Artykuł metodologiczny

Stworzenie wysokoprzepustowej platformy badań przesiewowych w celu oceny heterogeniczności amplifikacji genu HER2 w raku piersi

DOI:

10.3791/56686

⸱

5 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogeniczny rozkład komórek HER2-dodatnich można zaobserwować w podgrupie nowotworów piersi i rodzi dylematy kliniczne. W tym miejscu przedstawiamy niezawodny i opłacalny protokół definiowania, ilościowego określania i porównywania heterogeniczności genetycznej HER2 wewnątrz guza w dużej serii heterogennie przetworzonych nowotworów piersi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapie celowane przeciwko receptorowi ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) radykalnie zmieniły wyniki leczenia pacjentek z HER2-dodatnim rakiem piersi. Jednak mniejszość przypadków wykazuje niejednorodną dystrybucję komórek HER2-dodatnich, co generuje poważne wyzwania kliniczne. Do tej pory nie zaproponowano wiarygodnych i ustandaryzowanych protokołów charakterystyki i kwantyfikacji heterogenicznej amplifikacji genów HER2 w dużych kohortach. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustową metodologię jednoczesnej oceny statusu HER2 w różnych obszarach topograficznych mnogiego raka piersi. W szczególności ilustrujemy procedurę laboratoryjną mającą na celu skonstruowanie ulepszonych mikromacierzy tkankowych (TMA) obejmujących ukierunkowane mapowanie guzów. Wszystkie parametry TMA zostały specjalnie zoptymalizowane pod kątem hybrydyzacji srebra in situ (SISH) tkanek piersi zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie. Analiza immunohistochemiczna biomarkerów prognostycznych i predykcyjnych (tj. ER, PR, Ki67 i HER2) powinna być wykonywana przy użyciu procedur automatycznych. Wdrożono dostosowany protokół SISH, aby umożliwić wysokiej jakości analizę molekularną wielu tkanek, które zostały poddane różnym procedurom utrwalania, przetwarzania i przechowywania. W tym badaniu dostarczyliśmy dowodu na zasadę, że określone sekwencje DNA mogą być zlokalizowane jednocześnie w różnych obszarach topograficznych mnogich i niejednorodnie przetworzonych raków piersi przy użyciu wydajnej i opłacalnej metody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 to protoonkogen, który ulega nadekspresji i amplifikacji w 15 - 30% wszystkich inwazyjnych nowotworów piersi1,2. Nadekspresję HER2 wnioskuje się o obecności >10% komórek z silnym barwieniem immunohistochemicznym błony (IHC) (3+), podczas gdy amplifikację genu można ocenić, gdy stosunek HER2 / centromerów wynosi ≥2 lub liczba kopii genu wynosi ≥6, po zliczeniu co najmniej 20 komórek przez hybrydyzację in situ (ISH)3.

Niejednorodność genetyczna wewnątrz guza została szeroko opisana w raku piersi, będąc potencjalnie niekorzystnym czynnikiem wpływającym na ocenę biomarkerów i odpowiedź na leczenie4. Według College of American Pathologists (CAP), heterogeniczność HER2 istnieje, jeśli HER2 jest amplifikowany w >5% i <50% naciekających komórek nowotworowych5. Niestety, rzeczywista częstość występowania niejednorodności przestrzennej HER2 w raku piersi pozostaje przedmiotem kontrowersji wśród patologów, przy czym niektórzy autorzy utrzymują, że jest to niezwykle rzadkie zdarzenie, a inni sugerują, że do 40% przypadków to HER2-heterogeny1,5,6,7,8,9,10. Pomimo tego, że mechanizmy biologiczne leżące u podstaw tego stanu nie są jeszcze w pełni wyjaśnione, prognostyczne i kliniczne skutki wewnątrznowotworowej heterogeniczności HER2 są kluczowe dla pacjentek z rakiem piersi11.

