Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zmodyfikowanego labiryntu T do oceny wyników pamięci funkcjonalnej po zatrzymaniu krążenia

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56694

⸱

5 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Louisiana State University Health Science Center, 2Center for Brain Health, Louisiana State University Health Science Center, 3Department of Cellular Biology and Anatomy, Louisiana State University Health Science Center, 4Department of Neurology, Cerebral Vascular Disease Research Laboratories, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Biomedical Sciences, West Virginia School of Osteopathic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie zmodyfikowanego labiryntu T do oceny funkcjonalnego uczenia się/pamięci w niedokrwieniu mózgu wywołanym zatrzymaniem krążenia.

Streszczenie

Tło: Ocena łagodnego do umiarkowanego upośledzenia funkcji poznawczych w globalnym modelu niedokrwienia mózgu (np. zatrzymania krążenia) może być trudna z powodu słabej lokomocji po operacji. Na przykład szczury, które przechodzą zabiegi chirurgiczne i są poddawane labiryntowi wodnemu Morrisa, mogą nie być w stanie pływać, co unieważnia eksperyment.

Nowa metoda: Stworzyliśmy zmodyfikowany test T-labiryntu spontanicznej przemiany behawioralnej. Główną zaletą zmodyfikowanego protokołu T-maze jest jego stosunkowo prosta konstrukcja, która jest wystarczająco potężna, aby ocenić funkcjonalne uczenie się/pamięć po niedokrwieniu. Dodatkowo analiza danych jest prosta i nieskomplikowana. Użyliśmy labiryntu T do określenia deficytów uczenia się / pamięci szczurów zarówno w obecności, jak i braku łagodnego do umiarkowanego (6 min) uduszonego zatrzymania krążenia (ACA). Szczury mają naturalną tendencję do eksploracji i będą eksplorować alternatywne ramiona w labiryncie T, podczas gdy szczury z uszkodzeniem hipokampa mają tendencję do przyjmowania preferencji bocznej, co skutkuje zmniejszeniem spontanicznych współczynników naprzemienności, ujawniając funkcjonalne uczenie się / pamięć związaną z hipokampem w obecności lub braku ACA.

Wyniki: Grupy ACA mają wyższe współczynniki preferencji ubocznych i niższe zmiany w porównaniu do grupy kontrolnej.

Porównanie z istniejącymi metodami: Woda Morrisa i labirynt Barnesa są bardziej widoczne w ocenie funkcji uczenia się/pamięci. Jednak labirynt wodny Morris jest bardziej stresujący niż inne labirynty. Labirynt Barnesa jest szeroko stosowany do pomiaru pamięci referencyjnej (długotrwałej), podczas gdy deficyty neurokognitywne wywołane przez ACA są ściślej związane z pamięcią roboczą (krótkotrwałą).

Wnioski: Opracowaliśmy prostą, ale skuteczną strategię wyznaczania pamięci roboczej (krótkotrwałej) za pomocą labiryntu T w naszym globalnym modelu niedokrwienia mózgu (ACA).

Wprowadzenie

Według American Heart Association (2017), śmiertelność spowodowana zatrzymaniem krążenia (CA) występuje co cztery minuty i dotyka ponad 400 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych1. Jest dobrze udokumentowane, że CA może powodować uszkodzenie neuronów mózgu w wyniku niedostatecznej perfuzji krwi2,3,4. Uszkodzenie mózgu wywołane przez CA występuje w wrażliwym na niedokrwienie regionie CA1 hipokampa5,6,7, wpływając na neurony, które są kluczowe dla uczenia się i pamięci8,9,10,11,12. Co więcej, utrata gęstości kolców dendrytycznych w warunkach niedokrwiennych w hipokampie (tj. neuronach CA1) odgrywa kluczową rolę w upośledzeniu pamięci przestrzennej13,14,15. Ze względu na te patologiczne zmiany po CA częściej występują zaburzenia zachowania, takie jak: lęk, depresja, zespół stresu pourazowego i utrata pamięci. Chociaż nastąpił postęp w technologii medycznej (tj. wydajna usługa ambulatoryjna), które korelują z lepszymi wskaźnikami przeżycia CA, większość terapii neuroprotekcyjnych (z wyjątkiem hipotermii) nie poprawia wyników funkcjonalnych po CA16,17. Osoby, które przeżyły CA, zazwyczaj mają niską jakość życia i są obciążone rosnącymi wydatkami medycznymi16.

