Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie zmodyfikowanego labiryntu T do oceny wyników pamięci funkcjonalnej po zatrzymaniu krążenia

DOI:

10.3791/56694

⸱

5 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Louisiana State University Health Science Center, 2Center for Brain Health, Louisiana State University Health Science Center, 3Department of Cellular Biology and Anatomy, Louisiana State University Health Science Center, 4Department of Neurology, Cerebral Vascular Disease Research Laboratories, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Biomedical Sciences, West Virginia School of Osteopathic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie zmodyfikowanego labiryntu T do oceny funkcjonalnego uczenia się/pamięci w niedokrwieniu mózgu wywołanym zatrzymaniem krążenia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tło: Ocena łagodnego do umiarkowanego upośledzenia funkcji poznawczych w globalnym modelu niedokrwienia mózgu (np. zatrzymania krążenia) może być trudna z powodu słabej lokomocji po operacji. Na przykład szczury, które przechodzą zabiegi chirurgiczne i są poddawane labiryntowi wodnemu Morrisa, mogą nie być w stanie pływać, co unieważnia eksperyment.

Nowa metoda: Stworzyliśmy zmodyfikowany test T-labiryntu spontanicznej przemiany behawioralnej. Główną zaletą zmodyfikowanego protokołu T-maze jest jego stosunkowo prosta konstrukcja, która jest wystarczająco potężna, aby ocenić funkcjonalne uczenie się/pamięć po niedokrwieniu. Dodatkowo analiza danych jest prosta i nieskomplikowana. Użyliśmy labiryntu T do określenia deficytów uczenia się / pamięci szczurów zarówno w obecności, jak i braku łagodnego do umiarkowanego (6 min) uduszonego zatrzymania krążenia (ACA). Szczury mają naturalną tendencję do eksploracji i będą eksplorować alternatywne ramiona w labiryncie T, podczas gdy szczury z uszkodzeniem hipokampa mają tendencję do przyjmowania preferencji bocznej, co skutkuje zmniejszeniem spontanicznych współczynników naprzemienności, ujawniając funkcjonalne uczenie się / pamięć związaną z hipokampem w obecności lub braku ACA.

Wyniki: Grupy ACA mają wyższe współczynniki preferencji ubocznych i niższe zmiany w porównaniu do grupy kontrolnej.

Porównanie z istniejącymi metodami: Woda Morrisa i labirynt Barnesa są bardziej widoczne w ocenie funkcji uczenia się/pamięci. Jednak labirynt wodny Morris jest bardziej stresujący niż inne labirynty. Labirynt Barnesa jest szeroko stosowany do pomiaru pamięci referencyjnej (długotrwałej), podczas gdy deficyty neurokognitywne wywołane przez ACA są ściślej związane z pamięcią roboczą (krótkotrwałą).

Wnioski: Opracowaliśmy prostą, ale skuteczną strategię wyznaczania pamięci roboczej (krótkotrwałej) za pomocą labiryntu T w naszym globalnym modelu niedokrwienia mózgu (ACA).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według American Heart Association (2017), śmiertelność spowodowana zatrzymaniem krążenia (CA) występuje co cztery minuty i dotyka ponad 400 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych1. Jest dobrze udokumentowane, że CA może powodować uszkodzenie neuronów mózgu w wyniku niedostatecznej perfuzji krwi2,3,4. Uszkodzenie mózgu wywołane przez CA występuje w wrażliwym na niedokrwienie regionie CA1 hipokampa5,6,7, wpływając na neurony, które są kluczowe dla uczenia się i pamięci8,9,10,11,12. Co więcej, utrata gęstości kolców dendrytycznych w warunkach niedokrwiennych w hipokampie (tj. neuronach CA1) odgrywa kluczową rolę w upośledzeniu pamięci przestrzennej13,14,15. Ze względu na te patologiczne zmiany po CA częściej występują zaburzenia zachowania, takie jak: lęk, depresja, zespół stresu pourazowego i utrata pamięci. Chociaż nastąpił postęp w technologii medycznej (tj. wydajna usługa ambulatoryjna), które korelują z lepszymi wskaźnikami przeżycia CA, większość terapii neuroprotekcyjnych (z wyjątkiem hipotermii) nie poprawia wyników funkcjonalnych po CA16,17. Osoby, które przeżyły CA, zazwyczaj mają niską jakość życia i są obciążone rosnącymi wydatkami medycznymi16.

