Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Podsumowanie

Ektopowo wyraziliśmy podjednostkę NR1 receptora NMDA oznaczoną zielonym białkiem fluorescencyjnym w ludzkich komórkach embrionalnych (HEK293) jako antygen do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu. Ta prosta metoda może być odpowiednia do celów przesiewowych w warunkach klinicznych.

Streszczenie

Obecność autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA może powodować różne objawy neuropsychiatryczne u dotkniętych chorobą, określane jako autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA. Wykrycie swoistego autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA we krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) jest niezbędne do dokładnej diagnozy tego schorzenia. Receptor NMDA jest kompleksem białkowym kanału jonowego, który zawiera cztery podjednostki, w tym dwie obowiązkowe podjednostki receptora NMDA 1 (NR1) i jedną lub dwie podjednostki receptora NMDA 2A (NR2A), podjednostkę receptora NMDA 2B (NR2B), podjednostkę receptora NMDA 2C (NR2C) lub podjednostkę receptora NMDA 2D (NR2D). Doniesiono, że epitop autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA jest obecny w zewnątrzkomórkowej domenie N-końcowej podjednostki NR1 receptora NMDA. Celem tego badania jest opracowanie prostego testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach, który może być stosowany jako test przesiewowy do wykrywania obecności autoprzeciwciał przeciwko podjednostce NR1 receptora NMDA we krwi, aby ułatwić badania kliniczne i podstawowe autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA.

Wprowadzenie

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA jest nowo rozpoznaną jednostką chorobową, która może wystąpić u pacjentów w każdym wieku i dotyka głównie pacjentki płci żeńskiej^1,2. Jest to jedno z najczęściej diagnozowanych zapaleń mózgu wśród pacjentów z początkową nieznaną etiologią zapalenia mózgu³. Pacjenci dotknięci zapaleniem mózgu z receptorem anty-NMDA zwykle mają objawy prodromalne w postaci bólu głowy lub gorączki, po których następuje szybki rozwój zmiany poziomu świadomości i różne ostre objawy neuropsychiatryczne, w tym pobudzenie, drażliwość, lęk, bezsenność, halucynacje, urojenia, agresja, dziwaczne zachowania, nieprawidłowości ruchowe, dysregulacja autonomiczna i napady padaczkowe^4,5. Wczesne rozpoznanie tego stanu i terminowe leczenie immunoterapią są ważne dla lepszych wyników, a nawet pełnego wyzdrowienia u pacjentów dotkniętych chorobą⁶. W związku z tym sugeruje się, że autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA powinno być brane pod uwagę jako ważna diagnostyka różnicowa u pacjentów z ostrymi lub nowo pojawiającymi się cechami psychotycznymi^7,8.

Oprócz cech klinicznych, wykrycie autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym jest niezbędne do dokładnej diagnozy autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA⁹. Większość testów immunologicznych wykrywających autoprzeciwciało przeciwko receptorowi anty-NMDA jest dostępna w kilku laboratoriach badawczych^10,11, a na rynku dostępny jest tylko jeden test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do badania przesiewowego autoprzeciwciał receptora anty-NMDA¹². Celem tego badania jest opracowanie prostego, wewnętrznego testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach, który może być wygodnie stosowany w laboratorium do badania przesiewowego obecności autoprzeciwciał receptora anty-NMDA, aby ułatwić badania kliniczne autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA. Receptor NMDA jest heterotetramerowym kompleksem białkowym kanałów jonowych, specyficznie wyrażanym w mózgu. Składa się z dwóch obowiązkowych podjednostek NR1 oraz kombinacji jednej lub dwóch podjednostek NR2A, NR2B, NR2C lub NR2D¹³. Poprzednie badanie wykazało, że główny epitop, w który celowane są przeciwciała, znajdował się w zewnątrzkomórkowej domenie N-końcowej podjednostki NR1⁵. W związku z tym w tym protokole wyrażamy ludzkie rekombinowane białko podjednostkowe NR1 receptora NMDA znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w ludzkiej linii komórek nabłonka nerki embrionalnej (HEK293) i opracowujemy komórkowy test immunofluorescencyjny w celu wykrycia klasy IgG autoprzeciwciał receptora anty-NMDA we krwi.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital w Linkuo, Taoyuan, Tajwan (102-2577A3).

