Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transport jonów przez błony komórkowe zapewnia precyzyjną kontrolę zawartości jonów wewnątrz i na zewnątrz komórki, która jest niezbędna do przetrwania komórki. W tych mechanizmach transportu pośredniczą działania wyspecjalizowanych białek transportowych. W szczególności dynamika pH jest precyzyjnie kontrolowana przez systemy wytłaczania protonów z błoną plazmatyczną (H+), takie jak rodzina białek wymiennika Na+/H+ (NHE). Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków mających na celu zbadanie mechanizmów leżących u podstaw regulacji NHE, nasza obecna wiedza na temat biofizycznych i molekularnych właściwości rodziny NHE jest niewystarczająca ze względu na ograniczoną dostępność metod skutecznego pomiaru aktywności NHE. W tym manuskrypcie użyliśmy elektrod selektywnych H+ podczas nagrywania zaciskania łat na całe ogniwa, aby zmierzyć strumień H+ indukowany przez NHE. Zaproponowaliśmy to podejście, aby przezwyciężyć pewne ograniczenia zwykle stosowanych metod pomiaru aktywności NHE, takich jak wychwyt radioaktywny i przepuszczalność błon fluorescencyjnych. Pomiar aktywności NHE za pomocą opisanej metody umożliwia uzyskanie wysokiej czułości i rozdzielczości czasowej oraz skuteczniejszą kontrolę wewnątrzkomórkowych stężeń H+. Elektrody selektywne H+ opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. Elektroda selektywna H+ poruszająca się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia, która jest zależna od strumienia H+. Podczas gdy elektrody selektywne H+ są używane do wykrywania strumienia H+ wychodzącego z ogniwa, metoda patch clamp w konfiguracji całego ogniwa służy do kontrolowania wewnątrzkomórkowego składu jonowego. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów. Aktywność transportera izoformy 3 NHE (NHE3) zmierzono przy użyciu tego podejścia technicznego w celu zbadania molekularnych podstaw regulacji NHE3 przez fosfoinozytydy.
Wprowadzenie
Transport jonów i substancji rozpuszczonych przez błonę plazmatyczną jest niezbędny dla przetrwania komórek, a co za tym idzie, organizmów1. Selektywny transport jonów i substancji rozpuszczonych jest osiągany przez szereg wyspecjalizowanych białek kanałowych i transportowych. Mutacje w tych białkach często prowadzą do różnych stanów klinicznych, co sprawia, że białka kanałowe i transportowe stają się potencjalnymi celami leczenia farmakologicznego1. Niestety, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i regulacji kanałów i transporterów jest często ograniczone przez dostępne podejścia do badania ich aktywności2,3,4.
Konkretnie, transportery można z grubsza podzielić na dwie duże grupy w zależności od tego, czy zmieniają potencjał transbłonowy komórki podczas transportu substancji rozpuszczonych: zmieniające się transportery jonów elektrogenicznych [np. kotransporter sodowo-fosforanowy 2a (NaPi2a), wymiennik sodowo-wapniowy (NCX), itp.] lub niezmieniające się transportery jonów elektroneutralnych [np. wymiennik sodowo-protonowy (NHE), kotransporter sodowo-chlorkowy, NaPi2c, itp.]. Aktywność obu klas transporterów została szeroko przebadana przy użyciu wychwytu izotopów promieniotwórczych i barwników fluorescencyjnych przenikających błonę2. Oba podejścia szacują aktywność transporterów poprzez pomiar zmian w stężeniu masowym określonych jonów cytoplazmatycznych i obie metody mają ograniczenia, takie jak umiarkowana czułość i rozdzielczość czasowa oraz niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego. Rzeczywiście, aktywność wielu transporterów zależy od stężenia cytoplazmatycznego przenoszonych jonów (np. NHE3, NCX), a oczekuje się, że zmiany tych stężeń jonów będą odgrywać znaczącą rolę w regulacji aktywności transportera2,3,5. Precyzyjny pomiar tych mechanizmów regulacyjnych jest ograniczony przy użyciu klasycznych metod.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, do badania aktywności transportera stosuje się metody zaciskania krosowego2,6. W szczególności samoreferencyjne elektrody jonoselektywne (ISE)7,8 w połączeniu z systemem zaciskania krosówek umożliwiły ostatnio pomiar aktywności transportera elektroneutralnego3,4,5. ISE opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. ISE poruszający się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia (μV). Różnice napięć można przekształcić w wartości strumienia jonów za pomocą metody kalibracji, która stosuje pierwszą zasadę dyfuzji Ficka2,9. Podczas gdy ISE są używane do wykrywania strumienia jonów wychodzących z komórek, metoda patch clamp zarówno w konfiguracjach całej komórki, jak i na lewą stronę jest stosowana do kontrolowania potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego składu jonów. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów i białek3,5.
