Ten artykuł opisuje protokół do tworzenia trójwymiarowych map chemicznych łączących obrazowanie z filtrem energii i tomografię elektronową. Zbadano rozkład chemiczny dwóch nośników katalizatora utworzonych przez pierwiastki trudne do odróżnienia za pomocą innych technik obrazowania. Każda aplikacja polega na mapowaniu nakładających się na siebie pierwiastków chemicznych - odpowiednio rozstawionych krawędzi jonizacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Uzyskiwanie map chemicznych 3D za pomocą tomografii tomografii mikroskopii elektronowej z filtrowaną transmisją energii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tomografia mikroskopii elektronowej z filtrem energii (tomografia EFTEM) może dostarczyć trójwymiarowe (3D) mapy chemiczne materiałów w skali nanometrycznej. Tomografia EFTEM pozwala na oddzielenie pierwiastków chemicznych, które są bardzo trudne do odróżnienia przy użyciu innych technik obrazowania. Opisany tutaj protokół eksperymentalny pokazuje, jak tworzyć mapy chemiczne 3D, aby zrozumieć rozkład chemiczny i morfologię materiału. Przedstawiono przykładowe etapy przygotowania do segmentacji danych. Protokół ten umożliwia analizę rozkładu 3D pierwiastków chemicznych w próbce nanometrycznej. Należy jednak zauważyć, że obecnie mapy chemiczne 3D można generować tylko dla próbek, które nie są wrażliwe na wiązkę, ponieważ zapis przefiltrowanych obrazów wymaga długich czasów naświetlania intensywnej wiązki elektronów. Protokół zastosowano do ilościowego określenia rozkładu chemicznego składników dwóch różnych heterogenicznych nośników katalizatora. W pierwszym badaniu przeanalizowano rozkład chemiczny aluminium i tytanu w podporach tytanowo-tlenku glinu. Próbki przygotowano metodą swing-pH. W drugim badano rozkład chemiczny glinu i krzemu w podłożach krzemionkowo-tlenku glinu, które przygotowano metodami zol-proszek i mieszaniny mechanicznej.
Wprowadzenie
Właściwości materiałów funkcjonalnych zależą od ich parametrów 3D. Aby w pełni zrozumieć ich właściwości i poprawić ich funkcje, ważne jest, aby przeanalizować ich morfologię i rozkład chemiczny w 3D. Tomografia elektronowa1 (ET) jest jedną z najlepszych technik dostarczania tych informacji w skali nanometrów2,3. Polega na obracaniu próbki w dużym zakresie kątowym i rejestrowaniu jednego obrazu na każdym kroku kątowym. Uzyskany szereg pochyleń służy do rekonstrukcji objętości próbki za pomocą algorytmów matematycznych opartych na transformacie Radona 4,5. Wybór poziomów szarości w objętości pomaga modelować próbkę w 3D i ilościowo określać parametry 3D, takie jak lokalizacja cząstek6 i rozkład rozmiarów7, położenie porów i rozkład rozmiaru8, itd.
Ogólnie, ET jest wykonywany za pomocą mikroskopu elektronowego, przechylając próbkę do maksymalnego możliwego kąta, najlepiej więcej niż 70° w dowolnym kierunku. Przy każdym kącie nachylenia rejestrowana jest projekcja próbki, tworząca serię nachylenia obrazów. Ta seria nachylenia jest wyrównywana i wykorzystywana do rekonstrukcji objętości próbki, która zostanie podzielona na segmenty i określona ilościowo. Ponieważ próbki nie można obrócić w zakresie od -90° do +90°, zrekonstruowana objętość ma rozdzielczość anizotropową wzdłuż osi ortogonalnej9 ze względu na ślepy kąt zapisu.
ET może być wykonywane w różnych trybach obrazowania. Tryb TEM W JASNYM POLU (BF-TEM) służy do badania materiałów amorficznych, próbek biologicznych, polimerów lub nośników katalizatorów o skomplikowanych kształtach. Analiza obrazu opiera się na różnicowaniu poziomów szarości charakteryzujących gęstość komponentów10 (składnik gęsty będzie bardziej ciemny niż składnik jaśniejszy, tj. mniej gęsty). Ciemne pole pierścieniowe o wysokim kącie nachylenia w trybie skanowania TEM (HAADF-STEM) służy do analizy próbek krystalicznych. Sygnał dostarcza informacji chemicznej w funkcji liczby atomowej; Ciężki składnik próbki będzie jaśniejszy niż lżejszy ONE9. Inne tryby, takie jak spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDX), która zbiera promieniowanie rentgenowskie emitowane przez material11, oraz tryb obrazowania z filtrem energii (EFTEM)12,13, są również w stanie ocenić rozkład chemiczny 3D w próbce.
