Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Interakcje białko-białko są podstawowymi mechanizmami przekazywania transdukcji sygnału w większości procesów komórkowych; dlatego identyfikacja nowych par interakcji białko-białko i monitorowanie dynamiki interakcji białek są szczególnie interesujące dla ujawnienia, jak rośliny reagują na czynniki środowiskowe i/lub sygnały rozwojowe. Opracowano wiele podejść do badania interakcji białko-białko, zarówno in vitro, jak i in vivo. Wśród nich niedawno opracowany test obrazowania komplementacji lucyferazy (LCI) jest najprostszą i najszybszą metodą wykazywania interakcji białko-białko in vivo. W tym teście białko A lub białko B jest połączone odpowiednio z amino-końcową lub karboksylowo-końcową połową lucyferazy. Kiedy białko A oddziałuje z białkiem B, dwie połówki lucyferazy zostaną odtworzone, tworząc funkcjonalny i aktywny enzym lucyferazy. Aktywność lucyferazy może być rejestrowana za pomocą luminometru lub kamery CCD. W porównaniu z innymi podejściami, test LCI pokazuje interakcje białko-białko zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym. Naciek Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana jest szeroko stosowanym systemem przejściowej ekspresji białek. Dzięki połączeniu LCI i ekspresji przejściowej, podejścia te pokazują, że fizyczna interakcja między COP1 i SPA1 była stopniowo zmniejszana po leczeniu jasmonianem.
Wprowadzenie
Aby koordynować wzrost ze swoim środowiskiem, rośliny rozwinęły eleganckie ścieżki sygnałowe, aby wyczuwać, przekazywać i reagować na sygnały sygnalizacyjne. Podobnie jak biegacze w sztafecie, białka są niezbędnymi graczami w transdukcji sygnału roślinnego. Powszechnie uznaje się, że interakcja białko-białko (PPI) odgrywa główną rolę w komunikacji komórkowej. Fosforylacja, acetylacja i degradacja białek zależą od fizycznej interakcji między białkiem docelowym a jego enzymami modyfikującymi. Na przykład białka z rodziny Jasmonate ZIM-domain protein (JAZ) oddziałują z czynnikiem transkrypcyjnym MYC2 i hamują jego aktywność transkrypcyjną1,2. Biorąc pod uwagę znaczenie PPI, ostatnio zbadano interakcje białek na dużą skalę w roślinach3,4,5. Wyniki interaktomii dodatkowo ujawniają złożoną sieć regulacyjną, która koordynuje różne funkcje komórkowe.
Istnieją pewne sprawdzone podejścia do monitorowania PPI. Test drożdży dwuhybrydowych (Y2H) jest najczęściej stosowaną metodą wykrywania IPP. Y2H jest łatwy do wykonania i nadaje się do szybkiego testu w celu zbadania interakcji białek. Y2H jest również szeroko stosowany do badań przesiewowych nieznanych partnerów interakcji dla określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Ponieważ jednak Y2H jest w całości przeprowadzany w drożdżach, nie może odzwierciedlać prawdziwego scenariusza w komórkach roślinnych i zapewnia wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich. Inną podobną strategią jest test pull-down. Ogólnie rzecz biorąc, dwa białka są wyrażane i oczyszczane z komórek Escherichia coli, a następnie mieszane i unieruchamiane w celu wykrycia interakcji białkowych. Chociaż metoda ta nie jest czasochłonna, nie pozwala również uzyskać wyników interakcji in vivo. Do celów interakcji in vivo koimmunoprecypitacja (co-IP) jest najpopularniejszym testem, który wymaga wysokiej jakości przeciwciała do immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie może wykluczyć możliwości wystąpienia pośrednich IPP. Ponadto, ze względu na skomplikowane procedury eksperymentalne w co-IP, wyniki zwykle różnią się w zależności od indywidualnej wiedzy specjalistycznej.
Testy rekonstytucji oparte na reporterach znacznie przyspieszają wykrywanie in vivo IPI. Metody te obejmują transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)6, dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną (BiFC)7 oraz test obrazowania komplementacji lucyferazy świetlika (LCI)8. Chociaż te trzy podejścia są lepsze niż co-IP, aby odzwierciedlić bezpośrednie PPI in vivo, FRET i BiFC wymagają specjalnych mikroskopów do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych i nie mogą łatwo określić ilościowo intensywności oddziaływania. W przeciwieństwie do tego, LCI wykorzystuje lucyferazę świetlika, która będzie świecić po reakcji z substratem lucyferyną. Co ważniejsze, intensywność PPI można określić na podstawie wartości aktywności lucyferazy. W ten sposób LCI nie tylko wskazuje, czy dwa białka oddziałują na siebie, czy nie, ale także dostarcza informacji na temat dynamiki interakcji po poddaniu działaniu substancji. Chociaż istnieją pewne ustalone metody monitorowania dynamiki oddziaływań (oparte na powierzchniowym rezonansie plazmonów lub przesunięciach termostabilności)9,10, podejścia te wymagają delikatnych instrumentów lub specjalnego etykietowania. W przeciwieństwie do tego, LCI jest łatwiejszy do wykonania i wykrycia.
