną prognozę, takich jak ngLOC v1.017 z ustawieniami domyślnymi, targetP v1.118 z ustawieniami domyślnymi i lokalizacja subkomórkowa prowler białek v1.219 z granicą prawdopodobieństwa 0,5. W przypadku miejsc fosforylacji użyj narzędzia internetowego MUsite v1.020 z parametrami domyślnymi.
  2. Zbadaj dodatkowe domeny białkowe u członków rodziny.
    1. Otwórz stronę bazy danych Pham21, wybierz narzędzie "Wyszukiwanie sekwencji", prześlij sekwencje białek w polu zapytania i kliknij "Przejdź", aby uruchomić analizę.
      UWAGA: Każda sekwencja białka jest analizowana indywidualnie. Wartość E równa 1,0 w ustawieniu domyślnym umożliwia rozróżnianie między znaczącymi i nieistotnymi trafieniami.
    2. Otwórz TMHMM Server22 z Centrum Analizy Sekwencji Biologicznych, aby zbadać obecność przypuszczalnych regionów transbłonowych. Wklej wszystkie sekwencje białek jednocześnie w polu zapytania (lub alternatywnie prześlij plik tekstowy zawierający wszystkie sekwencje białek w formacie FAPSA) i kliknij "Prześlij", aby uruchomić analizę.
    3. Analizuj białka pozbawione przewidywanych domen transbłonowych, zgodnie z TMHMM (krok 3.2.2), za pomocą narzędzia ProtScale do identyfikacji przypuszczalnych regionów hydrofobowych. Otwórz stronę internetową ProtScale23. Wklej każdą sekwencję białka w polu zapytania i wybierz "Hphob. / Kyte & Doolittle" jako skala aminokwasów. Kliknij przycisk "Prześlij", aby uruchomić analizę.

4. Dystrybucja chromosomów, duplikacje i organizacja ekson-intronów

  1. Mapuj członków rodziny ATL na chromosomach na podstawie informacji pobranych ze strony internetowej Grapevine Genome CRIBI Biotech Center24.
    1. Przeglądaj stronę główną witryny PhenoGram25. Napisz "Plik wejściowy" jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami z określonymi cechami genów, które mają być zmapowane na chromosomach, zgodnie z wyczerpującymi wytycznymi i przykładami dotyczącymi kompilacji dostarczonego pliku po ścieżce "Fenogram" → "Dokumentacja" → "Opcje" → "Plik wejściowy".
    2. Napisz "Tytuł" pracy. Wybierz genom, który chcesz narysować. W przypadku genomów, które nie są zaimplementowane w oprogramowaniu, takich jak genom winorośli, wybierz "inne" z menu rozwijanego. Napisz plik genomu zgodnie z podanymi wskazówkami i przykładami, podążając ścieżką "Fenogram" → "Dokumentacja" → "Opcje" → "Genom" i prześlij go.
    3. Użyj domyślnych parametrów "Odstępy fenotypowe", "Kolor fenotypu", "Format obrazu" lub wybierz alternatywy w odpowiednich menu i kliknij "Drukuj", aby uzyskać wizualizację genów na chromosomach.
  2. Zdefiniuj stan duplikacji członków rodziny za pomocą oprogramowania MCScanX class26.
    1. Pobierz i rozpakuj kopię MCscanX na komputerze lokalnym z uruchomionymi wierszami poleceń 1 (Plik uzupełniający 1). Wejdź do folderu MCscanX i utwórz wymagane pliki wykonywalne z uruchomionymi wierszami poleceń 2 (Plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Instalacja MCscanX kończy się niepowodzeniem na niektórych 64-bitowych maszynach z Linuxem z powodu problemu dotyczącego funkcji chdir. Jeśli podczas wykonywania polecenia make zostanie zwrócony komunikat o błędzie związany z tą funkcją, należy uruchomić wiersze poleceń 3 (plik uzupełniający 1), a następnie spróbować wykonać polecenie "make".