W obrazowaniu EFTEM, mapy chemiczne 2D mogą być rejestrowane za pomocą TEM ze spektrometrem energii elektronów. Spektrometr działa jak pryzmat magnetyczny, rozpraszając elektrony w funkcji ich energii. Obraz jest tworzony przez elektrony w zależności od energii utraconej w wyniku interakcji z określonym atomem. Jeśli ta sama mapa chemiczna 2D zostanie obliczona pod różnymi kątami nachylenia, uzyskuje się serię projekcji chemicznych pod kątem nachylenia, które można wykorzystać do rekonstrukcji objętości chemicznej 3D.
Nie wszystkie materiały mogą być analizowane za pomocą tomografii EFTEM. Technika ta jest zarezerwowana dla próbek ze słabymi lub nieuporządkowanymi materiałami. Niemniej jednak może być używany do analizy lekkich elementów, które są bardzo trudne do rozróżnienia przy użyciu innych technik obrazowania. Ponadto, aby uzyskać wiarygodne mapy chemiczne 2D, grubość materiału musi być mniejsza niż średnia swobodna ścieżka elektronów przez materiał14. W tym stanie prawdopodobieństwo oddziaływania pojedynczego elektronu z pojedynczym atomem jest największe. Do obliczenia mapy chemicznej 2D stosuje się dwie metody. Pierwszą i najczęściej stosowaną jest "metoda trzech okien", w której dwa przefiltrowane okna energetyczne są rejestrowane przed krawędzią jonizacji analizowanego elementu, a trzecie po krawędzi jonizacji edge13. Pierwsze dwa obrazy służą do oszacowania tła, które jest ekstrapolowane za pomocą prawa potęgowego w pozycji trzeciego okna i odejmowane od niego. Uzyskany obraz jest rzutem 3D rozkładu analizowanego pierwiastka chemicznego w objętości próbki. Druga metoda nazywana jest "współczynnikiem skoku"; Wykorzystuje tylko dwa obrazy z filtrem energii, jeden przed i jeden za krawędzią jonizacji. Ta metoda jest jakościowa, ponieważ ostateczny obraz jest obliczany tylko poprzez zastosowanie stosunku między tymi dwoma obrazami i nie uwzględnia zmian energii tła.
Łącząc EFTEM z ET, można uzyskać tomografię analityczną przefiltrowanej energii. Tomografia EFTEM i tomografia sondy atomowej (APT) są technikami uzupełniającymi. W porównaniu z APT, tomografia EFTEM jest nieniszczącą analizą charakterystyki, która nie wymaga skomplikowanego przygotowania próbki. Może być używany do wykonywania różnych charakterystyk unikalnej nanocząstki. Tomografia EFTEM może analizować materiały izolacyjne, podczas gdy APT potrzebuje co najmniej pomocy lasera do ich pomiaru. APT działa w skali atomowej, podczas gdy tomografia EFTEM działa odpowiednio z niższą rozdzielczością. Tomografia EFTEM jest odpowiednia tylko dla próbek, które są odporne na degradację wiązki podczas eksperymentu. Aby zarejestrować wszystkie przefiltrowane obrazy pod wszystkimi kątami nachylenia, próbka może być wystawiona na działanie wiązki elektronów nawet przez 2 godziny. Ponadto, aby zarejestrować maksymalny sygnał chemiczny na mapach 2D, konieczne może być wydłużenie czasu ekspozycji przy dużym natężeniu wiązki. W takich warunkach próbki wrażliwe na wiązkę ulegają drastycznym zmianom morfologicznym i chemicznym. W związku z tym przed rozpoczęciem doświadczenia należy ustalić dokładny pomiar wrażliwości próbki na wiązkę elektronów. Ponadto tomografia EFTEM jest wynikiem zarejestrowania tylu tomogramów, ile jest konieczne do określenia lokalizacji przestrzennej i charakteru pierwiastków chemicznych obecnych w próbce. Niemniej jednak tomografia EFTEM może dostarczyć ważnych informacji na temat rozkładu chemicznego 3D dla próbek, takich jak nośniki katalizatorów, aby dostarczyć nowych informacji na temat modelowania ich zastosowań katalitycznych.
Dzisiaj można korzystać z dedykowanego oprogramowania, które może wybierać przedział energii, rejestrować przefiltrowane obrazy okien energetycznych i obliczać mapy chemiczne pod różnymi kątami nachylenia. Umożliwiają one przechylanie próbki, śledzenie, ustawianie ostrości i nagrywanie przefiltrowanego obrazu w trybie EFTEM. Można obliczyć mapy chemiczne 2D, następnie wyrównać szereg nachylenia, obliczyć objętość chemiczną za pomocą algorytmów iteracyjnych, a na koniec szereg można podzielić na segmenty i określić ilościowo15,16.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek
- Rozetrzeć próbkę w moździerzu i rozproszyć ją w alkoholu lub wodzie destylowanej; nanieść kroplę próbki na siatkę mikroskopową i pozostawić do wyschnięcia.