1. Przygotowanie plazmidu ekspresyjnego NR1-GFP

1. Wymieszaj 10 ng plazmidu NR1-GFP ze 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli, przecedź DH5α w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół 4-6 razy i inkubuj probówkę na lodzie przez 20 minut.
2. Inkubować probówkę w temperaturze 42 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej, wyjąć probówkę z łaźni wodnej, dodać 1 ml bulionu lizogenicznego (LB) do probówki i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
3. Rozprowadzić 50 μl mieszaniny na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (0,1 mg/ml) i inkubować płytkę agarową LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc.
4. Za pomocą sterylnej końcówki wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB na noc i zakręć końcówką w probówce do hodowli bakteryjnej zawierającej 5 ml pożywki LB i ampicyliny (0,1 mg / ml). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze, wytrząsając przez noc.
5. Podać 3 ml nocnej hodowli bakteryjnej do kolby o pojemności 500 ml, która zawiera 250 ml sterylnej pożywki LB i ampicylinę (0,1 mg/ml). Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, wstrząsając. Regularnie sprawdzaj gęstość optyczną (OD) kultury bakteryjnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrometru, aż OD600 osiągnie 0,6-1,0,
   UWAGA: Dobrze wymieszaj 800 μl nocnej kultury bakteryjnej z 200 μl glicerolu w celu przygotowania bulionu glicerolowego i przechowuj zapas glicerolu w temperaturze poniżej -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
6. Przygotować plazmid ekspresji NR1-GFP z 250 ml kultury bakteryjnej
   1. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego RNazę; dokładnie przetrząsać, aż nie będzie widać grudki.
   3. Dodać 10 ml buforu do lizy do zawiesiny bakteryjnej, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy i inkubować lizat w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
   4. Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego buforu strącającego do lizatu, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy.
   5. Wlej lizat do cylindra wkładu filtracyjnego z założoną nakrętką; odczekaj 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Zdjąć nasadkę z dyszy wylotowej wkładu, włożyć tłok do wkładu i delikatnie nacisnąć tłok. Zebrać przefiltrowany lizat do probówki o pojemności 50 ml.
   7. Do przefiltrowanego lizatu dodać 2,5 ml zastrzeżonego buforu od producenta, wymieszać mieszaninę, odwracając probówkę około 10 razy i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
   8. Przefiltrowaną mieszaninę lizatu nanieść na kolumnę filtracyjną, która została wstępnie zrównoważona 10 ml buforu równoważącego. Pozwól kolumnie spłynąć grawitacyjnie.
   9. Przemyć kolumnę dwukrotnie 30 ml buforu do przemywania wodą, a następnie wymyć DNA z kolumny za pomocą 15 ml buforu elucyjnego.
   10. Dodać 10,5 ml (0,7 objętości) izopropanolu do eluowanego buforu DNA, dobrze wymieszać i odwirować mieszaninę przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   11. Ostrożnie zdekantować supernatant, przemyć osad DNA 5 ml 70% etanolu wolnego od endotoksyn i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut.
   12. Zdekantować sklarant, suszyć osad przez 5-10 minut w okapie chemicznym i rozpuścić osad w 300-500 μl buforu wolnego od endotoksyn
   .
   13. Oznaczyć stężenie plazmidu, mierząc absorpcję roztworu w promieniowaniu UV 260/280 nm za pomocą spektrofotometru.
       UWAGA: Przygotuj ekspresję plazmidu GFP przy użyciu tego samego protokołu.

2. Transfekcja komórek HEK293 z plazmidem ekspresyjnym NR1-GFP

1. Podamy 200 μl 2% roztworu żelatyny do każdego dołka na 48-dołkowej płytce hodowlanej i inkubujemy płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
2. Odessać roztwór żelatyny z dołka i wysiać 5 x 10⁴ komórek HEK293 w 200 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w każdym dołku. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% CO₂ przez noc.
   UWAGA: Komórki policzono za pomocą hemocytometru.
3. Następnego dnia zastąp zużytą pożywkę hodowlaną 200 μl świeżej pożywki zawierającej 10% FBS na studzienkę.
4. Dla każdej pojedynczej studzienki przygotować roztwór A, mieszając 100 ng plazmidu NR1-tGFP z 20 μl pożywki hodowlanej, a roztwór B mieszając 0,8 μl odczynnika do transfekcji z 20 μl pożywki hodowlanej. Pomnóż liczbę studzienek potrzebnych do przygotowania całkowitej objętości dla każdego eksperymentu.
5. Przygotować roztwór C, mieszając roztwór A i roztwór B, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.
6. Porcję 40 μl roztworu C do każdej studzienki zawierającej komórki HEK293, delikatnie zakręcić płytką i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO_{2 przez} noc.
7. Sprawdź ekspresję rekombinowanego białka NR1-GFP w komórkach gospodarza pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 40X-200X (wzbudzenie/emisja: 482/502 nm) i przejdź do testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach.
   UWAGA: Transfekować ekspresję plazmidu GFP do komórek HEK293 przy użyciu tego samego protokołu.

