Artykuł metodologiczny

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

DOI:

10.3791/56650

⸱

28 czerwca 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest śmiertelną chorobą oporną na leczenie, która jest biologicznie niejednorodna. Aby zrozumieć i skutecznie leczyć pełne spektrum kliniczne nowotworów złośliwych klatki piersiowej, potrzebne są dodatkowe modele zwierzęce, które mogą podsumować różne podtypy i stadia ludzkiego raka płuca. Modele przeszczepów allogenicznych lub ksenoprzeszczepów są wszechstronne i umożliwiają ilościowe określenie zdolności rakotwórczych in vivo, przy użyciu komórek nowotworowych pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Jednak wcześniej opisane metody wszczepiania komórek raka płuc były wykonywane w miejscach niefizjologicznych, takich jak bok myszy, ze względu na nieskuteczność ortotopowego przeszczepu komórek do płuc. W tym badaniu opisujemy metodę zwiększania wszczepienia komórek ortotopowego raka płuc poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą czynnika indukującego zwłóknienie bleomycyny. W ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji zastosowaliśmy to podejście do wszczepienia komórek nowotworowych podtypu gruczolakoraka płuc, uzyskanych ze źródeł mysich lub ludzkich, do różnych szczepów myszy. Wykazujemy, że uszkodzenie dróg oddechowych bleomycyną przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych zwiększa wszczepienie komórek nowotworowych z 0-17% do 71-100%. Co istotne, metoda ta zwiększyła częstość występowania nowotworów płuc i ich późniejszy wzrost przy użyciu różnych modeli i szczepów myszy. Ponadto wszczepione komórki raka płuc rozprzestrzeniają się z płuc do odpowiednich odległych narządów. W ten sposób udostępniamy protokół, który można wykorzystać do ustanowienia i utrzymania nowych modeli ortotopowych raka płuc z ograniczoną liczbą komórek lub próbek biologicznych oraz do ilościowej oceny zdolności nowotworowej komórek raka płuc w fizjologicznie istotnych warunkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie1. Pacjenci z rakiem płuc ostatecznie ulegają przerzutom do odległych narządów, zwłaszcza do ośrodkowego układu nerwowego, wątroby, nadnerczy i kości2,3,4. Nowotwory złośliwe klatki piersiowej są tradycyjnie klasyfikowane jako drobnokomórkowy rak płuca (SCLC) lub niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC)5. NSCLC jest najczęściej diagnozowanym nowotworem złośliwym i można go podzielić na różne podtypy histologiczne, w tym gruczolakorak płuc (LUAD) i rak płaskonabłonkowy płuc (LUSC)6. Analiza genomiczna wyciętych pierwotnych nowotworów płuc u ludzi wykazała, że guzy w obrębie danego histotypu mogą również wyrażać różne zaburzenia molekularne, co dodatkowo przyczynia się do ich rozbieżnego postępu klinicznego i zakłóca rokowanie pacjentów. Niezwykła heterogeniczność nowotworów płuc stanowi poważne wyzwanie dla racjonalnego projektowania, badań przedklinicznych i wdrażania skutecznych strategii terapeutycznych. W związku z tym istnieje potrzeba poszerzenia repertuaru wykonalnych eksperymentalnych modeli raka płuc w celu zbadania różnorodnego pochodzenia komórkowego, podtypów molekularnych i etapów tej choroby.

Do badania raka płuc in vivo zastosowano różne podejścia wykorzystujące modele zwierzęce, każde z własnymi zaletami i wadami w zależności od interesującego pytania biologicznego. Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) mogą celować w określone zmiany genetyczne w danym typie komórek progenitorowych, powodując nowotwory, które rozwijają się w obrębie immunokompetentnego gospodarza7. Chociaż niezwykle silne i klinicznie istotne, opóźnienie, zmienność i/lub zachorowalność na raka płuc związane z GEMM mogą być zaporowe dla niektórych pomiarów ilościowych i wykrywania przerzutów w późnym stadium w odległych narządach8. Podejściem uzupełniającym jest wykorzystanie modeli przeszczepu allogenicznego, w których komórki raka płuc, uzyskane bezpośrednio z guza myszy lub uzyskane najpierw jako ustalone linie komórkowe w hodowli, są ponownie wprowadzane do gospodarzy syngenicznych. Analogicznie, ksenoprzeszczepy raka płuc są tworzone z ludzkich linii komórkowych lub próbek guza pochodzących od pacjenta. Ksenoprzeszczepy ludzkiej linii komórkowej lub ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są na ogół utrzymywane u myszy z obniżoną odpornością i dlatego wykluczają pełny nadzór immunologiczny9. Pomimo tej wady, zapewniają one drogę do rozmnażania ograniczonych ilości ludzkich próbek biologicznych i badania podstawowych właściwości in vivo ludzkich komórek nowotworowych, które kodują bardziej złożone aberracje genomowe niż guzy GEMM.