Ocena stanu poznawczego niedokrwienia mózgu za pomocą testów behawioralnych jest ważna dla określenia zarówno skuteczności leku, jak i ostatecznie opracowania udanego badania klinicznego. W latach czterdziestych XX wieku Edward Tolman zaprojektował pierwszą próbę behawioralną do badania pamięci przestrzennej opartej na hipokampie18. Następnie opracowano różne labirynty (tj. labirynt wodny Morrisa, labirynt promieniowy, labirynt T lub Y oraz labirynt Barnesa) w celu oceny uczenia się przestrzennego i pamięci opartej na hipokampie u szczurów19,20,21,22,23. Jednym z częściej stosowanych testów behawioralnych jest labirynt wodny Morrisa, który bada uczenie się przestrzenne i pamięć w modelach szczurów24. Jednak labirynt wodny Morrisa wymaga od szczura pływania i sprawowania pełnej funkcji motorycznej i kontroli. W przypadku eksperymentów niedokrwiennych, takich jak model uduszonego zatrzymania krążenia (ACA, szczurzy model CA), wymagana jest kaniulacja tętnicy/żyły udowej w celu uzyskania niezbędnego ciśnienia krwi, gazometrii krwi i wprowadzenia różnych leków. Ponieważ kaniulacja tętnicy udowej / żyły może hamować ruchomość nóg, powodując zdolność szczura do prawidłowego pływania, labirynt wodny Morrisa może nie być najbardziej odpowiedni do testowania zaburzeń poznawczych w ramach ACA.

Labirynt Barnesa jest drugim powszechnie używanym testem behawioralnym do badania uczenia się przestrzennego i pamięci w modelach gryzoni. Labirynt Barnesa nie wymaga wysiłku pełnej funkcji motorycznej i kontroli, a co za tym idzie jest mniej stresujący niż labirynt wodny Morrisa. W przeszłości przeprowadziliśmy eksperymenty z wykorzystaniem labiryntu Barnesa, aby określić, czy różnice w funkcjonalnym uczeniu się / pamięci występują między szczurami kontrolnymi lub pozorowanymi a szczurami indukowanymi ACA. Dane uzyskane dla labiryntu Barnesa nie miały rozdzielczości pozwalającej na testowanie zaburzeń poznawczych po łagodnym do umiarkowanego ACA ze względu na fakt, że labirynt Barnesa jest szeroko stosowany do pomiaru pamięci referencyjnej (długotrwałej)25,26, podczas gdy deficyty neurokognitywne wywołane przez ACA są ściślej związane z pamięcią roboczą (krótkotrwałą)27,28,29,30 sugerujący, że labirynt Barnesa jest mniej przydatny do oceny funkcji pamięci w naszym modelu ACA.

Opracowaliśmy więc zmodyfikowany labirynt T, wykorzystując spontaniczny test naprzemienny do oceny pamięci roboczej (krótkotrwałej) po ACA. Główną zaletą zmodyfikowanego testu spontanicznej przemiany labiryntu T-maze jest jego prostota i minimalny stres dla szczurów w porównaniu z innymi testami behawioralnymi ze względu na fakt, że zmodyfikowany labirynt T nie wymaga wcześniejszego szkolenia zwierząt, a także ciężkiej analizy obliczeniowej lub podprogramów (tj. obrazowania wideo szczura), jak wymaga tego labirynt wodny Morrisa i labirynt Barnesa. Tutaj pokazujemy, że zmodyfikowany test spontanicznej przemiany labiryntu T-labirynt jest prostym, a jednocześnie bardzo skutecznym paradygmatem próby behawioralnej, który może zaoferować wystarczającą rozdzielczość, aby dokładnie wykryć i ocenić funkcję hipokampa w chorobach powodujących utratę pamięci krótkotrwałej (tj. ACA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (LSU Health Sciences Center-Shreveport) w zakresie wykorzystania samców szczurów Sprague Dawley (300-350 g, w wieku 9-10 tygodni). Szczury pozostawiono na czczo przez noc przed operacją ACA.

1. Projekt i konfiguracja aparatury labiryntu T

UWAGA: Konstrukcję labiryntu w kształcie litery T należy oprzeć na modelu Deacona i Rawlinsa z 2006 roku31.

