Artykuł metodologiczny

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

17.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56662

⸱

13 grudnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokoły izolacji struktur 3D jelit z organoidów in vivo i in vitro w macierzy podstawnej, a także szczegółowo opisujemy różne protokoły utrwalania i barwienia zoptymalizowane pod kątem znakowania immunologicznego białek mikrotubulowych, centrosomalnych i łączących, a także markerów komórkowych, w tym białka komórek macierzystych Lgr5.

Streszczenie

Pojawienie się organoidów 3D in vitro, które naśladują architekturę i morfogenezę tkanek in vivo, znacznie zwiększyło możliwości badania kluczowych zagadnień biologicznych w biologii komórkowej i rozwojowej. Ponadto organoidy w połączeniu z najnowszymi osiągnięciami technicznymi w zakresie edycji genów i dostarczania genów wirusowych mogą przyczynić się do postępu w badaniach medycznych i opracowywaniu nowych leków stosowanych w leczeniu chorób. Organoidy hodowane in vitro w macierzy podstawowej zapewniają potężne systemy modelowe do badania zachowania i funkcji różnych białek i dobrze nadają się do obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie. Jednak ustalenie ekspresji i lokalizacji endogennych białek w tkance ex vivo i organoidach in vitro jest ważne dla weryfikacji zachowania znakowanych białek. W tym celu opracowaliśmy i zmodyfikowaliśmy protokoły izolacji, utrwalania i znakowania immunologicznego tkanek do lokalizacji mikrotubul, białek centrosomalnych i powiązanych białek w tkance jelitowej ex vivo oraz w organoidach jelitowych in vitro. Celem było, aby utrwalacz zachował architekturę 3D organoidów/tkanki, zachowując jednocześnie antygenowość przeciwciał i umożliwiając dobrą penetrację i usuwanie utrwalacza i przeciwciał. Wystawienie na działanie zimna depolimeryzuje wszystkie mikrotubule z wyjątkiem stabilnych, co było kluczowym czynnikiem przy modyfikowaniu różnych protokołów. Stwierdziliśmy, że zwiększenie stężenia kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) z 3 mM do 30 mM dało skuteczne oderwanie kosmków i krypt w jelicie cienkim, podczas gdy 3 mM EDTA było wystarczające dla krypt okrężnicy. Opracowany protokół wiązania formaldehydu/metanolu zapewnił bardzo dobrą konserwację strukturalną, zachowując jednocześnie antygenowość w celu skutecznego znakowania mikrotubul, aktyny i białek wiążących koniec (EB). Działało to również w przypadku białka centrosomalnego nineiny, chociaż protokół metanolowy działał bardziej konsekwentnie. Ustaliliśmy ponadto, że utrwalenie i znakowanie immunologiczne mikrotubul i powiązanych białek można osiągnąć za pomocą organoidów wyizolowanych z macierzy podstawnej lub pozostających w niej.

Wprowadzenie

Tworzenie nabłonka o polaryzacji apico-bazalnej jest podstawowym procesem rozwoju i obejmuje radykalną reorganizację mikrotubul i białek centrosomalnych. Promieniowa matryca mikrotubul wychodząca z centralnie umieszczonego centrosomalnego centrum organizowania mikrotubul (MTOC) jest widoczna w wielu komórkach zwierzęcych i dobrze nadaje się do stosunkowo płaskich komórek. Natomiast komórki nabłonka walcowatego, takie jak komórki jelita, gromadzą niepromieniowe transkomórkowe układy mikrotubul, które lepiej wspierają kształt i wyspecjalizowane funkcje tych komórek. Ta radykalna reorganizacja mikrotubul jest osiągana poprzez przemieszczanie się centrosomu do wierzchołka i tworzenie wierzchołkowych niecentrosomalnych MTOC (n-MTOCs), które stają się odpowiedzialne za zakotwiczenie transkomórkowych mikrotubul1,2,3,4,5.

Duża część naszej wiedzy na temat różnicowania nabłonka i związanej z tym reorganizacji mikrotubul pochodzi z badań warstw komórkowych 2D in vitro, które nie wykazują architektury tkankowej in vivo. Rozwój 3D kultur organoidowych in vitro, zapoczątkowany przez Cleversa i współpracowników6, stanowi duży postęp technologiczny, ponieważ naśladują one architekturę i rozwój in vivo. Hierarchia różnicowania nabłonka jest widoczna w jelicie; Komórki macierzyste na dnie krypt powodują powstawanie niedojrzałych komórek amplifikujących tranzyt, które namnażają się i stopniowo różnicują podczas migracji w górę krypty na kosmki jelita cienkiego lub powierzchnię okrężnicy, gdzie stają się w pełni zróżnicowane przed wydaleniem do lumen7. Co ważne, jest to replikowane w organoidach jelitowych, w których komórki z niszy komórek macierzystych namnażają się, tworząc torbiele, które następnie generują pąki przypominające krypty z komórkami macierzystymi na dole i różnicowaniem stopniowo postępującym w kierunku obszaru torbieli, który staje się podobny do kosmków8. Organoid jelitowy stanowi zatem potężny model do badania nie tylko mikrotubul i reorganizacji centrosomalnej podczas różnicowania nabłonka, ale także wielu innych białek, a także stanowi idealną platformę do badań przesiewowych leków i związków spożywczych o potencjalnych korzyściach terapeutycznych9,10.

Organoidy dobrze nadają się do obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie, a zarówno organoidy typu knock-in, jak i knock-out mogą być generowane za pomocą edycji genów CRISPR/Cas911,12. Jednak ustalenie ekspresji i lokalizacji endogennych białek, które mają być badane, jest ważne, zwłaszcza w celu zweryfikowania zachowania oznakowanych białek. Znakowanie immunologiczne organoidów 3D hodowanych w macierzy podstawowej lub tkance izolowanej ex vivo jest bardziej złożone niż komórki hodowane na szalkach hodowlanych w 2D. Protokół utrwalania musi zachować delikatną architekturę 3D organoidów, jednocześnie zachowując antygenowość przeciwciał (tj. epitopy do wiązania przeciwciał). Na przykład 4% paraformaldehyd (PFA) jest powszechnie stosowany jako utrwalacz, ale chociaż jest to stosunkowo szybko działający utrwalacz i zapewnia dobre zachowanie morfologiczne, z naszego doświadczenia wynika, że często powoduje utratę antygenowości i nie jest odpowiedni dla wielu przeciwciał centrosomalnych. Należy również wziąć pod uwagę zdolność utrwalacza i przeciwciał do przenikania do struktur i tkanek 3D. W tym celu zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy protokoły izolacji tkanek i pośredniego znakowania immunologicznego organoidów 3D in vitro i izolowanej ex vivo tkanki jelitowej. Opisujemy, jak wyizolować krypty i kosmki jelita cienkiego oraz tkankę okrężnicy, a także dołączamy protokół izolacji organoidów 3D jako alternatywę dla utrwalania i znakowania immunologicznego w macierzy podstawnej. Przedstawiamy trzy alternatywne protokoły utrwalania do znakowania immunologicznego mikrotubul i białek centrosomalnych, takich jak nineina oraz białka śledzące plus-end mikrotubul (+TIP), takie jak białka EB i CLIP-170 (patrz również referencje8,13). Omawiamy również zalety i wady związane z każdym protokołem.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Wschodniej Anglii dotyczącymi licencji instytucjonalnych.