UWAGA: Próbki takie jak krzemionka glinowa lub tytanion glinowy mogą mieć postać proszku lub materiału ekstrudowanego i mogą zostać rozdrobnione oraz rozproszone w roztworze przy użyciu ultradźwięków. Ogólnie, w analizie ET ważne jest, aby stężenie próbki na siatce było niskie, aby uniknąć nakładania się próbek i powstawania cieni podczas przechylania siatki pod dużymi kątami. Zaleca się stosowanie siatek mikroskopowych o rozmiarze 20 mesh z warstwą węgla dziurawego (holey carbon) lub koronkowego (lacey carbon). - Za pomocą pipety nanieść kroplę roztworu koloidalnego zawierającego znaczniki fiducjalne na próbkę. Odessać nadmiar roztworu i pozostawić do wyschnięcia.
UWAGA: Znaczniki fiducjalne to dobrze skalibrowane nanocząsteczki Au zawieszone w roztworze. Znaczniki fiducjalne można również rozproszyć na siatce przed nałożeniem próbki. Przykładowo, jeśli próbka składa się z nanocząsteczek o rozmiarach zbliżonych do znaczników fiducjalnych, należy nanieść znaczniki na siatkę, aby umożliwić ich wyraźne rozróżnienie podczas segmentacji i kwantyfikacji danych. Znaczniki fiducjalne służą jako punkty odniesienia pozycji podczas wyrównywania obrazów przechylonych.
2. Rejestracja obrazów serii przechyłów z filtrowaniem
- Za pomocą mikroskopu elektronowego odnaleźć wyizolowaną próbkę w centrum siatki mikroskopowej.
UWAGA: W mikroskopie elektronowym oś X przebiega wzdłuż uchwytu próbki, oś Y jest prostopadła do uchwytu próbki, a oś Z przebiega wzdłuż wiązki elektronów. Aby móc przechylić próbkę pod maksymalnym kątem, należy analizować fragment próbki położony jak najbliżej osi X. - Po prawidłowym ustawieniu próbki należy sprawdzić jej skład chemiczny. Przeprowadzić analizę chemiczną za pomocą spektrometrii rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS) lub spektrometrii strat energii elektronów (EELS), skupiając wiązkę na wybranej próbce i rejestrując widmo. Jeśli próbka zawiera interesujące elementy chemiczne, należy odsunąć się od niej i przeprowadzić kolejne testy na pobliskiej reprezentatywnej próbce.
- Należy sprawdzić natężenie wiązki elektronów nad próbką, szerokość okien energetycznych obrazów filtrowanych oraz czas ekspozycji każdego obrazu filtrowanego. Należy znaleźć optymalny kompromis dla próbki pomiędzy uszkodzeniami wywołanymi wiązką a sygnałem chemicznym zarejestrowanym w projekcjach chemicznych.12,13,17.
UWAGA: Aby zarejestrować maksymalny sygnał chemiczny na obrazach filtrowanych, należy zastosować maksymalną intensywność wiązki. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek analiz konieczne jest jednak przeprowadzenie testu naświetlania w celu sprawdzenia, czy pod wpływem wiązki elektronów nie doszło do zmian w próbce. W tym celu należy obliczyć dawkę elektronów podczas rejestracji serii pochyleń. Dodatkowo można przeprowadzić test sprawdzający, porównując obraz przed i po eksperymencie. - Używając trybu EFTEM w oprogramowaniu rejestrującym, oblicz dwuwymiarową mapę chemiczną metodą trzech okien i sprawdź, czy zarejestrowano wystarczający sygnał chemiczny.
UWAGA: Oprogramowanie rejestruje trzy obrazy przefiltrowane; dwa pierwsze służą do oszacowania tła z trzeciego obrazu.- W oprogramowaniu należy wybrać badany pierwiastek chemiczny oraz jego krawędź jonizacji. Następnie należy ustawić szerokość okna energetycznego i czas ekspozycji. Po zarejestrowaniu obrazów należy obliczyć mapę chemiczną, stosując prawo potęgowe w celu usunięcia tła. W środowisku 32-bitowym przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli minimalny sygnał w zarejestrowanym obrazie chemicznym wynosi około 30–40 zliczeń na piksel.
- Ustaw próbkę na wysokości eukentrycznej i sprawdź minimalny kąt nachylenia, tj., -70° lub mniej, oraz maksymalny kąt nachylenia, t.j., +70° lub więcej.