    2. Pobierz białka V. vinifera i plik adnotacji, uruchamiając wiersze poleceń 4 (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Plik adnotacji winorośli musi zostać rozpakowany, a informacje o pojedynczych chromosomach muszą zostać umieszczone w unikalnym pliku, uruchamiając wiersze poleceń 5 (Plik uzupełniający 1).
    3. Uruchom wyszukiwanie blastp "wszyscy kontra wszyscy", używając pliku białka V. vinifera zarówno jako zapytania, jak i tematu.
    4. Utwórz przeszukiwalną bazę danych blastów za pomocą pliku białka V. vinifera z uruchomionymi wierszami poleceń 6 (Plik uzupełniający 1). Przeprowadź wyszukiwanie blastp, używając pliku białek V. vinifera jako zapytania do bazy danych utworzonej wcześniej za pomocą uruchomionych wierszy poleceń 7 (Plik uzupełniający 1).
    5. Przekonwertuj plik adnotacji na format odpowiedni dla MCScanX. Uruchom wiersz poleceń 8 (Plik uzupełniający 1), aby pobrać niestandardowy skrypt perla parseMSCanXgff.pl. Wykonaj analizę, uruchamiając wiersze poleceń 9 (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Generowany jest plik vitis.gff, który zawiera współrzędne genów w następującym formacie:
      SP# Pozycja początkowa genu Pozycja końcowa
      gdzie "sp" to dwuliterowy kod gatunku (Vv dla winorośli), podczas gdy "#" to nazwa rusztowania. Zauważ, że dostarczony niestandardowy skrypt perla jest odpowiedni dla większości konwersji, chociaż w niektórych szczególnych przypadkach może być wymagana pewna modyfikacja kodu ze względu na różnorodność informacji podanych w dostępnym pliku adnotacji.
    6. Uruchom MCScanX z uruchomionymi wierszami poleceń 10 (Plik uzupełniający 1).
      UWAGA: "vitis" jest prefiksem zarówno adnotacji, jak i pliku wyjściowego blast. Jest to obowiązkowy wymóg do uruchomienia oprogramowania.
    7. Analizuj wyniki MCScanX. MCScanX tworzy jeden plik tekstowy "vitis.collinearity", który zawiera bloki współliniowe. Taki plik może być sprawdzony przez dowolny edytor tekstu (patrz przykładowe wyjście 1 Plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Generowany jest katalog "mcscaxOutput.html", który zawiera pliki html zawierające wiele wyrównań współliniowych bloków względem każdego chromosomu referencyjnego. Pliki te można przeglądać za pomocą przeglądarki internetowej.
    8. Klasyfikuj geny paralogiczne na podstawie ich względnego położenia w chromosomach z uruchomionymi wierszami poleceń 11 (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Klasyfikacja genów paralogicznych jest opisana w Tabeli Uzupełniającej II. Wygenerowany plik wyjściowy "vitis.gene_type" zawiera wszystkie informacje o pochodzeniu w prostym formacie rozdzielanym tabulatorami.
    9. Wykonaj analizę wzbogacenia, aby ocenić, czy rodzina genów została w przeważającej mierze zapoczątkowana przez określony mechanizm uruchamiający wiersze poleceń 12 (plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Plik "vitis.gene_type" jest generowany w kroku 4.2.8, podczas gdy plik "gene_family_file" reprezentuje jednowierszowy plik tekstowy, w którym po nazwie rodziny (np. ATL_genes) następują nazwy locus dla wszystkich genów należących do rodziny oddzielone zakładką. Stosowanym testem statystycznym do wzbogacania jest dokładny test Fishera, a wartości p różnego pochodzenia są przechowywane w pliku "outputFile.txt".
  3. Wizualizuj organizację genów egzon-intron za pomocą Interactive Tree Of Life (iTOL)27, narzędzia on-line do wyświetlania, adnotacji i zarządzania drzewami filogenetycznymi.