Zasada dla LCI polega na tym, że połówki amino-końcowe i karboksylowe lucyferazy (nazwane odpowiednio N-Luc lub C-Luc) zostały połączone z białkiem A i B, a te dwa białka fuzyjne były jednocześnie wyrażane w komórkach roślinnych. Jeśli białko A oddziałuje z białkiem B, wówczas dwie połówki lucyferazy zostaną odtworzone, aby stać się aktywnym enzymem lucyferazy. Aktywność lucyferazy można wykryć za pomocą luminometru lub kamery CCD. Nie jest konieczne otrzymywanie stabilnych transformantów dla LCI; Wyrażenie przejściowe wystarczy, aby uzyskać wynik interakcji wysokiej jakości.
RING-typ E3 konstytutywny fotomorfogenny 1 (COP1) ubikwityny typu E3 oddziałuje z niezliczonymi czynnikami transkrypcyjnymi i wspomaga ich degradację poprzez proteasom 26S11. Niektóre z tych czynników transkrypcyjnych ukierunkowanych na COP1 są pozytywnymi regulatorami fotomorfogenezy. W ciemności COP1 oddziałuje z supresorem fitochromu A-105 1 (SPA1), który zwiększa aktywność COP1 E3 8. Po percepcji światła fotoreceptory znoszą interakcję COP1-SPA1, aby zahamować aktywność COP1, a następnie ustabilizować substraty COP112,13,14. Przykład ten ilustruje biologiczne znaczenie badania PPI i określania dynamiki PPI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roślin (8 tygodni)
- Umieść 50 nasion Nicotiana benthamiana w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 5% roztworu NaClO i 0,1% Triton X-100 (V/V) i pozostaw na 5 minut w celu wysterylizowania nasion.
- Opłucz nasiona sterylną wodą 5 razy i zawieś nasiona w 200 μl sterylnej wody.
- Ostrożnie umieść pojedyncze nasiona na powierzchni pożywki MS-agar (1 l: 1x sole Murashige i Skoog, 10 g sacharozy, pH 5,8 (KOH), 1% agar) z cienkimi końcówkami i przechowuj średnie płytki w 4 °C przez 3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.
UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologami, wykonaj ten krok na czystej stole. Podczas sterylizacji nie ma potrzeby potrząsania probówką. - Umieść pożywki w normalnych warunkach wzrostu (22 °C, natężenie światła białego 80 - 90 μmolm-2 s-1) na 10 dni, a następnie przenieś kiełkujące sadzonki do gleby.
UWAGA: Upewnij się, że wkładasz korzenie sadzonek do gleby i nie uszkadzaj korzeni. Przykryj tacę przezroczystą plastikową osłoną na noc, aby utrzymać wilgotność. - Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu o kontrolowanym wzroście w cyklu 16 godzin/8 godzin światła/ciemności i wilgotności 70%. 7-tygodniowe rośliny N. benthamiana są gotowe do infiltracji Agrobacteriumtumefaciens (Rysunek 1A).
UWAGA: Podlewaj rośliny i zwalczaj szkodniki w razie potrzeby, aby utrzymać rośliny w zdrowiu.
2. Przejściowe wyrażenie w liściach N. bentamiana (7 - 10 dni)
- Dostarczyć 150 ng plazmidów (plazmid kontrolny pEGAD-HA-LUC, pusty wektor i skonstruowany plazmid do testu LCI, w tym przypadku użyliśmy pCAMBIA1300-Nluc i pCAMBIA1300-Cluc do budowy plazmidu) do A. tumefaciens kompetentnego szczepu komórkowego GV3101 za pomocą standardowej metody elektroporacji.
- Kultura A. tumefaciens na podłożu agarowym Luria-Bertani (LB) (1 l: 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu, 1,5% agaru) zawierającym 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny w temperaturze 28 °C przez 4 dni.
UWAGA: Wybór antybiotyków zależy od zastosowanego wektora i szczepu A. tumefaciens. - Zaszczepić jedną pojedynczą kolonię A. tumefaciens z każdej płytki do 3 ml płynnego podłoża LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny i wstrząsać z prędkością 220 obr./min w temperaturze 28 °C przez 24 godziny w celu rozmnażania hodowli komórkowej.
- Przenieść 75 μl kultury bakteryjnej do 15 ml świeżej płynnej pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ryfampicyny, rozcieńczając ją przez współczynnik 200. Hodować bakterie przy 220 obr./min w temperaturze 30 °C przez około 8 godzin, aż OD600 osiągnie wartość od 0,5 do 1,0.
- Przenieść płynną kulturę A. tumefaciens do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 15 ml roztworu transformacyjnego w celu przepłukania osadu.
- Wirować probówkę w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut i wyrzucić supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.
