Artykuł metodologiczny

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

DOI:

10.3791/56630

⸱

3 lutego 2018

 ,  , 
1Physiology and Pharmacology Department, Des Moines University, 2School of Liberal Arts and Sciences, Mercy College of Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transport jonów przez błony komórkowe zapewnia precyzyjną kontrolę zawartości jonów wewnątrz i na zewnątrz komórki, która jest niezbędna do przetrwania komórki. W tych mechanizmach transportu pośredniczą działania wyspecjalizowanych białek transportowych. W szczególności dynamika pH jest precyzyjnie kontrolowana przez systemy wytłaczania protonów z błoną plazmatyczną (H+), takie jak rodzina białek wymiennika Na+/H+ (NHE). Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków mających na celu zbadanie mechanizmów leżących u podstaw regulacji NHE, nasza obecna wiedza na temat biofizycznych i molekularnych właściwości rodziny NHE jest niewystarczająca ze względu na ograniczoną dostępność metod skutecznego pomiaru aktywności NHE. W tym manuskrypcie użyliśmy elektrod selektywnych H+ podczas nagrywania zaciskania łat na całe ogniwa, aby zmierzyć strumień H+ indukowany przez NHE. Zaproponowaliśmy to podejście, aby przezwyciężyć pewne ograniczenia zwykle stosowanych metod pomiaru aktywności NHE, takich jak wychwyt radioaktywny i przepuszczalność błon fluorescencyjnych. Pomiar aktywności NHE za pomocą opisanej metody umożliwia uzyskanie wysokiej czułości i rozdzielczości czasowej oraz skuteczniejszą kontrolę wewnątrzkomórkowych stężeń H+. Elektrody selektywne H+ opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. Elektroda selektywna H+ poruszająca się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia, która jest zależna od strumienia H+. Podczas gdy elektrody selektywne H+ są używane do wykrywania strumienia H+ wychodzącego z ogniwa, metoda patch clamp w konfiguracji całego ogniwa służy do kontrolowania wewnątrzkomórkowego składu jonowego. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów. Aktywność transportera izoformy 3 NHE (NHE3) zmierzono przy użyciu tego podejścia technicznego w celu zbadania molekularnych podstaw regulacji NHE3 przez fosfoinozytydy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transport jonów i substancji rozpuszczonych przez błonę plazmatyczną jest niezbędny dla przetrwania komórek, a co za tym idzie, organizmów1. Selektywny transport jonów i substancji rozpuszczonych jest osiągany przez szereg wyspecjalizowanych białek kanałowych i transportowych. Mutacje w tych białkach często prowadzą do różnych stanów klinicznych, co sprawia, że białka kanałowe i transportowe stają się potencjalnymi celami leczenia farmakologicznego1. Niestety, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i regulacji kanałów i transporterów jest często ograniczone przez dostępne podejścia do badania ich aktywności2,3,4.

Konkretnie, transportery można z grubsza podzielić na dwie duże grupy w zależności od tego, czy zmieniają potencjał transbłonowy komórki podczas transportu substancji rozpuszczonych: zmieniające się transportery jonów elektrogenicznych [np. kotransporter sodowo-fosforanowy 2a (NaPi2a), wymiennik sodowo-wapniowy (NCX), itp.] lub niezmieniające się transportery jonów elektroneutralnych [np. wymiennik sodowo-protonowy (NHE), kotransporter sodowo-chlorkowy, NaPi2c, itp.]. Aktywność obu klas transporterów została szeroko przebadana przy użyciu wychwytu izotopów promieniotwórczych i barwników fluorescencyjnych przenikających błonę2. Oba podejścia szacują aktywność transporterów poprzez pomiar zmian w stężeniu masowym określonych jonów cytoplazmatycznych i obie metody mają ograniczenia, takie jak umiarkowana czułość i rozdzielczość czasowa oraz niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego. Rzeczywiście, aktywność wielu transporterów zależy od stężenia cytoplazmatycznego przenoszonych jonów (np. NHE3, NCX), a oczekuje się, że zmiany tych stężeń jonów będą odgrywać znaczącą rolę w regulacji aktywności transportera2,3,5. Precyzyjny pomiar tych mechanizmów regulacyjnych jest ograniczony przy użyciu klasycznych metod.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, do badania aktywności transportera stosuje się metody zaciskania krosowego2,6. W szczególności samoreferencyjne elektrody jonoselektywne (ISE)7,8 w połączeniu z systemem zaciskania krosówek umożliwiły ostatnio pomiar aktywności transportera elektroneutralnego3,4,5. ISE opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. ISE poruszający się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia (μV). Różnice napięć można przekształcić w wartości strumienia jonów za pomocą metody kalibracji, która stosuje pierwszą zasadę dyfuzji Ficka2,9. Podczas gdy ISE są używane do wykrywania strumienia jonów wychodzących z komórek, metoda patch clamp zarówno w konfiguracjach całej komórki, jak i na lewą stronę jest stosowana do kontrolowania potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego składu jonów. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów i białek3,5.

