Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Summary

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Abstract

Limfocyty T angażują się w szybką, spolaryzowaną sygnalizację, która następuje w ciągu kilku minut po aktywacji TCR. Powoduje to tworzenie synapsy immunologicznej, stereotypowego połączenia komórka-komórka, które reguluje aktywację limfocytów T i kierunkowo celuje w odpowiedzi efektorowe. Aby skutecznie badać te procesy, konieczne jest podejście do obrazowania, które jest dostosowane do uchwycenia szybkich, spolaryzowanych reakcji. Protokół ten opisuje taki system, który opiera się na fotoaktywowanym peptydowo-głównym kompleksie zgodności tkankowej (pMHC), który nie jest stymulujący, dopóki nie zostanie wystawiony na działanie światła ultrafioletowego. Ukierunkowane detrykowanie tego odczynnika podczas eksperymentów wideomikroskopowych umożliwia precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji TCR i monitorowanie w wysokiej rozdzielczości kolejnych odpowiedzi komórkowych za pomocą obrazowania całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Podejście to jest również zgodne z genetycznymi i farmakologicznymi strategiami perturbacji. Pozwala to na tworzenie dobrze zdefiniowanych szlaków molekularnych, które łączą sygnalizację TCR z tworzeniem spolaryzowanych struktur cytoszkieletu, które leżą u podstaw synapsy immunologicznej.

Introduction

Limfocyty T (limfocyty T) odgrywają kluczową rolę w odporności komórkowej, rozpoznając peptydy antygenowe wyświetlane w kontekście MHC na powierzchni komórki. Rozpoznawanie antygenu, w którym pośredniczy TCR, napędza różnicowanie naiwnych limfocytów T i sprzyja dostarczaniu odpowiedzi cytolitycznych i komunikacyjnych przez populacje efektorowe. Zaangażowanie TCR wywołuje również dramatyczne zmiany w architekturze komórkowej. W ciągu kilku minut limfocyty T zbrylają się po stronie komórki prezentującej antygen (APC), tworząc spolaryzowany interfejs znany jako synapsa immunologiczna (IS)^1,2. IS nasila odpowiedzi efektorowe limfocytów T, umożliwiając kierunkowe uwalnianie cytokin lub, w przypadku cytotoksycznych limfocytów T (CTL), białek litycznych, które niszczą APC.

Zaangażowanie TCR przez pMHC indukuje szybką fosforylację wielu kolejnych cząsteczek adaptorowych, w tym Linkera do aktywacji limfocytów T (LAT), co ostatecznie sprzyja solidnej przebudowie cytoszkieletu synaptycznego². Korowa aktyna nitkowa (F-aktyna) napędza rozprzestrzenianie się limfocytów T po powierzchni APC, a następnie przekształca się w strukturę pierścieniową charakteryzującą się akumulacją F-aktyny na obrzeżach IS i zubożeniem od środka. Tworzenie pierścienia F-aktyny jest ściśle sprzężone z reorientacją centrum organizacyjnego mikrotubul (MTOC, zwanego również centrosomem w komórkach T) do pozycji tuż poniżej środka interfejsu. Oba zdarzenia zachodzą w ciągu kilku minut od początkowego rozpoznania antygenu i ustanawiają kontekst architektoniczny, w którym zachodzą kolejne zdarzenia aktywacji i odpowiedzi efektorowe.

Aby badać powstawanie IS, różne laboratoria opracowały metody, w których APC jest zastępowane szklaną powierzchnią, która albo zawiera unieruchomione ligandy TCR, albo wspiera dwuwarstwę lipidową, która sama zawiera ligandy3^,4. Limfocyty T tworzą na tych powierzchniach kontakty podobne do IS, które można obrazować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) lub mikroskopii konfokalnej, umożliwiając badania w wysokiej rozdzielczości wczesnej aktywacji limfocytów T i tworzenia IS.