Ocena stanu poznawczego niedokrwienia mózgu za pomocą testów behawioralnych jest ważna dla określenia zarówno skuteczności leku, jak i ostatecznie opracowania udanego badania klinicznego. W latach czterdziestych XX wieku Edward Tolman zaprojektował pierwszą próbę behawioralną do badania pamięci przestrzennej opartej na hipokampie18. Następnie opracowano różne labirynty (tj. labirynt wodny Morrisa, labirynt promieniowy, labirynt T lub Y oraz labirynt Barnesa) w celu oceny uczenia się przestrzennego i pamięci opartej na hipokampie u szczurów19,20,21,22,23. Jednym z częściej stosowanych testów behawioralnych jest labirynt wodny Morrisa, który bada uczenie się przestrzenne i pamięć w modelach szczurów24. Jednak labirynt wodny Morrisa wymaga od szczura pływania i sprawowania pełnej funkcji motorycznej i kontroli. W przypadku eksperymentów niedokrwiennych, takich jak model uduszonego zatrzymania krążenia (ACA, szczurzy model CA), wymagana jest kaniulacja tętnicy/żyły udowej w celu uzyskania niezbędnego ciśnienia krwi, gazometrii krwi i wprowadzenia różnych leków. Ponieważ kaniulacja tętnicy udowej / żyły może hamować ruchomość nóg, powodując zdolność szczura do prawidłowego pływania, labirynt wodny Morrisa może nie być najbardziej odpowiedni do testowania zaburzeń poznawczych w ramach ACA.

Labirynt Barnesa jest drugim powszechnie używanym testem behawioralnym do badania uczenia się przestrzennego i pamięci w modelach gryzoni. Labirynt Barnesa nie wymaga wysiłku pełnej funkcji motorycznej i kontroli, a co za tym idzie jest mniej stresujący niż labirynt wodny Morrisa. W przeszłości przeprowadziliśmy eksperymenty z wykorzystaniem labiryntu Barnesa, aby określić, czy różnice w funkcjonalnym uczeniu się / pamięci występują między szczurami kontrolnymi lub pozorowanymi a szczurami indukowanymi ACA. Dane uzyskane dla labiryntu Barnesa nie miały rozdzielczości pozwalającej na testowanie zaburzeń poznawczych po łagodnym do umiarkowanego ACA ze względu na fakt, że labirynt Barnesa jest szeroko stosowany do pomiaru pamięci referencyjnej (długotrwałej)25,26, podczas gdy deficyty neurokognitywne wywołane przez ACA są ściślej związane z pamięcią roboczą (krótkotrwałą)27,28,29,30 sugerujący, że labirynt Barnesa jest mniej przydatny do oceny funkcji pamięci w naszym modelu ACA.

Opracowaliśmy więc zmodyfikowany labirynt T, wykorzystując spontaniczny test naprzemienny do oceny pamięci roboczej (krótkotrwałej) po ACA. Główną zaletą zmodyfikowanego testu spontanicznej przemiany labiryntu T-maze jest jego prostota i minimalny stres dla szczurów w porównaniu z innymi testami behawioralnymi ze względu na fakt, że zmodyfikowany labirynt T nie wymaga wcześniejszego szkolenia zwierząt, a także ciężkiej analizy obliczeniowej lub podprogramów (tj. obrazowania wideo szczura), jak wymaga tego labirynt wodny Morrisa i labirynt Barnesa. Tutaj pokazujemy, że zmodyfikowany test spontanicznej przemiany labiryntu T-labirynt jest prostym, a jednocześnie bardzo skutecznym paradygmatem próby behawioralnej, który może zaoferować wystarczającą rozdzielczość, aby dokładnie wykryć i ocenić funkcję hipokampa w chorobach powodujących utratę pamięci krótkotrwałej (tj. ACA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (LSU Health Sciences Center-Shreveport) do użytku samców szczurów Sprague Dawley (300-350 g, 9-10 tygodni). Szczury były na czczo przez noc przed operacją ACA.