  1. Zaprojektuj strukturę 3D labiryntu, wykorzystując program SketchUp32. Aby stworzyć strukturę 3D labiryntu w kształcie litery T, wykonaj ramię startowe o długości zewnętrznej 200 mm, szerokości 165 mm i wysokości 148 mm, aby zmieściło się w wymiarach druku drukarki 3D. Zastosuj grubość ścianek 5,5 mm oraz grubość podłogi 8 mm.
  2. Wydrukuj labirynt za pomocą drukarki 3D (patrz tabela materiałów)32. Jeśli w laboratorium nie ma drukarki 3D, użyj innych materiałów, takich jak drewno, płyta MDF lub tworzywo sztuczne (np. polichlorek winylu), które można kupić w sklepach budowlanych.
    1. Ze względu na ograniczenia wysokości obszaru druku, wykonaj ścianki labiryntu w dwóch osobnych wydrukach 3D i połącz je podczas montażu labiryntu (tj. do sekcji labiryntu dodano drugą wysokość ścianki, aby zwiększyć wysokość o 140 mm, co dało całkowitą wysokość ścianek 280 mm). Każda osobna podstawa wydruku 3D zawierała mechanizm blokujący w kształcie litery „T”, w którym jedna sekcja łączyła się z następną.
    2. Na styku ramienia startowego z ramionami celu stwórz sekcję o szerokości 165 mm, aby połączyć szerokość ramienia startowego z szerokością ramion celu. Wykonaj ramiona celu, stosując podobną metodę projektowania jak w przypadku ramienia startowego; jednak zmniejsz szerokość ramienia do 100 mm zgodnie z projektem Deacona i Rawlinsa.
    3. Szczegółowy schemat i wymiary labiryntu T znajdują się na Rysunku 1.
    4. Wprowadź do projektu przegrodę środkową na styku ramienia startowego i ramion celu. Przedłuż tę przegrodę od tylnej ścianki labiryntu T na 200 mm do wnętrza ramienia startowego, aby oddzielić ramiona celu. Przegroda ta zwiększała również wysokość labiryntu (Rysunek 1).