1. Izolacja tkanki jelitowej

  1. Izolacja krypt okrężnicy w celu znakowania immunologicznego (patrz Rysunek 1, schemat)
    1. Poddaj mysz eutanazji (za pomocą uduszenia CO2 ) i usuń okrężnicę (zaczynając od kątnicy i usuwając doogonowo) za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety14.
    2. Przepłukać zawartość jelita grubego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką. PBS: chlorek sodu (8,0 g/l), chlorek potasu (0,2 g/l), wodorofosforan disodowy (1,15 g/l) i diwodorofosforan potasu (0,2 g/l) o pH 7,3.
    3. Za pomocą metalowego pręta (średnica 2,4 mm) lub końcówki szklanej pipety przytrzymaj jeden koniec rurki okrężnicy, delikatnie przesuwając tkankę po pręciku/pipecie, odcinając w ten sposób tkankę okrężnicy, tak aby nabłonek znalazł się teraz na zewnątrz.
      UWAGA: Jeśli nie jest to możliwe, otwórz okrężnicę nożyczkami i pokrój na 5 mm kawałki.
    4. Przenieś okrężnicę lub kawałki jelita grubego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml PBS.
    5. Odwróć rurkę kilka razy, aby dodatkowo usunąć zawartość jelit, śluz itp.
    6. Przenieść okrężnicę/kawałki do 40 ml 3 mM EDTA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 min.
      UWAGA: Rozcieńczyć 0,5 M EDTA pH 8,0 PBS.
    7. Wstrząsnąć w celu usunięcia śluzu i przenieść okrężnicę/kawałki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej świeże 40 ml 3 mM EDTA w PBS. Inkubować przez 35 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Przenieś okrężnicę/kawałki do 10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj przez 30 sekund, aby uwolnić krypty (frakcję krypty).
    9. Wyjmij okrężnicę/kawałki z probówki i umieść z powrotem w 3 mM EDTA na wypadek, gdyby wymagana była dalsza izolacja. Odwirować pozostałą frakcję krypty przy sile 300 x g przez 5 minut.
    10. Usunąć 5 ml supernatantu i ponownie zawiesić osad krypty w pozostałej objętości 5 ml.
    11. Obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym z zoomem (powiększenie 50 - 100x), aby sprawdzić, czy nie ma krypt okrężnicy.
      UWAGA: Jeśli nie ma żadnych krypt, inkubuj dwukropek/kawałki w 3 mM EDTA w PBS przez kolejne 30 minut, a następnie powtórz kroki 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Odwirować frakcję krypty przy 300 x g przez 5 min.
    13. Usunąć cały supernatant w celu uzyskania osadu kryptowego i natychmiast przystąpić do utrwalania (sekcja 3).
  2. Izolacja krypt i kosmków jelita cienkiego do znakowania immunologicznego (Rysunek 2)
    1. Poddać mysz eutanazji (za pomocą uduszenia CO2) i usunąć jelito cienkie (od proksymalnej dwunastnicy do końcowego odcinka jelita krętego) za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety14.
      UWAGA: Aby wyświetlić różne odcinki jelita cienkiego, na tym etapie oddziel je i traktuj osobno. Zobacz Rysunek 1 i Tabela 1 dla diagramu przepływu i czasów.
    2. Przepłukać zawartość jelita cienkiego PBS za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką.
    3. Rozciąć jelito cienkie nożyczkami do preparowania i umieścić w 15 ml PBS na szalce Petriego.
    4. Delikatnie umyj jelito w PBS, aby usunąć zawartość światła, nie uszkadzając jednocześnie powierzchni błony śluzowej. Przenieś tkankę na świeżą szalkę Petriego i powtórz płukanie PBS.
    5. Pociąć jelito na 3-5 mm kawałki i przenieść na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 15 ml 30 mM EDTA w PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie inkubować w 3 mM EDTA w PBS przez 30 minut.
    6. Frakcja 1 (izolacja kosmków): Przenieść kawałki jelita do 10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, energicznie wstrząsać przez 10 s i przelać na 100 mm szalkę Petriego. Sprawdź frakcję izolowanych kosmków pod mikroskopem stereoskopowym. Na tym etapie powinny być obecne głównie kosmki, ale może się to różnić w zależności od izolacji.
      UWAGA: Aby zapobiec przywieraniu izolowanych kosmków/krypt do plastiku, szalki Petriego i probówki zbiorcze powinny być wstępnie pokryte płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wlej FBS do naczyń i/lub probówek i natychmiast go wyjmij. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przewodnikami dotyczącymi czasu dla każdej frakcji.
    7. Przenieś kawałki jelita z powrotem do 30 mM EDTA w PBS i inkubuj przez 5 minut. Podczas tej inkubacji zebrać frakcję 1 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (wstępnie pokrytej FBS) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    8. Frakcja 2: Przenieść kawałki jelita do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml PBS, energicznie wstrząsać przez 20 s, a następnie przelać na 100 mm szalkę Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Zazwyczaj na tym etapie obecna jest mieszana kultura kosmków i krypt (Rysunek 2A).
    9. Przenieś kawałki jelita z powrotem do 30 mM EDTA w PBS i inkubuj przez kolejne 5 minut. Podczas tej inkubacji osad frakcji 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (wstępnie pokrytej FBS) o sile 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant z frakcji 1 i 2 bez naruszania osadu i natychmiast przystąpić do utrwalania (krok 3).
    10. Frakcja 3 (izolacja krypty): Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS w probówce o pojemności 50 ml, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Na tym etapie frakcja będzie zawierała głównie krypty (Rysunek 2B).
    11. Frakcja 4: Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Na tym etapie powinny być obecne tylko krypty.
    12. Frakcja 5: Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Zazwyczaj na tym etapie wydobywa się bardzo niewiele krypt. Jeśli wyodrębnionych zostanie więcej niż kilka krypt, kontynuuj z 6. frakcją.
      UWAGA: Jeśli pożądana jest czysta populacja krypty (na przykład do generowania organoidów), należy użyć sitka komórkowego o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie nienaruszone kosmki z frakcji wzbogaconej w kryptę.
    13. Zebrać frakcje 3 - 5 w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    14. Sprawdzić osady frakcji 3 - 5 i usunąć supernatanty bez naruszania osadów, a następnie natychmiast przystąpić do utrwalania (sekcja 3).

2. Izolacja organoidów jelitowych z kopuł macierzy podłoża w płytkach 24-dołkowych

UWAGA: Powstawanie organoidów w kopułach macierzy piwnicznych zostało opisane gdzie indziej12.

  1. Przykryj studzienki kopułą macierzystą piwnicy zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Studnie zawierające kopuły z matrycą piwniczną należy przepłukać 500 μl PBS.
  3. Dodać zimne 250 μl roztworu do odzyskiwania komórek (4 °C) do każdej studzienki (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Roztwór do odzyskiwania zimnych komórek zdepolimeryzuje wszystkie mikrotubule z wyjątkiem stabilnych.
  4. Zeskrob kopuły matrycy piwnicy za pomocą mikropipety P1000 i ostrożnie pipetuj w górę iw dół w całej studzience, aby rozbić i usunąć matrycę piwniczną z plastiku.
  5. Zebrać supernatant w probówkach wirówkowych o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml.
  6. Odwróć kilkakrotnie probówkę o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml i sprawdź pod mikroskopem, czy organoidy zostały wyizolowane i poruszają się swobodnie, a nie w grudkach. Trzymaj tubus pod mikroskopem stereoskopowym i view w małym (50x) powiększeniu.
  7. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usuń odczynnik do odzyskiwania i natychmiast przystąp do utrwalania (krok 3).