Podsumowując, wszechstronność metody zaciskania krostek w porównaniu z innymi metodami do badania aktywności transportera sprawiła, że zaciskanie łat jest odpowiednie do przezwyciężenia typowych ograniczeń tych innych metod. Połączenie samoreferencyjnych ISE i technik patch clamp oferuje unikalną możliwość pomiaru aktywności transporterów elektroneutralnych w ściśle kontrolowanym środowisku eksperymentalnym oraz odkrycia nowych biofizycznych i molekularnych właściwości transportu błony komórkowej3,4,5. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do badania aktywności NHE. Rodzina białek NHE ssaków katalizuje elektroneutralną wymianę netto zewnątrzkomórkowego sodu (Na+) na wewnątrzkomórkowy proton (H+)10,11 wykorzystując wewnętrzny gradient Na+. U ssaków rodzina białek NHE obejmuje 11 pokrewnych białek (NHE1-9 i NHA1-2) oraz specyficzne dla plemników NHE10,12,13.

NHE (rodzina SLC9a) są powszechnie spotykane w większości organizmów żywych, od prostych prokariontów do wyższych eukariontów i są zaangażowane w różne funkcje życiowe komórek10,11, w tym kontrolowanie obrony komórek przed zasoleniem u prokariontów, utrzymywanie homeostazy kwasowo-zasadowej i objętości komórek oraz regulowanie wchłaniania soli i wody w różnych wyspecjalizowanych nabłonkach10,12,14,15. Kluczowe role biologiczne NHE i znaczenie ich funkcji zostały określone w kilku badaniach; jednak niewiele badań dotyczyło biofizycznych i molekularnych właściwości NHE ssaków ze względu na ograniczenia metodologiczne4. Niedawne zastosowanie samoreferencyjnych ISE podczas zaciskania łatek w całych komórkach ujawniło nowe mechanizmy molekularne izoform NHE regulowanych przez zmiany w wewnątrzkomórkowych stężeniach jonów, białek i fosfolipidów3,4.

