Method Article

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

DOI:

10.3791/56650

⸱

June 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest śmiertelną chorobą oporną na leczenie, która jest biologicznie niejednorodna. Aby zrozumieć i skutecznie leczyć pełne spektrum kliniczne nowotworów złośliwych klatki piersiowej, potrzebne są dodatkowe modele zwierzęce, które mogą podsumować różne podtypy i stadia ludzkiego raka płuca. Modele przeszczepów allogenicznych lub ksenoprzeszczepów są wszechstronne i umożliwiają ilościowe określenie zdolności rakotwórczych in vivo, przy użyciu komórek nowotworowych pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Jednak wcześniej opisane metody wszczepiania komórek raka płuc były wykonywane w miejscach niefizjologicznych, takich jak bok myszy, ze względu na nieskuteczność ortotopowego przeszczepu komórek do płuc. W tym badaniu opisujemy metodę zwiększania wszczepienia komórek ortotopowego raka płuc poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą czynnika indukującego zwłóknienie bleomycyny. W ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji zastosowaliśmy to podejście do wszczepienia komórek nowotworowych podtypu gruczolakoraka płuc, uzyskanych ze źródeł mysich lub ludzkich, do różnych szczepów myszy. Wykazujemy, że uszkodzenie dróg oddechowych bleomycyną przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych zwiększa wszczepienie komórek nowotworowych z 0-17% do 71-100%. Co istotne, metoda ta zwiększyła częstość występowania nowotworów płuc i ich późniejszy wzrost przy użyciu różnych modeli i szczepów myszy. Ponadto wszczepione komórki raka płuc rozprzestrzeniają się z płuc do odpowiednich odległych narządów. W ten sposób udostępniamy protokół, który można wykorzystać do ustanowienia i utrzymania nowych modeli ortotopowych raka płuc z ograniczoną liczbą komórek lub próbek biologicznych oraz do ilościowej oceny zdolności nowotworowej komórek raka płuc w fizjologicznie istotnych warunkach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie1. Pacjenci z rakiem płuc ostatecznie ulegają przerzutom do odległych narządów, zwłaszcza do ośrodkowego układu nerwowego, wątroby, nadnerczy i kości2,3,4. Nowotwory złośliwe klatki piersiowej są tradycyjnie klasyfikowane jako drobnokomórkowy rak płuca (SCLC) lub niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC)5. NSCLC jest najczęściej diagnozowanym nowotworem złośliwym i można go podzielić na różne podtypy histologiczne, w tym gruczolakorak płuc (LUAD) i rak pła....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Yale.

