Artykuł metodologiczny

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

DOI:

10.3791/56678

⸱

24 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnętrzna komórka rzęsata jest jednym z dwóch typów czuciowych komórek rzęsatych w ślimaku ssaków. Zmieniają one długość komórek za pomocą potencjału receptora, aby wzmocnić słabe wibracje sygnału dźwiękowego o niskim poziomie. Morfologia i właściwości elektrofizjologiczne zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC) rozwijają się we wczesnym wieku postnatalnym. Dojrzewanie zewnętrznej komórki rzęsatej może przyczyniać się do rozwoju układu słuchowego. Jednak proces powstawania OHC nie jest dobrze zbadany. Wynika to częściowo z trudności w zmierzeniu ich funkcji za pomocą podejścia elektrofizjologicznego. W celu opracowania prostej metody rozwiązania powyższego problemu, tutaj opisujemy krok po kroku protokół badania funkcji OHC w ślimaku z ostrą dysocjacją od szczurów po urodzeniu. Dzięki tej metodzie możemy ocenić reakcję ślimaka na bodźce czysto tonalne oraz zbadać poziom ekspresji i funkcję białka motorycznego prestyny w OHC. Metoda ta może być również stosowana do badania wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie odrębne funkcje czuciowych komórek rzęsatych ślimaka są niezbędne dla słuchu ssaków: transdukcja mechanoelektryczna (MET) i elektromotoryka1,2. Poprzez kanały MET zlokalizowane w pęczku włosa, IHC (IHC) i OHC przekształcają wibracje dźwiękowe w zmiany potencjału błonowego, a także sygnały elektryczne unerwionych neuronów zwoju spiralnego. OHC zmieniają długość komórek wraz z potencjałem błonowym i wzmacniają wibracje dźwięku o niskim natężeniu. Ta aktywność określana jako elektromotoryka jest uzyskiwana przez białko motoryczne prestyny znajdujące się w bocznej ścianie OHCs3.

U wielu gatunków, w tym gryzoni, funkcja słuchu jest niedojrzała we wczesnej epoce postnatalnej4,5. Nie można było wykryć potencjału czynnościowego w odpowiedzi na sygnały dźwiękowe w korze słuchowej przed wystąpieniem słuchu6,7. Rozwój morfologii i funkcji ślimaka był szeroko badany u myszy, myszoskoczka i szczura4,5,8. Mechanotransdukcja i elektromotoryka komórek rzęsatych są również rozwijane we wczesnej epoce życia5.

Aby ocenić wrażliwość słuchową szczurów w różnym wieku postnatalnym, opracowaliśmy metodę rejestracji słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) u młodych szczurów. Patch clamp do całych komórek jest idealną technologią do elektrofizjologicznego badania OHC. Jednak w porównaniu z zaciskiem łatkowym wykonywanym w neuronach i innych komórkach nabłonkowych, niski wskaźnik uszczelniania całych komórek ograniczał badanie elektroruchliwości izolowanych OHC.

Tutaj opisujemy procedurę morfologicznego i elektrofizjologicznego badania OHC w ślimaku ostro dysocjacyjnym od szczurów po urodzeniu. Metoda ta może być modyfikowana w celu zbadania mechanizmów molekularnych, które regulują rozwój i funkcję wewnętrznych komórek rzęsatych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Południowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Przygotuj rozwiązania do eksperymentów

  1. Przygotuj środek znieczulający (patrz tabela materiałów): 1,5% pentobarbital sodu rozpuszczony w ddH2O.
  2. Przygotować roztwór preparacyjny (patrz tabela materiałów): Rozpuścić jedną torebkę proszku L-15 Leiboviza w 1 l ddH2O. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1 M NaOH. Dostosuj osmolarność do 300-330 mOsm za pomocą osmometru i 10 mM HEPES przed użyciem.
  3. Rozpuścić 2 mg/ml kolagenazy IV (patrz tabela materiałów) w roztworze preparacyjnym przygotowanym w kroku 1.2.
  4. Przygotować roztwory do barwienia immunologicznego (patrz tabela materiałów): Rozpuść 4% paraformaldehyd w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  5. Rozcieńczyć 0,3% środek przepuszczalności w PBS. Rozcieńczyć 10% normalną surowicę kozią w PBS jako bufor blokujący. Rozcieńczyć przeciwciało prestyny w stosunku 1:200 w buforze blokującym. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z Alexa488 w stosunku 1:600 w buforze blokującym. Rozcieńczyć izotiocyjanian falloidyny-tetrametylorodaminy B w stosunku 1:200 w PBS.
  6. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy (patrz Tabela Materiałów): Przygotować pożywkę L-15 Leiboviza zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2).
  7. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy (patrz Tabela materiałów).

2. Nagrywanie ABR

UWAGA: Zapis ABR został wcześniej szczegółowo opisany w naszym poprzednim badaniu9.