3. Utrwalenie izolowanej tkanki jelitowej i organoidów

  1. Utrwalanie metanolu
    1. Zawiesić wyizolowaną frakcję krypty/kosmków jelitowych w 10 ml i organoidy w 1 ml metanolu w temperaturze -20 °C.
    2. Inkubować krypty/kosmki/organoidy w temperaturze -20 °C w zamrażarce przez 15 minut i odwracać probówkę (probówki) co 5 minut.
    3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć metanol i dodać roztwór płuczący (1 ml dla organoidów i 10 ml dla wyizolowanych frakcji crypt/kosmków). Roztwór myjący może składać się z PBS z 1% surowicy lub PBS z 0,1% detergentem i 1% surowicy.
      UWAGA: Należy użyć surowicy tego samego gatunku, co surowica przeciwciał drugorzędowych. Na przykład, jeśli przeciwciała drugorzędowe zostały wytworzone u kozy, użyj koziej surowicy.
    5. Natychmiast odwirować krypty/kosmki/organoidy przy 1,000 x g przez 5 minut w celu osadzania.
    6. Usunąć roztwór płuczący i ponownie zawiesić krypty/kosmki/organoidy w świeżym roztworze do mycia.
    7. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
      UWAGA: Jeśli rotator probówek nie jest dostępny, należy ręcznie odwracać probówki co 5 minut, aby ponownie zawiesić izolowane kultury.
  2. Wiązanie formaldehydu/metanolu
    UWAGA: Z utrwalaczami i formaldehydem należy obchodzić się w dygestorium.
    1. Zawiesić wyizolowane krypty/kosmki w 10 ml lub organoidy w 1 ml roztworu utrwalającego o temperaturze -20 °C (9,2 ml metanolu z 800 μl roztworu formaldehydu).
    2. Utrwalić krypty/kosmki/organoidy w temperaturze -20 °C w zamrażarce przez 15 minut i odwracać probówkę co 5 minut.
    3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
    4. Usunąć formaldehyd/metanol i dodać roztwór myjący (1 ml dla organoidów lub 10 ml dla izolowanych krypt/frakcji kosmków). Roztwór myjący może składać się z PBS z 1% koziej surowicy lub PBS z 0,1% detergentu i 1% surowicy.
    5. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów.
    6. Usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić w świeżym roztworze myjącym.
    7. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
  3. Utrwalanie PFA
    UWAGA: Proszek i roztwory PFA należy obchodzić w dygestorium.
    UWAGA: W większości przypadków stosuje się 4% PFA w PBS, ale w zależności od zachowania antygenowości przeciwciał można zastosować niższe stężenia.
    1. Ponownie zawiesić izolowane granulowane krypty/kosmki w 10 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a izolowane granulowane organoidy w 1 ml 4% PFA i inkubować przez 30 minut. W obu przypadkach należy odwracać rurkę (rurki) co 10 minut.
    2. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
    3. Usunąć PFA i dodać roztwór myjący (1 ml dla organoidów i 10 ml dla izolowanych krypt/kosmków). Roztwór myjący składa się z PBS z 0,1% detergentem i 1% serum.
    4. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzania krypt/kosmków/organoidów.
    5. Usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić w świeżym roztworze myjącym.
    6. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
      UWAGA: Jeśli rotator probówek nie jest dostępny, należy ręcznie odwracać probówki co 5 minut, aby ponownie zawiesić izolowane kultury.
    7. Pobieranie antygenu (opcjonalny krok zalecany do utrwalenia PFA)
      1. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      2. Dodać 1 - 10 ml 10 mM cytrynianu sodu o pH 6,0 (podgrzanego do 80 °C) i inkubować w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
      3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      4. Dodać 1 - 10 ml świeżego 10 mM cytrynianu sodu o pH 6,0 (podgrzanego do 80 °C) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      5. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      6. Przemyć 1 - 10 ml PBS z 1% surowicą i powtórzyć dalsze 3 razy, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1,000 x g przez 5 minut) przed dodaniem świeżego roztworu do mycia.

4. Krok blokujący

  1. Przygotuj roztwór blokujący: dodaj 10% surowicy przeciwciał drugorzędowych do PBS (opcjonalnie: dodaj 0,1% detergentu).
  2. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) i usunąć supernatant.
  3. Dodać 5 - 10 ml roztworu blokującego, w zależności od wymaganej liczby próbek (patrz uwaga poniżej). Na tym etapie należy podzielić roztwór krypt/kosmków/organoidów na pojedyncze probówki (1,5 ml probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania, z których każda zawiera 0,2 - 1 ml) w celu barwienia różnymi przeciwciałami.
    UWAGA: Każda izolowana frakcja krypt/kosmków da od 5 do 10 próbek, które można wykorzystać do różnych kombinacji etykietowania w zależności od wielkości granulki. Idealnie, dla każdej próbki wymagany jest rozmiar granulki od 2 do 4 mm. Na tym etapie można łączyć różne frakcje, ponieważ krypty i kosmki można łatwo zidentyfikować (Rysunek 2).
  4. Inkubować w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym przez 1 godzinę.

5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych

  1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w PBS zawierającym 10% surowicy i 0,1% detergentu. Na próbkę z probówki mikrowirówki wymagane jest od 100 do 200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
  2. Usunąć roztwór blokujący przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut).
  3. Zawiesić krypty/kosmki/organoidy w roztworze przeciwciała pierwotnego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą rotatora probówki (20 obr./min) w celu utrzymania krypt/kosmków/organoidów w zawiesinie.
  4. Następnego dnia: Przynieś próbki z powrotem do RT na 1 godzinę na rotatorze rurowym (20 obr./min).
  5. Osadzać próbkę przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) i usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.
  6. Dodać 1 ml roztworu myjącego i ponownie zawiesić osady krypty/kosmków/organoidów.
  7. Natychmiast usunąć roztwór przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut).
  8. Dodaj 1 ml świeżego roztworu do płukania i obracaj komórki na rotatorze probówki (20 obr./min) przez 2 godziny. Roztwór płuczący należy zmieniać przez odwirowywanie co 30 minut, jak w kroku 5.7.

6. Inkubacja przeciwciał wtórnych

  1. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów) w PBS 10% surowicy i 0,1% detergentu. Potrzeba około 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych na próbkę probówki mikrowirówki.
    UWAGA: Przeciwciała o wysokim stopniu wchłaniania krzyżowego powinny być stosowane w celu zmniejszenia reaktywności przeciwciał drugorzędowych w krypcie myszy / kosmkach / organoidach.
  2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów i ponownego zawieszenia osadów w 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych.
  3. Obracaj rurki na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze RT przez 1 godzinę.
  4. Wirować przy 1,000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów i usunięcia supernatantów (niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych).
  5. Zawiesić osad w roztworze płuczącym i natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów.
  6. Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżego roztworu do płukania.
  7. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1,5 - 2 godziny, zmieniając roztwór myjący co 20 - 30 minut, jak opisano wcześniej w krokach 6.3 - 6.6.