W szczególności, protokół zawarty w tym manuskrypcie przedstawia metody i podejścia do badania aktywności i regulacji izoformy NHE 3 (NHE3), głównego gracza w absorpcji Na+, Cl-, HCO3- i płynu w błonie granicznej nabłonka nerek i jelit14,16. Przedstawiono nowe informacje na temat różnic we wrażliwości aktywności NHE3 na wewnątrzkomórkowe fosfoinozytydy (4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytylu [PI(4,5)P2] i fosfatydyloinozytod 3,4,5-trifosforan [PI(3,4,5]P3]). Białka transportu komórkowego, takie jak kanały i transportery, są regulowane przez fosfoinozytydy17, a NHE3 bezpośrednio wiąże zarówno PI(4,5)P2, jak i PI(3,4,5)P318. Opierając się na aktualnej literaturze, fosfoinozytyd może być istotny dla fizjologicznej lub patofizjologicznej regulacji NHE35,18,19. Nasze odkrycia potwierdzają odrębne role PI(4,5)P2 i PI(3,4,5)P3 w regulacji aktywności NHE3. To rozróżnienie było możliwe dzięki zastosowaniu technik ISE w połączeniu z nagrywaniem z użyciem clampu krosowego całej komórki. Technika ta umożliwia również kontrolę zawartości komórkowej fosfoinozytolu poprzez wewnątrzkomórkową perfuzję różnych fosfoinozytydów podczas pomiaru aktywności NHE3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Dwa wzmacniacze są wymagane do rejestrowania aktywności transporterów elektroneutralnych przez samoodnoszące się ISE w połączeniu z zaciskaniem krosowym, wzmacniacz patch clamp do utrzymania ogniwa w konfiguracji całego ogniwa oraz wzmacniacz o wysokiej impedancji (elektrometr) do rejestrowania aktywności transportera przez ISE (patrz Tabela materiałów). Wzmacniacz z zaciskiem krosowym jest bezpośrednio podłączony do zacisku płytki akwizycyjnej. Elektrometr jest podłączony do wzmacniacza różnicowego służącego do filtrowania i wzmacniania sygnału. Wzmacniacz różnicowy jest podłączony do zacisku płytki akwizycyjnej. Capmeter, oprogramowanie do zaciskania krosówek, które monitoruje pojemność komórki, było używane w poprzednich badaniach20 (patrz Tabela materiałów). Komora rejestracyjna i roztwory perfuzyjne są utrzymywane w temperaturze 37 °C.

1. Przygotowanie pipet dla ISE

  1. Wyciągnąć pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego na średnicę zewnętrzną 1,2 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą ściągacza do pipet2 .
  2. Wypoleruj pipetę za pomocą mikrokuźni. Średnica końcówki pipety powinna wynosić 2-3 μm.
  3. Umieść pipety w uchwycie na słoik na pipety z końcówką pipety skierowaną do góry (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Kroki 1.4-1.6 należy wykonać w dobrze wentylowanym okapie oparów chemicznych.
  4. Wymieszaj mieszaninę silikonową, która składa się z 1 kropli (~150 μl) bis(dimetyloamino)dimetylosilianu i 10 kropli czterochlorku węgla (patrz tabela materiałów).
  5. Wlej mieszaninę silikonową do słoika i szczelnie zamknij pokrywkę.
  6. Inkubować słoik z mieszaniną silikonową przez 24-48 godzin w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej, aż mieszanina całkowicie odparuje.
  7. Wypełnij pipetę odpowiednią żywicą jonoselektywną, aby utworzyć kolumnę o średnicy około 2-4 mm.
    UWAGA: Jonofor wodorowy I koktajl B może być używany do rejestrowania aktywności NHE (patrz Tabela Materiałów).
  8. Postukaj w końcówkę pipety, aby rozprowadzić żywicę jonoselektywną na końcówce, a następnie umieść pipetę pionowo w uchwycie słoika końcówką pipety do dołu.
  9. Sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym, czy koktajl żywiczny dotarł do końca końcówki. W razie potrzeby zastosuj nadciśnienie, aby popchnąć żywicę do końca.
  10. Napełnić połówkę pipety odpowiednim roztworem (~ 100 μL). Tutaj użyj 100 mM KCl i 10 mM HEPES przy pH 7,0, jeśli używasz koktajlu jonoforowego I B.
  11. Podłącz ISE do elektrometru i umieść końcówkę ISE w roztworze kąpieli używanym do nagrywania. Wyzeruj elektrometr.
  12. Zbadaj selektywną odpowiedź H+ ISE, zmieniając pH roztworu kąpieli. Średnia selektywna odpowiedź H+ ISE wynosi ~ 58 mV na jednostkę pH.
  13. Okresowo oceniaj reakcję ISE na kalibrację.

