Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Tworzenie nabłonka o polaryzacji apico-bazalnej jest podstawowym procesem rozwoju i obejmuje radykalną reorganizację mikrotubul i białek centrosomalnych. Promieniowa matryca mikrotubul wychodząca z centralnie umieszczonego centrosomalnego centrum organizowania mikrotubul (MTOC) jest widoczna w wielu komórkach zwierzęcych i dobrze nadaje się do stosunkowo płaskich komórek. Natomiast komórki nabłonka walcowatego, takie jak komórki jelita, gromadzą niepromieniowe transkomórkowe układy mikrotubul, które lepiej wspierają kształt i wyspecjalizowane funkcje tych komórek. Ta radykalna reorganizacja mikrotubul jest osiągana poprzez przemieszczanie się centrosomu do wierzchołka i tworzenie wierzchołkowych niecentrosomalnych MTOC (n-MTOCs), które stają się odpowiedzialne za zakotwiczenie transkomórkowych mikrotubul^1,2,3,4,5.

Duża część naszej wiedzy na temat różnicowania nabłonka i związanej z tym reorganizacji mikrotubul pochodzi z badań warstw komórkowych 2D in vitro, które nie wykazują architektury tkankowej in vivo. Rozwój 3D kultur organoidowych in vitro, zapoczątkowany przez Cleversa i współpracowników⁶, stanowi duży postęp technologiczny, ponieważ naśladują one architekturę i rozwój in vivo. Hierarchia różnicowania nabłonka jest widoczna w jelicie; Komórki macierzyste na dnie krypt powodują powstawanie niedojrzałych komórek amplifikujących tranzyt, które namnażają się i stopniowo różnicują podczas migracji w górę krypty na kosmki jelita cienkiego lub powierzchnię okrężnicy, gdzie stają się w pełni zróżnicowane przed wydaleniem do lumen⁷. Co ważne, jest to replikowane w organoidach jelitowych, w których komórki z niszy komórek macierzystych namnażają się, tworząc torbiele, które następnie generują pąki przypominające krypty z komórkami macierzystymi na dole i różnicowaniem stopniowo postępującym w kierunku obszaru torbieli, który staje się podobny do kosmków⁸. Organoid jelitowy stanowi zatem potężny model do badania nie tylko mikrotubul i reorganizacji centrosomalnej podczas różnicowania nabłonka, ale także wielu innych białek, a także stanowi idealną platformę do badań przesiewowych leków i związków spożywczych o potencjalnych korzyściach terapeutycznych9^,10.

Organoidy dobrze nadają się do obrazowania na żywo białek znakowanych fluorescencyjnie, a zarówno organoidy typu knock-in, jak i knock-out mogą być generowane za pomocą edycji genów CRISPR/Cas9^11,12. Jednak ustalenie ekspresji i lokalizacji endogennych białek, które mają być badane, jest ważne, zwłaszcza w celu zweryfikowania zachowania oznakowanych białek. Znakowanie immunologiczne organoidów 3D hodowanych w macierzy podstawowej lub tkance izolowanej ex vivo jest bardziej złożone niż komórki hodowane na szalkach hodowlanych w 2D. Protokół utrwalania musi zachować delikatną architekturę 3D organoidów, jednocześnie zachowując antygenowość przeciwciał (tj. epitopy do wiązania przeciwciał). Na przykład 4% paraformaldehyd (PFA) jest powszechnie stosowany jako utrwalacz, ale chociaż jest to stosunkowo szybko działający utrwalacz i zapewnia dobre zachowanie morfologiczne, z naszego doświadczenia wynika, że często powoduje utratę antygenowości i nie jest odpowiedni dla wielu przeciwciał centrosomalnych. Należy również wziąć pod uwagę zdolność utrwalacza i przeciwciał do przenikania do struktur i tkanek 3D. W tym celu zmodyfikowaliśmy i opracowaliśmy protokoły izolacji tkanek i pośredniego znakowania immunologicznego organoidów 3D in vitro i izolowanej ex vivo tkanki jelitowej. Opisujemy, jak wyizolować krypty i kosmki jelita cienkiego oraz tkankę okrężnicy, a także dołączamy protokół izolacji organoidów 3D jako alternatywę dla utrwalania i znakowania immunologicznego w macierzy podstawnej. Przedstawiamy trzy alternatywne protokoły utrwalania do znakowania immunologicznego mikrotubul i białek centrosomalnych, takich jak nineina oraz białka śledzące plus-end mikrotubul (+TIP), takie jak białka EB i CLIP-170 (patrz również referencje^8,13). Omawiamy również zalety i wady związane z każdym protokołem.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Wschodniej Anglii dotyczącymi licencji instytucjonalnych.