Chociaż te podejścia pozwoliły na doskonałą wizualizację w pełni złożonego IS, większość sygnalizacji po ligacji TCR:pMHC następuje w ciągu kilku sekund, komplikując wysiłki zmierzające do dokładnego określenia sekwencji zdarzeń następujących po aktywacji TCR. Aby obejść ten problem, opracowano podejście fotoaktywacyjne, w którym fotoaktywowany pMHC jest używany do osiągnięcia czasoprzestrzennej kontroli aktywacji TCR^5,6,7. W tym systemie limfocyty T są przyłączone do szklanych powierzchni zawierających fotoaktywowany pMHC, który nie stymuluje TCR, dopóki nie zostanie naświetlony światłem ultrafioletowym (UV). Naświetlanie promieniami UV mikronowego obszaru powierzchni pod komórką T usuwa fotoklatkę, tworząc strefę stymulacyjną, która może być rozpoznana przez komórkę T. Kolejne zdarzenia sygnalizacyjne i przebudowa cytoszkieletu są następnie monitorowane za pomocą genetycznie kodowanych reporterów fluorescencyjnych. Opracowano dwie fotoaktywowane wersje peptydów antygenowych, cytochrom c_88-103 (MCC) i albuminę jaja kurzego_257-264 (OVA), które są przedstawione odpowiednio w kontekście klasy II MHC^{I-E k} i klasy I MHC^{H2-K b} (Figura 1). Umożliwia to analizę obu limfocytów T CD4 ⁺ specyficznych dla MCC-I-E^k (wyrażających 5C. C7, 2B4 lub AND TCR) i limfocyty T CD8 ⁺ specyficzne dla OVA-H2-K^b (wyrażające TCR OT1).

W ciągu ostatniej dekady, metoda fotoaktywacji i obrazowania TCR została wykorzystana do ustalenia precyzyjnej kinetyki wczesnych etapów sygnalizacji TCR, a także do identyfikacji szlaków molekularnych rządzących spolaryzowaną przebudową cytoszkieletu5^,6,7,8,9,10. Na przykład test odegrał zasadniczą rolę w ustaleniu, że reorientacja centrosomów w kierunku APC odbywa się za pośrednictwem zlokalizowanego gradientu drugiego przekaźnika lipidowego diacyloglicerolu wyśrodkowanego w IS. Przewiduje się, że metodologia ta będzie nadal przydatna w zastosowaniach, które wymagają analizy obrazowej funkcji limfocytów T w wysokiej rozdzielczości.