Jedną z użytecznych właściwości alloprzeszczepów i ksenoprzeszczepów jest to, że są one podatne na tradycyjne testy ograniczające rozcieńczanie komórek, stosowane do ilościowego określania częstości komórek inicjujących nowotwór (TICs) w populacji komórek nowotworowych10. W tych eksperymentach określona liczba komórek jest wstrzykiwana podskórnie w bok zwierząt, a częstość TIC można oszacować na podstawie szybkości wchłaniania guza. Guzy podskórne mogą być jednak bardziej niedotlenione11 i mogą nie modelować kluczowych ograniczeń fizjologicznych mikrośrodowiska guza płuc. Dotchawicze dostarczanie nabłonkowych komórek macierzystych lub progenitorowych do płuc myszy jest metodą badania regeneracji płuc i biologii komórek macierzystych dróg oddechowych12. Jednak szybkość wszczepiania tą techniką może być stosunkowo niska, chyba że płuca zostaną najpierw poddane fizjologicznym formom urazu, takim jak infekcja wirusowa13,14. Wsparcie ze strony zapalnych komórek zrębu i/lub przerwanie błony podstawnej płuc może poprawić retencję przeszczepionych komórek w odpowiednich niszach komórek macierzystych w dystalnych drogach oddechowych15. Czynniki wywołujące zwłóknienie mogą również wstępnie kondycjonować płuca, aby zwiększyć wszczepienie indukowanych komórek pluripotencjalnych16 i mezenchymalne komórki macierzyste17. To, czy podobne formy uszkodzenia dróg oddechowych mogą wpływać na szybkość wszczepiania, zdolność inicjowania guza i wzrost komórek raka płuc, nie zostało jeszcze systematycznie ocenione.

W tym badaniu opisujemy metodę zwiększania skuteczności ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc, poprzez wstępne kondycjonowanie płuc myszy z urazem. LUAD powstaje w dystalnych drogach oddechowych, a znaczna podgrupa tych nowotworów rozwija zwłóknienie zrąbka zrębu18, co często koreluje ze złym rokowaniem19. Bleomycyna, naturalna nierybosomalna hybryda peptydu i poliketydu, jest szeroko stosowana do wywoływania zwłóknienia płuc u myszy20. Wkraplanie bleomycyny do dróg oddechowych najpierw sprzyja ścieraniu się nabłonka w pęcherzykach płucnych i rekrutacji komórek zapalnych, w tym makrofagów, neutrofili i monocytów21. Następnie następuje przebudowa tkanek w dystalnych drogach oddechowych, reorganizacja błony podstawnej22,23 i odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)24. Efekty pojedynczego wstrzyknięcia bleomycyny są przemijające, a zwłóknienie ustępuje po 30 dniach w większości badań25. Korzystając zarówno z modeli przeszczepu allogenicznego, jak i ksenoprzeszczepu, sprawdziliśmy, czy wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny może znacznie zwiększyć szybkość pobierania komórek LUAD w płucach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Yale.