    1. Prześlij drzewo filogenetyczne w sekcji "Prześlij" na stronie internetowej iTOL. Drzewo jest zbudowane zgodnie z sekcją 5 poniżej. Dla każdego genu członka rodziny pobierz przewidywanie struktury genu z adnotacji V1 genomu winorośli (strona internetowa CRIBI cytowana powyżej). Oblicz długość (w bp) przypuszczalnych eksonów, intronów i regionów nieulegających translacji (UTR).
    2. Użyj zestawu danych "Domeny białkowe" do graficznej wizualizacji wzorca ekson-intron. Napisz zwykły plik tekstowy zawierający obliczone długości zgodnie ze specyfikacjami podanymi zgodnie ze ścieżką "Pomoc" → "Strony pomocy" → "Typy zestawów danych" → "Domeny białkowe" na stronie internetowej iTOL27. Korzystając z zestawu danych "Domeny białkowe", kształty "prostokąt (RE)" i "odstęp prostokątny (GP)" reprezentują odpowiednio ekson i UTR.

5. Analiza filogenetyczna i nomenklatura

  1. Analiza powiązań między członkami rodziny ATL poprzez konstrukcję wysokiej jakości drzewa filogenetycznego i definicję nomenklatury rodzinnej.
    1. W przypadku rodziny genów winorośli należy postępować zgodnie z zasadami ustanowionymi przez Komitet Super Nomenklatury Winorośli8.
    2. Pobierz sekwencje ATL A. thaliana, wymagane jako odniesienie dla nomenklatury genów winorośli8, z bazy danych UniProt 28 .
    3. Napisz plik FASTA zawierający wszystkie sekwencje nukleotydowe członków rodziny genów winorośli i A. thaliana, które mają zostać uwzględnione w analizie filogenetycznej. Sekwencje nukleotydowe pozwalają na maksymalną zmienność między członkami rodziny (w porównaniu z sekwencjami białkowymi).
  2. Drzewo filogenetyczne<br /> UWAGA: Użycie potoku Phylogeny.fr 29 jest zalecane w celu uzyskania wysokiej jakości drzewa filogenetycznego, ale nie jest to obowiązkowe.
    1. Przejrzyj Phylogeny.fr stronę główną29 i wybierz potok "Analiza filogenezy".
      UWAGA: "One Click" jest odpowiedni w większości przypadków, ale w razie potrzeby możliwe jest wybranie określonych ustawień zaawansowanych ("Zaawansowane") lub nawet w pełni spersonalizowanej analizy ("A la Carte"; patrz krok 5.2.5).
    2. Wpisz "Nazwę analizy", prześlij utworzony wcześniej plik FASTA (krok 5.2.1) i kliknij "Prześlij", aby uruchomić analizę.
    3. Alternatywnie, jeśli procedura opisana powyżej (kroki 5.2.1, 5.2.2) spowoduje wyświetlenie komunikatu o błędzie, wykonaj każdy krok potoku pakietu filogenezy indywidualnie, w następujący sposób.
      1. Ze strony głównej oprogramowania MUSCLE 30 prześlij plik FASTA w "KROKU 1", wybierz "Pearson/FASTA" jako "Format wyjściowy" w "KROKU 2" i kliknij "Prześlij" w "KROKU 3", aby wyrównać sekwencje zapytań.
      2. Kliknij "Pobierz plik wyrównania" i zapisz jako plik FAPSA, aby uzyskać dalsze kroki.
      3. Przetwórz plik FASTA wyrównania, aby wyeliminować źle wyrównane pozycje za pomocą narzędzia Gblocks Server tool31. Prześlij plik FASTA dopasowania, wybierz "DNA" jako "Typ sekwencji" i wybierz opcję (opcje) rygorystyczności, która najlepiej pasuje do analizy (np. dla rodziny genów ATL winorośli wybierz wszystkie trzy opcje proponowane dla "mniej rygorystycznej selekcji" ze względu na dużą rozbieżność sekwencji). Kliknij "Pobierz bloki", aby uruchomić analizę.