7. Plama jądrowa

  1. Rozcieńczyć plamę jądrową w roztworze do mycia (zgodnie z protokołem producenta), takim jak DAPI lub Hoechst. Na przykład: roztwór podstawowy DAPI (20 mg/ml) rozcieńcza się w stosunku 1:10 000. Roztwór podstawowy można przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
  2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut, aby osadzać krypty/kosmki/organoidy i usunąć roztwór myjący.
  3. Ponownie zawiesić osad w roztworze barwnika jądrowego.
  4. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) z prędkością obrotową przez 10 min.
  5. Wirować przy 1,000 x g przez 5 minut, aby zagnieździć krypty/kosmki/organoidy, usunąć roztwór plamy jądrowej i ponownie zawiesić osad w roztworze do mycia.
  6. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 30 - 60 min, zmieniając roztwór myjący co 10 minut.

8. Montaż odizolowanych krypt, Villi i organoidów

  1. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut, aby osadzać krypty/kosmki/organoidy i usunąć cały roztwór do mycia.
    UWAGA: Jeśli osad się rozproszy, należy ponownie odwirować.
  2. Dodaj do granulatu 2 krople twardego podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu.
  3. Odetnij końcówkę mikropipety P200 i ostrożnie ponownie zawieś granulkę w materiale montażowym. Unikaj generowania bąbelków.
    UWAGA: Izolowane kultury organoidów są bardzo lepkie; Upewnij się, że całkowicie zawiesiłeś ponownie.
  4. Za pomocą mikropipety przenieś mieszaninę krypt/kosmków/organoidów do roztworu podłoża montażowego i dozuj w linii wzdłuż środka szkiełka mikroskopowego.
    UWAGA: Linia nie powinna być dłuższa niż szkło nakrywkowe, które ma być używane. Sprawdź za pomocą mikroskopu stereoskopowego, czy krypty/kosmki/organoidy są dobrze rozłożone na szkiełku i nie są zbrylone.
  5. Ostrożnie umieść szklankę nakrywkową na wierzchu; unikaj tworzenia bąbelków.
  6. Umieść szkiełko podstawowe w zeszycie slajdów i przechowuj przez noc w lodówce, aby nośnik montażowy zastygł przed analizą pod mikroskopem konfokalnym.
    UWAGA: Do barwienia przeciwciał myszy w tkance myszy należy użyć komercyjnego zestawu immunofluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów). Zastąp etap blokujący (sekcja 4) 10-minutowym blokiem z roztworem blokującym białka, a następnie 1-godzinną inkubacją z odczynnikiem blokującym dołączonym do zestawu. Następnie w kroku 5.8 (w środku mycia) dodać 1-godzinną inkubację z odczynnikiem wzmacniającym sygnał fluorescencyjny. Następnie użyj odczynnika z zestawu w rozcieńczalniku fluorescencyjnym (w połączeniu z tym odczynnikiem można również użyć innych przeciwciał drugorzędowych). Inkubuj jak powyżej i przejdź od kroku 6 z resztą protokołu.

9. Utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów w macierzy podłoża

UWAGA: Organoidy przeznaczone do utrwalenia i immunoznakowania, pozostając w macierzy podstawowej, zostały wygenerowane w kopułach matrycy piwnicznej na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowej płytce (jedna kopuła na studzienkę). Organoidowe kopuły macierzy podłoża poddano obróbce w 24-dołkowej płytce poprzez dodawanie i usuwanie różnych roztworów.

  1. Usuń pożywkę z dołków i dodaj utrwalacz; Pozostaw na 1 godzinę.
  2. Usuń utrwalacz i myj w PBS zawierającym 1% serum i 0,1% detergentu przez 2 godziny, zmieniając co 30 min.
  3. Usuń roztwór myjący i zablokuj w PBS 10% serum i 0,1% detergentu na 1 godzinę.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała w PBS 1% surowicy lub PBS 1% surowicy i 0,1% detergentu.
  5. Usunąć roztwór blokujący i dodać 100 - 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki.
    UWAGA: ważne jest, aby usunąć cały roztwór blokujący, aby nie rozcieńczać przeciwciał dalej.
  6. Umieścić płytkę w lodówce i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C
  7. Następnie wyjazd w RT na 1 - 2 godziny.
  8. Usunąć roztwór przeciwciał i myć przez 2 - 3 godziny, zmieniając roztwór myjący co 20 minut.
  9. Usunąć cały roztwór do przemywania i dodać 100-200 μl przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych (patrz tabela materiałów) w PBS z 1% surowicą; inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć wtórny roztwór przeciwciał i myć przez 2 godziny, zmieniając co 20 minut.
  11. Usunąć roztwór płuczący i dodać roztwór DAPI; pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyć roztworu podstawowego DAPI (20 mg/ml) rozcieńczonego w stosunku 1:10 000. Roztwór podstawowy można przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
  12. Usuń roztwór DAPI i myj przez 40 minut, zmieniając co 10 minut.
  13. Za pomocą kleszczy usuń szklane szkiełko nakrywkowe z kopułką matrycy piwnicznej i umieść na szkiełku tak, aby kopuła matrycy piwnicznej była skierowana do góry; dodaj kilka kropli podłoża montażowego, a następnie połóż na wierzchu szklane szkiełko nakrywkowe.
  14. Umieść szkiełko w zeszycie ze slajdami i pozostaw na noc w lodówce, aby nośnik montażowy stężał.

Wyniki

Izolacja tkanki jelitowej do immunoznakowania
Opisane protokoły izolacji tkanek okrężnicy i jelita cienkiego zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania i immunoznakowania mikrotubul oraz białek z nimi związanych, a nie pod kątem żywotności komórek macierzystych i generowania organoidów (Rycina 1 i Tabela 1Celem było uzyskanie frakcji krypt i kosmków, które byłyby jak najbardziej czyste (pozbawione śluzu i innych tkanek), przy jednoczesnym zminimalizowaniu kontaktu z EDTA oraz niską temperaturą, aby zachować strukturę i zapobiec depolimeryzacji mikrotubul za pomocą lodowatych roztworów, które indukują depolimeryzację wszystkich mikrotubul poza tymi stabilnymi. Rysunek 2 przedstawia przykłady obrazów frakcji 2 i 3 z wyizolowanej tkanki jelita cienkiego, przy czym frakcja 2 zawiera mieszaninę kosmków i krypt (Rycina 2A, B), podczas gdy frakcja 3 zawiera głównie krypty (Rycina 2C, D).