2. Asfyktyczne zatrzymanie krążenia (ACA)

  1. Przed rozpoczęciem operacji wysterylizować narzędzia chirurgiczne w autoklawie (121 °C przez 15 min). Zdezynfekować stół operacyjny 70% etanolem przez 15 min. Ogolić sierść zwierzęcia w miejscu operacji. Nałożyć roztwór betadyny na powierzchnie skóry w miejscu zabiegu.
  2. Znieczulenie
    1. Znieczulić szczury 4% izofluranem oraz mieszanką O2 i N2O w proporcji 30:70 (300 mL/min O2 i 700 mL/min N2O) za pomocą maski.
    2. Wykonać intubację endotrachealną szczurów w celu zapewnienia wentylacji mechanicznej (po intubacji szczury podłączono do respiratora).
    3. Podtrzymać znieczulenie, obniżając stężenie izofluranu z 4% do 2% przy mieszance O2 i N2O w proporcji 30:70. Głębokość znieczulenia określić metodą reakcji na uszczypnięcie.
    4. Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas znieczulenia. Regulować temperaturę ciała za pomocą maty grzewczej dla gryzoni z sondą analną jako referencją temperatury.
  3. Intubacja endotrachealna
    1. Umieścić szczura w komorze indukcyjnej. Znieczulić szczury 4% izofluranem i mieszanką O2 i N2O w proporcji 30:70.
    2. Wyjąć szczura z komory indukcyjnej. Umieścić znieczulone zwierzę w pozycji na plecach, z pyszczkiem skierowanym w stronę maski do znieczulenia.
    3. Za pomocą lewego kciuka i palca wskazującego delikatnie przesunąć język zwierzęcia w lewo lub w prawo.
    4. Nasunąć elastyczny cewnik dożylny 14G (długość 49 mm) na igłę pipetującą z tępym końcem 17G (długość 93 mm, kąt 10 stopni na końcówce). Wprowadzić igłę pipetującą z tępym końcem 17G do tchawicy.
    5. Delikatnie wysunąć igłę pipetującą 17G z tchawicy. Połączyć nasadę cewnika 14G z respiratorem. Ustawić objętość oddechową respiratora na 0,67 mL/100 g i częstość oddechów na 60 oddechów/min.
    6. Podtrzymać temperaturę głowy i ciała na poziomie 37 °C podczas całej procedury za pomocą maty grzewczej dla gryzoni z sondą analną jako referencją temperatury.
  4. Kanulacja tętnicy i żyły udowej
    1. Ogolić sierść w okolicy pachwinowej (po obu stronach) i nałożyć betadynę na powierzchnie skóry w miejscu operacji.
    2. Umieścić szczura w pozycji na plecach. Wykonać nacięcie (10 mm) w okolicy pachwinowej za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    3. Rozdzielić tkankę łączną pęsetą z tępym końcem, aż do odsłonięcia więzadła pachwinowego. Użyć hemostatu do uchwycenia więzadła pachwinowego. Tętnica i żyła udowa znajdują się pod więzadłem pachwinowym.
    4. Użyć pęsety z tępym końcem do rozdzielenia tkanki łącznej, aż do odsłonięcia tętnicy i żyły udowej.
    5. Za pomocą pęsety z cienkim końcem delikatnie odsunąć nerw udowy biegnący wzdłuż tętnicy udowej. Ostrożnie oddzielić tętnicę i żyłę udową jako jedną jednostkę za pomocą pęsety z cienkim końcem.
    6. Użyć pęsety z cienkim końcem do oddzielenia tętnicy udowej od żyły.
    7. Umieścić dwa fragmenty szwu jedwabnego 5-0 (jeden w stronę nogi, drugi w stronę ciała) pod żyłą.
    8. Związać luźny węzeł po stronie ciała. Użyć hemostatu, aby utrzymać i odciągnąć szew jak najdalej w stronę przeciwległej części ciała.
    9. Związać luźny węzeł po stronie nogi. Przytrzymać i odciągnąć szew w stronę nogi za pomocą hemostatu, aby umożliwić napełnienie żyły krwią.
    10. Wykonać małe nacięcie w żyle (około 0,1 mm) za pomocą mikro-nożyczek chirurgicznych (pod kątem 45°). Wchłonąć krew za pomocą sterylnej gazy.
    11. Podłączyć strzykawkę z igłą o tępym końcu (wypełnioną solą fizjologiczną z heparyną 20 U/mL) do cewnika PE-50. Wypełnić cewnik PE-50 solą fizjologiczną z heparyną 20 U/mL. Odciąć cewnik PE-50 nożyczkami chirurgicznymi pod kątem 45°, aby stworzyć ostry koniec. Użyć pęsety z tępym końcem do przytrzymania końca cewnika PE-50. Delikatnie wprowadzić cewnik PE-50 do żyły udowej.
    12. Po pełnym wprowadzeniu cewnika powoli podać 0,1 mL roztworu heparyny z solą fizjologiczną, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Związać mocne węzły (pojedyncze) w celu stabilizacji cewnika PE-50. Pozostawić cewnik PE-50 do ciągłego wstrzykiwania dożylnego (IV) różnych leków.
    13. Użyć strzykawki 1 mL połączonej z adapterem Luer stub 23G do podania bromku wekuronium (0,67 mg/kg, podawanego co 10 min) do żyły udowej w celu unieruchomienia szczura podczas całej procedury.