Ostatnio, techniki molekularne jasnego pola, takie jak chromogenne ISH (CISH) i srebrne ISH (SISH), okazały się niezawodnymi metodami wykrywania heterogeniczności HER2 w tkankach FFPE, z pewnymi zaletami w porównaniu do fluorescencyjnego ISH (FISH)12. Niestety, masowa analiza pojedynczych przypadków pozostaje niepraktyczna w badaniach naukowych o dużej kohortach. Kilka grup zasugerowało, że połączenie histochemii, IHC i ISH z technologiami TMA może stanowić cenną strategię w badaniach biologii nowotworów13,14,15,16. Dzięki tej powszechnie przyjętej metodzie, próbki tkanek od różnych pacjentów mogą być analizowane jednocześnie, minimalizując ilość stosowanych tkanek i odczynników, a tym samym sprzyjając jednolitej analizie dużej serii przypadków14. Nie są jednak dostępne żadne protokoły jednoczesnej, wysokoprzepustowej charakterystyki molekularnej wielu próbek tkanek, które zostały poddane różnym przetwarzaniu pod względem odczynników, czasów utrwalania i zastosowanych metod konserwacji, takich jak bloki archiwalne.

Biorąc pod uwagę prognostyczne i kliniczne implikacje przestrzennej heterogeniczności HER2 w rakach piersi, opracowaliśmy zintegrowaną platformę molekularną do oceny jej w dużych seriach heterogenicznie przetworzonych przypadków. W tym miejscu przedstawiamy strategie laboratoryjne do generowania i analizowania wewnątrzguzowej heterogeniczności amplifikacji HER2 w wysokowydajnych TMA raka piersi za pomocą SISH. Następujący protokół został opracowany dla guzów mierzących >5 mm (>pT1b zgodnie z TNM 2017)17. W przypadku mniejszych zmian zalecamy wykonanie analizy na pełnych przekrojach seryjnych. Nasza procedura pozwala na jednoczesną analizę IHC i SISH do 30 nowotworów piersi, obejmujących średnio 6 odrębnych obszarów (zakres 4 - 8) dla każdego przypadku. W sumie dla każdego bloku TMA zostanie wygenerowanych 180 rdzeni tkankowych o średnicy 1 mm, z 500 μm między rdzeniami i 2 mm między siatką a krawędziami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalne Komisje Rewizyjne z IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico Hospital, Mediolan, Włochy.

1. Wybór pacjentów i próbek tkanek

  1. Pobierz slajdy archiwalne wszystkich przypadków, które mają być analizowane, w tym wszystkie dostępne preparaty hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz IHC z pierwotnej diagnozy oraz, jeśli występują, jeden H&E dopasowanej nienowotworowej tkanki piersi (np. margines chirurgiczny).
  2. Przeprowadzanie przeglądów przypadków.
    UWAGA: W tym zadaniu co najmniej dwóch patologów z doświadczeniem w patologii piersi powinno omówić szkiełka diagnostyczne i kolegialnie rozstrzygnąć spory. Używaj konwencjonalnego mikroskopu lub narzędzi telepatologicznych (faworyzuj te ostatnie w badaniach wieloośrodkowych). Jeśli występują, wyklucz wszystkie przypadki niezgodności.
    1. Wykonaj histologiczną reklasyfikację wszystkich przypadków zgodnie z najnowszą edycją klasyfikacji nowotworów piersi Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) class18.
    2. Upewnij się, że normalna tkanka w każdym przypadku, jeśli jest obecna w archiwalnych próbkach klinicznych, składa się z co najmniej jednej nienowotworowej końcowej jednostki przewodowo-zrazikowej.
    3. Zidentyfikuj wszystkie obszary nowotworowe, które wykazują niejednorodne cechy cytologiczne, architektoniczne lub IHC, za pomocą mikroskopu jasnego pola (który ma być wykonany wspólnie przez patologa i technika(ów), który skonstruuje TMA).
  3. Zaznacz dyskretne obszary topograficzne markerem na szkiełku lub odpowiednim narzędziem w oprogramowaniu do slajdów cyfrowych (Rysunek 1A).
  4. Na podstawie wybranych slajdów pobierz odpowiednie bloki FFPE z archiwum.
    UWAGA: Aby zoptymalizować konstrukcję TMA, uniknąć zubożenia tkanki i zachować integralność strukturalną stempla TMA, należy wykluczyć przypadki z resztkami tkanki o grubości <1 mm.

