Prosty test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do wykrywania autoprzeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) we krwi

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA jest nowo rozpoznaną jednostką chorobową, która może wystąpić u pacjentów w każdym wieku i dotyka głównie pacjentki płci żeńskiej^1,2. Jest to jedno z najczęściej diagnozowanych zapaleń mózgu wśród pacjentów z początkową nieznaną etiologią zapalenia mózgu³. Pacjenci dotknięci zapaleniem mózgu z receptorem anty-NMDA zwykle mają objawy prodromalne w postaci bólu głowy lub gorączki, po których następuje szybki rozwój zmiany poziomu świadomości i różne ostre objawy neuropsychiatryczne, w tym pobudzenie, drażliwość, lęk, bezsenność, halucynacje, urojenia, agresja, dziwaczne zachowania, nieprawidłowości ruchowe, dysregulacja autonomiczna i napady padaczkowe^4,5. Wczesne rozpoznanie tego stanu i terminowe leczenie immunoterapią są ważne dla lepszych wyników, a nawet pełnego wyzdrowienia u pacjentów dotkniętych chorobą⁶. W związku z tym sugeruje się, że autoimmunologiczne zapalenie mózgu z receptorem anty-NMDA powinno być brane pod uwagę jako ważna diagnostyka różnicowa u pacjentów z ostrymi lub nowo pojawiającymi się cechami psychotycznymi^7,8.

Oprócz cech klinicznych, wykrycie autoprzeciwciał przeciwko receptorowi NMDA we krwi lub płynie mózgowo-rdzeniowym jest niezbędne do dokładnej diagnozy autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA⁹. Większość testów immunologicznych wykrywających autoprzeciwciało przeciwko receptorowi anty-NMDA jest dostępna w kilku laboratoriach badawczych^10,11, a na rynku dostępny jest tylko jeden test immunofluorescencyjny oparty na komórkach do badania przesiewowego autoprzeciwciał receptora anty-NMDA¹². Celem tego badania jest opracowanie prostego, wewnętrznego testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach, który może być wygodnie stosowany w laboratorium do badania przesiewowego obecności autoprzeciwciał receptora anty-NMDA, aby ułatwić badania kliniczne autoimmunologicznego zapalenia mózgu z receptorem anty-NMDA. Receptor NMDA jest heterotetramerowym kompleksem białkowym kanałów jonowych, specyficznie wyrażanym w mózgu. Składa się z dwóch obowiązkowych podjednostek NR1 oraz kombinacji jednej lub dwóch podjednostek NR2A, NR2B, NR2C lub NR2D¹³. Poprzednie badanie wykazało, że główny epitop, w który celowane są przeciwciała, znajdował się w zewnątrzkomórkowej domenie N-końcowej podjednostki NR1⁵. W związku z tym w tym protokole wyrażamy ludzkie rekombinowane białko podjednostkowe NR1 receptora NMDA znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w ludzkiej linii komórek nabłonka nerki embrionalnej (HEK293) i opracowujemy komórkowy test immunofluorescencyjny w celu wykrycia klasy IgG autoprzeciwciał receptora anty-NMDA we krwi.

Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital w Linkuo, Taoyuan, Tajwan (102-2577A3).