1. Konfiguracja / Przygotowanie odczynników.

  1. Bleomycin
    Uwaga: W oparciu o Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), bleomycyna jest klasyfikowana jako zagrożenie dla zdrowia GHS08.
    1. Przygotuj bleomycynę w kapturze chemicznym. Ponownie zawiesić 15 j. w 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Porcję 100-200 μl roztworu rozmieścić w szklanych fiolkach i zamrozić w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Prawidłowo oznaczyć probówki datą ponownego zawieszenia. Zużyć w ciągu 6 miesięcy od tej daty.
      UWAGA: Każdy szczep myszy ma inną wrażliwość na bleomycin26. Zaleca się testowanie różnych dawek bleomycyny dla każdego szczepu myszy. Szczepy myszy i odpowiadające im dawki bleomycyny stosowane w reprezentatywnych doświadczeniach są wymienione w Tabeli 1.
  2. Myszy
    1. Kup myszy potrzebne do eksperymentu i pozwól myszom na 7 dni na aklimatyzację przed wstrzyknięciem. Wykonaj infuzje w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Przeniesienie zwierząt trzymanych w pomieszczeniu niezgodnym z BSL2 do pomieszczenia BSL2 przy użyciu standardowych procedur instytucjonalnych przed infuzją bleomycyny. Wstrzyknąć myszy w wieku 6-8 tygodni.
      Uwaga: Wstrzyknąć myszom zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi czynników niebezpiecznych, poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) i aprobatą IACUC.
      UWAGA: Myszy zakupione do reprezentatywnych eksperymentów są wymienione w Tabeli Materiałów. Użyto tylko samców myszy.
  3. Linie komórkowe raka płuc
    1. Hoduj pożądane linie komórkowe w odpowiednich pożywkach. Przed wstrzyknięciem należy wykonać krótkie, powtórzone profilowanie DNA lub badania genetyczne, aby zapewnić prawidłową identyfikację linii komórkowej. Aby ułatwić obrazowanie in vivo i ex vivo, zainfekuj linie komórkowe lentiwirusem eksprymującym kinazę tymidynową, zielone białko fluorescencyjne (GFP) i lucyferazy fusion reporter27 i posortuj komórki reporterowo-dodatnie przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przed wszczepieniem. Linie testowe na obecność mykoplazmy co 6 miesięcy.
      1. Hodowla ludzkiej linii komórkowej raka H2030 zgodnie z zaleceniami producenta przy użyciu pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną-streptomycyną i amfoterycyną B.
      2. Hodowla mysia linia komórkowa 368T1 (pochodząca z KrasG12D; p53-/- mysz) przy użyciu zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% FBS, penicyliną-streptomycyną i amfoterycyną B.
      3. Hodowla ludzkiej linii komórkowej raka PC9 przy użyciu RPMI z 10% FBS, penicyliną-streptomycyną i amfoterycyną B.

2. Leczenie bleomycyną

  1. Zaplanuj wstrzyknięcie myszom dotchawczo bleomycyny na 14 dni przed wszczepieniem komórek nowotworowych.
  2. Rozmrozić bulion z bleomycyny na lodzie 2 godziny przed wstrzyknięciem.
  3. Po rozmrożeniu rozcieńczyć bleomycynę do pożądanego stężenia roboczego (0,02 U/50 μL lub 0,005 U/50 μL) i przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Stężenie bleomycyny zależy od szczepu myszy użytego do eksperymentów (Tabela 1). Należy zwiększyć dawkę bleomycyny u myszy w celu ustalenia optymalnej dawki.
  4. Przygotować znieczulenie, rozcieńczając ketaminę i ksylazynę do końcowego stężenia odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml, Używając strzykawki 1 ml i igły 27 G, znieczulić każdą mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór ketaminy/ksylazyny odpowiednio w dawkach 100/10 mg/kg.
  5. Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palców u stóp. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  6. Umieść 1 mysz na raz na platformie intubacyjnej, zawieszając jej przednie zęby tyłem o platformę.
  7. Oświetl górną część klatki piersiowej za pomocą oświetlacza światłowodowego, aby pomóc w wizualizacji tchawicy. Otwórz usta myszy i delikatnie wyciągnij język sterylnymi płaskimi kleszczami.
  8. Używaj cewnika dożylnego bez igły, aby uniknąć zablokowania oddychania. Umieść cewnik nad białym światłem emitowanym przez otwór tchawicy.
  9. Wprowadzić cewnik do tchawicy, aż górna część cewnika dotrze do przednich zębów. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika w tchawicy, wizualizując białe światło świecące przez otwór cewnika w jamie ustnej.
  10. Za pomocą pipety dozować 50 μl bleomycyny lub nośnika (PBS) bezpośrednio do cewnika, aby upewnić się, że cała objętość została wdychana. Wykonaj ten krok w sterylnych warunkach.
  11. Jeśli cewnik zostanie prawidłowo wprowadzony, mysz natychmiast wdycha zawartość cewnika. Odczekaj kilka sekund, aż cała objętość przesunie się w dół cewnika. Następnie wyjmij cewnik z tchawicy i wylej do 10% roztworu wybielacza.
    UWAGA: Średni czas wykonywania kroków 2.7-2.11 przez jedną mysz wynosi około 5 minut.
  12. Jeśli mysz nie wdycha płynu, uważnie monitoruj oddech i wyreguluj położenie cewnika. Jeśli mysz przestanie oddychać, natychmiast wyjmij cewnik i pozwól myszy wznowić normalne oddychanie przed ponownym włożeniem cewnika.
  13. Umieść wstrzykniętą mysz na zatwierdzonej przez IACUC poduszce grzewczej na plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania sprawności. Cała procedura zajmie 10 minut na mysz. Nie należy zwracać zwierzęcia, które zostało poddane wstrzyknięciu, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
  14. Umieść kartę "Niebezpieczna substancja chemiczna w użyciu" na klatce na 24 godziny.