1. Konfiguracja / Przygotowanie odczynników.

  1. Bleomycin
    Uwaga: W oparciu o Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), bleomycyna jest klasyfikowana jako zagrożenie dla zdrowia GHS08.
    1. Przygotuj bleomycynę w kapturze chemicznym. Ponownie zawiesić 15 j. w 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Porcję 100-200 μl roztworu rozmieścić w szklanyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zwiększyć skuteczność wszczepiania komórek rakowych LUAD do płuc myszy, opracowaliśmy protokół, który najpierw wstępnie kondycjonuje drogi oddechowe za pomocą bleomycyny, a następnie wstrzyknięcia ortotopowej komórki nowotworowej (Rysunek 1). Potwierdziliśmy, że nawet po podaniu myszom z obniżoną odpornością, bleomycyna indukowała przejściowe zwłóknienie do 14 dnia, o czym świadczy utrata architektury dróg oddechowych i zwiększone odkładanie kolagenu (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udokumentowano uderzające podobieństwa kliniczne między rakiem płuc a innymi przewlekłymi chorobami płuc36. W szczególności pacjenci z idiopatycznym zwłóknieniem płuc (IPF) mają zwiększoną predylekcję do rozwoju raka płuc, a związek ten jest niezależny od historii paleniatytoniu 37,38. IPF charakteryzuje się postępującym niszczeniem architektury płuc i upośledzeniem funkcji oddechowych poprzez odkładanie się ECM39. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Cancer Institute (R01CA166376 i R01CA191489 dla D.X. Nguyen) oraz Departamentu Obrony (W81XWH-16-1-0227 dla D.X. Nguyen).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNUWAGA Zagrożenie dla zdrowia GHS08
Cewnik Exel 24GFisher1484121Usuń igłę. Do wstrzykiwań dotchawiczych
Ketamina (Ketaset inl 100 mg / ml C3N 10 mL)Butler Schein56344Do znieczulania myszy
KsylazynaButler Schein33198Do znieczulania myszy
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Przeciwbólowa
Puralube Weterynaryjna maść okulistycznaBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia,
D-Lucyferin w proszkuPerkin, Elmer Health Sciences, Inc122799Do obrazowania luminescencyjnego. Rozpuść proszek za pomocą PBS do uzyskania stężenia roboczego 15 mg/ml. Chronić przed światłem
Stanowisko do intubacji gryzoniBraintree ScientificRIS-100Zalecany stojak do wstrzykiwań dotchawiczych
MI-150 ILUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MDo oświetlania i wizualizacji tchawicy
Kleszcze Graefe, ząbkowany o długości 2,75 (7 cm)RobozRS-5111Do wstrzykiwań dotchawiczych
Strzykawka Luer-Lok Sterylna 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth firmy Conair Dual Foil Golarka akumulatorowa do golenia na mokro/na suchoMysz do goleniaConair-To
Nożyczki Bonn, 3,5" proste 15 mm ostre/ostre ostrza do pewnego cięciaRobozRS-5840SC
15 ml Probówki wirówkoweBD / Fisher352097
1,5 mlUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Fiolka scyntylacyjna 7 ml szkło borokrzemianowe GPIFisher701350
Końcówki do pipet z filtrem (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami14190-144
0,25% Trypsyna-EDTALife Technologies25200-056
DMEM o wysokiej glukozieLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Surowica bydlęca płodu USDALife Technologies10437-028
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15140-122
Amfoterycyna BSigmaA2942-20ML
Trypanowa niebieska plama 0,4%Life Technologies15250-061
Countess Automatyczny licznik komórekLife TechnologiesAMQAX1000
Kolba T / C 75 cm kwadratowa z pochyloną szyjką, niebieska nasadkaFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo
Oprogramowanie do żywego obrazuPerkin Elmer Health Sciences Inc128113Do analizy bioluminescencji in vivo System anestezjologiczny
XGI-8Perkin Elmer Health Sciences Inc118918Do znieczulenia izofluranem
BD Ultra-Fine II Strzykawka insulinowa z krótką igłą 1 cm31 G x 8 mm (5/16 cala)BD / FisherBD328418Do zaoczodołowej strzykawki do wstrzykiwań lucyferyny
1mlBD / Fisher14-823-434Do wstrzyknięć dootrzewnowych
igła 26 G x 1/2 cala BD/ Fisher305111Do iniekcji dootrzewnowych
4% ParaformaldehydVWR43368-9MUWAGA Zagrożenie dla zdrowia GHS07, GHS08. Do mocowania bibułki
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Mikroskopiaelektronowa Mayera MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI517-28-2
Barwienie eozyną Y 0,25% (w/v) w 57%Fisher67-63-0
Zestaw bejc trichromowych MassonIMEB IncK7228Do barwienia trichromu masson w celu wizualizacji kolagenu
Superfrost plus szkiełka szkiełkoweFisher
Płytka 6-dołkowaCorningC3516
Uniwersalny zestaw do wykrywania mykoplazmyATCC30-1012K
OCT Związek do zatapianiaMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA SCIENCES62550-12Do zatapiania tkanek do zamrożonych skrawków
Kriostat badawczy Leica CM3050 SLeicaCM3050 SDo sekcji tkanki do analizy
barwieniaMikroskop fluorescencyjny Keyence All-in-OneKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 dla systemu Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Myszy atymiczne (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)Charles RiverNIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) myszy,Jackson Laboratories5557
B6129SF1/J, myszyJackson Laboratories101043
NIH-H2030, komórki ATCCCRL-5914
368T1hojnie dostarczone przez Monte Winslow (Standford University)-
PC9 komórkiNguyen, DX i wsp., Komórka, 2009; 138:51–
Komórki BrM3Nguyen DX i wsp. Komórka 2009; 138:51– 62-
Probówka stożkowa 17014411 1255015, , , , 62-H2030

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in a....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Orthotopic Lung CancerBleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

Related Articles