  1. Szczury Sprague Dawley (SD) (1-14-dniowe młode i 2-miesięczne dorosłe osobniki, obu płci) należy znieczulić pojedynczym wstrzyknięciem 1,5% pentobarbitalu sodu (22 mg/kg dla młodych i 30 mg/kg dla dorosłych, dootrzewnowo (i.p.)).
  2. Umieść znieczulone zwierzę w formie z pianki polietylenowej, aby unieruchomić ciało zwierzęcia. Umieść zwierzę na stole antywibracyjnym w pomieszczeniu tłumiącym dźwięk. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą poduszki grzewczej.
  3. Przetrzyj obszar głowy 70% (vol/vol) etanolem. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj 1-2 mm nacięcie brzuszno-boczne do zewnętrznej małżowiny usznej, aby umieścić elektrodę odniesienia lub masę. Podskórna elektroda igłowa (elektroda rejestrująca) znajduje się nad wierzchołkiem czaszki (Rysunek 1A).
  4. Korzystając z generatora funkcyjnego, generuj skalibrowane impulsy tonów (narastanie/opadanie 1 ms, plateau 3 ms) o różnych częstotliwościach (2, 4, 8, 16, 24 i 32 kHz) i natężeniach (zmniejszone z 85 do 10 dB SPL w kroku 5 dB). Zmieniaj częstotliwość i amplitudę ręcznie lub za pomocą komputera. Dostarczaj bodźce dźwiękowe przez głośnik elektrostatyczny umieszczony w odległości 10 cm w kierunku głowy zwierzęcia.
  5. Filtruj (100-1,000 Hz), wzmacniaj i uśredniaj (256 razy) potencjał generowanego dźwięku za pomocą wielofunkcyjnego procesora, aby uzyskać ABR. Ślady ABR są monitorowane online i przechowywane do analizy w trybie offline. Wykonanie nagrania ABR z jednego zwierzęcia zajmuje około 40 minut.
    UWAGA: Zazwyczaj można zidentyfikować od trzech do siedmiu szczytów (od fali I do fali VII) z opóźnieniami mniejszymi niż 15 ms (Rysunek 1B). Próg ABR definiuje się jako minimalny poziom dźwięku, przy którym można wykryć falę I i II.
  6. Poddaj się eutanazji, zanim zwierzęta obudzą się ze znieczulenia (z dootrzewnowym wstrzyknięciem 0,3 ml 1,5% pentobarbitalu sodu).

3. Sekcja narządów Cortiego (OC)

  1. Znieczulić szczenięta szczurów. W przypadku szczurów w wieku poniżej 6 dni (P6 znieczulić zwierzę pojedynczym wstrzyknięciem 1,5% pentobarbitalu sodu (22 mg/kg, i.p.). Odetnij głowę szczeniętom szczura po znieczuleniu.
  2. Wysterylizuj głowę, spryskując ją etanolem o sprysku 70% (obj./obj.).
  3. Otwórz czaszkę wzdłuż strzałkowej linii środkowej nożyczkami; usuń mózg, aby odsłonić ucho wewnętrzne.
  4. Przenieś ucho wewnętrzne na 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 3 ml lodowatego L-15 (Ryc. 2A).
  5. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć kostną torebkę ślimaka (Ryc. 2B).
  6. Rozpakuj OC i związane z nim prążki naczyniowe (SV) od modiolus.
  7. Trzymając podstawową część SV za pomocą kleszczy, całkowicie oddziel OC od SV, powoli rozwijając się od podstawy do wierzchołka (Rysunek 2C).
  8. Pokrój OC równomiernie na trzy części, używając cienkich nożyczek (Rysunek 2D).

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl przenieść segmenty OC (krok 3.8) na szkiełko podstawowe i utrwalić 100 μl 4% paraformaldehydu przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.
  2. Umyj tkankę, wypierając paraformaldehyd 100 μl świeżego PBS. Umyj chusteczkę trzy razy przez 10 minut.
  3. Inkubować tkankę z 0,3% środkiem przepuszczalności w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wyrzucić środek przepuszczalności z PBS i przemyć tkankę trzykrotnie PBS.
  5. Blok z 10% normalną surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubować z przeciwciałem anty-prestyno-C-końcowym (1:200) w roztworze blokującym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  7. Umyć trzy razy PBS przez 5 minut.
  8. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z Alexa488 (1:600) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Umyj trzy razy PBS przez 5 minut w ciemności.
  10. Inkubować z rodaminą-falloidyną (1:200) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Umyj trzy razy PBS przez 5 minut w ciemności.
  12. Montaż na szkiełku podstawowym z medium montażowym (zawierającym DAPI). Obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu laserów 405 nm, 488 nm i 594 nm. Ustaw moc lasera na 0,1-0,5 mW, a prędkość skanowania na 0,5 klatki/s.