3. Monitorowanie myszy po intubacji

  1. Monitoruj myszy pod kątem niewydolności oddechowej natychmiast po intubacji, a następnie co 15 minut, aż myszy obudzą się ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
  2. Ketoprofen (5 mg/kg) należy wstrzykiwać dootrzewnowo w celu złagodzenia bólu.
  3. Badaj myszy 24 godziny po intubacji i 3 razy w tygodniu pod kątem jakichkolwiek oznak zachorowalności.
  4. Prowadź zapis daty zabiegu, identyfikacji zwierzęcia, rodzaju zabiegu, rodzaju znieczulenia oraz obserwacji pooperacyjnych wraz z czasem.
  5. Monitoruj myszy pod kątem utraty wagi, niewydolności oddechowej, nieprawidłowości behawioralnych i oceny stanu ciała <2 (segmentacja widocznych kręgosłupów / grzbietowych kości miednicy jest wyczuwalna) co dwa tygodnie po wstrzyknięciu bleomycyny.
  6. Eutanazja myszy z niewydolnością oddechową lub myszy, które doświadczyły 15% utraty masy ciała przez CO2 lub ketaminę/ksylazynę, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Potwierdź eutanazję, przeprowadzając badanie palpacyjne pod kątem aktywności oddechowej.

4. Wszczepienie linii komórkowych gruczolakoraka płuc.

UWAGA: Wykonaj wszczepienie komórek 14 dni po wstrzyknięciu bleomycyny (krok 2.1).