2. Projektowanie i konstruowanie TMA w oparciu o technikę Kononen

  1. Utwórz i otwórz nowy plik arkusza kalkulacyjnego zawierający zapisy z różnych obszarów każdej sprawy. Należy uwzględnić następujące dane w oddzielnych kolumnach, jak pokazano w tabeli 1: ID przypadku, identyfikator bloku, identyfikator obszaru, typ tkanki (np. tkanka normalna, histotyp składnika inwazyjnego, histotyp składnika in situ), topografia (np. rdzeń guza, front inwazyjny), morfologia (np. stopień jądrowy, architektura, mitozy, cechy cytologiczne), status biomarkerów (tj. receptor estrogenowy (ER), receptor progesteronu (PR), Ki67 i HER2) oraz wszystkie inne dostępne funkcje IHC.
    1. Zapisz dokument.
  2. Utwórz projekt TMA.
    1. Zainstaluj i otwórz oprogramowanie do projektowania TMA.
    2. Zdefiniuj bloki adresatów TMA: dostęp za pośrednictwem menu Plik > Nowy blok > lub za pomocą CTRL+B.
    3. Kliknij w pierwsze pole, aby wypełnić lub naciśnij Tab, a następnie wpisz wymiary bloku parafinowego: szerokość 35 (mm), wysokość 20 (mm). Wpisz "2" jako wartość "marginesu" (tj. odległość od krawędzi parafiny w mm) (Rysunek 1B). Zapisz dane, klikając odpowiedni przycisk. Nowy szablon bloku biorczego jest teraz zapisany i gotowy do użycia w nowych szablonach matryc tkankowych.
    4. Utwórz projekt tablicy tkankowej: dostęp do menu Plik > Nowy > Tissue Array lub za pomocą CTRL+T.
    5. Wpisz nazwę tablicy tkankowej, komentarze i autora, a następnie kliknij "dalej". Kliknij ikonę "importuj", wybierz plik szablonu wcześniej utworzonego bloku odbiorcy i kliknij "dalej".
    6. Wybierz 1 mm jako rozmiar plamki, klikając okrągły przycisk. Wybierz 500 μm jako odstęp między punktami, który jest przestrzenią między dwoma środkami sąsiednich punktów. Kliknij ikonę kalkulatora, aby obliczyć łączną liczbę utworzonych miejsc, która powinna wynosić 231. Kliknij "Dalej".
    7. Zdefiniuj tryb numeracji miejsc, klikając na niego raz. Kliknij przycisk "zdefiniuj", aby utworzyć siatki i podsiatki. Usuń linię środkową (linię 6) oraz kolumny 8 i 15. Zachowaj 3 miejsca w wierszu 1 dla orientacji. Ostateczna mapa powinna obejmować łączną liczbę 183 miejsc, zgodnie z Rysunek 2.
    8. Zdefiniuj listę typów tkanek: dostęp poprzez menu Plik > Nowy > Lista typów tkanek lub za pomocą CTRL+L.
    9. Wstawić wcześniej zdefiniowane opisy tkanek. Naciśnij strzałkę w dół lub kliknij przycisk +, aby dodać linię.
    10. Zdefiniuj projekt: dostęp za pośrednictwem menu Plik > Nowy projekt > Booster lub za pomocą CTRL+P.