      4. Kliknij "Wyrównanie wynikowe" u dołu strony wyjściowej i zapisz wyniki jako nowy plik FAPSA.
      5. Na stronie głównejPhylogeny.fr 29 wybierz "A la Carte" jako potok "Analiza filogenezy". Następnie usuń zaznaczenie opcji "Wielokrotne wyrównanie" i "Kuratorium wyrównania". Kliknij "Utwórz przepływ pracy", prześlij plik FASTA wyselekcjonowany przez Gblocks (krok 5.2.5.4), wybierz "Procedura bootstrappingu" z domyślnymi parametrami w "Ustawieniach" i kliknij "Prześlij", aby uruchomić analizę.
    4. Zwiń słabo obsługiwane gałęzie (tj. wartości bootstrap < 70%), klikając "Zwiń gałęzie" w sekcji "Wybierz i działanie" i pobierz końcowe wyniki w formacie Newick do dalszych analiz.
  3. Przypisz nazwę genu na podstawie filogenezy.
    1. Przejrzyj drzewo filogenetyczne, aby ocenić wiarygodność struktury drzewa, przesyłając je do pakietu iTOL cytowanego powyżej (sekcja 4.3).
    2. Ręcznie przypisz nazwę genu do każdego członka rodziny. W przypadku ortologów jeden do jednego należy przypisać nazwę podobną do rzodkiewnika (np. AtATL3 → VviATL3). Różnicowanie genów winorośli (dwóch lub więcej) pochodzących z jednego homologu Arabidopsis o tej samej odległości filogenetycznej za pomocą cyfr lub liter, jeśli gen Arabidopsis kończy się cyfrą (np. AtATL23 → VviATL23a, VviATL23b).
    3. W przypadku ortologów jeden-do-wielu lub wiele-do-wielu, przypisz nową nazwę genu składającą się z nazwy podobnej do Arabidopsis (tutaj "ATL") w połączeniu z liczbą wyższą niż najwyższa liczba już używana zarówno dla V. vinifera, jak i Arabidopsis (np. VviATL83).
    4. Uzupełnij nomenklaturę nowo zdefiniowanej rodziny schodzącej od góry do dołu drzewa filogenetycznego.

6. Profilowanie organów winorośli i ekspresji scenicznej

  1. Wygeneruj roboczą macierz danych zawierającą dane wyrażeń dla członków rodziny.
    1. Pobierz Datamatrix V. vinifera cv. Corvina gene expression Atlas z linku rozpowszechnionego na platformie ResearchGate32. Ten plik zawiera znormalizowane wartości wyrażeń RMA, które mają być używane w poniższych krokach.
    2. Wyodrębnij wartości wyrażeń dla każdego genu rodziny z macierzy danych Atlas i napisz "roboczą macierz danych" zawierającą ten sam wiersz nagłówka, co datamatrix Atlas. Zapisz "roboczą macierz danych" jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.
  2. Wykonaj hierarchiczną analizę dwuklastrową za pomocą oprogramowania Multi Experiment Viewer (MeV).
    1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie MeV33.
    2. Prześlij "roboczą macierz danych" (krok 6.1.2) po ścieżce "Plik" → "Załaduj dane" → "Przeglądaj" i wybierz plik tekstowy. Wybierz "Tablica jednokolorowa" i usuń zaznaczenie z "Załaduj adnotację", jeśli adnotacja automatyczna nie jest dostępna. Wybierz skrajną lewą górną wartość wyrażenia w podglądzie tabeli wyrażeń i kliknij przycisk "Załaduj".
    3. Dostosuj dane, stosując transformację Log2 ("Dostosuj dane" → "Transformacje logarytmu" → "Transformacja Log2") i normalizację genu/wiersza ("Dostosuj dane" → "Korekty genu/wiersza" → "Mediana środka genu/wiersza"). Ustaw odpowiedni limit skali ("Wyświetlacz" → "Ustaw limity skali kolorów").
    4. Oblicz grupowanie hierarchiczne zgodnie ze ścieżką "Analiza" → "Grupowanie" → "HCL". Wybierz "Optymalizuj kolejność liści genów" i "Optymalizuj kolejność liści próbki" w polu "Optymalizacja kolejności", "Korelacja Pearsona" w polu "Wybór macierzy odległości" i "Średnie grupowanie wiązań" w polu "Wybór metody łączenia". Następnie kliknij "OK", aby uruchomić analizę.