1. Projektowanie i ustawienie aparatury T-labirynt

UWAGA: Oprzyj projekt labiryntu T-labirynt na modelu Deacona i Rawlinsa z 2006 roku31.

  1. Zaprojektuj strukturę 3D labiryntu za pomocą programu SketchUp32. Aby stworzyć strukturę 3D labiryntu T, skonstruuj ramię startowe o długości zewnętrznej 200 mm, szerokości 165 mm i wysokości 148 mm, aby zmieściło się w wymiarach drukowania drukarki 3D. Użyj grubości ścianki 5,5 mm i grubości podłogi 8 mm.
  2. Wydrukuj labirynt za pomocą drukarki 3D (patrz tabela materiałów)32. Jeśli drukarka 3D nie jest dostępna w laboratorium, użyj innych materiałów, takich jak drewno, płyta pilśniowa o średniej gęstości lub plastik (np. polichlorek winylu), które można kupić w sklepach dla majsterkowiczów.
    1. Ze względu na ograniczenia wysokości w obszarze drukowania, zbuduj ściany labiryntu w dwóch oddzielnych wydrukach 3D i połącz je ze sobą po złożeniu labiryntu (tj. druga wysokość ściany została dodana do sekcji labiryntu, aby zwiększyć wysokość o 140 mm, co daje całkowitą wysokość ściany 280 mm). Każda oddzielna podstawa druku 3D zawierała mechanizm blokujący w kształcie litery "T", w którym jedna sekcja łączyła się z drugą.
    2. Na styku ramienia startowego z ramionami bramki utwórz odcinek o szerokości 165 mm, aby połączyć szerokość ramienia startowego z szerokością ramion bramki. Zbuduj ramiona bramki, używając podobnej metody projektowania, jak ramię startowe; jednak zmniejsz szerokość ramienia do 100 mm zgodnie z projektem Deacona i Rawlinsa.
    3. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się ze szczegółowym schematem/wymiarami labiryntu T.
    4. Uwzględnij centralną przegrodę w projekcie na styku ramienia startowego i ramienia bramki. Wysuń tę przegrodę od tylnej ściany labiryntu w kształcie litery T i 200 mm do ramienia startowego, aby podzielić ramiona bramki. Przegroda ta zwiększyła też wysokość labiryntu (Rysunek 1).