    14. Umieścić dwa fragmenty szwu jedwabnego 5-0 (jeden w stronę nogi, drugi w stronę ciała) pod tętnicą.
    15. Związać luźny węzeł po stronie nogi. Użyć hemostatu, aby utrzymać i odciągnąć szew jak najdalej w stronę nogi.
    16. Związać luźny węzeł po stronie ciała. Przytrzymać i odciągnąć szew w stronę ciała za pomocą hemostatu, aby umożliwić napełnienie tętnicy krwią.
    17. Wykonać małe nacięcie w tętnicy (około 0,1 mm) za pomocą mikro-nożyczek chirurgicznych (pod kątem 45°).
    18. Podłączyć strzykawkę z igłą o tępym końcu (wypełnioną solą fizjologiczną z heparyną 20 U/mL) do cewnika PE-50. Wypełnić cewnik PE-50 solą fizjologiczną z heparyną 20 U/mL. Odciąć cewnik PE-50 nożyczkami chirurgicznymi pod kątem 45 stopni, aby stworzyć ostry koniec. Użyć pęsety z tępym końcem do przytrzymania końca cewnika PE-50. Delikatnie wprowadzić cewnik PE-50 do tętnicy udowej.
    19. Po pełnym wprowadzeniu cewnika powoli odessać zawartość strzykawką, aby upewnić się, że cewnik jest drożny. Związać mocne węzły (pojedyncze) w celu stabilizacji cewnika PE-50. Pozostawić cewnik PE-50 do ciągłego pomiaru ciśnienia tętniczego i gazometrii krwi.
  5. Procedura zatrzymania krążenia z powodu asfiksji (ACA)
    1. Dostosować parametry fizjologiczne (tj. pO2, pCO2, ciśnienie krwi i wartość pH) w razie potrzeby poprzez modulowanie objętości oddechowej oraz poziomów O2 lub N2O. Stosować normalne fizjologiczne zakresy tych parametrów: pO2: 100 mmHg, pCO2: 35-40 mmHg, ciśnienie krwi: 100 mmHg i pH: 7,4.
    2. Użyć strzykawki 1 mL połączonej z adapterem Luer stub 23G do podania bromku wekuronium (0,67 mg/kg, I.V.) do żyły udowej i odczekać 2 min. Przed wykonaniem ACA upewnić się, że ciśnienie krwi wynosi około 100 mmHg.
    3. Wywołać bezdech (6 min) poprzez odłączenie rurki endotrachealnej (nasady cewnika 14G) od respiratora. Dodatkowo zablokować rurkę endotrachealną za pomocą strzykawki 1 mL, aby zapewnić całkowity bezdech.
      UWAGA: 6-minutowy czas asfiksji definiuje się jako okres między odłączeniem respiratora a rozpoczęciem reanimacji. Całkowite zatrzymanie krążenia definiuje się jako średnie ciśnienie tętnicze poniżej 10 mmHg.
    4. W ostatniej minucie bezdechu ustawić częstość oddechów respiratora na 80 oddechów/min i zwiększyć poziom O2 do 2 L/min przy 0% N2O. Działanie to usunie pozostały izofluran lub N2O z respiratora.
    5. W minucie po bezdechu usunąć strzykawkę 1 mL z rurki endotrachealnej. Ponownie podłączyć rurkę endotrachealną do respiratora.
    6. Użyć strzykawki 1 mL połączonej z adapterem Luer stub 23G do podania epinefryny (0,005 mg/kg, I.V.) do żyły udowej i wykonywać manualny uciśki klatki piersiowej kciukiem, palcem wskazującym i środkowym na klatce piersiowej zwierzęcia, wykonując lekkie ruchy okrężne na osi x i z (200/min), aż do powrotu spontanicznego krążenia (średnie ciśnienie tętnicze ≥ 50 mmHg)33,34,35.
    7. Użyć kolejnej strzykawki 1 mL połączonej z adapterem Luer stub 23G do podania wodorowęglanu sodu (1 meq/kg, I.V.) do żyły udowej natychmiast po powrocie do spontanicznego krążenia (50 mmHg lub więcej)33,34,35 w celu złagodzenia kwasicy oddechowej.
    8. Ponownie zmierzyć gazy krwi 10 min po reanimacji, aby określić stan kwasowo-zasadowy (pH po ACA powinno wynosić od 7,35 do 7,40).
    9. Użyć hemostatu do zaklemowania tętnicy i żyły udowej. Powoli i delikatnie usunąć cewniki tętnicze i żylne za pomocą pęsety z tępym końcem. Podwiązać tętnicę/żyłę udową szwem jedwabnym 5-0, aby zapobiec krwawieniu. Zamknąć skórę nad miejscem operacyjnym szwem jedwabnym 3-0. Zastosować technikę szwu przerywanego, aby zminimalizować ryzyko ponownego otwarcia się rany.
    10. Odczekać, aż szczur zacznie oddychać samodzielnie (zazwyczaj od 30 do 60 min po reanimacji), odłączyć szczura od respiratora i delikatnie usunąć rurkę endotrachealną.
    11. Umieścić szczura w inkubatorze (27 °C, 50% wilgotności) na noc. Umieścić w inkubatorze zmiękczony pokarm (przygotowany przez namoczenie w wodzie) oraz wodę na noc.
    12. Przenieść szczura do indywidualnej klatki i zwrócić go do pomieszczenia dla zwierząt z regularną karmą i wodą. Testy w labiryncie T rozpoczynają się 3 dni po ACA.