    5. Wyświetl wyniki w menu "Wyniki analizy" → "HCL" w lewym panelu okna. Wyeksportuj mapę cieplną, klikając "Zapisz obraz" w menu "Plik".

7. Profilowanie ekspresji w odpowiedzi na stresy biotyczne i abiotyczne

  1. Powtórz krok 6.1 z identyfikatorem przystąpienia do GSE uzyskanym z odpowiednich publikacji i badań dotyczących stresu biotycznego i abiotycznego w winorośli. Na przykład eksperymenty dostarczające profilu transkryptomu jagód winorośli zakażonych patogenem grzybowym Botrytis cinerea przy użyciu mikromacierzy NimbleGen Grape Whole-genome można przeglądać za pomocą identyfikatora GSE GSE52586. Powtórz kroki 6.1.1 i 6.1.2.
  2. Przeszukaj NCBI Sequence Reads Archive34 z identyfikatorem/BioProject (np. SRP055458 lub PRJNA275778 dla eksperymentów z "cieniowaniem kwiatów winorośli") i pobierz wszystkie powiązane odczyty surowych sekwencji. Zestawy danych sekwencyjnych RNA z wielu różnych badań są przetwarzane przy użyciu jednego potoku w celu zapewnienia spójności.
    1. Krótko mówiąc, przycinanie surowej sekwencji odczytuje FASTQ (pojedynczy i parzy) i filtruje jakość za pomocą Trimmomatic35. Użyj filtrów AVGQUAL i MINLEN odpowiednio 20 i 40, a wszystkie parametry są domyślne.
    2. Indeksuj 12X genom referencyjny winorośli1 za pomocą Bowtie236. Pobierz genom referencyjny 12X winorośli (np. bowtie2-build) przed uruchomieniem polecenia bowtie2.
    3. Uzyskaj tabele macierzy zliczania za pomocą htseq-count37 przy użyciu pliku adnotacji modelu genu winorośli V1 (GFF/GTF).
  3. Wykonaj różnicową analizę (re)ekspresji genów w R38 z bibliotekami limma39 dla macierzy znormalizowanych RMA i bibliotekami DESeq240 dla tabel macierzy zliczania uzyskanych odpowiednio z kroków 7.1.1 i 7.2.1.
    1. Wykonaj standardowe porównanie "dwóch grup" (tj. "leczenie"/"kontrola"). Należy upewnić się, że matryca projektowa/grupy warunków "kontroli" i "traktowania" są prawidłowo określone.
      UWAGA: Typowy projekt analizy różnicowej wyrażeń mikromacierzy (GSE52586) w celu porównania jagód EL-33 zakażonych Botrytis cinerea z jagodami kontrolnymi (zdrowymi) na tym samym etapie rozwoju z limmą z uruchomionymi wierszami poleceń 13 jest pokazany w pliku uzupełniającym 1. Typowy projekt analizy różnicowej ekspresji RNA-seq (SRP055458 lub PRJNA275778) w celu porównania kwiatów (7 dni po opadnięciu czapeczki) pod zacienieniem z kontrolą z uruchomionymi wierszami poleceń DESeq2 14 jest pokazany w pliku uzupełniającym 1.
    2. Uzyskaj listy genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) w każdym kontraście, dla limma użyj funkcji lmFit(), a następnie eBayes(), a następnie funkcji topTable(), podczas gdy dla DESeq2 użyj funkcji DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq() i results(). Poniżej znajduje się typowy przepływ pracy, którego należy przestrzegać.