- Ponownie wycentruj próbkę przeznaczoną do analizy w polu widzenia i zarejestruj obraz (będzie to obraz przed akwizycją). Następnie zarejestruj serię obrazów filtrowanych pod różnymi kątami nachylenia, korzystając z odpowiedniego oprogramowania.
UWAGA: Dedykowane wtyczki do tomografii EFTEM umożliwiają jednoczesną rejestrację kilku serii nachyleń. Oznacza to, że dla każdego kąta nachylenia można zarejestrować kilka następujących po sobie obrazów. Pierwszym obrazem może być obraz filtrowany z centrum w obszarze zerowej straty energii, który jest typowym obrazem w polu jasnym. Następnie rejestrowane są obrazy przedkrawędziowe i obraz pokrawędziowy pierwszego pierwiastka chemicznego, a po nich obrazy przedkrawędziowe i obraz pokrawędziowy drugiego pierwiastka chemicznego. Kolejność pierwiastków chemicznych wynika z wybranej krawędzi jonizacji.- W oprogramowaniu do rejestracji serii pochyleń EFTEM należy wybrać szerokość każdego okna energetycznego oraz czas jego ekspozycji, a następnie maksymalny i minimalny kąt pochylenia oraz krok kątowy pochylenia. Aby osiągnąć kompromis między liczbą obrazów w serii pochyleń a całkowitym czasem ekspozycji próbki na wiązkę elektronów, należy zastosować krok pochylenia wynoszący 4°, t. j., 51 obrazów na serię pochyleń w zakresie ± 71°; jednakże można wybrać mniejszy skok nachylenia, jeśli próbka nie ulega degradacji pod wpływem wiązki.
- Dla każdego pierwiastka chemicznego należy zarejestrować trzy serie przechyłów obrazów filtrowanych, aby obliczyć projekcję chemiczną przy użyciu metody trzech okien. Aby określić naturalny dryft próbki pod każdym kątem przechyłu podczas rejestracji obrazów filtrowanych (próbka może pozostawać pod określonymi kątami przechyłu przez ponad 1 minutę), pierwszy obraz może być obrazem filtrowanym dla sygnału zerowej straty energii, tak aby ostatni zarejestrowany obraz był obrazem niefiltrowanym, utworzonym przez wszystkie elektrony o wszystkich energiach. Te dwa obrazy mogą zostać wykorzystane do obliczenia mapy grubości próbki. Zatem w celu obserwacji rozkładu chemicznego dwóch pierwiastków pod każdym kątem przechyłu należy zarejestrować 7 obrazów filtrowanych (1 dla zerowej straty, 3 dla pierwszego pierwiastka chemicznego, 3 dla drugiego pierwiastka chemicznego) oraz 1 obraz niefiltrowany (łącznie zarejestrowanych zostanie 8 serii przechyłów).
3. Dopasowanie i rekonstrukcja serii nachyleń
- Wyrównaj trzy przefiltrowane obrazy odpowiadające każdemu pierwiastkowi chemicznemu dla każdego kąta nachylenia, a następnie oblicz mapę chemiczną przy użyciu specjalistycznego oprogramowania EFTEMT.15,18 wtyczka programu ImageJ. W oprogramowaniu ImageJ należy przejść przez ścieżkę Plik | Otwórz i wybierz pliki odpowiadające serii pochyleń obrazów filtrowanych. Otwórz wszystkie trzy filtrowane serie pochyleń: dwie przed krawędzią i jedną po krawędzi.
- Otwórz dedykowaną wtyczkę EFTEMTJ. Kliknij w + | Obraz lub stos obrazów i wybierz serie nachyleń, które są już otwarte.
- W wyświetlonej tabeli należy wypełnić Przesunięcie energetyczne dla każdej serii pochyleń, t. j., energia, przy której zarejestrowano każdą serię pochyleń. Należy również wypełnić Szerokość szczeliny, t.j., okna energetyczne. Wypełnij Czas ekspozycji każdego przefiltrowanego obrazu. Sprawdź wszystkie trzy serie pochyleń MapowanieKliknij w Następnie.
- Wybierz pierwszy obraz jako obraz referencyjny, a następnie kliknij ZastosujKliknij w Dalejpojawia się podgląd proponowanego dopasowania. Należy wizualnie zweryfikować, czy 3 obrazy zarejestrowane pod tym samym kątem nachylenia są dobrze nałożone na siebie (nie powinno być zauważalne żadne przesunięcie między obrazami).
UWAGA: Niniejszy protokół został wykonany w wersji 0.9 wtyczki EFTEMTJ. W tej chwili obrazy filtrowane, zarejestrowane pod tym samym kątem nachylenia, są wyrównane. - W oknie EFTEMTJ zaznacz obrazy odpowiadające Wstęp or do substancji chemicznej KrawędźWybierz model ekstrakcji sygnału jako Moca następnie kliknij w Tworzenie mapyW programie ImageJ wybierz Plik | Zapisz i znajdź ścieżkę zapisu tego ostatniego pliku.