5. Nagrywanie izolowanych OHC za pomocą zacisku krosowego

  1. Za pomocą ściągacza do pipet i mikrokucharki można przygotować pipety z końcówką o średnicy 2-3 μm. Uzupełnić pipety roztworem wewnątrzkomórkowym. Zazwyczaj początkowy opór pipety punktowej wynosił 2,5-3,5 MΩ w roztworze kąpielowym.
  2. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl przenieś cząstkę OC (z kroku 3.8) na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Trawić tkankę za pomocą 100 μl pożywki do trawienia enzymatycznego (kolagenaza IV, patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Wyprzeć pożywkę do trawienia enzymatycznego 100 μl L-15. Pokrój tkankę na małe kawałki za pomocą mikroskalpela, aby wyizolować komórki rzęsate.
  4. Po delikatnym pipetowaniu przenieś komórki do domowej roboty małej plastikowej komory (średnica ~ 1,5 cm) wypełnionej roztworem do kąpieli bez enzymów (~ 1,5 ml, patrz tabela materiałów).
  5. Umieść komorę na stoliku mikroskopu odwróconego. Znajdź zdrowo wyglądające samotne OHC.
  6. Załaduj pipetę krosową do stopnia głównego wzmacniacza 700B. Ostrożnie przesuń pipetę z plastrem za pomocą mikromanipulatora i umieść ją wokół dolnej części zewnętrznej komórki włosowatej (Rysunek 3A).
  7. Łatka na całe komórki zaciska OHC, uszczelniając boczną ścianę korpusu komórki. Zastosuj lekkie ssanie, aż błona komórkowa zostanie pęknięta. Ustaw potencjał podtrzymania na -70 mV. Ogniwa o rezystancji dostępu wahały się od 10 do 17 MΩ, a rezystancja błony wahała się od 100 do 500 MΩ i są uważane za udaną konfigurację całych komórek.
  8. Za pomocą sterowania komputerowego zastosuj napięcie hiperpolaryzacyjne i depolaryzacyjne (czas trwania 250 ms i zakres od -140 do +94 mV w krokach co 13 mV) do ogniwa, aby wywołać prądy dla całego ogniwa.
  9. Wzmocnij prądy całego ogniwa, przefiltruj (częstotliwość narożna 5 kHz) za pomocą wzmacniacza 700B. Przekonwertuj dane za pomocą konwertera 1440A i zapisz je do analizy w trybie offline.
  10. Zmierz pojemność membrany OHC za pomocą protokołu dwufalowego bodźca napięciowego kontrolowanego przez oprogramowanie do zacisków krosowych. Ustaw zakres napięcia stymulacji od -140 do 110 mV. Przechowywanie danych do analizy w trybie offline.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ABR można uzyskać od znieczulonych szczurzych szczeniąt starszych niż 7 dzień po urodzeniu (P7) za pomocą czystych impulsów tonalnych (Rysunek 1A). Jak pokazano na Rysunek 1B, przebiegi ABR uzyskane od młodych szczurów pokazywały tylko trzy do czterech wyraźnych fal o małej amplitudzie. Zazwyczaj obserwowano do siedmiu pików w przebiegach ABR u dorosłych zwierząt (Rysunek 1B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U szczurów w wieku poniżej 11 dnia nie zaobserwowano potencjału czynnościowego w odpowiedzi na stymulację dźwiękiem w korze słuchowej 6,7. W związku z tym 11. dzień po porodzie określa się mianem "początku słuchu"10. Rozwój funkcji słuchu przed wystąpieniem słuchu nie został jeszcze dobrze zbadany. Stosując podobną metodę do rejestracji dorosłych osobników ABR, wykazujemy, że ABR mogą być wywołane przez czysty impuls tonalny od młodych szc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Programu 973 (2014CB943002) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (11534013, 31500841).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
znieczulający
Pentobarbital sodowySigmaP37611,5% w wodzie
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Roztwór preparacyjny
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 opakowanie w 1 L wody
Kolagenaza IVSigmaC51382 mg/ml w L-15
HEPESSigma7365-45-910 mM
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Roztwory do barwienia immunologicznego
PBSThermo Fisher Scientific10010023PH 7,3
ParaformaldehydSigma1581274% w PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940,3% w PBS
Normalna surowica koziaThermo Fisher Scientific10000C10% w PBS
przeciwciało prestynySanta CruzSC-22694dil 1:200
Przeciwciało sprzężone Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Izotiocyjanian falloidyny-tetrametylorodaminy BSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
Nazwa FirmaNumer katalogowyUwagi
Roztwór zewnątrzkomórkowy
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 opakowanie w 1 L wody
HEPESSigma7365-45-910 mM
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Roztwór wewnątrzkomórkowy
CsClSigma7647-17-8140
mM MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 mM
HEPESSigma7365-45-910 mM
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt
OsmometrGonotecOSMOMAT 3000 basic
KleszczWPI14095Pęseta Dumont
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentMODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Mini system operacyjnySutter InstrumentMP-285
MultiClampAxon700B
System akwizycji danych o niskim poziomie szumówAxon1440A
ES1 głośnikTucker-Davis Technologies
System TDT 3Tucker-Davis Technologies
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
SigGenRPOprogramowanie Tucker-Davis Technologies
BioSigRPTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NazwaFirma>Numer katalogowyUwagi
Animal
SD szczurCentrum Zwierząt Doświadczalnych Południowego Uniwersytetu
Medycznego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
  3. Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
  4. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  5. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
  6. Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123(2001).
  7. De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826(2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki rz skowe limakaekspresja prestynymikroskopia konfokalnatrawienie tkanekizolacja kom rek rz skowychrejestracja elektrofizjologiczna

Powiązane artykuły