3. Labirynt w kształcie litery T

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Dzień przed operacją (pozorną lub ACA) należy oswoić każdego szczura poprzez 5-minutowe manipulowanie zwierzęciem. Podczas oswojenia nigdy nie należy wyjmować szczurów z klatki (klatka plastikowa, przezroczysta, 480 mm x 250 mm x 200 mm) (Rycina 2).
    2. Po pochwyceniu szczura należy go delikatnie podnieść za ogon jedną ręką, podczas gdy druga ręka powinna podtrzymywać jego kończyny. Pozwolić zwierzętom 5-krotnie przeskoczyć z dłoni do klatki (wysokość 100 mm). Każdego szczura należy umieścić w oddzielnej klatce, aby zapobiec dominacji przy dostępie do pokarmu i/lub walkom.
    3. Trzy dni po operacji pozorowanej lub operacji ACA (Rysunek 2), przenieś szczury wraz z klatką do cichego i ciemnego pomieszczenia przed rozpoczęciem pierwszego przejścia. Włącz jedynie lampkę biurkową o niskiej mocy i ustaw ją w rogu pomieszczenia badawczego, aby zachować minimalne oświetlenie. Pozostaw szczura na 10 min w celu adaptacji do ciemności.
    4. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzać po południu, aby uniknąć wpływu zmienności dobowej na wyniki szczurów. Nie należy informować operatora, który szczur został poddany operacji pozorowanej, a który operacji ACA.
  2. Spontaniczna alternacja
    1. Rozłożyć cienką warstwę ściółki (grubości ok. 10 mm), aby pokryła całą podłogę labiryntu. Następnie umieścić szczura w ramieniu startowym (dolna część litery „T”), który stanowi punkt startowy każdego przejścia, i pozwolić każdemu zwierzęciu na 3-minutową eksplorację prawego lub lewego ramienia docelowego.
    2. Gdy szczur zdecyduje się na konkretne ramię docelowe (wszystkie cztery łapy szczura znajdą się w ramieniu docelowym), zablokuj rozgałęzienie w kształcie litery „T” między ramieniem startowym a przeciwległym ramieniem docelowym (Rysunek 1) aby zapobiec wejściu szczura do przeciwległego ramienia celu. Pozostaw szczura w labiryncie na 30 sekund, następnie podnieś go i umieść z powrotem w klatce na krótki czas (~30 sekund). Następnie usuń blokadę rozgałęzienia w kształcie litery „T” (125 mm x 230 mm x 65 mm, wykonaną na drukarce 3D) z labiryntu w kształcie litery T.
    3. Umieść szczura w ramieniu startowym i powtórz krok 3.2.2. Alternację definiuje się jako sytuację, w której szczur wchodzi do ramienia przeciwległego w stosunku do poprzedniego przejścia.36Szczury powinny wykonać 4 próby dziennie w następujący sposób:
      1st uruchom
      2nd uruchom
      10-minutowa przerwa
      3rd uruchom
      4th uruchom
    4. Wymieniaj ściółkę podczas 10-minutowej przerwy oraz pomiędzy zwierzętami, aby wyeliminować wpływ zapachowy. Pod koniec każdego dnia eksperymentalnego czyść labirynt w kształcie litery T 75% etanolem, a następnie wodą destylowaną.
    5. Powtórz kroki 3.2.1. – 3.2.4. przez kolejne dwa dni (łącznie 12 serii), zgodnie z Rycina 2.
  3. Obliczenia wskaźnika naprzemienności i wskaźnika preferencji strony
    1. Oblicz % naprzemienności (Alternation) oraz % preferencji strony (Side Preference), gdzie
      L: szczury wybierają lewe ramię
      R: szczury wybierają prawe ramię
      Poprawny wybór: 2nd cykl różni się od 1Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. w danym zestawie (każdy zestaw zawiera dwa przebiegi)
      Błędny wybór: szczury wybierają to samo ramię, podobnie jak w poprzedniej próbie
      Obliczanie procentu naprzemienności; schemat wzoru przedstawia % naprzemienności = (poprawne wybory / całkowita liczba serii) x 100%.
      Wzór preferencji strony u szczura. Przedstawiony w %, obliczany jako liczba wejść na wybraną stronę/całkowita liczba prób x 100. Schemat.
      Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
      Dzień 1: L L / L L
      Dzień 2: L L / L R
      Dzień 3: P P / L L
      Naprzemienność: 2 (poprawne wybory) / 6 (całkowita liczba wykonanych serii) * 100 = 33,33%
      Preferencja strony: 10 (L, strona preferowana) / 12 (całkowita liczba wykonanych serii) * 100 = 83,33%
  4. Opieka pooperacyjna:
    1. Podawać szczurom buprenorfinę (0,01 mg/kg IP) co 12 h przez 2 dni po operacji. Obserwować szczury do 1 h po zatrzymaniu krążenia.
    2. Podłącz szczury do respiratora i mata grzewczego, aż odzyskają wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję brzuszną. Aby utrzymać temperaturę ciała zwierząt po operacji, umieść szczura w inkubatorze dla niemowląt (ustawionym na 27 °C, 50% wilgotności).