      1. Aby zapoznać się z analizą wyrażeń różnicowych w mikromacierzy, zobacz wiersze poleceń 15 (Plik uzupełniający 1). Aby zapoznać się z analizą różnicową ekspresji RNA-seq, patrz wiersze poleceń 16 (Plik uzupełniający 1). Powtórz powyższe kroki dla wszystkich innych kontrastów z innym odpowiednim schematem projektowym (patrz przykłady w kroku 7.3.1)
  4. Z list wygenerowanych DEG wyodrębnij wszystkie wiersze, które nie odpowiadają akcesji do ATL V1, zachowaj kolumny zawierające log2 Krotna zmiana (leczenie/kontrola) > |0,5| i skorygowane wartości p (FDR) < 0,05, a następnie połącz je odpowiednio w tabelę macierzy, niezależnie od tego, czy badanie mieści się w kompendiach "abiotycznych" czy "interakcji biotycznych/patogenów".
  5. Skonstruuj hierarchiczne klastrowane mapy cieplne (kompendia abiotyczne i biotyczne) w języku R, korzystając z bibliotek gplots.
    UWAGA: Wywołanie funkcji heatmap.2 konstruuje mapę cieplną wraz z dendrogramami wierszy z odpowiednich tabel macierzy. Dodatkowe argumenty wykorzystujące funkcję cellnote pomagają rozróżnić geny ATL o zróżnicowanej ekspresji (log2FC > 0,5, FDR < 0,05) w każdym porównaniu w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych za pomocą symbolu *. Zastosuj typowy przepływ pracy w języku R, uruchamiając wiersze poleceń 17 (plik uzupełniający 1) lub alternatywnie powtórz kroki od 6.2.2 do 6.2.5, aby skonstruować mapy cieplne za pomocą oprogramowania MeV.

8. Analiza zależności między rozbieżnością sekwencji paralogicznych a koekspresją genów

  1. Skonstruuj macierz zawierającą podobieństwo parami. Elementami macierzy podobieństwa są wartości podobieństwa sekwencji obliczone na podstawie par dopasowań białek.
    1. Użyj igły EMBOSS web server41 z ustawieniami domyślnymi, aby wyrównać sekwencję parami i zapisać jako plik tekstowy. Otwórz wyjściowy plik tekstowy i usuń wszystkie wiersze komentarzy wraz z nazwami kolumn i wierszy, aby wygenerować plik o nazwie "similarityTable.txt".
      UWAGA: Taka tabela zawiera linię dla każdego genu ATL przedstawiającą wartości podobieństwa obliczone w każdym z dopasowań par. Kolejność loci w wierszach i kolumnach jest taka sama, tak że generowana jest macierz symetryczna względem wartości przekątnej.
  2. Skonstruuj macierz z danymi koekspresji, obliczając współczynnik korelacji Pearsona. Poniższa procedura wymaga R i modułu perla PDL.
    1. Pobierz wartości wyrażeń dla 96 genów ATL z uruchomionymi wierszami poleceń 18 (plik uzupełniający 1) w terminalu. Wykonaj analizę współwyrażeń przy użyciu niestandardowego skryptu perla, który można pobrać, uruchamiając wiersze poleceń 19 (Plik uzupełniający 1). Taki skrypt obliczy współczynnik korelacji Pearsona między parami loci ATL, jak wcześniej podawano.
    2. Uruchom skrypt z uruchomionymi wierszami poleceń 20 (plik uzupełniający 1) i postępuj zgodnie z instrukcjami wyjściowymi. Skrypt utworzy plik wyjściowy (a mianowicie "coexpressionTable.txt") zawierający macierz współwyrażeń z tą samą kolejnością nazw locus co macierz uzyskaną w kroku 8.1 (ta kolejność jest niezbędna do uruchomienia testu Mantel, patrz poniżej).
  3. Wykonaj test Mantel między macierzami danych uzyskanymi w krokach 8.1 i 8.2. Po wejściu do środowiska R (uruchom polecenie "R" z poziomu terminala), załaduj bibliotekę ade4 za pomocą następującego polecenia: library(ade4)
    1. Uruchom test Mantel, ładując dwie macierze danych i wykonując statystyki, uruchamiając wiersze poleceń 21 (plik uzupełniający 1), gdzie "nrep" reprezentuje liczbę permutacji. Test polega na obliczeniu korelacji między elementami tych macierzy, permutacji macierzy, a następnie ponownym obliczeniu tej samej statystyki testowej.