    11. Wpisz nazwę macierzy tkankowej, komentarze i autora, a następnie kliknij "dalej". Zaimportuj plik arkusza kalkulacyjnego, listę typów tkanek i utworzony wcześniej model macierzy tkanek, klikając odpowiednie ikony.
    12. Kliknij "zaznacz wszystko" i określ liczbę plamek dla każdego typu tkanki; kliknij przycisk "dopasuj", aby zastosować ustawienia. Pojawi się tabela z łączną liczbą rdzeni, które zostaną próbkowane i przeniesione do bloków odbiorców w tym projekcie. Zapisz projekt i zamknij program.
  3. Przygotuj blok(i) akceptora (Rysunek 1B).
    1. Oczyszczone formy metalowe napełnić elastyczną parafiną w temperaturze 65 °C.
    2. Pozostaw bloki parafiny do ostygnięcia w temperaturze pokojowej na noc wewnątrz metalowych form.
    3. Wyciągnij bloki parafiny z metalowych form. Jeśli wystąpią pęknięcia, wyrzuć blok i powtórz kroki 2.3.1-2.3.3.
  4. Skonstruuj TMA za pomocą zautomatyzowanego lub półautomatycznego arrayer19.
    1. Pobierz wszystkie wybrane bloki FFPE i odpowiadające im sekcje H&E z adnotacjami.
    2. Włącz arrayer i wstaw blok(i) akceptora (bloki) do karuzeli tablicy.
    3. Otwórz oprogramowanie stacji sterującej macierzem, kliknij "New Tissue Array" i załaduj wcześniej utworzony projekt (Rysunek 1C).
    4. Kliknij "Kontynuuj" i wybierz z menu pozycję bloku (bloków) dawcy.
    5. Określ pozycję początkową na każdym bloku odbiorcy: użyj strzałek, aby przesunąć światło laserowe i wyrównać je z lewą górną krawędzią parafiny bloku odbiorcy.
    6. Kliknij "dalej" i powtórz dla wyrównania w pionie.
    7. Kliknij "dalej", aby automatycznie utworzyć otwór w wcześniej zdefiniowanej współrzędnej bloku odbiorcy (akceptora).
    8. Opróżnij stempel.
    9. Ustaw blok dawcy do pobrania próbki i usuń rdzeń tkankowy z wcześniej opisanego obszaru zainteresowania.
    10. Włóż rdzeń tkanki dawcy do otworu w bloku biorcy (akceptora).
    11. Usuń blok dawcy z macierzy.
    12. Powtarzaj kroki 2.4.5-2.4.11, aż TMA zostanie zakończony.
  5. Umieścić stronę tkankową nowo utworzonego bloku TMA na sterylnym czystym szkiełku podstawowym i umieścić je w piecu laboratoryjnym w temperaturze 45 °C na 5 minut.
  6. Delikatnie dociśnij klocek na szkiełku przez 5 sekund, aby spłaszczyć rdzenie tkanek. Powtórz raz (w sumie 2 razy).
  7. Wyjmij blok TMA wraz ze zjeżdżalnią z piekarnika, odwróć je i delikatnie odłącz blok od zjeżdżalni.
  8. Pokryć powierzchnię tkanki TMA cienką warstwą elastycznej parafiny w temperaturze 65 °C.
  9. Pozostaw blok TMA w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
  10. Przenieść blok TMA w temperaturze 4 °C przez 24 h.
    UWAGA: Blok TMA może być przechowywany w temperaturze 4 °C aż do wyczerpania.