2. Przygotowanie pipet z zaciskiem krosowym do nagrywania

UWAGA: Metoda opisana przez Donalda Hilgemanna w jego artykule na temat nagrywania jednokanałowego21 jest zalecana.

  1. Wyciągnij pipety do gigantycznej łaty z kapilar ze szkła borokrzemianowego (2,0 mmOD / 1,5 mm ID) na ściągaczu do pipet2,22,23.
  2. Użyj mikrokuźni zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, aby przygotować szeroką końcówkę pipety (10 - 22 μm)23. Rozpuść koralik (~ 0,5 ml) miękkiego szkła na grubym drucie platynowym mikrokuźni.
    UWAGA: Do produkcji gigantycznych pipet z plastrami wymagany jest stosunkowo gruby drut platynowy (~0,5 mm).
  3. Umieść pipetę z plastrem blisko miękkiej szklanej kulki i podgrzej ją mocno, aż końcówka zacznie się cofać. Drut platynowy przesunie się nieznacznie w kierunku środka podczas ogrzewania.
  4. Wyłącz ogień i wepchnij końcówkę pipety w zmiękczoną szklaną kulkę. Drut chłodzący cofnie się i złamie końcówkę pipety.
  5. Ponownie zastosuj ciepło, aby wygładzić końcówkę pipety i utwórz końcówkę pipety o pożądanej średnicy. Średnica końcówki zależy od wielkości komórki, która ma być załatana (8 - 10 μm w tym badaniu).

3. Przygotowanie komórek

  1. Rozgrzać bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) bezCa2+ iMg2+, roztworu trypsyny-EDTA i pożywki wzrostowej do temperatury 37 °C.
  2. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Użyć 1 ml buforu na płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm.
  3. Dodać 0,5 ml trypsyny do komórek na płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm.
    Uwaga: Gdy komórki zaczną się zaokrąglać, potrząśnij płytką, aby odczepić komórki.
  4. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 5 ml (ilość na płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm) kompletnej pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą.
    UWAGA: Czas reakcji trypsyny jest zależny od typu komórki.
  5. Umieść komórki na wytrząsarce z kołysaniem, aby zapobiec tworzeniu się grudek.
  6. Używaj komórek do 2 godzin po trypsynizacji.
    UWAGA: Czas może się różnić w zależności od linii komórkowej.

4. Przygotowanie systemu perfuzji wewnątrzpipetowej

  1. Wytnij rurkę kwarcową o odpowiednim rozmiarze (150 μm OD / 75 μm ID), aby przygotować linię perfuzji wewnątrz pipety.
  2. Włóż jedną stronę rurki kwarcowej do końcówki pipety o pojemności 200 μl. Przyklej rurkę kwarcową do końcówki i odetnij koniec końcówki ostrą żyletką.
  3. Podłącz linię perfuzyjną (rurkę kwarcową przyklejoną do końcówki) do małego kawałka silikonowej rurki, która służyłaby jako zbiornik na roztwór perfuzyjny wewnątrz pipety.
  4. Podłącz silikonową rurkę do strzykawki, aby wytworzyć nadciśnienie.
  5. Włóż wolny koniec rurki kwarcowej przez rurkę polietylenową uchwytu pipety w porcie perfuzyjnym (patrz Tabela materiałów).
  6. Oceń linię perfuzyjną za pomocą roztworu pipety.

5. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować mocno zbuforowany roztwór pipet do zapisu NHE (115 mM asparaginianu potasu (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM RURKI, 12,5 mM MOPS i 12,5 mM MES, pH 6,0 dostosowane kwasem asparaginowym).
    UWAGA: Przygotować podstawowy roztwór pipety i przefiltrować. Dodaj Mg-ATP przed nagrywaniem.
  2. Za każdym razem przygotuj świeży roztwór do kąpieli (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 i 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).