- Zawiesić osad w 5 ml roztworu transformacyjnego i przechowywać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dostosuj gęstość komórek osadów A. tumefaciens roztworem transformacyjnym, aż końcowe stężenie OD600 wyniesie 0,5 lub wymieszaj dwie próbki o równej objętości w celu zbadania sparowanych oddziaływań białkowych.
- Naciekaj zawieszone komórki do4-tych do7-tych liści za pomocą 1 ml bezigłowej strzykawki (Rysunek 1BC). Po infiltracji natychmiast przykryj rośliny czarną plastikową osłoną i umieść tacę w ciemności na 12 godzin. Następnie hoduj rośliny jak zwykle przez 2 do 4 dni, zanim wykryjesz aktywność LUC.
UWAGA: Wybierz zdrowe liście o podobnej wielkości. Infiltracja czterech różnych stref w jednym liściu jest w porządku.
3. Wykrywanie aktywności lucyferazy (jeden dzień)
Uwaga: Istnieją dwa sposoby monitorowania aktywności lucyferazy. Jeden opiera się na obrazowaniu, a drugi ma na celu ilościowy pomiar aktywności lucyferazy.
- Metoda obrazowania
- Oderwij naciekany liść i umieść całą ulotkę na podłożu MS-agar.
- Rozpyl bufor roboczy lucyferyny na powierzchnię przyosiową liścia za pomocą butelki z rozpylaczem o pojemności 50 ml. Trzymaj materiały w ciemności przez 5 minut, aby ugasić autofluorescencję chlorofilu.
- Użyj aparatu do obrazowania CCD chłodzonego słabym oświetleniem (schłodzonego do -30 °C) do robienia obrazów (Rysunek 2). Czas naświetlania pola świetlnego wynosi 50 ms, a czas wykrywania luminescencji 1 min.
UWAGA: Dostosuj parametry zgodnie z instrukcją obsługi maszyny. Niższe temperatury poprawią stosunek sygnału do szumu, aby poprawić jakość obrazu.
- Alternatywnie, zmierz luminescencję bezpośrednio za pomocą komercyjnego luminometru.
- Ostrożnie wyciąć fragmenty liści (około 0,25cm2) z obszaru infiltracji liści N. benthamiana i zanurzyć krążek liściowy w 100 μl wody dejonizowanej w 96-dołkowej białej płytce (Ryc. 3).
- Dodać 10 μl buforu roboczego lucyferyny i odstawić na 5 minut. Następnie wykonaj specjalne zabiegi, aby zbadać dynamikę interakcji białek.
UWAGA: Wykryj luminescencję za pomocą luminometru w różnych punktach czasowych, aby uzyskać dynamikę aktywności lucyferazy, która reprezentuje kinetykę interakcji białko-białko pod określonym traktowaniem. Metoda ta ma zalety w przypadku jednoczesnego testowania dużej liczby par białek. Dla tych, którzy nie mają komercyjnego luminometru, zbadaj obfitość białka lucyferazy za pomocą western blot, dlatego odnieś się do ilościowej aktywności LUC. Jeśli światło niekoniecznie jest wymagane, po prostu trzymaj płytkę w luminometrze i mierz luminescencję w różnych punktach czasowych. W przeciwnym razie przenieś płytkę do komory wzrostowej podczas szczeliny wykrywania. Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, należy użyć co najmniej trzech kontrprób biologicznych. Chociaż aktywność LUC z różnych stref infiltracji będzie się różnić, ich zmieniające się wzorce są spójne po normalizacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole komplementacji lucyferazy służącym do badania oddziaływań białko-białko in vivo można wyróżnić trzy główne etapy: wzrost roślin, infiltrację tytoniu oraz test lucyferazy. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest infiltracja liści N. benthamiana zawiesiną A. tumefaciens (Rysunek 1).
Poniżej przedstawiono przykład użyteczności tej techniki w potwier...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół jest prosty i powtarzalny do badania in vivo interakcji białko-białko, a szczególnie nadaje się do wykrywania dynamiki interakcji białek podczas leczenia egzogennego. Kluczowym krokiem w tym teście jest infiltracja N. benthamiana . Aby zapewnić powodzenie infiltracji, rośliny muszą być bardzo zdrowe. Innym krytycznym czynnikiem jest to, kiedy sprawdzić aktywność lucyferazy po infiltracji. Nie ma poprawnej odpowiedzi na to pytanie. Naukowcy są zachęcani do monitorowania aktywności ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20140919), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31470375), Priorytetowy Program Rozwoju Akademickiego Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu oraz Projekt Qing Lan.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór do przemian | |||
| 10 mM Kwas morpholineetanosulfonowy | VETEC | V900336 | |
| 27,8 mM Glukoza | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2&razy; 6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μ M Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5,7 | |||
| Lucyferyna bufor roboczy | |||
| 5 mM Sól potasowa lucyferyny | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0,025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O do 10 ml |
Bibliografia
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