Podsumowując, wszechstronność metody zaciskania krostek w porównaniu z innymi metodami do badania aktywności transportera sprawiła, że zaciskanie łat jest odpowiednie do przezwyciężenia typowych ograniczeń tych innych metod. Połączenie samoreferencyjnych ISE i technik patch clamp oferuje unikalną możliwość pomiaru aktywności transporterów elektroneutralnych w ściśle kontrolowanym środowisku eksperymentalnym oraz odkrycia nowych biofizycznych i molekularnych właściwości transportu błony komórkowej3,4,5. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do badania aktywności NHE. Rodzina białek NHE ssaków katalizuje elektroneutralną wymianę netto zewnątrzkomórkowego sodu (Na+) na wewnątrzkomórkowy proton (H+)10,11 wykorzystując wewnętrzny gradient Na+. U ssaków rodzina białek NHE obejmuje 11 pokrewnych białek (NHE1-9 i NHA1-2) oraz specyficzne dla plemników NHE10,12,13.
NHE (rodzina SLC9a) są powszechnie spotykane w większości organizmów żywych, od prostych prokariontów do wyższych eukariontów i są zaangażowane w różne funkcje życiowe komórek10,11, w tym kontrolowanie obrony komórek przed zasoleniem u prokariontów, utrzymywanie homeostazy kwasowo-zasadowej i objętości komórek oraz regulowanie wchłaniania soli i wody w różnych wyspecjalizowanych nabłonkach10,12,14,15. Kluczowe role biologiczne NHE i znaczenie ich funkcji zostały określone w kilku badaniach; jednak niewiele badań dotyczyło biofizycznych i molekularnych właściwości NHE ssaków ze względu na ograniczenia metodologiczne4. Niedawne zastosowanie samoreferencyjnych ISE podczas zaciskania łatek w całych komórkach ujawniło nowe mechanizmy molekularne izoform NHE regulowanych przez zmiany w wewnątrzkomórkowych stężeniach jonów, białek i fosfolipidów3,4.
W szczególności, protokół zawarty w tym manuskrypcie przedstawia metody i podejścia do badania aktywności i regulacji izoformy NHE 3 (NHE3), głównego gracza w absorpcji Na+, Cl-, HCO3- i płynu w błonie granicznej nabłonka nerek i jelit14,16. Przedstawiono nowe informacje na temat różnic we wrażliwości aktywności NHE3 na wewnątrzkomórkowe fosfoinozytydy (4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytylu [PI(4,5)P2] i fosfatydyloinozytod 3,4,5-trifosforan [PI(3,4,5]P3]). Białka transportu komórkowego, takie jak kanały i transportery, są regulowane przez fosfoinozytydy17, a NHE3 bezpośrednio wiąże zarówno PI(4,5)P2, jak i PI(3,4,5)P318. Opierając się na aktualnej literaturze, fosfoinozytyd może być istotny dla fizjologicznej lub patofizjologicznej regulacji NHE35,18,19. Nasze odkrycia potwierdzają odrębne role PI(4,5)P2 i PI(3,4,5)P3 w regulacji aktywności NHE3. To rozróżnienie było możliwe dzięki zastosowaniu technik ISE w połączeniu z nagrywaniem z użyciem clampu krosowego całej komórki. Technika ta umożliwia również kontrolę zawartości komórkowej fosfoinozytolu poprzez wewnątrzkomórkową perfuzję różnych fosfoinozytydów podczas pomiaru aktywności NHE3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Do rejestracji aktywności transporterów elektroneutralnych za pomocą samo-referencyjnej elektrody jonoselektywnej (ISE) w połączeniu z techniką patch clamp wymagane są dwa wzmacniacze: wzmacniacz patch clamp do utrzymania komórki w konfiguracji whole-cell oraz wzmacniacz o wysokiej impedancji (elektrometr) do rejestracji aktywności transportera za pomocą ISE (patrz Tabela materiałów). Wzmacniacz patch clamp jest bezpośrednio podłączony do terminala karty akwizycji danych. Elektrometr jest podłączony do wzmacniacza różnicowego służącego do filtrowania i wzmacniania sygnału. Wzmacniacz różnicowy jest podłączony do terminala karty akwizycji danych. W poprzednich badaniach20 wykorzystywano Capmeter, oprogramowanie do patch clamp monitorujące pojemność komórki (patrz Tabela materiałów). Komora rejestracyjna i roztwory perfuzyjne są utrzymywane w temperaturze 37 °C.