1. Izolacja tkanki jelitowej

1. Izolacja krypt okrężnicy w celu znakowania immunologicznego (patrz Rysunek 1, schemat)
   1. Poddaj mysz eutanazji (za pomocą uduszenia CO₂ ) i usuń okrężnicę (zaczynając od kątnicy i usuwając doogonowo) za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety¹⁴.
   2. Przepłukać zawartość jelita grubego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką. PBS: chlorek sodu (8,0 g/l), chlorek potasu (0,2 g/l), wodorofosforan disodowy (1,15 g/l) i diwodorofosforan potasu (0,2 g/l) o pH 7,3.
   3. Za pomocą metalowego pręta (średnica 2,4 mm) lub końcówki szklanej pipety przytrzymaj jeden koniec rurki okrężnicy, delikatnie przesuwając tkankę po pręciku/pipecie, odcinając w ten sposób tkankę okrężnicy, tak aby nabłonek znalazł się teraz na zewnątrz.
      UWAGA: Jeśli nie jest to możliwe, otwórz okrężnicę nożyczkami i pokrój na 5 mm kawałki.
   4. Przenieś okrężnicę lub kawałki jelita grubego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml PBS.
   5. Odwróć rurkę kilka razy, aby dodatkowo usunąć zawartość jelit, śluz itp.
   6. Przenieść okrężnicę/kawałki do 40 ml 3 mM EDTA w PBS i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 min.
      UWAGA: Rozcieńczyć 0,5 M EDTA pH 8,0 PBS.
   7. Wstrząsnąć w celu usunięcia śluzu i przenieść okrężnicę/kawałki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej świeże 40 ml 3 mM EDTA w PBS. Inkubować przez 35 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przenieś okrężnicę/kawałki do 10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i energicznie wstrząsaj przez 30 sekund, aby uwolnić krypty (frakcję krypty).
   9. Wyjmij okrężnicę/kawałki z probówki i umieść z powrotem w 3 mM EDTA na wypadek, gdyby wymagana była dalsza izolacja. Odwirować pozostałą frakcję krypty przy sile 300 x g przez 5 minut.
   10. Usunąć 5 ml supernatantu i ponownie zawiesić osad krypty w pozostałej objętości 5 ml.
   11. Obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym z zoomem (powiększenie 50 - 100x), aby sprawdzić, czy nie ma krypt okrężnicy.
       UWAGA: Jeśli nie ma żadnych krypt, inkubuj dwukropek/kawałki w 3 mM EDTA w PBS przez kolejne 30 minut, a następnie powtórz kroki 1.1.8 - 1.1.11.
   12. Odwirować frakcję krypty przy 300 x g przez 5 min.
   13. Usunąć cały supernatant w celu uzyskania osadu kryptowego i natychmiast przystąpić do utrwalania (sekcja 3).
2. Izolacja krypt i kosmków jelita cienkiego do znakowania immunologicznego (Rysunek 2)
   1. Poddać mysz eutanazji (za pomocą uduszenia CO₂) i usunąć jelito cienkie (od proksymalnej dwunastnicy do końcowego odcinka jelita krętego) za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety¹⁴.
      UWAGA: Aby wyświetlić różne odcinki jelita cienkiego, na tym etapie oddziel je i traktuj osobno. Zobacz Rysunek 1 i Tabela 1 dla diagramu przepływu i czasów.
   2. Przepłukać zawartość jelita cienkiego PBS za pomocą szklanej pipety z gumową gruszką.
   3. Rozciąć jelito cienkie nożyczkami do preparowania i umieścić w 15 ml PBS na szalce Petriego.
   4. Delikatnie umyj jelito w PBS, aby usunąć zawartość światła, nie uszkadzając jednocześnie powierzchni błony śluzowej. Przenieś tkankę na świeżą szalkę Petriego i powtórz płukanie PBS.
   5. Pociąć jelito na 3-5 mm kawałki i przenieść na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 15 ml 30 mM EDTA w PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie inkubować w 3 mM EDTA w PBS przez 30 minut.
   6. Frakcja 1 (izolacja kosmków): Przenieść kawałki jelita do 10 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, energicznie wstrząsać przez 10 s i przelać na 100 mm szalkę Petriego. Sprawdź frakcję izolowanych kosmków pod mikroskopem stereoskopowym. Na tym etapie powinny być obecne głównie kosmki, ale może się to różnić w zależności od izolacji.
      UWAGA: Aby zapobiec przywieraniu izolowanych kosmków/krypt do plastiku, szalki Petriego i probówki zbiorcze powinny być wstępnie pokryte płodową surowicą bydlęcą (FBS). Wlej FBS do naczyń i/lub probówek i natychmiast go wyjmij. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przewodnikami dotyczącymi czasu dla każdej frakcji.
   7. Przenieś kawałki jelita z powrotem do 30 mM EDTA w PBS i inkubuj przez 5 minut. Podczas tej inkubacji zebrać frakcję 1 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (wstępnie pokrytej FBS) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
   8. Frakcja 2: Przenieść kawałki jelita do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml PBS, energicznie wstrząsać przez 20 s, a następnie przelać na 100 mm szalkę Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Zazwyczaj na tym etapie obecna jest mieszana kultura kosmków i krypt (Rysunek 2A).
   9. Przenieś kawałki jelita z powrotem do 30 mM EDTA w PBS i inkubuj przez kolejne 5 minut. Podczas tej inkubacji osad frakcji 2 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (wstępnie pokrytej FBS) o sile 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant z frakcji 1 i 2 bez naruszania osadu i natychmiast przystąpić do utrwalania (krok 3).
   10. Frakcja 3 (izolacja krypty): Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS w probówce o pojemności 50 ml, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Na tym etapie frakcja będzie zawierała głównie krypty (Rysunek 2B).
   11. Frakcja 4: Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Na tym etapie powinny być obecne tylko krypty.
   12. Frakcja 5: Przenieś kawałki jelita do 10 ml PBS, wstrząsaj przez 20 s i wlej do 100 mm szalki Petriego. Sprawdź frakcję pod mikroskopem. Zazwyczaj na tym etapie wydobywa się bardzo niewiele krypt. Jeśli wyodrębnionych zostanie więcej niż kilka krypt, kontynuuj z 6^{. frakcją}.
       UWAGA: Jeśli pożądana jest czysta populacja krypty (na przykład do generowania organoidów), należy użyć sitka komórkowego o wielkości 70 μm, aby usunąć wszelkie nienaruszone kosmki z frakcji wzbogaconej w kryptę.
   13. Zebrać frakcje 3 - 5 w oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
   14. Sprawdzić osady frakcji 3 - 5 i usunąć supernatanty bez naruszania osadów, a następnie natychmiast przystąpić do utrwalania (sekcja 3).