6. Rejestrowanie aktywności transportera

  1. Utrzymywać komorę zapisu i wszystkie roztwory w temperaturze 37 °C, ponieważ aktywność transportera jest zależna od temperatury.
  2. Umieść komórki w komorze rejestracyjnej. Poczekaj, aż opadną na dno komory, ale nie pozwól im przyczepić się do komory.
  3. Wybierz odpowiednią komórkę. Zmierz średnicę komórki za pomocą mikrometru ocznego. Wybierz ogniwa o podobnych średnicach.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, duża komórka będzie miała większą powierzchnię komórkową i prawdopodobnie więcej transporterów ulegających ekspresji na błonie plazmatycznej, a zatem będzie miała również większą aktywność transportera. Jednak niekoniecznie jest to poprawne, ponieważ aktywność transportera zależy od konkretnego transportera i badanego typu komórki.
  4. Zamontuj pipetę mikroelektrody jonoselektywnej do mikromanipulatora, wypełnij pipetę z zaciskiem krosowym roztworem wewnątrzkomórkowym, upewnij się, że roztwór dociera do końcówki pipety2.
    UWAGA: Może być konieczne kilka delikatnych stuknięć, aby usunąć pęcherzyki na końcówce pipety.
  5. Zamontuj pipetę z mocowaniem plastra do głównego stopnia elektrofizjologii set up2,22,23.
    UWAGA: Ważne jest, aby stopień głowicy był ustawiony pod kątem około 45 stopni do osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wejścia pipety, który jest odpowiedni do utworzenia wysoce odpornego uszczelnienia.
  6. Zastosuj niewielkie nadciśnienie (~ 5 cm H2O) do pipety do plastrów, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki, i umieść ją w roztworze do kąpieli.
  7. Przestań przesuwać pipetę z zaciskiem krosowym, gdy końcówka znajdzie się blisko ogniwa.
  8. Zmniejszyć nadciśnienie, gdy pipeta dotyka kuwety i zastosować lekkie podciśnienie (~ 5 cm H2O), aby uzyskać uszczelnienie >1000 MΩ (Giga-om) na błonie komórkowej za pomocą pipety z plastrem23.
  9. Umieść pipetę z plastrem z kuwetą w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co ISE i przesuń pipetę z pipetą plastrową wraz z kuwetą w pobliżu ISE (~ 5 - 10 μm)2,5, ale nie pozwól, aby komórka stykała się z ISE (Rysunek 1A).
  10. Upewnij się, że potencjał podtrzymania wynosi 0 mV.
  11. Rozerwij uszczelkę serią krótkich ssań, aby uzyskać konfigurację całej komórki.
  12. Powoli przesuwaj pipetę ISE (lub pipetę z zaciskiem krosowym) w lewo i w prawo lub w górę i w dół, aby zarejestrować aktywność transportera (Rysunek 1B).
  13. Zapisz co najmniej 5-8 szczytów (Rysunek 1C, od A do B).
  14. Zastosuj perturbacje fali prostokątnej podczas nagrywania, aby monitorować jakość uszczelnienia i pojemności błony komórkowej ( Rysunek 1).
  15. Oszacuj strumień H+ (figure-protocol-1) na podstawie różnicy w stężeniu wolnego H+ między powierzchnią komórki a roztworem masowym (ΔH+)
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    UWAGA: figure-protocol-4 i figure-protocol-5 to odpowiednio współczynniki H+ i dyfuzji buforu, BT to całkowite stężenie buforu, KD to stała dysocjacji buforu, r to promień komórki, a figure-protocol-6 określa zmianę stężenia związanego H+ w stanie ustalonym dla niewielkiej zmiany swobodnego H+. H+ oznacza wolny proton w roztworze. Aby zachować spójność z poprzednimi badaniami, strumienie H+ są przekształcane na jednostki strumienia elektrofizjologicznego poprzez obliczenie aktualnych równoważników strumieni (figure-protocol-7/faraday) w pA3,5].
  16. Znormalizuj strumień protonów do powierzchni komórki, który można obliczyć na podstawie wielkości komórki lub pojemności błony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do badania regulacji aktywności NHE3 przez fosfoinozytydy zastosowano samoodnoszące się ISE podczas rejestracji klamry krosowej całej komórki. Użyto komórek podobnych do fibroblastów PS12024, które nie mają ekspresji endogennych błon plazmatycznych NHE. Mutanty NHE3 typu dzikiego (NHE3-wt) lub NHE3, które nie wiążą fosfoinozytydów [tyrozyna 501, arginina 503 i lizyna 505 zostały podstawione alaniną, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] ulegały stabilnej ekspresji w komórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo kluczowych funkcji transporterów, dostępne metody badania