3. Analizy histochemiczne i immunohistochemiczne

  1. Wytnij sekcje TMA.
    1. Umieść blok(i) akceptora TMA stroną parafinową do dołu na powierzchni o temperaturze -10 °C na 10 minut, aby schłodzić parafinę.
    2. Napełnić kąpiel pływakową ultraczystą wodą i ustawić temperaturę 38 °C.
    3. Umieść nowe ostrze na obrotowym mikrotomie i włóż blok do uchwytu mikrotomu tak, aby blok wosku był skierowany w stronę ostrza i był wyrównany w płaszczyźnie pionowej.
    4. Ostrożnie podejdź do bloku z ostrzem i wytnij kilka cienkich odcinków, aby upewnić się, że ustawienie jest prawidłowe; wyreguluj, jeśli to konieczne.
    5. Wytnij odcinki o grubości 3 μm.
    6. Podnieś skrawki za pomocą pęsety i unieś je na powierzchni kąpieli wodnej.
    7. Wyciągnij sekcje z kąpieli wodnej na szkiełkach zwykłych i IHC/ISH.
    8. Umieść szkiełka na ruszcie i przechowuj je przez noc w piekarniku w temperaturze 45 °C.
      UWAGA: Raz przygotowane skrawki TMA należy wybarwić w ciągu 24 godzin.
  2. Wykonaj barwienie histochemiczne (H&E) za pomocą automatycznego stainera.
    1. Włóż szkiełka do stojaka na markery i umieść je w temperaturze 60 °C na 10 minut.
    2. Otwórz szufladę załadunkową automatycznego stainera i włóż stojak z prowadnicami TMA do jednej ze stacji ładowania ze standardowym klipsem H&E skierowanym na zewnątrz.
    3. Po zamknięciu szuflady klips zostanie automatycznie rozpoznany przez system i rozpocznie się następujący protokół: stacja piekarnika w temperaturze 37 °C (6 min), ksylen (2 min), ksylen (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min), woda destylowana (4 min), hematoksylina Carazziego (9 min), Woda bieżąca pod niskim ciśnieniem (2 min), eozyna 1% (1 min), woda bieżąca pod niskim ciśnieniem (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 100% (15 s), etanol 100% (15 s), ksylen (30 s), ksylen (30 s).
    4. Wyjmij półki z szuflady i zamontuj prowadnicę z szkiełkiem nakrywkowym.
      1. Zebrać kroplę mocowania za pomocą pipety i umieścić ją na zewnętrznej krawędzi szkiełka pokrywującego.
      2. Umieść mokrą stronę szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i pozostaw uchwyt do wyschnięcia na 30 minut.
  3. Wykonaj barwienie IHC dla ER, PR, Ki67 i HER2 za pomocą automatycznego immunostainera.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem barwienia uruchom system i sprawdź butelki z odczynnikami eksploatacyjnymi (tabela materiałów) i pojemniki na odpady.
    1. Umieść szkiełka TMA do analizy w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
    2. Uruchom przyrząd do badania immunologicznego i oprogramowanie.
    3. W widoku głównym kliknij przycisk Protokoły, a następnie kliknij polecenie Utwórz/edytuj protokoły.
    4. Wybierz standardową procedurę IHC DAB (3, 3'-diaminobenzydyna), aby zmodyfikować szablon podstawowy.
    5. Oznacz "Deparafinowanie" na liście pól i ustaw temperaturę medium na 72 °C.
    6. Oznaczyć roztwór demaskujący cc1, ustawić temperaturę medium na 95 °C, a czas inkubacji na 36 min.
    7. Oznacz pudełko z przeciwciałem pierwotnym, wprowadź identyfikator wbudowanego dozownika ER (oprogramowanie przyrządu rozpozna dozownik na karuzeli odczynników) i ustaw czas inkubacji na 16 minut.