1. Przygotowanie pipet do ISE
- Wytnij pipety z kapilar borokrzemianowych do średnicy zewnętrznej 1,2 mm (patrz Tabela materiałów) za pomocą wyciągarki do pipet2 .
- Wypoleruj pipetę za pomocą mikrokuźni. Średnica końcówki pipety powinna wynosić 2-3 µm.
- Umieść pipety w uchwycie słoikowym do pipet końcówką skierowaną do góry (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Kroki 1.4-1.6 należy przeprowadzić w dobrze wentylowanej dygestorium chemicznym. - Przygotuj mieszaninę do silikonizacji składającą się z 1 kropli (~150 µL) bis(dimetylamino)dimetylosilanu i 10 kropli tetrachlorku węgla (patrz Tabela materiałów).
- Wlej mieszaninę do silikonizacji do słoika i szczelnie zamknij pokrywkę.
- Inkubuj słoik z mieszaniną do silikonizacji przez 24-48 h w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej, aż mieszanina całkowicie odparuje.
- Wypełnij pipetę od tyłu odpowiednią żywicą jonoselektywną, aby utworzyć kolumnę o długości około 2-4 mm.
UWAGA: Do rejestracji aktywności NHE można użyć Hydrogen ionophore I cocktail B (patrz Tabela materiałów). - Opukaj końcówkę pipety, aby rozprowadzić żywicę jonoselektywną do samego końca, a następnie umieść pipetę pionowo w uchwycie słoikowym końcówką skierowaną w dół.
- Sprawdź pod mikroskopem stereoskopowym, czy koktajl żywiczny dotarł do końca końcówki. W razie potrzeby zastosuj nadciśnienie, aby przepchnąć żywicę do końca.
- Wypełnij połowę pipety od tyłu odpowiednim roztworem (~ 100 μL). W przypadku użycia ionophore I cocktail B należy zastosować 100 mM KCl i 10 mM HEPES o pH 7,0.
- Podłącz ISE do elektrometru i umieść końcówkę ISE w roztworze kąpieli używanym do rejestracji. Wyzeruj elektrometr.
- Przetestuj odpowiedź H+-selektywnej ISE poprzez zmianę pH roztworu kąpieli. Średnia odpowiedź H+-selektywnej ISE wynosi ~ 58 mV na jednostkę pH.
- Okresowo oceniaj odpowiedź ISE w celu kalibracji.
2. Przygotowanie pipet do techniki patch-clamp do rejestracji
UWAGA: Zaleca się metodę opisaną przez Donalda Hilgemanna w jego artykule na temat rejestracji jednokanałowej21.
- Wytnij pipety do techniki giant patch z kapilar z borokrzemianowego szkła (2,0 mmOD / 1,5 mm ID) za pomocą wyciągarki do pipet2,22,23.
- Użyj mikrokuźni zamontowanej na stole mikroskopu odwróconego, aby wykonać szeroką końcówkę pipety (10 - 22 μm)23. Roztop kropelkę (~ 0,5 mL) miękkiego szkła na grubym platynowym drucie mikrokuźni.
UWAGA: Do wykonania pipet do techniki giant patch wymagany jest stosunkowo gruby drut platynowy (~0,5 mm). - Ustaw pipetę do patch-clampu blisko kropelki miękkiego szkła i przykładaj pełne ciepło, aż końcówka zacznie się cofać. Podczas nagrzewania drut platynowy będzie lekko przesuwał się w stronę środka.
- Wyłącz ogrzewanie i wciśnij końcówkę pipety w zmiękczoną kropelkę szkła. Stygnący drut cofnie się, odrywając końcówkę pipety.
- Ponownie zastosuj ciepło, aby wygładzić końcówkę pipety i uzyskać pożądaną średnicę. Średnica końcówki zależy od wielkości komórki poddawanej badaniu (w niniejszym badaniu 8 - 10 μm).
3. Przygotowanie komórek
- Podgrzać bufor fosforanowy (PBS) bez Ca2+ i Mg2+, roztwór trypsyny z EDTA oraz pożywkę wzrostową do temperatury 37 °C.