Fiksacja i immunoznakowanie wyizolowanej tkanki jelitowej
Poszczególne lub połączone frakcje poddano następnie procesowi fiksacji i immunoznakowania poprzez serię etapów obejmujących zastosowanie roztworów do fiksacji, detergentów, blokowanie, inkubację z przeciwciałami oraz przemywanie, a następnie zawieszono końcowy osad kosmków/krypt w medium montażowym, przeniesiono na szkiełka i przykryto szkiełkami nakrywkowymi. Obrazowanie krypt i kosmków wykonano za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Dobra konserwacja i znakowanie mikrotubul oraz aktyny zarówno w kosmkach, jak i w kryptach została osiągnięta dzięki następującym działaniom: zastosowaniu kombinacji fiksacji formaldehydem/metanolem w temperaturze -20 °C, wielokrotnego płukania w PBS zawierającym 0,1% detergentu i 1% surowicy oraz blokowania w PBS z 0,1% detergentu i 10% surowicy, a następnie inkubacji przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi, a następnie przez 2 h z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej (Rycina 3). Fiksacja formaldehydem/metanolem sprawdziła się również w przypadku znakowania +TIPs, takich jak EBs i CLIP-170, w izolowanych kryptach i kosmkach (Rycina 4). Akumulacje EB3 na końcach plus mikrotubul (znane jako komety) były widoczne w kryptach (Rycina 4A), natomiast asocjację wzdłuż sieci stabilnych mikrotubul można było zaobserwować w próbkach kosmków (Rycina 4C). Wyraźna lokalizacja CLIP-170 oraz p150Glued (podjednostka dynaktyny) była ewidentna w apikalnych n-MTOC w izolowanych kosmkach (Rycina 4B). Fiksacja zgodnie z protokołem formaldehyd/metanol nie działała konsekwentnie w przypadku lokalizacji nineiny w izolowanej tkance jelitowej przy użyciu naszego przeciwciała Pep3 przeciwko mysiej nineinie. Jednakże fiksacja metanolem w -20 °C, po której zastosowano te same roztwory do płukania i blokowania, co w przypadku formaldehydu/metanolu, pozwoliła na uzyskanie bardzo dobrej lokalizacji nineiny w izolowanych kryptach i kosmkach (Rycina 5; referencja8). Co ciekawe, choć nineina koncentruje się w apikalnych centrosomach, w niektórych komórkach w obrębie izolowanych krypt widoczna była pewna akumulacja u podstawy komórki (Rycina 5). Kwestia tego, czy wynika to z nieswoistego znakowania, czy jest konsekwencją procedury izolacji opóźniającej fiksację (a tym samym wpływająccej na konserwację), wymaga dalszych badań. Niemniej jednak, preparaty z kryptokriostatu kosmków utrwalone w metanolu (-20 °C) (patrz Rycina 3bi w8) również wykazały obecność nineiny u podstawy komórki w niektórych komórkach, co sugeruje, że nineina może również asocjować z basalną populacją mikrotubul.

Fiksacja i immunoznakowanie organoidów wyizolowanych z macierzy podstawnej
Organoidy jelita cienkiego generowano i hodowano w macierzy podstawnej przez trzy tygodnie lub dłużej (Rycina 6A; referencje6,15). Do izolacji organoidów z macierzy podstawnej zastosowano schłodzony (4 °C) roztwór do odzyskiwania komórek. Roztwór zdepolimeryzowanej macierzy podstawnej z organoidami przeniesiono do probówek i odwirowano przed fiksacją i immunoznakowaniem. Pozwoliło to na uzyskanie bardzo czystych preparatów oraz zapewniło dobry dostęp do organoidów dla poszczególnych roztworów. Zróżnicowane komórki w obrębie domen kosmków organoidu zawierają stabilne mikrotubule apikalno-bazalne; w większości przypadków były one dobrze znakowane (Rycina 6B, C), a EB1 można było dostrzec wzdłuż sieci mikrotubul (Rycina 6E; referencje13). Jednakże schłodzony roztwór do odzyskiwania komórek może prowadzić do depolimeryzacji dynamicznych mikrotubul, co w niektórych próbkach objawiało się brakiem komet EB1 (które wiążą się z końcem plus rosnących mikrotubul) w obrębie bazalnych domen krypt (Rycina 6F). W innych próbkach zachowano mikrotubule astralne (dynamiczne) (Rycina 6D). Izolacja organoidów przed fiksacją i immunoznakowaniem sprawdziła się również w przypadku białek złączy, nineiny, CLIP-170 oraz markerów komórkowych, takich jak mucyna dla komórek kubkowych i chromogranina A dla komórek enteroendokrynnych.

Fiksacja i immunoznakowanie organoidów w macierzy podstawnej
Rysunek 7 przedstawia organoid w stadium torbielkowatym (A-C) oraz we wczesnym stadium rozwoju krypt (D), oba utrwalone w formaldehydzie/metanolu i poddane immunoznakowaniu na mikrotubule oraz nineinę. Widoczne było prawidłowe zachowanie i znakowanie mikrotubul, a także znakowanie nineiny w apikalnych n-MTOC. Rysunek 8A, B przedstawia domenę krypty w 6-dniowym organoidzie utrwalonym zgodnie z protokołem z użyciem metanolu i poddanym znakowaniu na mikrotubule oraz EB1. Wyraźne zachowanie mikrotubul i komet EB1 sugeruje zachowanie dynamicznych mikrotubul.

Organoidy utrwalano i znakowano immunochemicznie, pozostawiając je w macierzy podstawnej. Wadami tej procedury mogą być słaba penetracja utrwalacza oraz uwięzienie przeciwciał w macierzy podstawnej (Rysunek 8B), choć w obu przypadkach działo się to rzadziej, gdy w utrwalaczu i/lub roztworach płuczących zastosowano 0,1% detergentu. Ponadto 4% PFA nie zapewniało dobrej konserwacji macierzy podstawnej, lecz powodowało jej rozpuszczanie, co w mniejszym stopniu występowało przy zastosowaniu 1% PFA. Z kolei utrwalanie metanolem czasami prowadziło do zapadnięcia się organoidów.

Oznakowanie niektórymi przeciwciałami, takimi jak przeciwko markerowi komórek macierzystych Lgr5 oraz markerowi komórek Panetha CD24, okazało się nieskuteczne przy zastosowaniu protokołów z 4% PFA, metanolem lub formaldehydem/metanolem. Jednakże utrwalenie organoidów w macierzy podstawowej przy użyciu 1% PFA w PBS z 0,1% detergentu w temperaturze pokojowej pozwoliło na oznakowanie zarówno Lgr5, jak i CD24 (Rysunek 9).