2. Izolacja organoidów jelitowych z kopuł macierzy podłoża w płytkach 24-dołkowych

UWAGA: Powstawanie organoidów w kopułach macierzy piwnicznych zostało opisane gdzie indziej¹².

1. Przykryj studzienki kopułą macierzystą piwnicy zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Studnie zawierające kopuły z matrycą piwniczną należy przepłukać 500 μl PBS.
3. Dodać zimne 250 μl roztworu do odzyskiwania komórek (4 °C) do każdej studzienki (patrz Tabela Materiałów).
   UWAGA: Roztwór do odzyskiwania zimnych komórek zdepolimeryzuje wszystkie mikrotubule z wyjątkiem stabilnych.
4. Zeskrob kopuły matrycy piwnicy za pomocą mikropipety P1000 i ostrożnie pipetuj w górę iw dół w całej studzience, aby rozbić i usunąć matrycę piwniczną z plastiku.
5. Zebrać supernatant w probówkach wirówkowych o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,5 ml.
6. Odwróć kilkakrotnie probówkę o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml i sprawdź pod mikroskopem, czy organoidy zostały wyizolowane i poruszają się swobodnie, a nie w grudkach. Trzymaj tubus pod mikroskopem stereoskopowym i view w małym (50x) powiększeniu.
7. Osadzać organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usuń odczynnik do odzyskiwania i natychmiast przystąp do utrwalania (krok 3).

3. Utrwalenie izolowanej tkanki jelitowej i organoidów

1. Utrwalanie metanolu
   1. Zawiesić wyizolowaną frakcję krypty/kosmków jelitowych w 10 ml i organoidy w 1 ml metanolu w temperaturze -20 °C.
   2. Inkubować krypty/kosmki/organoidy w temperaturze -20 °C w zamrażarce przez 15 minut i odwracać probówkę (probówki) co 5 minut.
   3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
   4. Usunąć metanol i dodać roztwór płuczący (1 ml dla organoidów i 10 ml dla wyizolowanych frakcji crypt/kosmków). Roztwór myjący może składać się z PBS z 1% surowicy lub PBS z 0,1% detergentem i 1% surowicy.
      UWAGA: Należy użyć surowicy tego samego gatunku, co surowica przeciwciał drugorzędowych. Na przykład, jeśli przeciwciała drugorzędowe zostały wytworzone u kozy, użyj koziej surowicy.
   5. Natychmiast odwirować krypty/kosmki/organoidy przy 1,000 x g przez 5 minut w celu osadzania.
   6. Usunąć roztwór płuczący i ponownie zawiesić krypty/kosmki/organoidy w świeżym roztworze do mycia.
   7. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
      UWAGA: Jeśli rotator probówek nie jest dostępny, należy ręcznie odwracać probówki co 5 minut, aby ponownie zawiesić izolowane kultury.
2. Wiązanie formaldehydu/metanolu
   UWAGA: Z utrwalaczami i formaldehydem należy obchodzić się w dygestorium.
   1. Zawiesić wyizolowane krypty/kosmki w 10 ml lub organoidy w 1 ml roztworu utrwalającego o temperaturze -20 °C (9,2 ml metanolu z 800 μl roztworu formaldehydu).
   2. Utrwalić krypty/kosmki/organoidy w temperaturze -20 °C w zamrażarce przez 15 minut i odwracać probówkę co 5 minut.
   3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
   4. Usunąć formaldehyd/metanol i dodać roztwór myjący (1 ml dla organoidów lub 10 ml dla izolowanych krypt/frakcji kosmków). Roztwór myjący może składać się z PBS z 1% koziej surowicy lub PBS z 0,1% detergentu i 1% surowicy.
   5. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów.
   6. Usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić w świeżym roztworze myjącym.
   7. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
3. Utrwalanie PFA
   UWAGA: Proszek i roztwory PFA należy obchodzić w dygestorium.
   UWAGA: W większości przypadków stosuje się 4% PFA w PBS, ale w zależności od zachowania antygenowości przeciwciał można zastosować niższe stężenia.
   1. Ponownie zawiesić izolowane granulowane krypty/kosmki w 10 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a izolowane granulowane organoidy w 1 ml 4% PFA i inkubować przez 30 minut. W obu przypadkach należy odwracać rurkę (rurki) co 10 minut.
   2. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut.
   3. Usunąć PFA i dodać roztwór myjący (1 ml dla organoidów i 10 ml dla izolowanych krypt/kosmków). Roztwór myjący składa się z PBS z 0,1% detergentem i 1% serum.
   4. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzania krypt/kosmków/organoidów.
   5. Usunąć roztwór myjący i ponownie zawiesić w świeżym roztworze myjącym.
   6. Umieść na rotatorze rurowym z prędkością ustawioną na 20 obr./min. Myć komórki łącznie przez 1 godzinę, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) co 15 minut i zastępując roztwór do mycia.
      UWAGA: Jeśli rotator probówek nie jest dostępny, należy ręcznie odwracać probówki co 5 minut, aby ponownie zawiesić izolowane kultury.
   7. Pobieranie antygenu (opcjonalny krok zalecany do utrwalenia PFA)
      1. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      2. Dodać 1 - 10 ml 10 mM cytrynianu sodu o pH 6,0 (podgrzanego do 80 °C) i inkubować w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
      3. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      4. Dodać 1 - 10 ml świeżego 10 mM cytrynianu sodu o pH 6,0 (podgrzanego do 80 °C) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      5. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
      6. Przemyć 1 - 10 ml PBS z 1% surowicą i powtórzyć dalsze 3 razy, granulując krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1,000 x g przez 5 minut) przed dodaniem świeżego roztworu do mycia.