    3. Przez pierwsze 24 h po operacji należy podawać zwierzętom zmiękczoną karmę (przygotowaną poprzez namoczenie w wodzie). Jeśli szczury nie piły wody, należy podawać bakteriostatyczną sól fizjologiczną (100 ml/kg/dobę, s.i.) aż do momentu, gdy zwierzę dojdzie do siebie i zacznie swobodnie pić wodę.
    4. Nanieść miejscowo antybiotyk z działaniem przeciwbólowym (maść z bacitracyną i lidokainą) na wszystkie rany szczurów. Przenieść szczury z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt po ich całkowitym wyzdrowieniu.
  5. Metoda eutanazji
    1. Stosować 5% izofluranu i 100% N22Aby poddać zwierzęta eutanazji po zakończeniu eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ACA (globalne niedokrwienie mózgu) powoduje przede wszystkim deficyty pamięci operacyjnej (krótkotrwałej)28,29. Aby ocenić funkcje uczenia się i pamięci po ACA, zastosowano zmodyfikowany test spontanicznej alternacji w celu oceny pamięci operacyjnej (krótkotrwałej)30. Wyniki testu spontanicznej alternacji wskazują, że wskaźnik alternacji z trzech kolejnych dni w grupie ACA (26,19 ± 4,96%) był znacząco niższ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu dokonano modyfikacji w porównaniu z protokołem31 Deacona i Rawlinsa. Do zbudowania labiryntu w kształcie litery T wykorzystano drukarkę 3D. Druk 3D zapewnia niedrogą i opłacalną alternatywę dla skomercjalizowanego labiryntu T. Aby zmniejszyć niepokój szczurów podczas testu, labirynt w kształcie litery T został wykonany w ciemnym pomieszczeniu przy minimalnym oświetleniu. Gdy szczur wszedł w jedno z ramion bramki, delikatnie zablokowaliśmy ramię przeciwnika. Pozwala to uniknąć ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke grant 1R01NS096225-01A1, American Heart Association grants AHA-13SDG1395001413, AHA-17GRNT33660336, AHA-17POST33660174, Louisiana State University Grant in Aid research council, The Malcolm Feist Cardiovascular Research Fellowship oraz Evelyn F. McKnight Brain Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3DMakerBotReplicatorDrukarka
3DHatchboxPLA, średnica filamentu 1,75 mm
200 Proof Pure EthanolKoptecV1005SG
Sani-ChipsPJ Murphy-Forest ProductsRozmiar: od 8 do 20 oczek; 2,2 stopy sześciennej / opakowanie; worki autoklawowalne
Laboratoria RatCharles RiverBromek Sprague-Dawley
VecuroniumSun Pharmaceutical47335-931-4010 mg
EpinefrynaPar Pharmaceutical42023-103-01Roztwór chlorku adrenaliny 1 mg / ml, 1:1000
Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwańPfizer00409-2012-320,3 mg / ml
SketchUpTrimble Inc.Oprogramowanie do modelowania 3D
VentElite Small Animal VentilatorHarvard Apparatus55-7040Zwierzęta szalejące wielkością od myszy do świnki morskiej (10g do 1kg)
PowerLab 8/35AdinstrumentsPL3508analogowych kanałów wejściowych – 4 z nich mogą być używane w trybie różnicowym.
Bio AmpsAdinstrumentsFE132Bio Amp to izolowany galwanicznie, wysokowydajny biowzmacniacz różnicowy zoptymalizowany do pomiaru szerokiej gamy sygnałów biologicznych, takich jak zapisy EKG, EMG i EEG.
Quad Bridge AmpAdinstrumentsFE224Czterokanałowy, nieizolowany wzmacniacz mostkowy zaprojektowany, aby umożliwić PowerLab podłączenie do większości przetworników mostka DC.
LabChart 8Adinstruments
ABL80 FLEX CO-OX analizator parametrów krytycznychRadiometerpH / p CO2 / p O2
SURFLO Teflonowy cewnik dożylnyTerumosc-361556Używaj wyłącznie elastycznego cewnika cienkościennego (o długości 49 mm) Igła
pipety/infuzjiHamilton7748-0317-gauge; 93 mm długości; Kąt 10 stopni
Klasyczny waporyzator T3SurgiVetVCT302Classic T3 Napełnianie lejka izofluranowego
ENVIRO-PURE Kanister na węgiel drzewnySurgiVet32373B10Przeznaczony do pochłaniania odpadowych gazów znieczulających
Przepływomierz pojedynczy O2SurgiVet32375B10-1000 mL
N2O PrzepływomierzVetEquip4017210-4LPM
Adapter Clay Adams Intramedic Luer-Stub (sterylny)Mikrokleszcze Becton Dickinson42756523 mm
Czarno-czarne chirurgiczneB3FRC-18 RM-87 1/4" (18 cm), 8mm RH, przeciwwaga z trzpieniem prowadzącym 2mm, platforma 6 x .3 mm, zakrzywiony.
Kleszczyki do komarów HalsteadRobozRS-7111zakrzywione; 5" Długość, 1,3 mm średnica końcówki, 2,1 mm szerokość szczęk
Kleszcze mieszająceRobozRS-72915,25" Zakrzywione bardzo delikatne, końcówki 1,1 mm
Castroviejo Micro Nożyczki sprężynowe do preparowaniaRobozRS-5650Proste, Ostre Końcówki; 9 mm Krawędź tnąca; 0.15 mm Szerokość końcówki; 3 1/2" Długość całkowita
NożyczkiMayo-StilleRobozRS-68915,5-calowe
okrągłe zakrzywione kleszcze Dumont #5RobozRS-505845 stopni Rozmiar końcówki Dumoxel .10 x .06 mm
Olsen-Hegar Kombinowany uchwyt nożycowy i igłyRobozRS-7884Końcówka do ząbkowania krzyżowego; 5.5"
Długość Kleszcze MoloneyRobozRS-8254Ząbkowane; Niewielka krzywa; Długość 4,5 cala
piątej generacji Filament 8 do