UWAGA: Uzyskano serię pochyleń mapy chemicznej. Więcej informacji na temat korzystania z wtyczki dostępnych jest w Internecie. - Powtórz krok 3.1 dla wszystkich chemicznych serii pochyleń.
- Wyrównaj serię pochyleń (tilt series) o zerowej stracie energii, korzystając z wersji oprogramowania Imod19 wydane w 209 roku w celu wyrównania serii pochyleń. Oprogramowanie umożliwia zastosowanie obliczonych wyrównań z jednej serii pochyleń do drugiej serii pochyleń.
UWAGA: Oprogramowanie do wyrównywania zapisuje na dysku pliki zawierające wszystkie przesunięcia zastosowane do każdego obrazu. Procedura wyrównywania z użyciem Imod20 zostały omówione w innej publikacji i nie mieszczą się w zakresie niniejszego artykułu. - Należy użyć dopasowania obliczonego dla serii przechyłów zero-loss i zastosować je do wcześniej obliczonej serii przechyłów chemicznych.
UWAGA: W tej wersji oprogramowania istnieje możliwość zastąpienia pliku serii nachyleń o zerowej stracie (zero-loss) plikiem serii nachyleń chemicznych, zachowując nazwę pliku i stosując wcześniej obliczone przesunięcia. W przeciwnym razie, z punktu widzenia oprogramowania, plik będzie miał tę samą nazwę, tę samą liczbę obrazów o tym samym rozmiarze, ale nie będzie zawierał obrazów o zerowej stracie, lecz obrazy chemiczne. - Ilościowo określ dryft poprzez kroskorelację pierwszego zarejestrowanego obrazu, t. j....wycentrowany na braku strat (zero loss) oraz ostatni (obraz niefiltrowany). Próbka może pozostawać pod każdym kątem nachylenia przez kilka sekund, podczas gdy rejestrowane są wszystkie obrazy filtrowane. W tym czasie próbka ulega naturalnemu, niewielkiemu przesunięciu.
- W oprogramowaniu ImageJ kliknij Plik | Otwórz następnie należy wybrać wyrównaną serię nachyleń z zerową stratą energii, a potem otworzyć wyrównaną serię nachyleń map chemicznych.
- Kliknij w Edytuj | Kolor | Połącz kanałyWybierz plik odpowiadający zerowej stracie dla koloru czerwonego, pierwszy pierwiastek chemiczny dla zielonego oraz drugi pierwiastek chemiczny dla niebieskiego, w tej kolejności. Odznacz Tworzenie kompozytu i sprawdzić Zachowaj obraz źródłowyDla wszystkich zarejestrowanych obrazów tworzony jest stos dla każdego z kątów nachylenia.
- Kliknij w Wtyczki | Plany wyrównywania kanałów RGB21Kolor czerwony oznacza obraz odniesienia. Wybierz kolor zielony i za pomocą strzałek nałóż go na obraz czerwony. Kliknij „dalej” i powtórz czynność dla wszystkich kątów.
- Kliknij w Edytuj | Kolor | Rozdziel kanały a stos RGB zostanie rozdzielony na trzy stosy: czerwony odpowiadający zerowej stracie oraz zielony i niebieski odpowiadające mapom chemicznym z korekcją dryftu. Kliknij w Plik | Zapisz w celu zapisania serii pochyleń.
- Kliknij w Wtyczki | Tomoj22,23 aby wybrać plik z kątem nachylenia. Ponieważ wszystkie serie nachyleń są już wyrównane, przejdź bezpośrednio do RekonstrukcjaOblicz objętości strat zerowych, jak oraz objętości chemiczne, wykorzystując algorytmy rekonstrukcji, takie jak ART, SIRT, OS-ART, itd..
UWAGA: Do rekonstrukcji wolumenów chemicznych zaleca się stosowanie algorytmu iteracyjnego. Dzięki wykorzystaniu tego oprogramowania możliwe jest przeprowadzenie rekonstrukcji wolumenów z wykorzystaniem procesora GPU. - Po obliczeniu wszystkich objętości należy użyć Łączenie kanałów możliwość przypisania różnych kolorów do uzyskanych objętości i nałożenia ich na siebie w obrębie jednej objętości w celu otrzymania trójwymiarowej mapy chemicznej.
4. Modelowanie 3D i kwantyfikacja
- Zbinaryzuj zrekonstruowaną objętość ZL, wybierając odpowiedni poziom szarości, tak aby objętość składała się z obszarów białych (w 8 bitach intensywność wynosi 255) i czarnych (w 8 bitach intensywność wynosi 0). W programie ImageJ skorzystaj z opcji „select threshold”. Zaznacz wszystkie piksele odpowiadające próbce (na obrazie BF ciemniejsze piksele odpowiadają masie próbki) i utwórz objętość, w której próbka jest biała, a próżnia czarna.