4. Krok blokujący

1. Przygotuj roztwór blokujący: dodaj 10% surowicy przeciwciał drugorzędowych do PBS (opcjonalnie: dodaj 0,1% detergentu).
2. Osadzać krypty/kosmki/organoidy przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) i usunąć supernatant.
3. Dodać 5 - 10 ml roztworu blokującego, w zależności od wymaganej liczby próbek (patrz uwaga poniżej). Na tym etapie należy podzielić roztwór krypt/kosmków/organoidów na pojedyncze probówki (1,5 ml probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania, z których każda zawiera 0,2 - 1 ml) w celu barwienia różnymi przeciwciałami.
   UWAGA: Każda izolowana frakcja krypt/kosmków da od 5 do 10 próbek, które można wykorzystać do różnych kombinacji etykietowania w zależności od wielkości granulki. Idealnie, dla każdej próbki wymagany jest rozmiar granulki od 2 do 4 mm. Na tym etapie można łączyć różne frakcje, ponieważ krypty i kosmki można łatwo zidentyfikować (Rysunek 2).
4. Inkubować w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej na rotatorze probówkowym przez 1 godzinę.

5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych

1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) w PBS zawierającym 10% surowicy i 0,1% detergentu. Na próbkę z probówki mikrowirówki wymagane jest od 100 do 200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
2. Usunąć roztwór blokujący przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut).
3. Zawiesić krypty/kosmki/organoidy w roztworze przeciwciała pierwotnego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą rotatora probówki (20 obr./min) w celu utrzymania krypt/kosmków/organoidów w zawiesinie.
4. Następnego dnia: Przynieś próbki z powrotem do RT na 1 godzinę na rotatorze rurowym (20 obr./min).
5. Osadzać próbkę przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut) i usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.
6. Dodać 1 ml roztworu myjącego i ponownie zawiesić osady krypty/kosmków/organoidów.
7. Natychmiast usunąć roztwór przez odwirowanie (1 000 x g przez 5 minut).
8. Dodaj 1 ml świeżego roztworu do płukania i obracaj komórki na rotatorze probówki (20 obr./min) przez 2 godziny. Roztwór płuczący należy zmieniać przez odwirowywanie co 30 minut, jak w kroku 5.7.

6. Inkubacja przeciwciał wtórnych

1. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (patrz tabela materiałów) w PBS 10% surowicy i 0,1% detergentu. Potrzeba około 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych na próbkę probówki mikrowirówki.
   UWAGA: Przeciwciała o wysokim stopniu wchłaniania krzyżowego powinny być stosowane w celu zmniejszenia reaktywności przeciwciał drugorzędowych w krypcie myszy / kosmkach / organoidach.
2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów i ponownego zawieszenia osadów w 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych.
3. Obracaj rurki na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze RT przez 1 godzinę.
4. Wirować przy 1,000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów i usunięcia supernatantów (niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych).
5. Zawiesić osad w roztworze płuczącym i natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w celu osadzenia krypt/kosmków/organoidów.
6. Usunąć sklarowany osad i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżego roztworu do płukania.
7. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 1,5 - 2 godziny, zmieniając roztwór myjący co 20 - 30 minut, jak opisano wcześniej w krokach 6.3 - 6.6.

7. Plama jądrowa

1. Rozcieńczyć plamę jądrową w roztworze do mycia (zgodnie z protokołem producenta), takim jak DAPI lub Hoechst. Na przykład: roztwór podstawowy DAPI (20 mg/ml) rozcieńcza się w stosunku 1:10 000. Roztwór podstawowy można przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
2. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut, aby osadzać krypty/kosmki/organoidy i usunąć roztwór myjący.
3. Ponownie zawiesić osad w roztworze barwnika jądrowego.
4. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) z prędkością obrotową przez 10 min.
5. Wirować przy 1,000 x g przez 5 minut, aby zagnieździć krypty/kosmki/organoidy, usunąć roztwór plamy jądrowej i ponownie zawiesić osad w roztworze do mycia.
6. Wirować na rotatorze rurowym (20 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 30 - 60 min, zmieniając roztwór myjący co 10 minut.