  1. Pozostawić komórki do wzrostu w kolbach o długości 75 cm2 bez przeszkód przez 3 dni przed dniem wstrzyknięcia za pomocą odpowiednich pożywek, jak podano w kroku 1.3.
    UWAGA: Powinny one zlewać się w 80% w dniu wstrzyknięcia (co odpowiada 2-3 x 106 w każdej kolbie w zależności od linii komórkowej).
  2. Umyć komórki rosnące na75 cm 2 kolbach z 5 ml PBS w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać PBS i dodać 1,5 ml trypsyny do komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą (zwykle 2-5 min).
    UWAGA: Zalecamy sprawdzanie co 2 minuty pod kątem oderwania komórek od plastiku poprzez prostą wizualizację dna kolby lub pod mikroskopem świetlnym. Nie należy przekraczać 5 minut inkubacji z trypsyną.
  4. Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 ml pożywki zawierającej 10% FBS (ta sama pożywka, co w kroku 4.1). Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować ją przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS w celu przepłukania komórek. Odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej do osadzania komórek. Powtórz to 1 raz.
  6. Zassać PBS i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml PBS na kolbę.
  7. Wymieszaj 50 μl mieszaniny komórek z 50 μl błękitu trypanowego i policz komórki za pomocą komory licznika komórek/hemocytometru28.
  8. Przygotować zawiesinę komórkową, rozcieńczając komórki w PBS, aby wstrzyknąć 1 x 105 komórek (lub inną wskazaną ilość) w 50 μl na mysz. Przed wstrzyknięciem należy przechowywać komórki na lodzie.
    UWAGA: Należy przygotować co najmniej dwa razy więcej komórek do wstrzyknięcia, aby uniknąć wyczerpania zawiesiny komórek.
  9. Przygotować znieczulenie, rozcieńczając ketaminę i ksylazynę do końcowego stężenia odpowiednio 10 mg/ml i 1 mg/ml, Używając strzykawki 1 ml i igły 27 G, znieczulić każdą mysz, wstrzykując dootrzewnowo roztwór ketaminy/ksylazyny odpowiednio w dawkach 100/10 mg/kg.
  10. Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palców u stóp. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  11. Umieść 1 mysz na raz na platformie intubacyjnej, zawieszając jej przednie zęby tyłem o platformę.
  12. Oświetl górną część klatki piersiowej za pomocą oświetlacza światłowodowego, aby pomóc w wizualizacji tchawicy.
  13. Delikatnie zawieś komórki za pomocą pipety p200, aby upewnić się, że nie tworzą grudek. Otwórz usta myszy i delikatnie wyciągnij język sterylnymi płaskimi kleszczami.
  14. Użyj cewnika dożylnego z usuniętą igłą, aby uniknąć zablokowania oddychania. Umieść cewnik nad białym światłem emitowanym przez otwór tchawicy.
  15. Wprowadzić cewnik do tchawicy, aż górna część cewnika dotrze do przednich zębów. Potwierdź prawidłowe umieszczenie cewnika w tchawicy, wizualizując białe światło świecące przez otwór cewnika w jamie ustnej.
  16. Za pomocą pipety dozuj 50 μl komórek bezpośrednio do cewnika, aby upewnić się, że cała objętość została wdychana. Wykonaj ten krok w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Jeśli cewnik zostanie prawidłowo włożony, mysz natychmiast wdycha zawartość cewnika.
  17. Odczekaj kilka sekund, aż cała objętość przesunie się w dół cewnika, a następnie wyjmij cewnik z tchawicy i wlej do 10% roztworu wybielacza.
  18. Jeśli mysz nie wdycha płynu, uważnie monitoruj oddech i wyreguluj położenie cewnika. Jeśli mysz przestanie oddychać, natychmiast wyjmij cewnik i pozwól myszy wznowić normalne oddychanie przed ponownym włożeniem cewnika.
    UWAGA: Średni czas wykonywania kroków 4.11-4.18 przez jedną mysz wynosi około 5 minut.
  19. Umieść mysz, której wstrzyknięto tabletkę, na poduszce grzewczej zatwierdzonej przez IACUC na plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania sprawności.
    UWAGA: Cała procedura zajmie 10 minut na mysz. Nie należy zwracać zwierzęcia, które zostało poddane wstrzyknięciu, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone.
  20. Przed obrazowaniem należy ogolić cały obszar żeber, zarówno brzusznie, jak i grzbietowo u B6129SF1/J i innych odmian myszy o ciemnych włosach, za pomocą golarki elektrycznej.
  21. 2-3 minuty po wstrzyknięciu komórki wstrzyknąć 100 μl lucyferyny retroorbitalnie (15 mg / ml) za pomocą igły insulinowej. Zmieniaj oko używane do wstrzykiwań podczas każdej sesji obrazowania.
  22. Po upływie co najmniej 2 minut umieść do 5 myszy w zwierzęcym obrazie bioluminescencyjnym w pozycji leżącej grzbietowej i uzyskaj obraz brzuszny za pomocą ustawień luminescencji29.
  23. Pod panelem sterowania dostosuj ustawienia rozdzielczości i czułości, aby zmierzyć luminescencję danej linii komórkowej. W przypadku większości zastosowań zacznij od 3 minut (lub "Auto" w przypadku nasycenia), binning=Średni (4), F/Stop=1, Pole widzenia=D, Wysokość obiektu=1,50,
    UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, sygnał luminescencyjny jest wykrywany w górnej części klatki piersiowej, w jednym płucu lub w obu płucach.
  24. Przełóż myszy do pozycji leżącej mostka i uzyskaj obraz grzbietowy, jak powyżej.
    UWAGA: Jeśli wstrzyknięcie komórek nie zostanie wykonane prawidłowo, komórki mogą gromadzić się przy wejściu do tchawicy lub w szyi.
  25. Ketoprofen należy wstrzykiwać dootrzewnowo w dawce 5 mg/kg mc. w celu złagodzenia bólu.
  26. Przenieś myszy z powrotem do klatki i umieść na niej kartę "BSL-2 Agent in Use".
  27. Monitoruj myszy pod kątem niewydolności oddechowej natychmiast po intubacji, a następnie co 15 minut, aż myszy obudzą się ze znieczulenia. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
  28. Badaj myszy 24 godziny po intubacji i trzy razy w tygodniu pod kątem jakichkolwiek oznak zachorowalności.
  29. Zapisuj w dzienniku datę zabiegu, dane identyfikacyjne zwierzęcia, rodzaj zabiegu, rodzaj znieczulenia oraz obserwacje i czas monitorowania pooperacyjnego.
  30. Monitoruj myszy pod kątem utraty wagi, niewydolności oddechowej, nieprawidłowości behawioralnych i oceny kondycji ciała <2 (segmentacja widocznego kręgosłupa/grzbietowych kości miednicy jest wyczuwalna) co dwa tygodnie po inokulacji bleomycyny.
    UWAGA: Myszy z guzami płuc mogą wykazywać podrażnienie dróg oddechowych, utratę masy ciała, kacheksję i/lub śmierć.
  31. Poddaj eutanazji myszy z powodu niewydolności oddechowej lub myszy, które doświadczyły 15% utraty masy ciała przez CO2 lub ketaminę/ksylazynę, a następnie zwichnięcie szyjki macicy w przypadku pobierania tkanek. Potwierdź eutanazję, przeprowadzając badanie palpacyjne pod kątem aktywności oddechowej.

5. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

  1. Powtórz obrazowanie myszy w 3. dniu po wszczepieniu, a następnie co tydzień.
  2. Znieczulenie myszy należy wstrzyknąć ketaminę/ksylazynę (zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.5) lub wziewny izofluran (2%). Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palca u nogi, aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Przed obrazowaniem należy ogolić cały obszar żeber, zarówno brzusznie, jak i grzbietowo u B6129SF1/J i innych odmian myszy o ciemnych włosach, za pomocą golarki elektrycznej.
  4. Gdy myszy znajdą się pod narkozą, wstrzyknij 100 μl lucyferyny retroorbitalnie (15 mg / ml) za pomocą igły insulinowej. Poczekaj 2 min. Zmieniaj oko używane do wstrzykiwań podczas każdej sesji obrazowania.
  5. Umieść myszy w imagerze i uzyskaj obrazy grzbietowe i brzuszne zgodnie z opisem w krokach 4.22-4.24.
  6. Po obrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatce, na ich plecach na płaskiej powierzchni w celu odzyskania zdrowia.
    UWAGA: Cała procedura zajmie 5 minut na grupę 5 myszy. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej świadomości, aby utrzymać leżący mostek.
  7. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania/analizy bioluminescencji.
    1. Wybierz odpowiednie obrazy i załaduj je jako grupę do oprogramowania do analizy bioluminescencyjnej.
    2. Kliknij ROI tool | square, aby dodać kwadratowy obszar zainteresowania (ROI). Umieść ROI w górnej części klatki piersiowej, pokrywając cały obraz płuc. Powtórz to dla każdego obrazu myszy.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz funkcję Kopiuj wszystko ROI, aby zastosować ten sam ROI do wszystkich obrazów w grupie i umieścić je w górnej części klatki piersiowej myszy, zarówno w widoku brzusznym, jak i grzbietowym.
    4. W lewym górnym rogu okna obrazu wybierz funkcję Photons. Kliknij funkcję Zmierz panel sterowania, aby zmierzyć zwrot z inwestycji. Skopiuj i wklej tabelę wyjściową zawierającą całkowity strumień (fotony/s) do wybranego oprogramowania, aby dalej analizować dane.
    5. Znormalizuj dzienną wartość zwrotu z inwestycji każdej myszy do jej wartości zwrotu z inwestycji zmierzonej w dniu 0.