    8. Oznacz pole Barwienie przeciwstawne, wybierz Hematoxylin I i ustaw czas inkubacji na 12 min.
    9. Kliknij przycisk "Zapisz jako" i nazwij protokół.
    10. Powtórzyć kroki 3.3.3-3.3.9 dla pozostałych przeciwciał, stosując następujące czasy inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych: PR 16 min, Ki67 16 min i HER2 12 min. Użyć wstępnie rozcieńczonych przeciwciał gotowych do użycia (RTU).
    11. W widoku głównym kliknij przycisk Utwórz etykietę.
    12. Kliknij przycisk Protokoły i dodaj protokoły ER, PR, Ki67 i HER2 dla każdego z TMA do analizy.
    13. Kliknij przycisk Zamknij /Drukuj.
    14. Po wyświetleniu szablonu etykiety wprowadź identyfikatory TMA dla etykiety.
    15. Kliknij przycisk Drukuj, aby wydrukować etykiety, a następnie zastosuj je na slajdach TMA.
    16. Kliknij ikonę instrumentu i ustaw tryb uruchamiania instrumentu na "Gotowy".
    17. Otwórz kaptur zakrywający karuzelę z odczynnikami, umieść system wykrywania i przeciwciała pierwotne, a następnie zamknij kaptur.
    18. Kliknij przedni przycisk na szufladzie na prowadnicach, aby ją otworzyć, załaduj prowadnice TMA i zamknij szufladę, klikając ten sam przycisk.
    19. Ustaw tryb uruchamiania instrumentu na "Uruchomiony" i postępuj zgodnie z instrukcjami.
    20. Pod koniec cyklu rozładuj szkiełka TMA, naciskając przycisk Otwórz wszystkie szuflady z ukończonymi prowadnicami na przyrządzie Slide Control i wypłucz je w ciepłej wodzie z mydłem, aby usunąć wszelkie pozostałe odczynniki.
    21. Umyj szkiełka pod zimną bieżącą wodą pod niskim ciśnieniem, odwodnij szkiełka TMA i nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na każde szkiełko.
  4. Przeprowadzić analizę IHC ER, PR i HER2 zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (ASCO)/CAP oraz Ki67 zgodnie z zaleceniami międzynarodowej grupy roboczej Ki67 w raku piersi (Tabela 2).
    UWAGA: Ta analiza powinna być wykonywana oddzielnie w dyskretnych miejscach tkankowych przez patologa z doświadczeniem w patologii piersi.
    1. Oceń wyrażenie ER jako pozytywne, jeśli ≥ 1% jąder komórek nowotworowych jest immunoreaktywnych20,21,22,23.
    2. Oceń wyrażenie PR jako pozytywne, jeśli ≥ 1% jąder komórek nowotworowych jest immunoreaktywnych20,21,22,23.
    3. Oceń ekspresję HER2 jako: a) wynik 3+, jeśli barwienie błony obwodowej jest pełne i intensywne, b) wynik 2+, jeśli barwienie błony obwodowej jest niepełne i/lub słabe/umiarkowane i mieści się w granicach > 10% inwazyjnych komórek nowotworowych lub całkowite i obwodowe barwienie błony jest intensywne i mieści się w granicach ≤ 10% od inwazyjnych komórek nowotworowych, c) Wynik 1+, jeśli niepełne zabarwienie błony jest słabe/ledwo zauważalne i w odległości > 10% od inwazyjnych komórek nowotworowych, d) negatywne, jeśli nie ma barwienia lub barwienie błony jest niepełne i słabe/ledwo zauważalne oraz w granicach ≤ 10% inwazyjnych komórek nowotworowych3,24.
    4. Oceń indeks Ki67 jako procent komórek z barwieniem jądrowym w co najmniej 1000 komórkach nowotworowych losowo wybranych w 10 polach o dużej mocy (powiększenie, 400X)25.