Protocol

1. Przygotowanie stymulujących powierzchni szklanych

1. Pokryj szkło nakrywkowe z ośmiokomorową biotynylowaną poli-L-lizyną (Bio-PLL) rozcieńczoną w stosunku 1:500 w destylowanej, dejonizowanej wodzie (ddH₂O). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
2. Umyć za pomocą_H2O.
3. Suszyć przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Powierzchnie pokryte Bio-PLL należy zablokować buforem blokującym (sól fizjologiczna buforowana przez HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], z 2% BSA) przez 30 min w temperaturze pokojowej.
   1. Rozpuścić 5 mg bromowodorku poli-L-lizyny w 1 ml 10 mM NaPO₄ o pH 8,5.
   2. Dodać 125 μmol (0,55 mg) NHS-biotyny (z zapasu 100 mg/ml w DMSO) i sprawdzić pH reakcji. Jeśli pH jest poniżej 8,5, dodaj 2 μl 4 N NaOH, aby podnieść je do pH między 8,5 a 9,5.
   3. Wiruj przez 30 minut.
   4. Ugasić reakcję 50 μl 100 mM glicyny rozpuszczonej w 20 mM Tris pH 8,0.
   5. Wirować z pełną mocą przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.
      UWAGA: Jakość Bio-PLL jest zwykle porównywana z poprzednimi preparatami poprzez seryjne dwukrotne rozcieńczenia materiału na 96-dołkowej płytce ELISA i ilościowe określenie zawartości biotyny po inkubacji ze streptawidyną sprzężoną z fosfatazą alkaliczną.
5. Usuń bufor blokujący. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek. Dodać streptawidynę (100 μg/ml w buforze blokującym). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
6. Umyć w HBS. Napełnij i odwróć studzienki przesuwne komory 4 - 5 razy, usuwając HBS ze studzienek. Nie dopuścić do wyschnięcia studzienek.
7. Dodaj biotynylowane ligandy pMHC i cząsteczki adhezyjne na powierzchnię.
   UWAGA: MCC i OVA można fotoklatować poprzez dodanie grup ochronnych na bazie orto-nitrobenzylu (np. nitrofenyloetylu (NPE) lub nitroweratryloksykarbonylu (NVOC)) do grupy ε-aminowej kluczowych lizyn (K12 w MCC, K7 w OVA). Fotoklatki MCC i OVA można uzyskać od komercyjnych dostawców. Po rozpuszczeniu w buforze wodnym są one ponownie składane do ulegających ekspresji bakteryjnej I-E^k i H2-K^b przy użyciu ustalonych metod^11,12.
8. Walidacja fotoaktywowanego peptydu MCC lub OVA
   1. Usuwanie peptydów chronionych przez NVOC poprzez naświetlanie promieniami UV za pomocą ręcznej lampy UV (patrz tabela materiałów) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Pulsować 1,0 x 10⁵ APC z 1 μM peptydu niestymulującego (kontrola ujemna, np. Hb), nienapromieniowanego peptydu fotoaktywowanego, napromieniowanego peptydu fotoaktywowanego i peptydu agonistycznego (kontrola pozytywna, np. MCC) przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 37 °C.
   3. Aby stymulować limfocyty T wyrażające 5C. C7 / 2B4 / I TCR, użyj komórek CH12 lub CH27 B. Aby stymulować limfocyty T OT1, użyj komórek grasiczaka RMA-s lub EL4.
   4. Zmieszać pulsacyjne APC z równą liczbą limfocytów T w 96-dołkowych płytkach o okrągłym dnie w końcowej objętości 200 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-24 godziny.
   5. Odzyskać supernatanty z każdej studzienki i przeanalizować IL-2 za pomocą testu ELISA z detekcją kolorymetryczną streptawidyny i peroksydazy chrzanowej.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się potwierdzenie statusu chętnięcia wszystkich peptydów za pomocą spektrometrii mas elektrorozpylania przed ponownym złożeniem do kompleksów MHC.
9. Wykonaj składanie i oczyszczanie MHC, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Na przykład, owiń reakcje fałdowania w folię aluminiową i przeprowadź chromatografię filtracji żelowej przy wyłączonej lampie UV.
   UWAGA: Stwierdzono, że fotoaktywowane MCC-I-E^k i OVA-H2-K^b indukują niezależną od UV aktywację limfocytów T przy dużej gęstości, prawdopodobnie z powodu niepełnego funkcjonalnego umieszczania w klatkach. W związku z tym fotoaktywowany pMHC jest rozcieńczany do 10-30-krotnego nadmiaru niestymulującego pMHC (np. I-E^k zawierającego peptyd hemoglobiny_64-76 (Hb)) na etapie immobilizacji. Zwiększa to stosunek sygnału do szumu w kolejnym eksperymencie obrazowania.
10. Aby fotoaktywować limfocyty T CD4 ⁺, należy wspólnie użyć mieszaniny biotynylowanych Hb-I-E^k (3 μg / ml), biotynylowanych fotoaktywowanych MCC-I-E^k (0,1 μg / ml) i biotynylowanego przeciwciała przeciwko MHC H2-K^k klasy I (0,5 μg / ml). Przeciwciało anty-H2-K^k zachęca do 5C. Limfocyty C7/2B4/I T, które eksprymują H2-K^k, rozprzestrzeniają się na powierzchnię szkła bez poddawania się aktywacji.
11. W przypadku limfocytów T CD8 ⁺ należy użyć mieszaniny biotynylowanych H2-D^b zawierających peptyd KAVYDFATL (1 μg/ml), biotynylowanego fotoaktywowanego OVA-H2-K^b (0,1 μg/ml) oraz domeny zewnątrzkomórkowej cząsteczki adhezyjnej ICAM-1 (2 μg/ml wytwarzanej przez hodowlę komórek owadów¹³). ICAM-1 zachęca do tworzenia bliskiego kontaktu poprzez angażowanie integryny LFA1 na powierzchni limfocytów T.
12. Umieścić wszystkie mieszaniny białek w buforze blokującym, a następnie inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Gęstość molekularna na powierzchniach tego rodzaju wynosząca ~8000 na μm² została wcześniej określona⁶. Biorąc pod uwagę, że fotoaktywowany pMHC stanowi ~1/30^tysięcznej biotynylowanego białka na powierzchni, jego gęstość wyniesie ~267 cząsteczek na μm² przed delegacją.
13. Umyć jak w kroku 1.6 i pozostawić w HBS do momentu użycia.
14. Dodać 200 000 limfocytów T CD4 ⁺ lub CD8 ⁺ wyrażających odpowiedni TCR do każdej studzienki i pozostawić komórkom do przylegania w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Gdy komórki przyczepią się do powierzchni i rozprzestrzenią się na niej, są gotowe do fotoaktywacji i obrazowania.
    UWAGA: Transdukcja retrowirusowa efektorowych limfocytów T za pomocą sond do obrazowania fluorescencyjnego jest szczegółowo opisana elswhere^6,7. Sygnalizację wapniową można również badać za pomocą nietransdukowanych limfocytów T obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Fluo-4⁶. Barwnik ratiometryczny Fura-2 nie jest zalecany, ponieważ wymaga wzbudzenia w zakresie UV, co również indukuje deaging fotoaktywowanego pMHC.