6. Izolacja i przetwarzanie tkanek.

  1. Znieczulenie myszy należy wstrzyknąć, wstrzykując ketaminę/ksylazynę (zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.5 lub wziewny izofluran (2%). Monitoruj oddech myszy i zastosuj szczypanie palców u stóp. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, gdy mysz nie reaguje na szczypanie palca. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Wstrzyknąć 100 μl lucyferyny po ortopie (15 mg/ml) za pomocą igły insulinowej. Poczekaj 2 min.
  3. Myszy obrazowe wykonując kroki 4.22-4.24 z tego protokołu.
  4. Przed eutanazją wstrzyknąć do drugiego oka z kroku 6.2 kolejne 100 μl lucyferyny po orlocie za pomocą igły insulinowej.
  5. Poddać myszy eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny (szczegóły w kroku 2.4), a następnie zwichnięcie szyjki macicy, jeśli myszy są pod głęboką narkozą zgodnie z wytycznymi dostarczonymi przez IACUC. Potwierdź eutanazję, przeprowadzając badanie palpacyjne pod kątem aktywności oddechowej.
  6. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry poniżej mostka. Otwórz warstwę mięśniową wzdłuż przepony za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych i odsłoń klatkę piersiową, przecinając klatkę piersiową po obu stronach, unikając wewnętrznych tętnic piersiowych.
  7. Wykonaj perfuzję myszy, wykonując małe nacięcie w prawym przedsionku serca i wstrzyknij 5 ml PBS przez lewą komorę. Kolor tkanki płucnej zmieni się z czerwonego na bladoróżowo-biały, jeśli perfuzja krwi zostanie wykonana prawidłowo.
  8. Ostrożnie wytnij płuca z jamy klatki piersiowej, chwytając przełyk lub serce kleszczami. Delikatnie pociągnij tkankę i za pomocą nożyczek chirurgicznych ostrożnie przeciąć tkankę łączącą, unikając nakłucia tkanki płucnej. Zachowaj tchawicę w jak największym stopniu, aby w późniejszym etapie napompować drogi oddechowe płuc.
  9. Przemyj płuco, zanurzając i obracając tkankę 3 razy w 6-dołkowej płytce wypełnionej 3 ml PBS w celu usunięcia nadmiaru krwi.
  10. Umieść płuco na pokrywie płytki 6-dołkowej i umieść pokrywkę zawierającą tkankę w obrazie bioluminescencyjnym i uzyskaj obraz luminescencyjny30.
    UWAGA: Zalecamy wybranie następujących ustawień z "Panelu sterowania akwizycją", "Pole view=A" i "Wysokość obiektu=0,75 cm", a następnie "Automatyczna ekspozycja", aby uniknąć nasycenia obrazów.
  11. Wytnij i zobrazuj inne narządy, jak to zrobiono w kroku 6.9-6.10, w których przerzuty zostały zidentyfikowane na podstawie luminescencji, takie jak mózg, wątroba, nadnercza, kości, węzły chłonne, nerka lub śledziona31.
  12. Perfon płuc za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu, wprowadzając igłę do tchawicy myszy. Płuca napełnią się, jeśli są dobrze ukrwione.
    Uwaga: 4% paraformaldehyd jest toksyczny, stanowi zagrożenie dla zdrowia GHS07 i GHS08.
  13. Przenieś płuca do stożka o pojemności 15 ml z 5 ml 4% paraformaldehydu.
  14. Utrwalić płuca lub inne tkanki, inkubując tkankę z 4% paraformaldehydem przez noc w temperaturze 4 °C w urządzeniu wstrząsającym z prędkością 30-50 obr./min.
  15. Osadź płuca (lub inne tkanki) w parafinie lub związku o optymalnej temperaturze skrawania, w zależności od zastosowania32.
    UWAGA: Parafina jest preferowaną metodą zachowania struktury płuc oraz barwienia trichromem Massona i hematoksyliną-eozyną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zwiększyć skuteczność wszczepiania komórek rakowych LUAD do płuc myszy, opracowaliśmy protokół, który najpierw wstępnie kondycjonuje drogi oddechowe za pomocą bleomycyny, a następnie wstrzyknięcia ortotopowej komórki nowotworowej (Rysunek 1). Potwierdziliśmy, że nawet po podaniu myszom z obniżoną odpornością, bleomycyna indukowała przejściowe zwłóknienie do 14 dnia, o czym świadczy utrata architektury dróg oddechowych i zwiększone odkładanie kolagenu (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udokumentowano uderzające podobieństwa kliniczne między rakiem płuc a innymi przewlekłymi chorobami płuc36. W szczególności pacjenci z idiopatycznym zwłóknieniem płuc (IPF) mają zwiększoną predylekcję do rozwoju raka płuc, a związek ten jest niezależny od historii paleniatytoniu 37,38. IPF charakteryzuje się postępującym niszczeniem architektury płuc i upośledzeniem funkcji oddechowych poprzez odkładanie się ECM39. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Cancer Institute (R01CA166376 i R01CA191489 dla D.X. Nguyen) oraz Departamentu Obrony (W81XWH-16-1-0227 dla D.X. Nguyen).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BleomycinSigmaB5507-15UNUWAGA Zagrożenie dla zdrowia GHS08