1. Przygotowanie plazmidu ekspresyjnego NR1-GFP

1. Wymieszaj 10 ng plazmidu NR1-GFP ze 100 μl kompetentnych komórek Escherichia coli, przecedź DH5α w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, delikatnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół 4-6 razy i inkubuj probówkę na lodzie przez 20 minut.
2. Inkubować probówkę w temperaturze 42 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej, wyjąć probówkę z łaźni wodnej, dodać 1 ml bulionu lizogenicznego (LB) do probówki i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
3. Rozprowadzić 50 μl mieszaniny na płytce agarowej LB zawierającej ampicylinę (0,1 mg/ml) i inkubować płytkę agarową LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc.
4. Za pomocą sterylnej końcówki wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB na noc i zakręć końcówką w probówce do hodowli bakteryjnej zawierającej 5 ml pożywki LB i ampicyliny (0,1 mg / ml). Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze, wytrząsając przez noc.
5. Podać 3 ml nocnej hodowli bakteryjnej do kolby o pojemności 500 ml, która zawiera 250 ml sterylnej pożywki LB i ampicylinę (0,1 mg/ml). Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C, wstrząsając. Regularnie sprawdzaj gęstość optyczną (OD) kultury bakteryjnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrometru, aż OD600 osiągnie 0,6-1,0,
   UWAGA: Dobrze wymieszaj 800 μl nocnej kultury bakteryjnej z 200 μl glicerolu w celu przygotowania bulionu glicerolowego i przechowuj zapas glicerolu w temperaturze poniżej -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
6. Przygotować plazmid ekspresji NR1-GFP z 250 ml kultury bakteryjnej
   1. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   2. Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego RNazę; dokładnie przetrząsać, aż nie będzie widać grudki.
   3. Dodać 10 ml buforu do lizy do zawiesiny bakteryjnej, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy i inkubować lizat w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
   4. Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego buforu strącającego do lizatu, delikatnie odwrócić mieszaninę 4-6 razy.
   5. Wlej lizat do cylindra wkładu filtracyjnego z założoną nakrętką; odczekaj 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Zdjąć nasadkę z dyszy wylotowej wkładu, włożyć tłok do wkładu i delikatnie nacisnąć tłok. Zebrać przefiltrowany lizat do probówki o pojemności 50 ml.
   7. Do przefiltrowanego lizatu dodać 2,5 ml zastrzeżonego buforu od producenta, wymieszać mieszaninę, odwracając probówkę około 10 razy i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
   8. Przefiltrowaną mieszaninę lizatu nanieść na kolumnę filtracyjną, która została wstępnie zrównoważona 10 ml buforu równoważącego. Pozwól kolumnie spłynąć grawitacyjnie.
   9. Przemyć kolumnę dwukrotnie 30 ml buforu do przemywania wodą, a następnie wymyć DNA z kolumny za pomocą 15 ml buforu elucyjnego.
   10. Dodać 10,5 ml (0,7 objętości) izopropanolu do eluowanego buforu DNA, dobrze wymieszać i odwirować mieszaninę przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   11. Ostrożnie zdekantować supernatant, przemyć osad DNA 5 ml 70% etanolu wolnego od endotoksyn i odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut.
   12. Zdekantować sklarant, suszyć osad przez 5-10 minut w okapie chemicznym i rozpuścić osad w 300-500 μl buforu wolnego od endotoksyn
   .
   13. Oznaczyć stężenie plazmidu, mierząc absorpcję roztworu w promieniowaniu UV 260/280 nm za pomocą spektrofotometru.
       UWAGA: Przygotuj ekspresję plazmidu GFP przy użyciu tego samego protokołu.

2. Transfekcja komórek HEK293 z plazmidem ekspresyjnym NR1-GFP

1. Podamy 200 μl 2% roztworu żelatyny do każdego dołka na 48-dołkowej płytce hodowlanej i inkubujemy płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
2. Odessać roztwór żelatyny z dołka i wysiać 5 x 10⁴ komórek HEK293 w 200 μl pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w każdym dołku. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zasilanym 5% CO₂ przez noc.
   UWAGA: Komórki policzono za pomocą hemocytometru.
3. Następnego dnia zastąp zużytą pożywkę hodowlaną 200 μl świeżej pożywki zawierającej 10% FBS na studzienkę.
4. Dla każdej pojedynczej studzienki przygotować roztwór A, mieszając 100 ng plazmidu NR1-tGFP z 20 μl pożywki hodowlanej, a roztwór B mieszając 0,8 μl odczynnika do transfekcji z 20 μl pożywki hodowlanej. Pomnóż liczbę studzienek potrzebnych do przygotowania całkowitej objętości dla każdego eksperymentu.
5. Przygotować roztwór C, mieszając roztwór A i roztwór B, a następnie inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.
6. Porcję 40 μl roztworu C do każdej studzienki zawierającej komórki HEK293, delikatnie zakręcić płytką i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO_{2 przez} noc.
7. Sprawdź ekspresję rekombinowanego białka NR1-GFP w komórkach gospodarza pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 40X-200X (wzbudzenie/emisja: 482/502 nm) i przejdź do testu immunofluorescencyjnego opartego na komórkach.
   UWAGA: Transfekować ekspresję plazmidu GFP do komórek HEK293 przy użyciu tego samego protokołu.