UWAGA: Obrazowanie z zerową stratą sygnału (zero-loss) dostarcza informacji morfologicznych o analizowanej próbce, t. j.kształt oraz rozmiar próbki. - Podziel binarną objętość zerowej straty przez 255, aby uzyskać objętość, w której intensywności wewnątrz próbki wynoszą 1, a poza nią 0. Jest to objętość znormalizowana.
- Pomnóż znormalizowaną objętość przez każdą z obliczonych objętości chemicznych (krok 4.1), aby uzyskać objętość, w której intensywności wewnątrz próbki odpowiadają informacjom chemicznym, a poza nią intensywności te wynoszą 0.
UWAGA: Informacje chemiczne pochodzą z próbki, w związku z czym wszystkie artefakty zostały wykluczone. - W programie ImageJ oblicz histogram objętości substancji chemicznej, a następnie zaimportuj wartości histogramu do programu arkusza kalkulacyjnego.
- W oprogramowaniu Tabulate należy usunąć wiersz z liczbą zliczeń najwyższej intensywności równą 0 (wiersz ten odpowiada próżni).
- W nowej kolumnie oblicz proporcję każdej intensywności w objętości. Podziel liczbę wystąpień każdej intensywności przez sumę wszystkich wystąpień, a następnie pomnóż wynik przez 10.
- W nowej kolumnie oblicz proporcję odpowiadającą intensywności całkowitej objętości, dodając sukcesywnie bieżącą proporcję liczebności, obliczoną wcześniej z poprzednią proporcją.
UWAGA: W objętościach chemicznych wysokie intensywności odpowiadają informacjom chemicznym. Jednakże intensywności są niskie, a szum w objętości wysoki. Próg jest tworzony poprzez wybór najwyższych intensywności. - Znając względne stężenie pierwiastka chemicznego w próbce obliczone na podstawie widma EELS, należy wybrać najwyższe intensywności. Należy zacząć od wartości 255 (jeśli istnieje) i zmniejszać intensywność zgodnie ze stężeniem pierwiastka chemicznego.
- Aby wyznaczyć najniższą intensywność odpowiadającą stężeniu chemicznemu, należy przejść do kolumny, w której obliczono proporcję odpowiadającej intensywności w całkowitej objętości; zazwyczaj 10% odpowiada intensywności 255. Od 10% należy odjąć obliczoną proporcję względną pierwiastka chemicznego (ze spektrum EELS): wynik będzie odpowiadał minimalnej intensywności w progu. W ten sposób otrzymuje się binarne objętości chemiczne, w których woksele odpowiadające danemu pierwiastkowi chemicznemu mają intensywność 25, a pozostałe mają wartość 0. Procedurę powtórzono dla drugiego pierwiastka, uzyskując dwie binarne objętości chemiczne.
- Nałóż na siebie zbinaryzowane objętości chemiczne, korzystając z opcji Merge Channels, a następnie przypisz różny kolor do objętości każdego pierwiastka, aby utworzyć objętość RGB.
UWAGA: Poprzez nałożenie na siebie dwóch zbinaryzowanych objętości chemicznych wyróżnione zostają woksele nałożone, które należą do obu pierwiastków chemicznych (woksele wspólne), oraz woksele, które nie należą do żadnego z pierwiastków chemicznych (woksele wolne). Na przykład, zbinaryzowane objętości chemiczne czerwieni i zieleni tworzą żółte woksele wspólne. - Przekształć wolumen RGB w wolumen 8-bitowy; kolory będą miały różne intensywności szarości. Używając opcji progu (threshold), zaznacz woksele należące do obu gatunków chemicznych (kolor żółty w wolumenie RGB). Następnie, korzystając z tej samej opcji progu, zaznacz woksele, które nie należą do żadnego pierwiastka chemicznego (mają one niższą intensywność niż woksele zaznaczone wcześniej). Nie zaznaczaj próżni o intensywności 0.
- Znormalizuj objętości wokseli wspólnych oraz objętość wokseli wolnych. Pomnóż objętości wokseli wolnych przez objętości chemiczne, a następnie odejmij objętość drugiej substancji chemicznej.
UWAGA: Operacja ta oblicza pierwiastek chemiczny o najwyższej intensywności w każdym wokselu. - Zsumuj objętości wokseli należących oraz tych, które nie należą do objętości pierwiastka chemicznego o najwyższej intensywności w tych wokselach.