- Przemyć komórki dwukrotnie buforem PBS. Dla płytki do hodowli komórek o średnicy 35 mm należy użyć 1 mL buforu.
- Dodać 0,5 mL trypsyny do komórek w płytce do hodowli o średnicy 35 mm.
Uwaga: Gdy komórki zaczną przybierać okrągły kształt, należy potrząsnąć płytką, aby odspoić komórki. - Zatrzymać działanie trypsyny, dodając 5 mL (ilość dla płytki do hodowli komórek o średnicy 35 mm) pełnej pożywki wzrostowej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej.
UWAGA: Czas inkubacji z trypsyną zależy od rodzaju komórek. - Umieścić komórki na wytrząsarce z funkcją kołysania, aby zapobiec tworzeniu się agregatów.
- Wykorzystać komórki w czasie do 2 h po trypsynizacji.
UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od linii komórkowej.
4. Przygotowanie wewnątrzpipetowego systemu perfuzji
- Odetnij odpowiedni odcinek rurki kwarcowej (150 µm OD / 75 µm ID), aby przygotować linię perfuzji wewnątrzpipetowej.
- Wsuń jeden koniec rurki kwarcowej do końcówki pipety o pojemności 200 µL. Przyklej rurkę kwarcową do końcówki, a następnie odetnij koniec końcówki ostrym ostrzem żyletki.
- Połącz linię perfuzji (rurkę kwarcową przyklejoną do końcówki) z krótkim odcinkiem rurki silikonowej, która będzie służyć jako zbiornik dla roztworu do perfuzji wewnątrzpipetowej.
- Połącz rurkę silikonową ze strzykawką, aby wytworzyć nadciśnienie.
- Wsuń wolny koniec rurki kwarcowej przez polietylenową rurkę uchwytu pipety w porcie perfuzyjnym (patrz Tabela materiałów).
- Sprawdź drożność linii perfuzji, używając roztworu pipetowego.
5. Przygotowanie roztworów
- Przygotować silnie buforowany roztwór do pipety do rejestracji NHE (115 mM aspar긴ianu potasu (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM PIPES, 12,5 mM MOPS oraz 12,5 mM MES, pH 6,0 skorygowane kwasem asparginowym).
UWAGA: Przygotować roztwór stokowy do pipety i przefiltrować go. Mg-ATP dodać przed rozpoczęciem rejestracji. - Za każdym razem przygotować świeży roztwór do kąpieli (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 oraz 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).
6. Rejestracja aktywności transportera
- Utrzymywać komorę rejestracyjną oraz wszystkie roztwory w temperaturze 37 °Cponieważ aktywność transportera jest zależna od temperatury.
- Umieść komórki w komorze pomiarowej. Odczekaj, aż opadną one na dno komory, ale nie dopuść do ich przywarcia do ścianek komory.
- Wybierz odpowiednią komórkę. Zmierz średnicę komórki za pomocą mikrometru okularowego. Wybierz komórki o podobnych średnicach.
UWAGA: Zazwyczaj duża komórka posiada większą powierzchnię komórkową i potencjalnie więcej transporterów eksponowanych na swojej błonie plazmatycznej, co przekłada się na wyższą aktywność transporterów. Nie musi to być jednak zawsze prawdą, ponieważ aktywność transporterów zależy od konkretnego transportera oraz badanego typu komórek. - Zamocuj pipetę mikroelektrody selektywnej jonowo do mikromanipulatora, wypełnij pipetę do patch-clampingu od tyłu roztworem wewnątrzkomórkowym i upewnij się, że roztwór dotarł do końcówki pipety.2.
UWAGA: Usunięcie pęcherzyków powietrza z końcówki pipety może wymagać kilku delikatnych uderzeń. - Zamocuj pipetę do patch-clampingu do głowicy układu elektrofizjologicznego2,22,23.
UWAGA: Ważne jest, aby zachować kąt nachylenia głowicy ok. 45 stopni względem osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wprowadzenia pipety odpowiedni do utworzenia bardzo szczelnego uszczelnienia (seal). - Przyłożyć niewielkie nadciśnienie (~ 5 cm H2O)2do pipety patch, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki, a następnie umieść ją w roztworze kąpielowym.
- Przestań przesuwać pipetę do patch-clampu, gdy jej końcówka znajdzie się blisko komórki.
- Zredukuj ciśnienie dodatnie w momencie, gdy pipeta dotyka komórki, a następnie zastosuj niewielkie ciśnienie ujemne (~ 5 cm H2O)2O) aby uzyskać >uszczelnienie rzędu 1000 MΩ (gigaomowe) na błonie komórkowej za pomocą pipety patchowej23.