Ekstrakcja kosmków i krypt jelitowych; schemat blokowy; diagram procesu; technika izolacji komórek.
Rysunek 1: Izolacja kosmków i krypt jelita cienkiego. Schemat blokowy kluczowych etapów izolacji kosmków i krypt jelita cienkiego przed utrwaleniem i immunoznakowaniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy przedstawiający kosmki i krypty jelitowe, analiza frakcji, badanie struktury komórkowej.
Rysunek 2: Wyizolowane kosmki i krypty z jelita cienkiego myszy. Obrazy z mikroskopu w świetle przechodzącym przedstawiające frakcje jelitowe z widocznymi kosmkami (duże strzałki) i kryptami (małe strzałki). (A, B) Frakcja 2 zawiera mieszaninę kosmków i krypt; zachowanie morfologii kosmków i krypt jest widoczne na obrazie B. (C, D) Frakcja 3 wykazuje izolację krypt oraz brak kosmków, a na obrazie C widoczne są nienaruszone krypty, w tym krypta rozwidlona. Paski skali = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat jelita cienkiego; różnicowanie komórek kosmka i krypty; mikroskopia, barwienie aktyny MT.
Rycina 3: Izolowany kosmek i krypta jelita cienkiego utrwalone w formaldehydzie/metanolu i znakowane immunochemicznie pod kątem mikrotubul i aktyny. (A) Schemat nabłonka kosmka i krypty z zaznaczonymi różnymi typami komórek. Wyróżnione ramki wskazują reprezentatywne obszary zobrazowane w częściach B oraz C. (B, C) Konfokalne przekroje optyczne przez fragment kosmka (B) i podstawy krypty (C) izolowanych z jelita cienkiego przy użyciu 30 mM EDTA i utrwalonych w formaldehydzie/metanolu, przemytych w PBS zawierającym 1% surowicy koziej i 0,1% detergentu, blokowanych w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz znakowanych pod kątem mikrotubul za pomocą szczurzego przeciwciała monoklonalnego anty-tubuliny (kolor zielony) i pod kątem aktyny za pomocą króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-β-aktyny (kolor czerwony). W komórkach kosmka i krypty widoczne są dobrze zachowane pęczki mikrotubul w osi apikalno-bazalnej, a aktyna jest skoncentrowana w regionie apikalnym skierowanym w stronę światła jelita (strzałka). Paski skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia immunofluorescencyjna, MT, barwienie EB3 i DAPI, krypta i kosmek jelitowy, struktura komórkowa.
Rysunek 4: Izolowane krypty i kosmki jelita cienkiego utrwalone w formaldehydzie/metanolu i oznakowane immunochemicznie pod kątem mikrotubul, EB3, p150Glued oraz CLIP-170. Konfokalne przekroje optyczne obszarów krypt i kosmków izolowanych z jelita cienkiego przy użyciu 30 mM EDTA i utrwalonych w formaldehydzie/metanolu, przemytych w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, blokowanych w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz oznakowanych immunochemicznie. (A) Krypta oznakowana króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko α-tubulinie (czerwony) i szczurzym monoklonalnym przeciwciałem EB3KT36 (zielony) oraz barwiona na DNA za pomocą DAPI (niebieski), wykazująca mikrotubule apiko-bazalne i komety EB3. Odwrócony obraz jednokanałowy wyraźnie pokazuje komety EB3 w komórkach bazalnych krypty, co sugeruje dobrą konserwację zarówno dynamicznych, jak i stabilnych mikrotubul. (B) Komórki nabłonkowe kosmków oznakowane króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko CLIP-170 (czerwony, patrz również referencja16) oraz mysim monoklonalnym przeciwciałem przeciwko p150Glued (zielony), wykazujące ko-lokalizację apikalną. Poniżej przedstawiono odwrócone obrazy jednokanałowe. (C) Komórki kosmków oznakowane króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciwko α-tubulinie (czerwony) i szczurzym monoklonalnym przeciwciałem EB3-KT36 (zielony) oraz barwione na DNA za pomocą DAPI (niebieski), wykazujące mikrotubule apiko-bazalne z EB3 wzdłuż sieci. Asocjacja EB3 z siecią została podkreślona na powiększonym obrazie, natomiast odwrócony obraz jednokanałowy sugeruje obecność zarówno komet EB3, jak i asocjację z siecią. Paski skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna obrazuje nineinę, E-kadherynę i DAPI w przekroju tkanki komórkowej kręgowca.
Rysunek 5: Izolowana krypta jelita grubego utrwalona w metanolu, oznakowana immunologicznie przeciwciałami przeciwko nineinie i E-kadherynie oraz barwiona DAPI. Konfokalny przekrój optyczny regionu podstawnego i regionu amplifikacji tranzycyjnej krypty izolowanej z jelita grubego przy użyciu 3 mM EDTA i utrwalonej w metanolu, przemytej w PBS zawierającym 1% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz zablokowanej w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu. Kryptę oznakowano króliczymi poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko nineinie (Pep3, patrz również referencja8, kolor czerwony) oraz mysimi monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko E-kadherynie (kolor zielony) i barwiono DAPI (kolor niebieski). Odwrócony obraz pojedynczego kanału pokazuje wyłącznie nineinę. Obraz przedstawia dobrze zachowaną kryptę, w której E-kadheryna ujawnia obrys poszczególnych komórek, a nineina jest skoncentrowana w apikalnych centrosomach. Sugeruje to dobrą penetrację utrwalacza i przeciwciał oraz zachowanie antygenowości. Pasek skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Etapy rozwoju organoidów; obrazy mikroskopowe agregatów komórkowych, formowania pączków, domen krypt i kosmków.
Rysunek 6: Rozwój organoidów, fiksacja i immunoznakowanie wyizolowanych organoidów. (A) Obrazy w kontraście fazowym przedstawiające różne etapy rozwoju organoidów: od agregatów komórkowych, przez cysty z inicjacją pączkowania, aż po w pełni uformowane organoidy z domenami krypt i kosmków. (B-F) Konfokalne przekroje optyczne przez organoidy wyizolowane z macierzy podstawowej przy użyciu roztworu do odzyskiwania komórek w 4 °C (10 min), a następnie poddane fiksacji formaldehydem/metanolem, przemyciu w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, blokowaniu w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz immunoznakowaniu na mikrotubule, β-catenin i EB1. (B) Cysta organoidowa znakowana na mikrotubule (niebieski) i β-catenin (czerwony), wykazująca dobrą konserwację i znakowanie mikrotubul w większości komórek. (C) Wyraźne mikrotubule apikalno-bazalne są widoczne w tych powiększonych komórkach nabłonkowych z cysty organoidowej. (D) Komórki w podziale znakowane na mikrotubule, ukazujące wrzeciona, w tym mikrotubule astralne (dynamiczne) (strzałka). (E, F) Regiony organoidów: domena kosmków (E) i domena krypt (F), wykazujące częściowe znakowanie EB1 wzdłuż sieci stabilnych mikrotubul, szczególnie w kosmkach, podczas gdy bardzo niewiele komet EB1 jest widocznych nawet w bazalnych kryptach, co sugeruje, że mikrotubule dynamiczne nie zostały zachowane. Paski skali = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza cyst organoidalnych, barwienie na ninein i mikrotubule, mikroskopia fluorescencyjna, biologia rozwoju.
Rycina 7: Organoidy utrwalone w macierzy podstawowej w formaldehydzie/metanolu i immunoznakowane pod kątem mikrotubul oraz nineina. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalonych w formaldehydzie/metanolu, przemytych i blokowanych w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, a następnie znakowanych z zachowaniem macierzy podstawowej. (A-C) Cysta organoidalna znakowana pod kątem mikrotubul (zielony) i nineina (Pep3; referencja8, czerwony) oraz barwiona DAPI (niebieski), gdzie A przedstawia obraz złożony, a B i C inwersyjne obrazy pojedynczych kanałów dla mikrotubul i nineina. Obrazy pokazują apikalno-bazalną lokalizację mikrotubul oraz apikalną lokalizację nineina, co sugeruje bardzo dobrą konserwację strukturalną organoidu oraz skuteczną penetrację przeciwciał, a także wypłukanie niezwiązanych przeciwciał. (D, E) Organoid z rozwijającą się kryptą, utrwalony i znakowany jak powyżej, ponownie wykazujący doskonałą konserwację strukturalną, znakowanie i wypłukanie przeciwciał. Wyraźna apikalno-bazalna lokalizacja mikrotubul oraz apikalna lokalizacja nineina w n-MTOC jest widoczna i podkreślona na powiększonym obrazie (E) obszaru zaznaczonego ramką w D. Paski skali = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Struktura domeny krypty organoidu, mikroskopia fluorescencyjna, macierz Matrigel, wizualizacja markerów komórkowych.
Rysunek 8: Organoidy utrwalone w macierzy podstawnej w metanolu i znakowane immunochemicznie pod kątem mikrotubul oraz EB1. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalonych w metanolu, przemytych i blokowanych w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, a następnie znakowanych, podczas gdy pozostawały one w macierzy podstawnej. (A) Domena cysty z w pełni rozwiniętego organoidu znakowana króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-α-tubulina (czerwony) i mysim monoklonalnym przeciwciałem anty-EB1 (zielony), wykazująca mikrotubule apiko-bazalne, wrzeciona (strzałka) w dwóch dzielących się komórkach oraz wyraźne komety EB1. Widoczne jest pewne uwięzienie niezwiązanych przeciwciał EB1. Niemniej jednak zaobserwowano dobrą konserwację strukturalną oraz znakowanie mikrotubul i EB1. Obecność komet EB1 sugeruje, że zachowano dynamiczne mikrotubule (A, obraz odwrócony). (B) Odwrócony obraz regionu cysty organoidu wykazujący znakowanie przeciwciałem anty-α-tubulina z wyraźną obecnością przeciwciał uwięzionych w otaczającej macierzy podstawnej (strzałka). Paski skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji CD24, kontrast fazowy, porównanie immunobarwienia, badanie struktury komórkowej.
Rycina 9: Organoidy utrwalone w macierzy podstawowej w 1% PFA i oznakowane immunochemicznie pod kątem Lgr5 i CD24. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalonych w macierzy podstawowej w 1% PFA w PBS zawierającym 0,1% detergentu, przemytych w PBS z 1% surowicą kozią i 0,1% detergentu oraz znakowanych przeciwciałami przeciwko Lgr5 i CD24. (A, B) Nisza komórek macierzystych w obrębie domeny krypty wykazująca komórki Panetha dodatnie dla CD24 (czerwony). Obrazy konfokalne i kontrastowe fazowe zostały nałożone na siebie w A. B przedstawia pojedynczy kanał znakowania CD24. (C) Region komórek macierzystych w obrębie domeny krypty wykazujący komórkę macierzystą dodatnią dla Lrg5. Paski skali = 10 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela z harmonogramem frakcjonowania komórek; przedstawiono etapy wirowania, stosowania EDTA i PBS w ciągu 40 min.
Tabela 1: Harmonogram izolacji i utrwalania krypt oraz kosmków jelita cienkiego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Izolacja tkanki jelitowej
Izolacja krypt i kosmków jelita cienkiego oraz krypt okrężnicy polega na odsłonięciu powierzchni błony śluzowej, potraktowaniu roztworem EDTA w celu rozluźnienia kontaktów komórkowych, frakcjonowaniu (wstrząsaniu) i odwirowaniu. Przedstawiony protokół izolacji kosmków jelitowych/krypty został zmodyfikowany na podstawie Belshaw i wsp. oraz Whiteheada i wsp.17,18