UWAGA: W ten sposób każdy wspólny woksel lub wolny woksel zostaje rozróżniony i przypisany do objętości tego pierwiastka chemicznego, który wykazuje w tym wokselu najwyższą intensywność. Można to wykonać za pomocą opcji „Kalkulator obrazów” (Image calculator):
- Aby określić liczbę wokseli tworzących próbkę, należy zaimportować segmentowane wolumeny do specjalistycznego oprogramowania do renderowania powierzchni, takiego jak 3D Slicer. Następnie należy pomnożyć objętość jednego woksela w nm3 w celu wyznaczenia objętości próbki w 3D.
- Wykorzystując Wykrywanie krawędzi opcja, określić liczbę wokseli tworzących powierzchnię próbki i pomnożyć ją przez pole powierzchni woksela w nm2 w celu uzyskania powierzchni próbki.
- Oblicz powierzchnię właściwą, dzieląc powierzchnię próbki przez masę próbki.
UWAGA: Masę próbki można oszacować, korzystając z jej teoretycznej gęstości. Generalnie powierzchnia właściwa obliczona metodą ET jest o 10 mniejsza niż powierzchnia właściwa obliczona metodami dedykowanymi, takimi jak N2 adsorpcja desorpcja - Aby obliczyć rozkład wielkości porów, należy wykorzystać zbinaryzowaną objętość obrazu bez strat (objętość BF). Objętość binarna rekonstrukcji BF jest rozszerzana za pomocą wtyczki 3D Toolkit/Morphological dilate 3D do momentu pokrycia wszystkich porów, a następnie poddawana erozji przy użyciu 3D Toolkit/Morphological erode 3D taką samą liczbę razy, ile przeprowadzono rozszerzanie. Następnie otrzymaną objętość mnoży się przez odwróconą objętość zbinaryzowanej objętości BF, aby uzyskać objętość rozkładu porów, którą można zwizualizować za pomocą dedykowanego oprogramowania do renderowania powierzchni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład zastosowania tego protokołu przedstawiono w odniesieniu13. Tomografię EFTEM wykorzystano do analizy nośników katalizatorów tytanu i glinu. Aby zwiększyć aktywność katalityczną czynnej fazy nanopartekulatu MoS2 w zastosowaniach takich jak hydrodesiarkowanie (HDS), ważne jest, aby tlenek tytanu występował w nadmiarze na powierzchni nośnika i był w kontakcie z fazą aktywną. Wiadomo, że tlenek tytanu ma mniejszą powierzchnię właściwą niż tlenek glin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Celem pracy jest opisanie, w jaki sposób można uzyskać trójwymiarowe mapy chemiczne za pomocą tomografii EFTEM. Protokół ten jest całkowicie oryginalny i został opracowany przez autorów.
Opisana tutaj tomografia EFTEM ma kilka wad: (i) Tylko próbki odporne na wiązkę elektronów mogą być analizowane, ze względu na długi czas ekspozycji potrzebny do uzyskania przefiltrowanych obrazów. (ii) Tomografia EFTEM jest wrażliwa na kontrast dyfrakcyjny. (iii) Wiele wyrównań zostało wykonanych ręcznie. Aby...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni francuskiemu Ministerstwu Szkolnictwa Wyższego i Badań, Conventions Industrielles de Formation par la Recherche (CIFRE) oraz IFP Energies Nouvelles za ich wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| JEOL 2100f | JEOL | Mikroskop elektronowy | |
| Tridiem Gatan Filtr obrazowania (GIF) | Gatan | Filtr energii po kolumnie | |
| Mikrografia cyfrowa | Gatan | Software | |
| Wtyczka tomografii Gatan EFTEM | Gatan | Dedykowane oprogramowanie do nagrywania serii przefiltrowanych pochyleń dla tomograohy | |
| EFTEM Tomoj | Wtyczka Imagej http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez Currie Institute w Paryżu, Francja dla wtyczki | |
| EFTEM-Tomoj | Imagej http://www.cmib.fr/en/download/softwares/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez Currie Institute w Paryżu, Francja , do obrazowania EFTEM | |
| Imod | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez University of Colorado, USA dla tomografii elektronowej | |
| Imagej | https://imagej.nih.gov/ij/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA do obróbki obrazów | |
| Scal kanały | https://imagej.net/Color_Image_Processing | Fonction w Imagej pozwalające na nadawanie różnych kolorów objętościom, gdy nakładają się na siebie | |
| 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez duże konsorcjum kierowane przez Rona Kikinisa , Harvard Medical School, Boston, MA, SUA | |
| Chimera | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | Darmowe oprogramowanie opracowane przez Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco, do segmentacji danych, kuratoryzacji i wizualizacji modeli 3D | |
| Podłoże katalizatora | z tlenku glinu krzemionkowegoPróbka IFPEN | przygotowana do elektryzacji tego protokołu | |
| tytan tlenek glinu nośnik katalizatora | Próbka IFPEN | przygotowana do elektroboracji tego protokołu | |
| alkohol | |||
| woda | |||
| Au nanocząstki 5 nm | BBI Solutions | ||
| Holey carbn film 200 mesh siatka mikroskopowa | Agar | ||
| Sepctrometr EDX | Oxford Instruments |
Bibliografia
- Frank, J. Electron Tomography - Methods for Three-Dimensional Visualization of Structures in the Cell. , Springer-Verlag. New York. (2006).