8. Montaż odizolowanych krypt, Villi i organoidów

1. Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut, aby osadzać krypty/kosmki/organoidy i usunąć cały roztwór do mycia.
   UWAGA: Jeśli osad się rozproszy, należy ponownie odwirować.
2. Dodaj do granulatu 2 krople twardego podłoża montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu.
3. Odetnij końcówkę mikropipety P200 i ostrożnie ponownie zawieś granulkę w materiale montażowym. Unikaj generowania bąbelków.
   UWAGA: Izolowane kultury organoidów są bardzo lepkie; Upewnij się, że całkowicie zawiesiłeś ponownie.
4. Za pomocą mikropipety przenieś mieszaninę krypt/kosmków/organoidów do roztworu podłoża montażowego i dozuj w linii wzdłuż środka szkiełka mikroskopowego.
   UWAGA: Linia nie powinna być dłuższa niż szkło nakrywkowe, które ma być używane. Sprawdź za pomocą mikroskopu stereoskopowego, czy krypty/kosmki/organoidy są dobrze rozłożone na szkiełku i nie są zbrylone.
5. Ostrożnie umieść szklankę nakrywkową na wierzchu; unikaj tworzenia bąbelków.
6. Umieść szkiełko podstawowe w zeszycie slajdów i przechowuj przez noc w lodówce, aby nośnik montażowy zastygł przed analizą pod mikroskopem konfokalnym.
   UWAGA: Do barwienia przeciwciał myszy w tkance myszy należy użyć komercyjnego zestawu immunofluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów). Zastąp etap blokujący (sekcja 4) 10-minutowym blokiem z roztworem blokującym białka, a następnie 1-godzinną inkubacją z odczynnikiem blokującym dołączonym do zestawu. Następnie w kroku 5.8 (w środku mycia) dodać 1-godzinną inkubację z odczynnikiem wzmacniającym sygnał fluorescencyjny. Następnie użyj odczynnika z zestawu w rozcieńczalniku fluorescencyjnym (w połączeniu z tym odczynnikiem można również użyć innych przeciwciał drugorzędowych). Inkubuj jak powyżej i przejdź od kroku 6 z resztą protokołu.

9. Utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów w macierzy podłoża

UWAGA: Organoidy przeznaczone do utrwalenia i immunoznakowania, pozostając w macierzy podstawowej, zostały wygenerowane w kopułach matrycy piwnicznej na okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych w 24-dołkowej płytce (jedna kopuła na studzienkę). Organoidowe kopuły macierzy podłoża poddano obróbce w 24-dołkowej płytce poprzez dodawanie i usuwanie różnych roztworów.

1. Usuń pożywkę z dołków i dodaj utrwalacz; Pozostaw na 1 godzinę.
2. Usuń utrwalacz i myj w PBS zawierającym 1% serum i 0,1% detergentu przez 2 godziny, zmieniając co 30 min.
3. Usuń roztwór myjący i zablokuj w PBS 10% serum i 0,1% detergentu na 1 godzinę.
4. Rozcieńczyć przeciwciała w PBS 1% surowicy lub PBS 1% surowicy i 0,1% detergentu.
5. Usunąć roztwór blokujący i dodać 100 - 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki.
   UWAGA: ważne jest, aby usunąć cały roztwór blokujący, aby nie rozcieńczać przeciwciał dalej.
6. Umieścić płytkę w lodówce i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C
7. Następnie wyjazd w RT na 1 - 2 godziny.
8. Usunąć roztwór przeciwciał i myć przez 2 - 3 godziny, zmieniając roztwór myjący co 20 minut.
9. Usunąć cały roztwór do przemywania i dodać 100-200 μl przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych (patrz tabela materiałów) w PBS z 1% surowicą; inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Usunąć wtórny roztwór przeciwciał i myć przez 2 godziny, zmieniając co 20 minut.
11. Usunąć roztwór płuczący i dodać roztwór DAPI; pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyć roztworu podstawowego DAPI (20 mg/ml) rozcieńczonego w stosunku 1:10 000. Roztwór podstawowy można przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
12. Usuń roztwór DAPI i myj przez 40 minut, zmieniając co 10 minut.
13. Za pomocą kleszczy usuń szklane szkiełko nakrywkowe z kopułką matrycy piwnicznej i umieść na szkiełku tak, aby kopuła matrycy piwnicznej była skierowana do góry; dodaj kilka kropli podłoża montażowego, a następnie połóż na wierzchu szklane szkiełko nakrywkowe.
14. Umieść szkiełko w zeszycie ze slajdami i pozostaw na noc w lodówce, aby nośnik montażowy stężał.

Izolacja tkanki jelitowej do immunoznakowania
Opisane protokoły izolacji tkanek dla okrężnicy i jelita cienkiego zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania i znakowania immunologicznego mikrotubul i powiązanych białek, ale nie pod kątem żywotności komórek macierzystych i generowania organoidów (Rysunek 1 i Tabela 1). Celem było wygenerowanie frakcji krypt i kosmków, które byłyby tak czyste (pozbawione śluzu i innych tkanek), jak to tylko możliwe, przy jednoczesnym zminimalizowaniu ekspozycji na EDTA i zimno, aby zachować strukturę i zapobiec depolimeryzacji mikrotubul lodowatymi roztworami, które indukują depolimeryzację wszystkich mikrotubul z wyjątkiem stabilnych. Rysunek 2 pokazuje przykłady obrazów frakcji 2 i 3 z izolowanej tkanki jelita cienkiego, przy czym frakcja 2 zawiera mieszaninę zarówno kosmków, jak i krypt (Rysunek 2A, B), podczas gdy frakcja 3 zawiera głównie krypty (Rysunek 2C, D).