2. Zatrzymanie krążenia w stanie uduszenia (ACA)

  1. Autoklaw narzędzi chirurgicznych (121 °C przez 15 min) przed rozpoczęciem zabiegu. Zdezynfekuj stół operacyjny 70% etanolem przez 15 min. Ogolić sierść zwierzęcia w miejscu zabiegu. Nałóż roztwór betadyny na powierzchnie skóry w celu przeprowadzenia operacji chirurgicznej.
  2. Znieczulenie
    1. Znieczulić szczury 4% izofluranem i mieszaniną O2 i N2O w proporcji 30:70 (300 ml/minO2 i 700 ml/minN2O) przez maskę.
    2. Poddać szczury intubacji dotchawiczej w celu wentylacji mechanicznej (po intubacji szczury podłączono do respiratora).
    3. Utrzymuj znieczulenie, obniżając izofluran z 4% do 2% za pomocą mieszaninyO2 i N2O w proporcji 30:70. Użyj metody pinch-response, aby określić głębokość znieczulenia.
    4. Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Reguluj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej dla gryzoni z sondą analną jako odniesieniem temperatury.
  3. Intubacja dotchawicza
    1. Umieść szczura w komorze indukcyjnej. Znieczulić szczury 4% izofluranem i mieszaniną O2 i N2O. w stosunku 30:70.
    2. Wyjmij szczura z komory indukcyjnej. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej twarzą szczura w kierunku maski anestezjologicznej.
    3. Delikatnie przesuń język w lewo lub w prawo zwierzęcia za pomocą lewego kciuka i palca wskazującego.
    4. Nasuń elastyczny cewnik dożylny o rozmiarze 14G (o długości 49 mm) na igłę do pipetowania z końcówką w rozmiarze 17G (o długości 93 mm i kącie 10 stopni na końcówce igły). Włóż igłę do pipetowania z końcówką w rozmiarze 17 rozmiarów do tchawicy.
    5. Delikatnie wyciągnąć igłę do pipetowania o rozmiarze 17 z tchawicy. Podłącz 14-częściowy koncentrator cewnika do respiratora. Dostosuj objętość wyrzutową respiratora do 0,67 ml/100 g i częstość oddechów 60 oddechów/min.
    6. Utrzymuj temperaturę głowy i ciała na poziomie 37 °C podczas całego zabiegu za pomocą poduszki grzewczej dla gryzoni z sondą analną jako odniesieniem temperatury.
  4. Cewnikowanie tętnic udowych i żył
    1. Ogolić włosy w pobliżu pachwiny (po obu stronach) i nałożyć betadynę na powierzchnie skóry w celu przeprowadzenia operacji chirurgicznej.
    2. Umieszczono szczura w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie (10 mm) w okolicy pachwinowej za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    3. Oddziel tkankę łączną za pomocą kleszczy z końcówką, aż więzadło pachwinowe zostanie odsłonięte. Użyj hemostatu, aby uchwycić więzadło pachwinowe. Tętnica i żyła udowa znajdują się pod więzadłem pachwinowym.
    4. Użyj kleszczyków z końcówką, aby oddzielić tkankę łączną, aż do odsłonięcia tętnicy udowej i żyły.
    5. Delikatnie oddziel nerw udowy, który biegnie wzdłuż tętnicy udowej, za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Ostrożnie oddziel tętnicę udową i żyłę jako jedność za pomocą kleszczyków z cienką końcówką.
    6. Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić tętnicę udową od żyły.
    7. Umieść 2 kawałki jedwabnego szwu 5-0 (jeden w kierunku nogi, a drugi w kierunku ciała) pod żyłą.
    8. Zawiąż luźny węzeł z boku w pobliżu ciała. Użyj hemostatu, aby przytrzymać i pociągnąć szew tak daleko, jak to możliwe, w kierunku przeciwnych stron ciała.
    9. Zawiąż luźny węzeł z boku w pobliżu nogi. Przytrzymaj i pociągnij szew w kierunku nogi za pomocą hemostatu, aby żyła wypełniła się krwią.
    10. Wykonaj małe nacięcie w żyle (około 0,1 mm) za pomocą nożyczek do mikropreparowania (pod kątem 45°). Wchłonąć krew wysterylizowaną gazą.
    11. Podłączyć strzykawkę z końcówką (wypełnioną solą fizjologiczną z 20 j./ml heparyny) do cewnika PE-50. Napełnij cewnik PE-50 solą fizjologiczną z 20 j./ml heparyny. Przeciąć cewnik PE-50 nożyczkami preparacyjnymi pod kątem 45°, aby uzyskać punktowy lub ostry koniec. Użyj kleszczyków z końcówką, aby przytrzymać koniec cewnika PE-50. Delikatnie wprowadzić cewnik PE-50 do żyły udowej.
    12. Po całkowitym wprowadzeniu cewnika powoli podawaj 0,1 ml heparyny/soli fizjologicznej, aby upewnić się, że nie ma wycieku. Zawiąż mocne węzły szwów (pojedynczy węzeł), aby ustabilizować cewnik PE-50. Trzymaj cewnik PE-50 do ciągłego dożylnego (IV) wstrzykiwania różnych leków.
    13. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z adapterem Luer w rozmiarze 23, aby podać bromek wekuronium (0,67 mg/kg, podawany co 10 minut) przez żyłę udową, aby unieruchomić szczura przez cały zabieg.