Odsłanianie powierzchni błony śluzowej
Eksperymentowaliśmy z wieloma podejściami do odsłonięcia powierzchni błony śluzowej przewodu pokarmowego podczas opracowywania tej procedury. Klasycznym podejściem jest wywrócenie rurki (odwrócenie jej na lewą stronę), zwykle w segmentach o długości około 100 mm, za pomocą metalowego pręta, który jest chwytany w fałdzie tkanki na jednym końcu, a następnie pozostała rurka nasunięta na rurkę19. W przypadku tkanek myszy idealny jest metalowy pręt (średnica 2,4 mm) z zaokrąglonymi końcami. Takie podejście ma tę zaletę, że rozszerza powierzchnię błony śluzowej, umożliwiając lepszy dostęp do PBS i EDTA. Początkowo stosowaliśmy to podejście, ale przeszliśmy do cięcia rurki na krótkie odcinki (około 5 cm) i otwierania każdej sekcji nożyczkami preparacyjnymi, ponieważ okazało się to łatwiejsze. Takie podejście jest odpowiednie, jeśli wymaganych jest tylko kilka jelit; ale jeśli w eksperymencie miałoby zostać użytych więcej zwierząt, to specjalnie skonstruowane urządzenie do rozcinania rurki wzdłużnie, jak opisali Yoneda i wsp.14 byłoby bardziej efektywne.

Oderwanie kosmków i krypt od warstwy mięśniowej
Początkowo zastosowaliśmy 3 mM EDTA w PBS i stosunkowo długi czas inkubacji do 60 minut, aby rozluźnić powierzchnię błony śluzowej z leżącej poniżej tkanki17,18. Przy tym stężeniu EDTA stwierdziliśmy, że czas inkubacji wynoszący 30 minut był wystarczający do rozluźnienia krypt z okrężnicy myszy. Jednak w przypadku izolacji krypty/kosmków jelita cienkiego próbowaliśmy użyć bardziej skoncentrowanego EDTA przez krótszy czas, co okazało się skutecznym podejściem. Wszystkie późniejsze prace przeprowadzono z tkanką ekstrahowaną przy użyciu techniki 30 mM EDTA, generując odpowiednie frakcje dla kosmków lub krypt. W przypadku krypt zwykle łączymy frakcje 3 - 5 przed ustaleniem, ale ważne jest, aby sprawdzić, czy są to odpowiednie frakcje, ponieważ czas będzie zależał od wielu czynników, takich jak pozycja wzdłuż przewodu pokarmowego, wiek myszy, stan zapalny, poprzednia dieta itp. Podobnie, czas trwania wstrząsu tkanki po leczeniu EDTA, aby był skuteczny, może się różnić w różnych warunkach. Wynikiem są izolowane frakcje tkankowe zawierające mieszaninę kosmków i krypt lub głównie kosmków lub krypt (ryc. 2). Ponieważ w okrężnicy nie ma kosmków, ekstrakcja krypty może być możliwa do osiągnięcia w jednym kroku, potrząsając tkanką w probówce przez 30 sekund. Frakcje te można następnie utrwalić i przetworzyć w celu znakowania immunologicznego.

Izolacja organoidów jelitowych z macierzy podstawnej
Izolację organoidów z kopuł macierzy piwnicznej można osiągnąć za pomocą roztworu do odzyskiwania komórek. Roztwór działa poprzez depolimeryzację zżelowanej matrycy podstawowej, ale temperatura musi wynosić 2 - 8 °C. Należy pamiętać, że dynamiczne mikrotubule mogą nie zostać zachowane. W związku z tym w przypadku znakowania immunologicznego dynamicznych mikrotubul i +TIP, takich jak komórka EBs, nie zaleca się odzyskiwania z macierzy podstawowej przed utrwaleniem. Jednak większość mikrotubul w różnicujących się komórkach organoidowych jest stosunkowo stabilna i zostały one zachowane (ryc. 6). Sprawdził się również w przypadku znakowania immunologicznego białek centrosomalnych i złączowych, a także markerów komórkowych.