      UWAGA: Wszystkie uzyskane wartości testu statystycznego są wykorzystywane do zbudowania rozkładu odniesienia testu statystycznego, który zostanie użyty do obliczenia wartości p w celu sprawdzenia istotności. Liczba permutacji określa precyzję, z jaką można uzyskać wartość p.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen VIT_05s0077g01970, zidentyfikowany jako najbardziej podobny do A. thaliana ATL2 (At3g16720) za pomocą wyszukiwania BLASTp, został użyty jako sonda do badania członków rodziny ATL w genomie winorośli (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). Analiza PSI-BLAST zbiegła się po kilku cyklach, ujawniając listę przypuszczalnych genów należących do rodziny genów ATL winorośli (Rysunek 1A). Obecność kanonicznej domeny RING-H2 dla każdego kandydata oceniono popr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W erze genomicznej wiele rodzin genów zostało głęboko scharakteryzowanych w kilku gatunkach roślin. Informacje te stanowią wstęp do badań funkcjonalnych i stanowią ramy do dalszego badania roli różnych członków w rodzinie. W tym kontekście istnieje również potrzeba wprowadzenia systemu nomenklatury pozwalającego na jednoznaczną identyfikację każdego członka rodziny, unikając nadmiarowości i nieporozumień, które mogą powstać, gdy imiona są przypisywane niezależnie różnym genom przez różne grupy badawcze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca była wspierana przez Uniwersytet w Weronie w ramach Wspólnego Projektu 2014 (Charakterystyka rodziny genów ATL u winorośli i jej udziału w odporności na Plasmopara viticola).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komputer
Podstawowe narzędzie do wyszukiwania dopasowania lokalnego (BLAST)https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Molekularna analiza genetyki ewolucyjnej (MEGA)http://www.megasoftware.net/
Narzędzia do analizy sekwencji opartej na motywach (MEME)http://meme-suite.org/
GeneiousBiomatters Limitedhttp://www.geneious.com/
Narzędziehttp://web.expasy.org/protparam/
ngLOChttp://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
TargetP v1.1
Białkowy Prowlerhttp://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
MUsitehttp://musite.sourceforge.net/
Pfamhttp://pfam.xfam.org/
TMHMM Server v. 2.0http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
ProtScalehttp://web.expasy.org/protscale/
Grape Genome Database (CRIBI)http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
PhenoGramhttp://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
MCScanXhttp://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
Interaktywne Drzewo Życia (iTOL)http://itol.embl.de/
UniProthttp://www.uniprot.org/
Phylogeny.fr
http://www.phylogeny.fr/index.cgi MUSCLEhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Gblocks Serverhttp://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
Vitis vinifera cv. Ekspresja genu Corvina Atlas datamatrixhttps://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_
datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
Przeglądarka wielu eksperymentów (MeV)http://mev.tm4.org/#/welcome
Archiwum odczytu sekwencji ()https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Rhttps://www.r-project.org/
Igła EMBOSS (EMBL-EBI http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/
osobisty ProtParam Serwer http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
  2. Adam-Blondon, A. -F., et al. Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. , Science Publishers. 211-234 (2011).
  3. Chen, L., Hellmann, H. Plant E3 Ligases: Flexible Enzymes in a Sessile World. Mol. Plant. 6 (5), 1388-1404 (2013).
  4. Vierstra, R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 385-397 (2009).
  5. Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type. J. Mol. Evol. 62 (4), 434-445 (2006).
  6. Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments. PLoS One. 6 (8), e23934(2011).
  7. Guzmán, P. The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases. Plant Signal Behav. 7 (8), 1014-1021 (2012).
  8. Grimplet, J., et al. The grapevine gene nomenclature system. BMC Genomics. 15, 1077(2014).
  9. Prince, V. E., Pickett, F. B. Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes. Nat. Rev. Genet. 3 (11), 827-837 (2002).
  10. Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. Gene duplication as a major force in evolution. J. Gen. 92 (1), 155-161 (2013).