Utrwalenie i znakowanie immunologiczne izolowanej tkanki jelitowej
Poszczególne lub połączone frakcje zostały następnie przetworzone w celu utrwalenia i znakowane immunologicznie przez szereg etapów, w tym utrwalanie, detergent, blokowanie, przeciwciała i roztwory myjące, przed ponownym zawieszeniem końcowej osadki kosmków / krypt w podłożu montażowym, przeniesieniem na szkiełka i pokryciem szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Krypty i kosmki zostały następnie zobrazowane pod mikroskopem konfokalnym.

Dobre zachowanie i oznakowanie mikrotubul i aktyny zarówno w kosmkach, jak i kryptach zostało osiągnięte dzięki następującym działaniom: połączenie wiązania formaldehydu/metanolu w temperaturze -20 °C, wielokrotne mycie w PBS zawierającym 0,1% detergentu i 1% surowicy oraz blokowanie w PBS 0,1% detergentu i 10% surowicy, a następnie całonocna inkubacja w temperaturze 4 °C w przeciwciałach pierwotnych, a następnie 2 godziny w przeciwciałach drugorzędowych w temperaturze pokojowej (Rysunek 3). Utrwalanie formaldehydu/metanolu działało również dobrze w przypadku etykietowania +TIPs, takich jak EBs i CLIP-170 w izolowanych kryptach i kosmkach (Rysunek 4). Nagromadzenie EB3 na dodatnim końcu mikrotubul (znanych jako komety) było widoczne w kryptach (Rysunek 4A), podczas gdy asocjację wzdłuż sieci stabilnych mikrotubul można było zaobserwować w próbkach kosmków (Rysunek 4C). Wyraźna lokalizacja CLIP-170 i p150Glued (podjednostka dynaktyny) była wyraźnie widoczna w wierzchołkowych n-MTOC w izolowanych kosmkach (Figura 4B). Fiksacja protokołem formaldehyd/metanol nie działała konsekwentnie w przypadku lokalizacji nineiny w izolowanej tkance jelitowej przy użyciu naszego przeciwciała Pep3 przeciwko mysiej dzienionce. Jednak wiązanie metanolu w temperaturze -20 °C, a następnie te same roztwory myjące i blokujące, co w przypadku formaldehydu/metanolu, dało bardzo dobrą lokalizację nineiny w izolowanych kryptach i kosmkach (Rysunek 5; odniesienie8). Co ciekawe, podczas gdy nineina jest skoncentrowana w wierzchołkowych centrosomach, pewna akumulacja u podstawy komórki była widoczna w niektórych komórkach w izolowanych kryptach (Ryc. 5). To, czy jest to spowodowane niespecyficznym oznakowaniem, czy też konsekwencją procedury izolacji, która opóźnia utrwalenie (a tym samym wpływa na konserwację), będzie wymagało dalszych badań. Jednak utrwalone metanolem (-20 °C) skriostaty kosmków (patrz Rysunek 3bi in8) również ujawniły dziewiątkę u podstawy komórki w niektórych komórkach, co sugeruje, że dziewinina może również wiązać się z podstawową populacją mikrotubul.

Utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów wyizolowanych z macierzy podstawowej
Organoidy jelita cienkiego zostały wygenerowane i hodowane w macierzy podstawowej przez trzy tygodnie lub dłużej (Rysunek 6A; odniesienie6,15). Zimny (4 °C) roztwór do odzyskiwania komórek użyto do wyizolowania organoidów z macierzy podstawowej. Zdepolimeryzowany roztwór macierzy podstawowej z organoidami przeniesiono do probówek i odwirowano przed utrwaleniem i immunoznakowaniem. W ten sposób uzyskano bardzo czyste preparaty i umożliwiono dobry dostęp do organoidów dla różnych roztworów. Zróżnicowane komórki w domenach biopsów organoidowych zawierają stabilne mikrotubule wierzchołkowo-podstawne; te dobrze oznaczone w większości przypadków (Rysunek 6B, C) i EB1 można było również zobaczyć wzdłuż siatki mikrotubul (Rysunek 6E; odniesienie13). Jednak roztwór do odzyskiwania zimnych komórek może spowodować depolimeryzację dynamicznych mikrotubul, co było widoczne w niektórych próbkach przez brak komet EB1 (które wiążą się z dodatnim końcem rosnących mikrotubul) w podstawowych domenach krypty (Figura 6F). W innych próbkach zachowały się astralne (dynamiczne) mikrotubule (Ryc. 6D). Izolacja organoidów przed utrwaleniem i znakowaniem immunologicznym działała również w przypadku białek połączeniowych, nineiny, CLIP-170 i markerów komórkowych, takich jak mucyna dla komórek kubkowych i chromogranina A dla komórek enteroendokrynnych.

Utrwalanie i znakowanie immunologiczne organoidów w macierzy podstawy
Rycina 7 przedstawia organoid w stadium torbieli (A-C) i we wczesnym stadium rozwoju krypty (D), oba utrwalone w formaldehydzie/metanolu i znakowane immunologicznie dla mikrotubul i dziewiątki. Widoczne było dobre zachowanie i znakowanie mikrotubul, a także znakowanie dla nineiny przy wierzchołkowych n-MTOC. Rysunek 8A, B pokazuje domenę kryptograficzną w organoidzie dnia 6 utrwaloną za pomocą protokołu metanolu i oznaczoną dla mikrotubul i EB1. Dobre zachowanie mikrotubul i komet EB1 było oczywiste, co sugeruje zachowanie dynamicznych mikrotubul

Organoidy zostały również utrwalone i znakowane immunologicznie, pozostając w macierzy podstawowej. Wadą tej procedury może być słaba penetracja utrwalacza i uwięzienie przeciwciał w macierzy podstawowej (Figura 8B), chociaż w obu przypadkach rzadziej, gdy 0,1% detergent był zawarty w roztworach utrwalających i/lub myjących. Ponadto 4% PFA nie konserwowało dobrze matrycy podstawowej, ale powodowało jej rozpuszczenie, chociaż było to mniejsze w przypadku 1% PFA. Z drugiej strony utrwalanie metanolu czasami powodowało zapadanie się organoidów.