Protokoły fiksacji
Formaldehyd (świeżo wyprodukowany z PFA) jest stosunkowo szybko działającym utrwalaczem, który tworzy odwracalne wiązania krzyżowe, a 4% PFA działa dobrze na przykład w mikrotubulach znakujących immunologicznie i gamma-tubulinie oraz barwieniu filamentów aktynowych falloidyną. Bardziej rozcieńczone roztwory PFA, takie jak 1%, działały dobrze w przypadku znakowania immunologicznego, na przykład z markerami komórek macierzystych Lgr5 i markerem komórek Panetha CD24 w niszy krypt komórek macierzystych, podczas gdy wyższe stężenia PFA nie działały.

Dodatek aldehydu glutarowego zapewnia lepszą konserwację mikrotubul, a tak zwane wiązanie PHEMO, które składa się z mieszaniny 3,7% PFA, 0,05% aldehydu glutarowego i 0,5% detergentu w buforze PHEMO (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA i 3 mM MgCl2)2 zapewnia doskonałe zachowanie mikrotubul bez uszczerbku dla antygenowości. Działa również dobrze do znakowania immunologicznego gamma-tubuliny, β-kateniny i E-kadheryny oraz barwienia filamentów aktynowych falloidyną. Jednak w hodowlach tkanek 3D i organoidów utrwalanie PHEMO dawało niespójne wyniki i dlatego nie było stosowane.

Metanol jest utrwalaczem koagulantu, który zapewnia stosunkowo dobrą penetrację i ma tendencję do zachowywania antygenowości. Utrwalanie 100% metanolem (-20 °C) wprowadza pewien skurcz, zapewnia umiarkowane zachowanie morfologii i działa w przypadku mikrotubul, +TIP i wielu przeciwciał centrosomalnych, w tym dzieniny, w hodowlach komórkowych 2D. Jednak niektóre organoidy zapadły się podczas stosowania tej metody utrwalania. Ponadto przenikanie przeciwciał przez całe krypty, kosmki lub organoidy było początkowo problemem, ale dodanie 0,1% detergentu do roztworu myjącego i długotrwałe mycie przyniosło lepsze wyniki.

Kombinacja formaldehydu i metanolu była wcześniej stosowana przez Rogersa i wsp.20 do znakowania immunologicznego EB1 u Drosophila. W związku z tym opracowano protokół utrwalania oparty na mieszaninie formaldehydu i metanolu dla tkanek jelitowych i organoidów na bazie 3% formaldehydu i 97% metanolu schłodzonego do temperatury -20 °C, ale z pominięciem 5 mM węglanu sodu w mieszaninie użytej przez Rogersa i wsp. 20 Ponadto próbki utrwalono w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Zadziałało to szczególnie dobrze w przypadku znakowania immunologicznego +TIP, takich jak CLIP-170 i EBs, ale okazało się również doskonałe do utrwalania i znakowania immunologicznego mikrotubul i aktyny w tkankach i organoidach 3D. Widoczne było bardzo dobre zachowanie strukturalne i antygenowość została zachowana dla kilku białek cytoszkieletu i związanych z nimi, a także białek centrosomalnych, takich jak gamma-tubulina i nineina, chociaż znakowanie dziewiątki działało bardziej konsekwentnie z wiązaniem metanolu.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Paulowi Thomasowi za porady i pomoc w zakresie mikroskopu. Prace te były wspierane przez BBSRC (grant nr. BB/J009040/1 do M.M.M. i T.W.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaD8537-500MLmycie i
roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253izolować organoidy
probówki do mikrowirówek lobindEppendorf30108116zapobiegać przywieraniu komórek
0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0Sigma03690-100MLIzolacja krypty
70 μ m sitko komórkoweFisher Scientific 11517532Izoluj krypty z kosmków
Triton X-100SigmaT8787detergentowa
surowica koziaSigmaG6767Środek blokujący
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigmastosowana jako środek nieprzywierający
Paraformaldehyd, 4% wutrwalaczu
PBS Alfa Aesar J61899Roztwór formaldehydu (36,5– 38% w H2O)SigmaF8775stosowany jako utrwalacz
Metanol 99,9% klasy analitycznejFisherM/4000/17stosowany jako utrwalacz
Mysz MaxFluor na myszy Zestaw do wykrywania immunofluorescencjiMaxvision
Biosciences		MF01-S; w celu zmniejszenia niespecyficznego znakowania
Rotator SB2 lub SB3Stuartrotator probówki mikrowirówki
Pobieranie antygenucytrynianu
HydromountNational DiagnosticsHS-106mocowanie
DABCO - 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanowyśrodek zapobiegający blaknięciuSigmaD27802
Trwały dodatnio naładowany, wstępnie umyty, 90 stopni szlifowane krawędziePrzejrzystośćSzkiełkaN / C366
Szkiełko nakrywkowe - grubość nr 1, 22 x 50 mmKlarownośćNQS13/2250szkiełka nakrywkowe
MatrigelCorning356231Matryca podstawowa do hodowli organoidów 3D
Probówki stożkowe 50 mlSarstedt62.547.254do przetwarzania tkanek/organoidów
Probówki stożkowe 15 mlSarstedt62.554.502do przetwarzania tkanek/organoidów
1,5 ml Probówki LoBindEppendorf30108051dla izolowanych organoidów
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-E-kadherynyBD Biosciences610181przeciwciało pierwszorzędowe 1:500
Przeciwciało monoklonalne antytubuliny YL1/2 szczuraPrzeciwciało pierwszorzędoweAbcamab6160
Przeciwciało alfa-tubuliny królikaAbcamab15246przeciwciało pierwszorzędowe 1:100
Przeciwciało anty-beta-aktyny królikaAbcamab8227przeciwciało pierwszorzędowe 1:100
Przeciwciało monoklonalne anty-p150 SzczurPrzeciwciało pierwszorzędoweBD Bioscience610473/4
Przeciwciało monoklonalne EB3KT36 szczuraPrzeciwciało pierwszorzędoweAbcamab53360
Mysie przeciwciało monoklonalne EB1Przeciwciało pierwszorzędowe610535 Bioscience
Przeciwciało królika anty-Lgr5AbgentAP2745dprzeciwciało pierwszorzędowe 1:100
Dylight anty-szczur 488Jackson112545167przeciwciało seconday 1:400
Dylight anti-mouse 488JacksonST115545166seconday przeciwciało 1:400
Dylight anti-rabbit 647Jackson111605144seconday przeciwciało 1:400
PFA sodu 1:100 1:100 1:200 1:200

Bibliografia

  1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
  2. Bellett, G., et al. Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).
  3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
  4. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila. J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).
  5. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Curr Opin Cell Biol. , (2016).
  6. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  7. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  8. Goldspink, D. A., et al. Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres. Open Biol. 7 (2), (2017).
  9. Verissimo, C. S., et al. Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening. Elife. 5, (2016).
  10. Young, M., Reed, K. R. Organoids as a Model for Colorectal Cancer. Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).
  11. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  12. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  13. Goldspink, D. A., et al. The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation. Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).
  14. Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J Vis Exp. (105), e53042(2015).
  15. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  16. Coquelle, F. M., et al. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).
  17. Belshaw, N. J., et al. Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa. Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).
  18. Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).
  19. Hamilton, K. L., Butt, A. G. Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice. Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).
  20. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znakowanie immunofluorescencyjnelokalizacja mikrotubultkanka ex vivofiksacja formaldehydem i metanolemmikroskopia konfokalnapenetracja przeciwciałizolacja organoidówzachowanie mikrotubul
Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.