3. Test immunofluorescencyjny oparty na komórkach

1. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, a następnie przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Dodać 200 μl 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki; inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
3. Odessać roztwór paraformaldehydu ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBS.
4. Do każdej studzienki dodać 200 μl 10% odtłuszczonego mleka w roztworze PBST (0,1% Tween-20 w PBS) i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem.
5. Odessać 10% odtłuszczone mleko w roztworze PBST ze studzienki, a następnie przemyć studzienki 200 μl PBST raz.
6. Inkubować studzienki z rozcieńczonym osoczem (1:100 w PBST) jako przeciwciałem pierwszorzędowym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 h,
   UWAGA: Osocze uzyskuje się z krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu.
7. Odessać rozcieńczone osocze ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.
8. Dodać 200 μl koziej antyludzkiej IgG sprzężonej z Alexa Fluor 594 (rozcieńczenie 1:1,000 w PBST) do każdej studzienki i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem przez 1 godzinę.
9. Odessać kozę anty-ludzką IgG sprzężoną z roztworem Alexa Fluor 594 i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.
10. Dodać 100 μl roztworu glicerolu (50% glicerolu w PBS i 1:100 000 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)) do każdego dołka.
11. Obserwuj i obrazuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą okularu 10X oraz obiektywów 4X, 10X i 20X.
    UWAGA: Do każdego barwnika należy stosować odpowiedni filtr: dla NR1-GFP (wzbudzenie/emisja = 482/502 nm), dla Alexa Fluor 594 (wzbudzenie/emisja = 561/594 nm), dla DAPI (wzbudzenie/emisja = 358/461 nm). Przeprowadzić kontrolę ujemną przy użyciu komórek HEK wykazujących ekspresję GFP w ten sam sposób.

Wyniki

Średnio udało nam się uzyskać 200-300 μg wolnego od endotoksyn plazmidu ekspresyjnego NR1-GFP i GFP z 250 ml hodowli bakteryjnej zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 1 protokołu. Ilość 100 ng/basenik plazmidu ekspresyjnego użyto do transfekcji komórek HEK293 hodowanych na 48-dołkowej płytce, jak opisano w sekcji 2 protokołu. 24-30 godzin po transfekcji komórki wykazywały ekspresję NR1-GFP, a rekombinowane białka GFP można było wykryć pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dyskusja

W literaturze opisano kilka testów immunologicznych opartych na komórkach w celu zbadania obecności autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA, w tym test immunofluorescencji opartej na żywych komórkach¹¹, test immunofluorescencyjny oparty na stałych komórkach⁹ i test oparty na cytometrii przepływowej¹⁴. Test immunofluorescencyjny na żywych komórkach powinien być wykonany wkrótce po przygotowaniu komórek eksprymujących ektopowo białko NR1, podczas gd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
GRIN1 (znakowany GFP) - Ludzki receptor glutaminianu, jonotropowy, N-metylo-D-asparaginian 1 (GRIN1), wariant transkryptu NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA	RG219368	Klon cDNA NR1 znakowany C-końcowymi sekwencjami tGFP
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA	PS100010	wektor ssaków z C-końcowym znacznikiem tGFP
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden, Niemcy)	12362
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Obniżona surowica	Medium Thermo Fisher	31985-070
DMEM, wysoka glukoza, pirogronian	Thermo Fisher	11995-065
Charakterystyka płodowej surowicy bydlęcej, pochodzenie z USA	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG (H+L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	A-11014
Kontrola pozytywna: receptor antyglutaminianu (typ NMDA)	Euroimmun AG, Lü beck, Niemcy	CA 112d-0101
			do oznaczania Euroimmun