    14. Umieść 2 kawałki jedwabnego szwu 5-0 (jeden w kierunku nogi, a drugi w kierunku ciała) pod tętnicą.
    15. Zawiąż luźny węzeł z boku w pobliżu nogi. Użyj hemostatu, aby przytrzymać i pociągnąć szew jak najdalej w kierunku nogi.
    16. Zawiąż luźny węzeł z boku w pobliżu ciała. Przytrzymaj i pociągnij szew w kierunku ciała za pomocą hemostatu, aby tętnica mogła wypełnić się krwią.
    17. Wykonaj małe nacięcie w tętnicy (około 0,1 mm) za pomocą nożyczek do mikropreparowania (pod kątem 45°).
    18. Podłączyć strzykawkę z końcówką (wypełnioną solą fizjologiczną z 20 j./ml heparyny) do cewnika PE-50. Napełnij cewnik PE-50 solą fizjologiczną z 20 j./ml heparyny. Przeciąć cewnik PE-50 nożyczkami preparacyjnymi pod kątem 45 stopni, aby utworzyć punkt lub ostry koniec. Użyj kleszczyków z końcówką, aby przytrzymać koniec cewnika PE-50. Użyj kleszczyków z końcówką, aby przytrzymać koniec cewnika PE-50. Delikatnie wprowadzić cewnik PE-50 do tętnicy udowej.
    19. Po całkowitym wprowadzeniu cewnika powoli odciągnij strzykawkę, aby upewnić się, że cewnik jest sprawny. Zawiąż mocne węzły szwów (pojedynczy węzeł), aby ustabilizować cewnik PE-50. Zachowaj cewnik PE-50 do ciągłego rejestrowania ciśnienia tętniczego i gazometrii krwi.
  5. Procedura uduszonego zatrzymania krążenia (ACA)
    1. Dostosuj parametry fizjologiczne (tj. pO2, pCO2, ciśnienie krwi i wartość pH) zgodnie z potrzebami, modulując objętość wyrzutową, poziomy O2 lub N2O. Weź normalne fizjologiczne zakresy tych parametrów: pO2: 100 mmHg, pCO2: 35-40 mmHg, ciśnienie krwi: 100 mmHg i pH: 7,4.
    2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z adapterem Luer o rozmiarze 23 podać bromek wekuronium (0,67 mg/kg, dożylnie) przez żyłę udową i odczekać 2 minuty. Upewnij się, że ciśnienie krwi wynosi lub około 100 mmHg przed wykonaniem ACA.
    3. Wywołać bezdech (6 min) poprzez odłączenie rurki dotchawiczej (14-stopniowej piasty cewnika) od respiratora. Następnie zablokuj rurkę dotchawiczą za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aby zapewnić całkowity bezdech.
      UWAGA: 6-minutowy czas uduszenia definiuje się jako okres między odłączeniem respiratora a rozpoczęciem resuscytacji. Całkowite zatrzymanie krążenia definiuje się jako średnie ciśnienie tętnicze niższe niż 10 mmHg.
    4. W ostatniej minucie bezdechu wyreguluj częstość oddechów respiratora do 80 oddechów/min i zwiększ O2 do 2 L/min za pomocą 0% N2O. To działanie spowoduje wydmuchanie pozostałego izofluranu lubN2Opozostającego w respiratorze.
    5. min po bezdechu wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml z rurki dotchawiczej. Ponownie podłącz rurkę dotchawiczą do respiratora.
    6. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z adapterem Luer o rozmiarze 23 podawać epinefrynę (0,005 mg/kg, dożylnie) przez żyłę udową i ręcznie uciskać klatkę piersiową kciukiem, palcem wskazującym i środkowym na klatkę piersiową zwierzęcia lekkim ruchem okrężnym na osiach x i z (200/min) aż do powrotu spontanicznego krążenia (średnie ciśnienie tętnicze ≥ 50 mmHg)33, 34,35.
    7. Użyj kolejnej strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z adapterem Luer o rozmiarze 23, aby podać wodorowęglan sodu (1 meq/kg, dożylnie) przez żyłę udową natychmiast po powrocie do spontanicznego krążenia (50 mmHg lub więcej)33,34,35 w celu złagodzenia kwasicy oddechowej.
    8. Ponownie zmierz gazometrię krwi 10 minut po resuscytacji, aby określić stan kwasowo-zasadowy (pH po ACA powinno wynosić około 7,35 do 7,40)
    9. Użyj hemostatu, aby zacisnąć tętnicę udową i żyłę. Powoli i delikatnie usuwaj cewniki tętnicze i żylne za pomocą kleszczy z końcówką. Podwiązywać tętnicę/żyłę udową za pomocą jedwabnego szwu 5-0, aby zapobiec krwawieniu. Zamknij skórę pokrywającą pole operacyjne za pomocą jedwabnego szwu 3-0. Stosuj technikę przerywanego szycia, aby zminimalizować ryzyko ponownego otwarcia rany.
    10. Poczekaj, aż szczur zacznie samodzielnie oddychać (zwykle od 30 minut do 60 minut po resuscytacji), odłącz szczura od respiratora i delikatnie wyjmij rurkę dotchawiczą.
    11. Umieść szczura w inkubatorze dla niemowląt (27 °C, 50% wilgotności) na noc. Umieść zmiękczone jedzenie (przygotowane przez namoczenie go w wodzie) i wodę w inkubatorze dla niemowląt na noc.
    12. Przenieś szczura do indywidualnej klatki i wróć do pomieszczenia dla zwierząt ze zwykłą karmą i wodą. Testy T-labiryntu rozpoczynają się 3 dni po ACA.