Cewnik Exel 24GFisher1484121Usuń igłę. Do wstrzykiwań dotchawiczych
Ketamina (Ketaset inl 100 mg / ml C3N 10 mL)Butler Schein56344Do znieczulania myszy
KsylazynaButler Schein33198Do znieczulania myszy
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Przeciwbólowa
Puralube Weterynaryjna maść okulistycznaBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia,
D-Lucyferin w proszkuPerkin, Elmer Health Sciences, Inc122799Do obrazowania luminescencyjnego. Rozpuść proszek za pomocą PBS do uzyskania stężenia roboczego 15 mg/ml. Chronić przed światłem
Stanowisko do intubacji gryzoniBraintree ScientificRIS-100Zalecany stojak do wstrzykiwań dotchawiczych
MI-150 ILUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MDo oświetlania i wizualizacji tchawicy
Kleszcze Graefe, ząbkowany o długości 2,75 (7 cm)RobozRS-5111Do wstrzykiwań dotchawiczych
Strzykawka Luer-Lok Sterylna 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth firmy Conair Dual Foil Golarka akumulatorowa do golenia na mokro/na suchoMysz do goleniaConair-To
Nożyczki Bonn, 3,5" proste 15 mm ostre/ostre ostrza do pewnego cięciaRobozRS-5840SC
15 ml Probówki wirówkoweBD / Fisher352097
1,5 mlUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Fiolka scyntylacyjna 7 ml szkło borokrzemianowe GPIFisher701350
Końcówki do pipet z filtrem (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami14190-144
0,25% Trypsyna-EDTALife Technologies25200-056
DMEM o wysokiej glukozieLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Surowica bydlęca płodu USDALife Technologies10437-028
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15140-122
Amfoterycyna BSigmaA2942-20ML
Trypanowa niebieska plama 0,4%Life Technologies15250-061
Countess Automatyczny licznik komórekLife TechnologiesAMQAX1000
Kolba T / C 75 cm kwadratowa z pochyloną szyjką, niebieska nasadkaFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo
Oprogramowanie do żywego obrazuPerkin Elmer Health Sciences Inc128113Do analizy bioluminescencji in vivo System anestezjologiczny
XGI-8Perkin Elmer Health Sciences Inc118918Do znieczulenia izofluranem
BD Ultra-Fine II Strzykawka insulinowa z krótką igłą 1 cm31 G x 8 mm (5/16 cala)BD / FisherBD328418Do zaoczodołowej strzykawki do wstrzykiwań lucyferyny
1mlBD / Fisher14-823-434Do wstrzyknięć dootrzewnowych
igła 26 G x 1/2 cala BD/ Fisher305111Do iniekcji dootrzewnowych
4% ParaformaldehydVWR43368-9MUWAGA Zagrożenie dla zdrowia GHS07, GHS08. Do mocowania bibułki
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Mikroskopiaelektronowa Mayera MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI517-28-2
Barwienie eozyną Y 0,25% (w/v) w 57%Fisher67-63-0
Zestaw bejc trichromowych MassonIMEB IncK7228Do barwienia trichromu masson w celu wizualizacji kolagenu
Superfrost plus szkiełka szkiełkoweFisher
Płytka 6-dołkowaCorningC3516
Uniwersalny zestaw do wykrywania mykoplazmyATCC30-1012K
OCT Związek do zatapianiaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES62550-12Do zatapiania tkanek do zamrożonych skrawków
Kriostat badawczy Leica CM3050 SLeicaCM3050 SDo sekcji tkanki do analizy
barwieniaMikroskop fluorescencyjny Keyence All-in-OneKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 dla systemu Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Myszy atymiczne (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)Charles RiverNIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) myszy,Jackson Laboratories5557
B6129SF1/J, myszyJackson Laboratories101043
NIH-H2030, komórki ATCCCRL-5914
368T1hojnie dostarczone przez Monte Winslow (Standford University)-
PC9 komórkiNguyen, DX i wsp., Komórka, 2009; 138:51–
Komórki BrM3Nguyen DX i wsp. Komórka 2009; 138:51– 62-
Probówka stożkowa 17014411 1255015, , , , 62-H2030

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , pdb prot078261 (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, Suppl 2. S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

Powiązane artykuły