Znakowanie niektórymi przeciwciałami, takimi jak przeciwko markerowi komórek macierzystych Lgr5 i markerowi komórek Panetha CD24, okazało się nieskuteczne w przypadku protokołów 4% PFA, metanolu lub formaldehydu/metanolu. Jednak utrwalenie organoidów w matrycy podłoża za pomocą 1% PFA w PBS z 0,1% detergentem w temperaturze pokojowej spowodowało oznakowanie zarówno dla Lgr5, jak i CD24 (Rysunek 9).

Rycina 1: Izolacja kosmków i krypt jelita cienkiego. Schemat przepływu kluczowych etapów izolacji kosmków jelita cienkiego i krypty przed utrwaleniem i immunoznakowaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Izolowane kosmki i krypty z jelita cienkiego myszy. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu frakcji jelitowych pokazujące kosmki (duże strzałki) i krypty (małe strzałki). (A, B) Frakcja 2 zawiera mieszaninę kosmków i krypt, a zachowanie morfologii na kosmkach i krypcie jest widoczne w B. (C, D) Frakcja 3 pokazuje izolację krypt i brak kosmków i nienaruszonych krypt, w tym rozwidlonej krypty w C. Podziałka = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wyizolowane kosmki i krypta jelita cienkiego utrwalone w formaldehydzie/metanolu i znakowane immunologicznie dla mikrotubul i aktyny. (A) Schemat nabłonka kosmków i krypty z zaznaczonymi różnymi typami komórek. Wyróżnione pola wskazują reprezentatywne regiony przedstawione na obrazach B i C. (B, C) Konfokalne przekroje optyczne przez część kosmków (B) i krypty podstawy (C) wyizolowane z jelita cienkiego za pomocą 30 mM EDTA i utrwalone w formaldehydzie/metanolu, przemyte w PBS zawierającym 1% surowicy koziej i 0,1% detergentu, zablokowane w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu i oznaczone dla mikrotubul przeciwciałem monoklonalnym antytubuliną szczura (zielony) i dla aktyny poliklonalnym przeciwciałem anty-β-aktyny królika (czerwony). Dobrze zachowane wiązki mikrotubul wierzchołkowo-podstawnych są widoczne zarówno w kosmkach, jak i komórkach kryptowych, a aktynę można zobaczyć skoncentrowaną w obszarze wierzchołkowym skierowanym w stronę światła (strzałka). Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Izolowana krypta i kosmki jelita cienkiego utrwalone w formaldehydzie/metanolu i znakowane immunologicznie dla mikrotubul, EB3,p150 Glued i CLIP-170. Konfokalne przekroje optyczne okolic krypty i kosmków wyizolowane z jelita cienkiego za pomocą 30 mM EDTA i utrwalone w formaldehydzie/metanolu, przemyte w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, zablokowane w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu i znakowane immunologicznie. (A) Krypta znakowana króliczym poliklonalnym przeciwciałem α-tubuliny (czerwonym) i przeciwciałem monoklonalnym EB3KT36 szczura (zielonym) oraz barwiona pod kątem DNA DAPI (niebieskim) wykazującym mikrotubule apiko-podstawne i komety EB3. Odwrócony obraz jednokanałowy wyraźnie pokazuje komety EB3 w podstawowych komórkach krypty, co sugeruje dobre zachowanie dynamicznych i stabilnych mikrotubul. (B) Komórki nabłonkowe kosmków znakowane króliczym poliklonalnym przeciwciałem CLIP-170 (czerwony, patrz również odniesienie16) i mysim monoklonalnym przeciwciałemklejonym p150 (zielonym) wykazującym kolokalizację wierzchołkową. Odwrócone obrazy jednokanałowe są pokazane poniżej. (C) Komórki kosmków znakowane króliczym poliklonalnym przeciwciałem α-tubuliny (czerwonym) i szczurzym przeciwciałem monoklonalnym EB3-KT36 (zielonym) i wybarwione pod kątem DNA za pomocą DAPI (niebieski) wykazujące mikrotubule apiko-podstawne z EB3 wzdłuż sieci. Asocjacja sieci EB3 jest zaznaczona na powiększonym obrazie, podczas gdy odwrócony obraz jednokanałowy sugeruje zarówno komety EB3, jak i asocjację sieci. Podziałka skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Izolowana krypta jelita grubego utrwalona w metanolu, znakowana immunologicznie dla dziewininy i E-kadheryny oraz wybarwiona DAPI. Konfokalny przekrój optyczny obszaru podstawnego i wzmacniającego tranzyt krypty wyizolowanej z okrężnicy za pomocą 3 mM EDTA i utrwalonej w metanolu, przemytej w PBS zawierającej 1% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz zablokowanej w PBS zawierającej 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu. Krypta została oznaczona króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi dziewięcioinowymi (Pep3, patrz także odniesienie8, czerwony) i mysim przeciwciałem monoklonalnym E-kadheryny (zielony) i wybarwiony DAPI (niebieski). Odwrócony obraz jednokanałowy pokazuje tylko dziewięć cali. Obraz przedstawia dobrze zachowaną kryptę z E-kadheryną odsłaniającą zarys poszczególnych komórek i dziewiątką skoncentrowaną w wierzchołkowych centrosomach. Sugeruje dobrą penetrację utrwalacza i przeciwciał oraz zachowanie antygenowości. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Rozwój, utrwalanie i znakowanie immunologiczne wyizolowanych organoidów. (A) Obrazy z kontrastem fazowym przedstawiające różne etapy rozwoju organoidów, od agregatów komórkowych do torbieli z inicjacją pąków i w pełni uformowanymi organoidami z domenami krypty i kosmków. (B-F) Konfokalne przekroje optyczne przez organoidy wyizolowane z macierzy podstawowej przy użyciu roztworu do odzyskiwania komórek w temperaturze 4 °C (10 min), a następnie utrwalenie formaldehydu/metanolu, przemycie w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu, blokowanie w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu oraz znakowanie immunologiczne mikrotubul, β-kateniny i EB1. (B) Torbiel organoidalna znakowana mikrotubulami (niebieska) i β-katenina (czerwona), ujawniająca dobre zachowanie i znakowanie mikrotubul w większości komórek. (C) Wyraźne mikrotubule wierzchołkowo-podstawne są widoczne w tych powiększonych komórkach nabłonka z torbieli organoidowej. (D) Dzielące się komórki oznaczone mikrotubulami pokazującymi wrzeciona, w tym mikrotubule astralne (dynamiczne) (strzałka). (E, F) Regiony organoidów domeny biomkowej (E) i domeny krypty (F) wykazują pewne znakowanie EB1 wzdłuż siatki stabilnych mikrotubul, zwłaszcza w kosmkach, podczas gdy bardzo niewiele komet EB1 jest widocznych nawet w krypcie podstawy, co sugeruje, że dynamiczne mikrotubule nie zostały zachowane. Podziałka = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Organoidy utrwalone w macierzy podstawowej w formaldehydzie/metanolu i znakowane immunologicznie dla mikrotubul i dziewiątki. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalone w formaldehydzie/metanolu, przemyte i zablokowane w PBS zawierającym 10% koziej surowicy i 0,1% detergentu i znakowane pozostając w macierzy podstawowej. (A-C) Torbiel organoidalna oznaczona dla mikrotubul (zielona) i dziewiątki (Pep3; odniesienie8, czerwona) i wybarwiona DAPI (niebieska) pokazująca scalony obraz w A i odwrócone obrazy jednokanałowe dla mikrotubul (B) i dziewiątki (C). Obrazy pokazują mikrotubule wierzchołkowo-podstawne i wierzchołkową lokalizację dziewiątki, co sugeruje bardzo dobre zachowanie strukturalne organoidu i penetrację przeciwciał, a także usuwanie niezwiązanych przeciwciał. (D, E) Organoid z rozwijającą się kryptą utrwaloną i oznaczoną jak powyżej i ponownie wykazujący doskonałe zachowanie strukturalne, znakowanie i usuwanie przeciwciał. Wyraźne mikrotubule wierzchołkowo-podstawne i wierzchołkowa lokalizacja n-MTOC ninein są widoczne i uwydatnione na powiększonym obrazie (E) obszaru pudełkowego w D. Podziałka liniowa = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Organoidy utrwalone w macierzy podstawowej w metanolu i znakowane immunologicznie dla mikrotubul i EB1. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalone w metanolu, przemyte i zablokowane w PBS zawierającym 10% surowicy koziej i 0,1% detergentu i znakowane, pozostając w matrycy podstawowej. (A) Domena torbieli z w pełni rozwiniętego organoidu znakowanego króliczą poliklonalną α-tubuliną (czerwoną) i mysimi przeciwciałami monoklonalnymi EB1 (zielonymi) wykazującymi mikrotubule apiko-podstawne, wrzeciona (strzałka) w dwóch dzielących się komórkach i odrębne komety EB1. Widoczne jest pewne wychwytywanie niezwiązanych przeciwciał EB1. Obserwuje się jednak dobre zachowanie strukturalne i oznakowanie mikrotubul i EB1. Obecność komet EB1 sugeruje, że zachowały się dynamiczne mikrotubule (A, odwrócone). (B) Odwrócony obraz regionu torbieli organoidowej pokazujący znakowanie przeciwciałami α-tubuliny ze znacznymi przeciwciałami uwięzionymi w otaczającej macierzy podstawnej (strzałka). Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 9: Organoidy utrwalone w macierzy podstawowej w 1% PFA i znakowane immunologicznie dla Lgr5 i CD24. Konfokalne przekroje optyczne organoidów utrwalone w matrycy podstawnej w 1% PFA w PBS zawierającym 0,1% detergentu, przemyte w PBS z 1% kozimi surowicą i 0,1% detergentem i znakowane przeciwciałami przeciwko Lgr5 i CD24. (A, B) Wnęka komórek macierzystych w domenie krypty pokazująca komórki Panetha dodatnie dla CD24 (czerwony). Obrazy konfokalne i kontrast fazowy zostały scalone w A. B pokazuje pojedynczy kanał etykietowania CD24. (C) Region komórek macierzystych w domenie krypty wykazujący komórkę macierzystą Lrg5 dodatnią. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Kalendarium izolacji i utrwalenia krypty i kosmków jelita cienkiego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.