4. Analiza SISH HER2

  1. Wytnij odcinki TMA (powtórz krok 3.1).
  2. Wykonaj SISH dla HER2 za pomocą automatycznego immunostainera.
    1. Umieść szkiełka TMA do analizy w temperaturze 60 °C przez 10 minut.
    2. Uruchom przyrząd do badania immunologicznego i oprogramowanie.
    3. W widoku głównym kliknij przycisk Protokoły, a następnie kliknij polecenie Utwórz/edytuj protokoły.
    4. Wybierz procedurę "U Dual ISH CKT", aby zmodyfikować szablon podstawowy.
    5. Oznacz "Suszenie" na liście pól i ustaw temperaturę na 63 °C na 20 minut.
    6. Na liście pól należy oznaczyć "Kondycjonowanie komórek", a następnie "Kondycjonowanie komórek CC2" i ustawić temperaturę na 86 °C, a czas inkubacji na 4 minuty.
    7. Oznacz CC2 jako łagodny (cykl 1), standardowy (cykl 2) i rozszerzony (cykl 3) odpowiednio na 8 minut, 12 minut i 8 minut.
    8. Oznacz "ISH-Protease 3" na liście pól i ustaw czas inkubacji na 16 min.
    9. Wybierz sondy HER2DNP i CHR17DIG i ustaw czas inkubacji na 6 godzin.
    10. Ustaw pranie na 76 °C na 8 min.
    11. Ustawić czas inkubacji multimeru SISH (SIL ISH DNP HRP) na 32 min.
    12. Ustawić czas inkubacji chromogenu srebra (SIL ISH DNP CHRC) na 4 min.
    13. Ustaw czas inkubacji czerwonego multimeru (RED ISH DIG AP) na 24 min.
    14. Ustaw czas inkubacji czerwonego chromogenu (RED ISH DIG FR) na 8 min.
    15. Zaznacz "Barwienie przeciwstawne" na liście pól, wybierz "HEMATOXYLIN II" i ustaw czas inkubacji na 8 min.
    16. Zaznacz "Post-Counterstaining" na liście pól, wybierz "ODCZYNNIK NIEBIESZCZENIA" i ustaw czas inkubacji na 4 min.
    17. Powtórz kroki z 3.3.11-3.3.15 (wybierz zmodyfikowany protokół U Dual ISH CKT).
    18. Otwórz kaptur zakrywający karuzelę z odczynnikami, umieść mycie i systemy wykrywania ISH, a następnie zamknij kaptur.
    19. Powtórz kroki z 3.3.18-3.3.21.
  3. Wykonaj analizę SISH dla HER2: oceń amplifikację genu HER2 jako pozytywną, jeśli stosunek HER2/CEP17 wynosi ≥2,0 ze średnią liczbą kopii HER2 ≥4,0 sygnałów na komórkę i ujemną, jeśli stosunek HER2/CEP17 wynosi <2,0 przy średniej liczbie kopii HER2 <4,0 sygnałów/komórka3,24,
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku IHC, analiza ta powinna być wykonywana oddzielnie w dyskretnych miejscach tkanek przez patologa z doświadczeniem w patologii piersi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogółem, 444 inwazyjne nowotwory piersi zostały włączone do 15 TMA specjalnie zoptymalizowanych do analiz ISH. Spośród 2 664 miejsc objętych próbą, 2 651 (99,5%) było reprezentatywnych dla wcześniej wybranych obszarów i w związku z tym zostało uznanych za nadające się do kolejnych analiz. Heterogeniczność wewnątrz guza określono za pomocą IHC i SIH, ze szczególnym uwzględnieniem heterogenicznego rozmieszczenia klonów HER2-dodatnich w różnych obszarach topograficznych guzów. Tabela ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy strategie laboratoryjne do przeprowadzania analiz SISH genu HER2 i odpowiadającego mu centromeru w wysokowydajnych TMA heterogennie przetworzonych raków piersi. Metoda ta jest opłacalna i może być przeprowadzana w większości laboratoriów w celu zbadania heterogeniczności amplifikacji genu HER2 w dużych kohortach nowotworów piersi pobranych z archiwów patologicznych.

