Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Summary

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Abstract

Interakcje białko-białko są podstawowymi mechanizmami przekazywania transdukcji sygnału w większości procesów komórkowych; dlatego identyfikacja nowych par interakcji białko-białko i monitorowanie dynamiki interakcji białek są szczególnie interesujące dla ujawnienia, jak rośliny reagują na czynniki środowiskowe i/lub sygnały rozwojowe. Opracowano wiele podejść do badania interakcji białko-białko, zarówno in vitro, jak i in vivo. Wśród nich niedawno opracowany test obrazowania komplementacji lucyferazy (LCI) jest najprostszą i najszybszą metodą wykazywania interakcji białko-białko in vivo. W tym teście białko A lub białko B jest połączone odpowiednio z amino-końcową lub karboksylowo-końcową połową lucyferazy. Kiedy białko A oddziałuje z białkiem B, dwie połówki lucyferazy zostaną odtworzone, tworząc funkcjonalny i aktywny enzym lucyferazy. Aktywność lucyferazy może być rejestrowana za pomocą luminometru lub kamery CCD. W porównaniu z innymi podejściami, test LCI pokazuje interakcje białko-białko zarówno pod względem jakościowym, jak i ilościowym. Naciek Agrobacterium w liściach Nicotiana benthamiana jest szeroko stosowanym systemem przejściowej ekspresji białek. Dzięki połączeniu LCI i ekspresji przejściowej, podejścia te pokazują, że fizyczna interakcja między COP1 i SPA1 była stopniowo zmniejszana po leczeniu jasmonianem.

Introduction

Aby koordynować wzrost ze swoim środowiskiem, rośliny rozwinęły eleganckie ścieżki sygnałowe, aby wyczuwać, przekazywać i reagować na sygnały sygnalizacyjne. Podobnie jak biegacze w sztafecie, białka są niezbędnymi graczami w transdukcji sygnału roślinnego. Powszechnie uznaje się, że interakcja białko-białko (PPI) odgrywa główną rolę w komunikacji komórkowej. Fosforylacja, acetylacja i degradacja białek zależą od fizycznej interakcji między białkiem docelowym a jego enzymami modyfikującymi. Na przykład białka z rodziny Jasmonate ZIM-domain protein (JAZ) oddziałują z czynnikiem transkrypcyjnym MYC2 i hamują jego aktywność transkrypcyjną^1,

Protocol

1. Przygotowanie roślin (8 tygodni)

1. Umieść 50 nasion Nicotiana benthamiana w jednej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 5% roztworu NaClO i 0,1% Triton X-100 (V/V) i pozostaw na 5 minut w celu wysterylizowania nasion.
2. Opłucz nasiona sterylną wodą 5 razy i zawieś nasiona w 200 μl sterylnej wody.
3. Ostrożnie umieść pojedyncze nasiona na powierzchni pożywki MS-agar (1 l: 1x sole Murashige i Skoog, 10 g sacharozy, pH 5,8 (KOH), 1% agar) z cienkimi końcówkami i przechowuj średnie płytki w 4 °C przez 3 dni, aby zsynchronizować kiełkowanie.
   UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologami, wykonaj ten....

Results

W tym protokole komplementacji lucyferazy można wyróżnić trzy główne kroki do badania interakcji białko-białko in vivo, w tym wzrost roślin, infiltracja tytoniu i test lucyferazy. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest infiltracja cieczy A. tumefaciens do liści N. benthamiana (Ryc. 1).

Oto przykład użyteczności tej techniki, potwierdzający zmniejszenie interakcji COP1-S.......

Discussion

Opisany tutaj protokół jest prosty i powtarzalny do badania in vivo interakcji białko-białko, a szczególnie nadaje się do wykrywania dynamiki interakcji białek podczas leczenia egzogennego. Kluczowym krokiem w tym teście jest infiltracja N. benthamiana . Aby zapewnić powodzenie infiltracji, rośliny muszą być bardzo zdrowe. Innym krytycznym czynnikiem jest to, kiedy sprawdzić aktywność lucyferazy po infiltracji. Nie ma poprawnej odpowiedzi na to pytanie. Naukowcy są zachęcani do monitorowania aktywności .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór do przemian
10 mM Kwas morpholineetanosulfonowy	VETEC	V900336
27,8 mM Glukoza	VETEC	V900392
10 mM MgCl2&razy; 6H2O	VETEC	V900020
150 μ M Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5,7
Lucyferyna bufor roboczy
5 mM Sól potasowa lucyferyny	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0,025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O do 10 ml