- Midgley, P. A., Dunin-Borkowski, R. E. Electron tomography and holography in materials science. Nat. Mater. 8, 271-280 (2009).
- Carenco, S. The core contribution of transmission electron microscopy to functional nanomaterials engineering. Nanoscale. 8 (3), 1260-1279 (2016).
- Radon, J. Uber die Bestimmung von Funktionen durch ihre Integralwerte langs gewisser Mannigfaltigkeiten. Akad. Wiss. 69, 262-277 (1917).
- Radermacher, M. Radon transform techniques for alignment and three-dimensional reconstruction from random projections. Scanning Microscopy. 11, 171-177 (1997).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Pham-Huu, C., Drillon, M., Ersen, O. 3D-TEM investigation of the nanostructure of a δ-Al2O3 catalyst support decorated with Pd nanoparticles. Nanoscale. 4 (3), 946-954 (2012).
- Georgescu, D., Roiban, L., Ersen, O., Ihiawakrim, D., Baia, L., Simon, S. Insights on Ag doped porous TiO2 nanostructures: a comprehensive study of their structural and morphological characteristics. RSC Adv. 2 (12), 5358(2012).
- Shakeri, M., Roiban, L., Yazerski, V., Prieto, G., Gebbink, M. J. M. G., de Jongh, P. E., de Jong, K. P. Engineering and Sizing Nanoreactors To Confine Metal Complexes for Enhanced Catalytic Performance. ACS Catal. 4 (10), 3791-3796 (2014).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Ersen, O., Florea, I., Hirlimann, C., Pham-Huu, C. Exploring nanomaterials with 3D electron microscopy. Mater. Today. 18 (7), 395-408 (2015).
- Lepinay, K., Lorut, F., Pantel, R., Epicier, T. Chemical 3D tomography of 28nm high K metal gate transistor: STEM XEDS experimental method and results. Micron. 47, 43-49 (2013).
- Roiban, L., Sorbier, L., Pichon, C., Bayle-Guillemaud, P., Werckmann, J., Drillon, M., Ersen, O. Three-Dimensional Chemistry of Multiphase Nanomaterials by Energy-Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography. Microsc. Microanal. 18 (05), 1118-1128 (2012).
- Roiban, L., Sorbier, L., Hirlimann, C., Ersen, O. 3 D Chemical Distribution of Titania-Alumina Catalyst Supports Prepared by the Swing-pH Method. ChemCatChem. 8 (9), 1651-1657 (2016).
- Egerton, R. F. Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , Springer. (2011).
- Messaoudi, C., Aschman, N., Cunha, M., Oikawa, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. Three-Dimensional Chemical Mapping by EFTEM-TomoJ Including Improvement of SNR by PCA and ART Reconstruction of Volume by Noise Suppression. Microscopy and Microanalysis. 19 (6), 1669-1677 (2013).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera-A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), (2004).
- Roiban, L., Ersen, O., Hirlimann, C., Drillon, M., Chaumonnot, A., Lemaitre, L., Gay, A. S., Sorbier, S. Three-Dimensional Analytical Surface Quantification of Heterogeneous Silica-Alumina Catalyst Supports. ChemCatChem. 9 (18), 3503-3512 (2017).
- EFTEM-TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/EFTEM-TomoJ.html (2018).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- The IMOD Home Page. , Available from: http://bio3d.colorado.edu/imod/ (2018).
- Landini, G. Align RGB planes. ImageJ. , Available from: https://ImageJ.net/Align_RGB_planes (2018).
- Messaoudi, C. TomoJ. , Available from: http://www.cmib.fr/en/download/softwares/TomoJ.html (2018).
- MessaoudiI, C., Boudier, T., Sorzano, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinf. 8 (1), 288(2007).
- Saxton, W. O., Baumeister, W., Hahn, M. Three-dimensional reconstruction of imperfect two-dimensional crystals. Ultramicroscopy. 13 (1-2), 57-70 (1984).
- Gatan, Inc. Quantum Energy Filters High Throughput Spectrometers. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/gif-quantum-energy-filters (2018).
- Gatan, Inc. Direct Detection 16-Megapixel Camera. , Available from: http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/k2-direct-detection-cameras (2018).
- Direct Electron, LP. DE-Series Cameras. , Available from: http://www.directelectron.com/products/de-series (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