ich aktywności są nieskuteczne i nieodpowiednie. Jednym z ograniczeń jest to, że dostępne metody mierzą ruch jonów, w którym pośredniczy aktywność transportera, bez uwzględniania wahań w wewnątrzkomórkowym składzie jonów podczas eksperymentu4. Przedstawiona metoda zapewnia precyzyjną kontrolę zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych składów jonowych oraz stanowi potężne narzędzie do modyfikacji wewnątrzkomórkowych kompozycji jonowyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fishbackowi (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) za pomoc w kręceniu i edycji filmu. Komórki podobne do fibroblastów PS120 stabilnie eksprymujące NHE3-wt lub NHE3-YRK zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr Marka Donowitza (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wzmacniacz z zaciskiem krosowymmolekularne
Dwukanałowy elektrometr różnicowy (HiZ-223)Warner Instruments64-1650
(DP-301)Warner Instruments64-0044
Oprogramowanie do zaciskania krosowego oparte na MatLabMatLab z zestawemZalecane
jest oprogramowanie capmeterSystem kontroli temperatury ThermoClamp-1  AutoMate Scientific03-11-LLNagrzewnica liniowa
Jednokanałowy regulator temperatury (TC-324C)Warner Instruments64-2400
Jednolufowe standardowe rurki ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B120F-3   Używany do elektrod jonoselektywnych
Słoik do przechowywania mikropipetWorld Precision InstrumentsE212
Bis(dimetyloamino)dimetylosilanSigma-Aldrich14755-100ML
Czterochlorek węglaSigma-Aldrich319961-500ML
Jonofor wodorowy I - koktajl BSigma-Aldrich95293
Cienkościenne rurki borokrzemianowe  Instrument SutterB200-156-15Używany do pipety z zaciskiem krosowym 
Miękkie szkło (Corning 8161 Patch Glass)Warner Instruments64-0815
Rurka kapilarna z krzemionki (150um OD/75um ID)Molex (Polymicro Technologies)106815-0018Używana do systemu perfuzji wewnątrzpipetowej
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333
Asparaginian potasu Sigma-AldrichA6558
EGTASigma-AldrichE3889
Chlorek magnezuSigma-AldrichM4880
Mg-ATPSigma-AldrichA9187
HEPESSigma-AldrichH3375
RURYSigma-AldrichP6757
MOPSSigma-AldrichM1254
MESSigma-AldrichM3671
Chlorek wapniaSigma-AldrichC5670
TrisSigma-AldrichT1503
Kwas solnySigma-AldrichH1758
ApyrazaSigma-AldrichA6535
Bisfosforan fosfatydyloinozytolu(4,5) diC8Echelon BiosciencesP-4508
3,4,5-trifosforan fosfatydyloinozytolu diC8Echelon BiosciencesP-3908
Urządzenia Wzmacniacz różnicowy narzędzi do akwizycji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
  2. Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
  3. Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
  4. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
  5. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
  6. Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
  7. Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
  8. Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).
  9. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
  10. Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
  11. Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
  12. Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
  13. Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
  14. Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
  15. Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
  16. Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
  17. Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19(2001).
  18. Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
  19. Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
  20. Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
  21. Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
  22. Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
  23. Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
  24. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
  25. Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

protonoselektywna mikroelektrodapatch clamp ca okom rkowywymiennik sodowo wodorowypomiar aktywno ci NHE3technika gigantycznego patchasystem perfuzji wewn trzkom rkowejdetekcja strumienia jon wregulacja fosfoinozytolempomiar strumienia H

Powiązane artykuły