Ze względu na kliniczne znaczenie badań HER2 w raku piersi i wyzwania zwią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Niemcy, UE39601006Podłoże do zatapiania tkanek, 56 & deg; C Temperatura topnienia
Eozyna Y  1% roztwór wodnyBio Optica, Mediolan, Włochy, UE510002Eozyna żółtawa, rozpuszczalna w wodzie
Carazzi' s hematoxylinBio Optica, Mediolan, Włochy,506012UE Ałun hematoksylina dojrzewająca przy użyciu jodanu potasu
Diamentowa jakośćLaboindustria, Arzergrande, Włochy, UE33533Szkiełka mikroskopowe 26x76 mm Leica
CV Mount LeicaBiosystems, Wetzlar, Niemcy, UE14046430011Podłoże montażowe, bez monomerów, na bazie polimerów metakrylanu butylu w ksylenach
Szkiełka mikroskopowe FLEX IHCAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Powlekane szkiełka mikroskopowe do adhezji FFPE do stosowania w
BenchMark ULTRAVentana, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSystem barwienia szkiełek
CONFIRM Receptor anty-estrogenowy (ER) (SP1) Monoklonalne przeciwciało pierwotne królikaVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Przeciwciało pierwotne, gotowe do użycia
POTWIERDŹ receptor anty-progesteronowy (PR) (1E2) Monoklonalne przeciwciało pierwotne królikaVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Przeciwciało pierwszorzędowe, gotowe do użycia
POTWIERDŹ anty-Ki-67 (30-9) Monoklonalne przeciwciało pierwotne królikaVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Przeciwciało pierwszorzędowe, gotowe do użycia
PATHWAY HER2 (4B5) Monoklonalne przeciwciało pierwotne królikaVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Przeciwciało pierwotne, gotowe do użycia
ultraView Uniwersalny zestaw do wykrywania DABSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA760-500Pośredni, niezawierający biotyny system do wykrywania mysich przeciwciał pierwotnych IgG, mysich IgM i królików
INFORM HER2 Podwójna sonda DNA ISH KoktajlSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA780-4422Test INFORM HER2 Dual ISH - Dwukolorowa hybrydyzacja in situ Zatwierdzony przez FDA automatyczny test do określania statusu genu HER2 u pacjentek z rakiem piersi 
ultraView Srebrny zestaw detekcyjny ISH DNPSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Czerwony zestaw detekcyjny ISH DIGSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana, Tucson, AZ, USA780-4149Stosowany w procesie ISH do usuwania białka otaczającego docelowe sekwencje DNA
HematoksylinaSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA760-2021Zmodyfikowany odczynnik do barwienia hematoksyliną Gilla Hematoksylina
II Przeciwbarwiącysystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA790-2208Zmodyfikowany odczynnik do barwienia hematoksyliny Meyera
Odczynnik do odniebieszczaniaSystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA760-2037Wodny roztwór buforowanego węglanu litu do niebieszczenia skrawków barwionych hematoksyliną na szkiełkach
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Bufor na bazie formamidu do testów ISH
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Koncentrat roztworu do usuwania parafiny z próbek tkanek podczas reakcji IHC i ISH oraz do rozcieńczenia 1:10.
Bufor SSC (10X)System medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA950-110Roztwór buforowy chlorku sodu i cytrynianu sodu służy do rygorystycznego mycia i płukania szkiełek między etapami barwienia i zapewnia stabilne środowisko wodne dla reakcji hybrydyzacji in situ. Rozcieńczyć 1:5.
System medyczny ULTRA LCSVentana, Tucson, AZ, USA650-210Wstępnie rozcieńczony (gotowy do użycia) roztwór szkiełka nakrywkowego stosowany jako bariera między odczynnikami wodnymi a powietrzem w celu zapobieżenia parowaniu w reakcjach IHC i ISH
Bufor reakcyjny (10x)System medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA950-300Roztwór buforowy na bazie Tris (pH 7,6 ± 0,2) do płukania szkiełek między etapami barwienia podczas IHC i ISH. Rozcieńczyć 1:10.
Kondycjonowanie komórek ULTRA (ULTRA CC2)System medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA950-223Etapy obróbki wstępnej w przetwarzaniu próbek tkanek podczas IHC i ISH. Gotowy do użycia.
Kondycjonowanie komórek ULTRA (ULTRA CC1)System medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IISystem medyczny Ventana, Tucson, AZ, USA780-003Gotowy do użycia roztwór do płukania szkiełek między etapami barwienia IHC i ISH
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Niemcy, UERM 2255Automatyczny mikrotom obrotowy
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Niemcy, EUST 5020Stacja robocza do automatycznego barwienia i szkiełek nakrywkowych
Minicore 1Alphelys, Plaisir, Francja, UE00-MICO-1Półautomatyczna matryca do budowy TMA z wbudowanym oprogramowaniem TMA Designer 2
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Niemcy, UEK080254Urządzenie do przechwytywania obrazów - cyfrowy skaner patomorfologiczny
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe BV4135Kaseta
Tissue-Tek Paraform Standardowa forma bazowaSakura Finetek Europe BV7055Forma z metalu nieszlachetnego ze stali nierdzewnej
systemie medycznym IHCSystem medyczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923(2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. , Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. , 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93(2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Heterogeniczno raka piersisrebrna hybrydyzacja in situtworzenie mikroarray tkankowegoutrwalenie w formalinie i zatopienie w parafinieanaliza immunohistochemicznaenumeracja chromosom w HER2mapowanie obszar w topograficznychautomatyczny aparat do barwienia immunohistochemicznego

Powiązane artykuły