3. Test immunofluorescencyjny oparty na komórkach

1. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, a następnie przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Dodać 200 μl 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki; inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
3. Odessać roztwór paraformaldehydu ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBS.
4. Do każdej studzienki dodać 200 μl 10% odtłuszczonego mleka w roztworze PBST (0,1% Tween-20 w PBS) i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem.
5. Odessać 10% odtłuszczone mleko w roztworze PBST ze studzienki, a następnie przemyć studzienki 200 μl PBST raz.
6. Inkubować studzienki z rozcieńczonym osoczem (1:100 w PBST) jako przeciwciałem pierwszorzędowym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 h,
   UWAGA: Osocze uzyskuje się z krwi pacjentów z podejrzeniem autoimmunologicznego zapalenia mózgu.
7. Odessać rozcieńczone osocze ze studzienek i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.
8. Dodać 200 μl koziej antyludzkiej IgG sprzężonej z Alexa Fluor 594 (rozcieńczenie 1:1,000 w PBST) do każdej studzienki i inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem przez 1 godzinę.
9. Odessać kozę anty-ludzką IgG sprzężoną z roztworem Alexa Fluor 594 i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBST.
10. Dodać 100 μl roztworu glicerolu (50% glicerolu w PBS i 1:100 000 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)) do każdego dołka.
11. Obserwuj i obrazuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą okularu 10X oraz obiektywów 4X, 10X i 20X.
    UWAGA: Do każdego barwnika należy stosować odpowiedni filtr: dla NR1-GFP (wzbudzenie/emisja = 482/502 nm), dla Alexa Fluor 594 (wzbudzenie/emisja = 561/594 nm), dla DAPI (wzbudzenie/emisja = 358/461 nm). Przeprowadzić kontrolę ujemną przy użyciu komórek HEK wykazujących ekspresję GFP w ten sam sposób.

Średnio udało nam się uzyskać 200-300 μg wolnego od endotoksyn plazmidu ekspresyjnego NR1-GFP i GFP z 250 ml hodowli bakteryjnej zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 1 protokołu. Ilość 100 ng/basenik plazmidu ekspresyjnego użyto do transfekcji komórek HEK293 hodowanych na 48-dołkowej płytce, jak opisano w sekcji 2 protokołu. 24-30 godzin po transfekcji komórki wykazywały ekspresję NR1-GFP, a rekombinowane białka GFP można było wykryć pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rysunek 1A pokazuje obraz komórek gospodarza, które wyrażają NR1-GFP, podczas gdy Rysunek 1D pokazuje komórki wyrażające GFP. Zielony sygnał może być wykorzystany jako kontroler jakości testu: około 30% komórek miało zielone sygnały pod mikroskopem fluorescencyjnym. Rysunek 1A i 1D pokazują obraz komórek gospodarza, które wyrażają NR1-GFP. Zielony sygnał może być wykorzystany jako kontroler jakości testu: około 30% komórek miało zielone sygnały pod mikroskopem fluorescencyjnym. Komórki wykazujące ekspresję NR1-GFP wykorzystano do badań przesiewowych na obecność autoprzeciwciał receptora anty-NMDA w próbce ludzkiego osocza.