2. Akwizycja obrazu

1. Do akwizycji obrazu należy użyć odwróconego mikroskopu TIRF wyposażonego w soczewkę obiektywu 150X zgodną z promieniowaniem UV. Promieniowanie UV naświetla obszary zdefiniowane przez użytkownika za pomocą cyfrowego systemu membranowego podłączonego do lampy rtęciowej o mocy 100 W (HBO). Skierować światło UV z tej lampy na próbkę za pomocą lustra o długości fali 400 nm.
2. Korzystaj z oprogramowania do analizy obrazu do zlokalizowanej fotoaktywacji i akwizycji poklatkowej. W większości eksperymentów monitoruj sondy zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym, używając odpowiednio laserów wzbudzających 488 nm i 561 nm. Światło lasera jest kierowane na próbkę za pomocą dwupasmowego zwierciadła dichroicznego, które transmituje również w zakresie UV (aby umożliwić deklarację). Proszę zapoznać się z Tabelą Materiałów i Rysunek 6, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat konfiguracji mikroskopu.
3. Po zamontowaniu szkiełka komory zawierającego limfocyty T, w razie potrzeby wyreguluj ustawienia, aby uzyskać oświetlenie TIRF lub epifluorescencyjne. W trybie na żywo wybierz pole komórek, które wyrażają interesujące nas sondy fluorescencyjne. Ustal obszary w skali mikronowej do fotoaktywacji pod pojedynczymi komórkami za pomocą sterowania programowego.
4. Rozpocznij akwizycję poklatkową. Zazwyczaj pozyskiwanych jest 80 punktów czasowych w odstępie 5 s między każdym punktem czasowym. Pozostawia to więcej niż wystarczająco dużo czasu na sekwencyjne ekspozycje 488 nm i 563 nm, w przypadku eksperymentów z dwoma kolorami.
5. Po upływie 10 punktów czasowych fotoaktywuj wybrane obszary, otwierając cyfrową migawkę przysłony na 1 - 1,5 s.
6. Po upływie czasu wybierz nowe pole komórek i powtórz proces.

3. Analiza danych

UWAGA: Zlokalizowana fotoaktywacja unieruchomionych ligandów tworzy dobrze zdefiniowany, stacjonarny region stymulujący, który może być wykorzystany do ilościowej analizy odpowiedzi sygnałowych i zdarzeń przebudowy cytoszkieletu. Protokoły analizy zazwyczaj obejmują albo ilościowe określenie intensywności fluorescencji w napromieniowanym obszarze, albo wykorzystanie napromieniowanego obszaru jako pozycyjnego punktu końcowego do pomiarów odległości (np. do oceny polaryzacji centrosomu w stosunku do napromieniowanego obszaru). Oba protokoły analizy zostały opisane poniżej. Różne interaktywne programy do analizy obrazu mogą być używane do wykonywania pomiarów intensywności i odległości, które można następnie wyprowadzić do dodatkowego przetwarzania i analizy.