  11. Wang, N. Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine. Plant Mol. Biol. Rep. 31 (4), 852-861 (2013).
  12. Fasoli, M. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
  13. BLAST. BLAST2.6.0. , Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2016).
  14. MEGA. MEGA7.0.25 build 7170412. , Available from: http://www.megasoftware.net/ (2017).
  15. MEME. MEME Suite Version 4.11.4. , Available from: http://meme-suite.org/ (2017).
  16. ProtParam. ExPASy Server. , Available from: http://web.expasy.org/protparam/ (2005).
  17. ngLOC v1.0. , Available from: http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html (2007).
  18. TargetP v1.1 Server. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ (2000).
  19. Prowler v1.2. , Available from: http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ (2005).
  20. MuSite v1.0. , Available from: http://musite.sourceforge.net/ (2010).
  21. Pfam. Pfam version 31.0. , Available from: http://pfam.xfam.org/ (2016).
  22. TMHMM v2.0c. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ (2007).
  23. ExPASy. ProtScale. , Available from: http://web.expasy.org/protscale/ (2005).
  24. CRIBI. Grape genome database. , Available from: http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ (2012).
  25. PhenoGram. , Available from: http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot (2012).
  26. ScanX v0.8. , Available from: http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ (2013).
  27. Interactive Tree Of Life (iTOL). Version3.5.3. , Available from: http://itol.embl.de/ (2016).
  28. UniProt. , Available from: http://www.uniprot.org/ (2016).
  29. Phylogeny.fr. , Available from: http://www.phylogeny.fr/index.cgi (2008).
  30. MUSCLE. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ (2017).
  31. Gblocks Server. Version 0.91b. , Available from: http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html (2002).
  32. Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 (2015).
  33. Multiple Experiment Viewer (MeV). Version 4.8.1. , Available from: http://mev.tm4.org/ (2017).
  34. Sequence Read Archive (SRA). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra (2017).
  35. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  37. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  38. R. Version 3.4.1. , Available from: https://www.r-project.org/ (2017).
  39. Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  40. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  41. EMBL-EBI. EMBOSS Needle. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ (2017).
  42. Ariani, P. Genome-wide characterisation and expression profile of the grapevine ATL ubiquitin ligase family reveal biotic and abiotic stress-responsive and development-related members. Sci. Rep. 6, 38260(2016).
  43. Vitulo, N., et al. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype. BMC Plant Biol. 14 (1), 99(2014).
  44. Overbeek, R., Fonstein, M., D'Souza, M., Pusch, G. D., Maltsev, N. The use of gene clusters to infer functional coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (6), 2896-2901 (1999).
  45. Dalquen, D. A., Dessimoz, C. Bidirectional Best Hits Miss Many Orthologs in Duplication-Rich Clades such as Plants and Animals. Genome Biol. Evol. 5 (10), 1800-1806 (2013).
  46. Remm, M., Storm, C. E. V., Sonnhammer, E. L. L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons1. J. Mol. Biol. 314 (5), 1041-1052 (2001).
  47. Kaduk, M., Sonnhammer, E. Improved orthology inference with Hieranoid 2. Bioinformatics. 33 (8), (2017).
  48. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 370(2014).
  49. Juretic, N., Hoen, D. R., Huynh, M. L., Harrison, P. M., Bureau, T. E. The evolutionary fate of MULE-mediated duplications of host gene fragments in rice. Genome Res. 15 (9), 1292-1297 (2005).
  50. Filichkin, S. A. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20 (1), 45-58 (2010).
  51. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  52. Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine. DNA Res. 24 (3), 311-326 (2017).
  53. Wong, D. C. J., Matus, J. T. Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities. Front. Plant Sci. 8, 505(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ATL E3 Ubiquitin LigaseGene Family CharacterizationGenome wide IdentificationPhylogenetic Tree ConstructionProtein Motif AnalysisGene Expression ProfilingPSI BLAST AnalysisMUSCLE AlignmentHierarchical Bi clustered AnalysisGrapevine Genome

Powiązane artykuły