W teście immunofluorescencyjnym opartym na komórkach, opisanym w sekcji 3 protokołu, dodatnia próbka kontrolna (uzyskana ze źródła komercyjnego, patrz Tabela Materiałów) została dodana do połączonego osocza w rozcieńczeniu 1:10 zgodnie z instrukcjami producenta. Połączone osocze przygotowano od 5 dorosłych samców i 5 dorosłych samic. Rysunek 1B to obraz Alexa Fluor-594 próbki kontroli pozytywnej po inkubacji z komórkami o ekspresji NR1-GFP, podczas gdy Rysunek 1E to obraz Alexa Fluor-594 próbki kontroli pozytywnej po inkubacji z ekspresją komórek GFP. Rysunek 1C to scalony obraz Rysunek 1A i Rysunek 1B: w tej samej komórce występują znaczne nakładanie się sygnałów zielonych i czerwonych, co wskazuje na kolokalizację NR1-GFP i przeciwciał przeciwko podjednostce NR1 receptora NMDA (strzałki). Próbka osocza, która wykazuje więcej niż 30% nakładania się sygnałów zielonych i czerwonych, zostanie w tym przypadku zinterpretowana jako pozytywna. Rysunek 1F to scalony obraz z Rysunek 1D i Rysunek 1E, który służy jako kontrola negatywna dla Rysunek 1C. Słaby czerwony kolor to fluorescencja tła obrazu Alexa Fluor-594. Sygnały zielone i czerwone w niewielkim stopniu nakładają się na siebie, co wskazuje na brak wiązania autoprzeciwciała receptora anty-NMDA z białkiem rekombinowanym.

Podczas ustanawiania procedur eksperymentalnych zaobserwowaliśmy niski stosunek sygnału do szumu obrazu Alexa Fluor-594 podczas testowania próbek plazmy. Próbowaliśmy zoptymalizować stosunek sygnału do szumu, przeprowadzając seryjne rozcieńczanie osocza w postaci 1:10, 1:50, 1:100 i 1:200 oraz testując różne stężenia przeciwciała wtórnego znakowanego Alexem Fluor-594 od 1:500 do 1:2,000. Stwierdziliśmy, że rozcieńczenie osocza 1:100 i rozcieńczenie 1:1000 lub 1:2000 Alexa Fluor-594 były optymalnymi warunkami do interpretacji danych.

Rycina 1: Reprezentatywne obrazy komórkowego testu immunofluorescencyjnego w celu wykrycia autoprzeciwciała przeciwko receptorowi NMDA. (A) Obraz komórek HEK293, które wyrażają NR1-GFP. (B) Obraz Alexa Fluor-594 wykonany z tego samego pola A po inkubacji z dodatnią próbką kontrolną. Czerwony sygnał wskazuje na wiązanie autoprzeciwciał receptora anty-NMDA z NR1 ulegającym ekspresji w komórkach HEK293. (C) Scalony obraz A i B. Kolor żółty wskazuje na kolokalizację NR1 (sygnał zielony) i autoprzeciwciał receptora anty-NMDA (sygnał czerwony). Strzałki wskazują przykłady niektórych wybitnych komórek wykazujących kolokalizację autoprzeciwciał receptora NR1-GFP i anty-NMDA. (D) Obraz komórek HEK293 eksprymujących NR1-GFP. (E) Obraz Alexa Fluor-594 wykonany z tego samego pola D po inkubacji z dodatnią próbką kontrolną. Słaby czerwony sygnał wskazuje na szum tła obrazu Alexa Fluor-594. (F) Zrośnięty obraz D i E. Ten obraz służy jako kontrola negatywna, ponieważ zaobserwowano niewiele żółtego sygnału. Obraz kontroli ujemnej pokazuje specyficzne wiązanie przeciwciał receptora anty-NMDA z NR1-GFP w teście. Wszystkie zdjęcia zostały wykonane pod obiektywem 10X i 20X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.