1. Intensywność fluorescencji
   1. Określ intensywność fluorescencji (FI) obszaru tła na zewnątrz komórki (FI_b). Zostanie to wykorzystane do korekcji tła.
      1. Narysuj kwadratowy obszar o wielkości mikronów na zewnątrz komórki i zrób maskę. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj | Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości.
         UWAGA: Szczegóły proceduralne (np. 3.1.1.1) odnoszą się do oprogramowania Slidebook (patrz Spis materiałów). Implementacja tego protokołu przy użyciu innych pakietów oprogramowania (np. FIJI) będzie nieco inna.
   2. Określ FI w obszarze aktywowanym fotografią dla każdego punktu czasowego.
      1. Wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Aby określić intensywność fluorescencji, kliknij Analizuj | Statystyki maski. Wybierz opcję Średnia intensywność fluorescencji i wyeksportuj wartości.
   3. Odejmij FI tła od zmierzonych wartości FI w regionie. Następnie znormalizuj skorygowane pomiary FI, dzieląc przez średnią, skorygowaną o tło FI pierwszych 9 klatek przed fotoaktywacją. ΔF/F = ((FI-FI_b)/średnia(FI_1-9)-FI_b)).
      UWAGA: Wykres ΔF/F w funkcji czasu.
2. odległość
   1. Uzyskaj współrzędne x i y środka obszaru aktywowanego zdjęciem.
      1. Aby określić współrzędne x i y środka obszaru aktywowanego zdjęciem, wybierz opcję Maska, aby podświetlić region, który został aktywowany fotograficznie. Po podświetleniu regionu fotoaktywacji wybierz opcję Analizuj | Statystyki maski | Środek obszaru i wyeksportuj wartości.
   2. Określ współrzędne x i y dla interesującej nas sondy fluorescencyjnej dla każdego punktu czasowego. Zazwyczaj osiąga się to poprzez ręczne lub automatyczne śledzenie cząstek.
      1. Aby określić współrzędne x i y interesującej nas sondy fluorescencyjnej, wybierz opcję Ręczne śledzenie cząstek i kliknij sondę fluorescencyjną, która Cię interesuje w czasie. Po śledzeniu wszystkich punktów czasowych wybierz pozycję Analizuj | Statystyki maski | Środek obszaru i wyeksportuj wartości.
   3. Oblicz odległość między interesującym białkiem fluorescencyjnym a środkiem obszaru fotoaktywowanego dla każdego punktu czasowego za pomocą równania: Odległość = √(x_{2-x 1})²+(y_{2-y 1})²), w którym x₂ i y₂ są współrzędnymi interesującego białka fluorescencyjnego, a x₁ i y₁ są współrzędnymi środka obszaru aktywowanego fotoaktywem.
   4. Wykres odległości w funkcji czasu.

Results

Podejście fotoaktywacji i obrazowania pozwala na obserwację i łatwą kwantyfikację szybkich, spolaryzowanych odpowiedzi sygnalizacyjnych. Aby zilustrować jego możliwości, przedstawiono tutaj eksperyment badający czasoprzestrzenną korelację między indukowaną przez TCR akumulacją DAG a reorientacją centrosomów. 5C. Blasty limfocytów T C7 transdukowano retrowirusowo za pomocą dwóch fluorescencyjnych reporterów: biosensora DAG zawierającego tandemowe domeny C1 z kinazy białkowej C-θ połączonej...

Discussion

W ostatnich latach światło stało się doskonałym narzędziem do czasowo kontrolowanej aktywacji procesów komórkowych. Opracowano różne metodologie, z których każda ma swoje zalety i wady. Opisany tutaj system, który opiera się na degeneracji unieruchomionych, zewnątrzkomórkowych ligandów, idealnie nadaje się do analizy szybkich, subkomórkowych, spolaryzowanych odpowiedzi sygnałowych. Podejście to zastosowano do zbadania tworzenia IS w limfocytach T, jak opisano powyżej. Ponadto zmodyfikowano ligandy w klatkach dla innych r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe	Thermofischer Scientific	155361
Bromowodorek poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P2636	Będzie musiał wyprodukować biotynylowany poli-L-lizynę
EZ-Link NHS-Biotyna	Thermofischer Scientific	20217	Będzie musiał wyprodukować biotynylowany poli-L-lizynę
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowej BirA	Avidity	BirA500	Będzie stosowany do biotynylacji białek
Biotynylowane Hb I-EK			Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w pozycji bibliograficznej 6. Do biotynylacji należy użyć zestawu BirA
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) można kupić w Anaspec
Biotinylated α Przeciwciało H2-Kk	Przeciwciało BD Biosciences	553591
Biotynylowane NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) można kupić w Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Niestandardowe zsyntetyzowane białko (KAVYDFATL) można kupić w Anaspec
Biotinylated ICAM1			Informacje na temat fałdowania białek znajdują się w odniesieniu w protokole. Do biotynylacji należy użyć zestawu BirA
Ręczna lampa UV	UVP	UVGL-25	Lampa jest trzymana < 1 cm od próbki.  30 s światła 365 wystarcza do wykrywalnego decytacji, 20 minut do ilościowego decytacji.
System Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olympus		Dodatkowe informacje na temat systemu obrazowania można znaleźć w Rysunek 6
Mosaic cyfrowa membrana	Andor
Oprogramowanie Slidebook	Inteligentne innowacje w obrazowaniu