Bibliografia

  1. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
  2. Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
  3. Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
  4. Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
  5. Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
  6. Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
  7. Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F. Selective vulnerability of the hippocampus in brain ischemia. Neuroscience. 40, 599-636 (1991).
  8. Corkin, S. What's new with the amnesic patient H.M.? Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
  9. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
  10. Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
  11. Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
  12. Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
  13. Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
  14. Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
  15. Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
  16. Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108(2016).
  17. Lee, R. H., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. Porto, L. F. , Nova Science Publishers, Inc. 1-15 (2014).
  18. Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
  19. Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
  20. Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
  21. Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
  22. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
  23. Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. Assessment of spatial memory in mice. Life Sci. 87, 521-536 (2010).
  24. Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
  25. Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
  26. Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
  27. Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
  28. Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
  29. Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
  30. Spontaneous alternation behavior. Dember, W. N., Richman, C. L. , (1989).
  31. Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
  32. Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
  33. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
  34. Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
  35. Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
  36. Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
  37. McDonald, J. H. Handbook of biological statistics. 2, Sparky House Publishing. Baltimore, MD. (2009).
  38. Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
  39. Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spontaniczna naprzemiennopami kr tkotrwa aniedokrwienie m zgufunkcja hipokampatest behawioralnymodel gryzoniocena pami cimodel niedokrwienia
Wykorzystanie zmodyfikowanego labiryntu T do oceny wyników pamięci funkcjonalnej po zatrzymaniu krążenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.