- Umieść pipetę do patch-clampu z komórką w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co elektroda ISE, a następnie przesuń pipetę z komórką w pobliże elektrody ISE (~ 5 – 10 µm)2,5 ale należy unikać kontaktu komórki z ISE (Rycina 1A).
- Upewnij się, że potencjał holdingowy wynosi 0 mV.
- Przerwij uszczelnienie za pomocą serii krótkich zasysań, aby uzyskać konfigurację whole-cell.
- Powoli przesuwaj elektrodę ISE (lub pipetę do patch-clampu) w lewo-prawo lub w górę-dół, aby zarejestrować aktywność transportera (Rycina 1B).
- Zarejestruj co najmniej 5–8 pików (Rysunek 1C, od A do B).
- Podczas rejestracji należy stosować perturbacje prostokątne w celu monitorowania jakości uszczelnienia oraz pojemności błony komórkowej (Rysunek 1).
- Oszacuj H+ strumień (
) z różnicy w wolnych H+ stężenie pomiędzy powierzchnią komórki a roztworem objętościowym (ΔH+)
UWAGA:
i 
czy H+ oraz współczynników dyfuzji buforu odpowiednio, BT jest całkowite stężenie buforu, KD jest stała dysocjacji buforu, r jest promieniem komórki, a 
wyznacza zmianę stanu stacjonarnego w stężeniu związanego H+ dla niewielkiej zmiany stężenia wolnych jonów H++. H+ oznacza wolny proton w roztworze. Aby zachować spójność z poprzednimi badaniami, H+ strumienie są przeliczane na jednostki strumienia elektrofizjologicznego poprzez obliczenie równoważników prądowych strumieni ((/faraday) w pA3,5]. - Znormalizuj strumień protonów do powierzchni komórki, którą można obliczyć na podstawie rozmiaru komórki, lub do pojemności błonowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu zbadania regulacji aktywności NHE3 przez fosfoinosytolami zastosowano samoodnośną elektrodę jonoselektywną (ISE) podczas rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell. Wykorzystano komórki fibroblastopodobne PS12024, w których nie występuje ekspresja endogennych NHE błony komórkowej. W komórkach fibroblastopodobnych PS120 stabilnie wyeksprymowano NHE3 typu dzikiego (NHE3-wt) lub mutanty NHE3, które nie wiążą fosfoinosytoli [tyrozyna 501, arginina ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo kluczowych funkcji transporterów, dostępne metody badania ich aktywności są nieskuteczne i niewystarczające. Jednym z ograniczeń jest fakt, że dostępne metody mierzą ruch jonów pośredniczony przez aktywność transporterów bez uwzględnienia wahań wewnątrzkomórkowego składu jonowego podczas eksperymentu4. Przedstawiona metoda zapewnia precyzyjną kontrolę pozakomórkowego i wewnątrzkomórkowego składu jonowego oraz oferuje potężne narzędzie do modyfikowania wewnątrzkomórkowego składu jonów, białe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fishbackowi (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) za pomoc w kręceniu i edycji filmu. Komórki podobne do fibroblastów PS120 stabilnie eksprymujące NHE3-wt lub NHE3-YRK zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr Marka Donowitza (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wzmacniacz z zaciskiem krosowym | molekularne | ||
| Dwukanałowy elektrometr różnicowy (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Oprogramowanie do zaciskania krosowego oparte na MatLab | MatLab z zestawem | Zalecane | |
| jest oprogramowanie capmeterSystem kontroli temperatury ThermoClamp-1 | AutoMate Scientific | 03-11-LL | Nagrzewnica liniowa |
| Jednokanałowy regulator temperatury (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Jednolufowe standardowe rurki ze szkła borokrzemianowego | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Używany do elektrod jonoselektywnych |
| Słoik do przechowywania mikropipet | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimetyloamino)dimetylosilan | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Czterochlorek węgla | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Jonofor wodorowy I - koktajl B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Cienkościenne rurki borokrzemianowe | Instrument Sutter | B200-156-15 | Używany do pipety z zaciskiem krosowym |
| Miękkie szkło (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Rurka kapilarna z krzemionki (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Używana do systemu perfuzji wewnątrzpipetowej |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Asparaginian potasu | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RURY | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyraza | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Bisfosforan fosfatydyloinozytolu(4,5) diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| 3,4,5-trifosforan fosfatydyloinozytolu diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
Bibliografia
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19(2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