3. Labirynt w kształcie litery T

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Dzień przed zabiegiem (pozorowanym lub ACA) należy obchodzić się z każdym szczurem przez 5 minut. Nigdy nie podnoś szczurów z klatki (480 mm x 250 mm x 200 mm, plastikowa przezroczysta klatka) podczas obchodzenia się z nimi (Rysunek 2).
    2. Po dotknięciu szczura delikatnie podnieś szczura za ogon jedną ręką, a drugą ręką podpieraj jego nogi. Pozwól mu przeskoczyć z ręki do klatki (100 mm wysokości) 5 razy. Podziel każdego szczura na osobne klatki, aby nie dominowały w walce o pożywienie i/lub walkę.
    3. Trzy dni po pozorowanej operacji lub operacji ACA (Ryc. 2), przenieś szczury z klatką do cichego i ciemnego pokoju przed rozpoczęciem pierwszego biegu. Włączaj tylko lampę biurkową o małej mocy i umieszczaj ją w rogu pokoju testowego, aby utrzymać minimalne oświetlenie. Pozwól szczurowi przyzwyczaić się do ciemności przez 10 minut.
    4. Wykonuj wszystkie eksperymenty po południu, aby uniknąć wpływu dziennych zmian na wydajność szczurów. Nie należy doradzać operatorowi, który szczur otrzymał pozorowaną operację lub operację ACA.
  2. Spontaniczna przemiana
    1. Rozłóż cienką warstwę ściółki (o grubości ~10 mm), aby pokryła całą podłogę labiryntu. Następnie umieść szczura na ramieniu startowym (na dole litery "T"), które jest punktem początkowym każdego biegu, i pozwól każdemu szczurowi na 3 minuty na zbadanie prawego lub lewego ramienia bramki.
    2. Gdy szczur zaangażuje się w określone ramię bramki (wszystkie cztery łapy szczura wejdą w ramię bramki), zablokuj połączenie "T" między ramieniem startowym a ramieniem bramki przeciwnika (Rysunek 1), aby zapobiec wejściu szczura do ramienia bramki przeciwnika. Zostaw szczura w labiryncie na 30 sekund, a następnie podnieś szczura i umieść go z powrotem w klatce na minimalny czas (~30 sekund). Następnie usuń blok łączący "T" (125 mm X 230 mm X 65 mm, wykonany przez drukarkę 3D) z labiryntu T.
    3. Umieścić szczura na ramieniu startowym i powtórzyć czynności opisane w pkt 3.2.2. Naprzemienność jest definiowana jako: gdy szczur wchodzi w przeciwległą rękę w porównaniu z poprzednim runem36. Niech szczury wykonują 4 biegi dziennie w następujący sposób:
      1st run
      2nd run
      10-minutowa przerwa
      3rd run
      4bieg
    4. Zmieniaj ściółkę podczas 10-minutowej przerwy i między zwierzętami, aby wyeliminować stronniczość zapachu. Oczyść labirynt w kształcie litery T za pomocą 75% etanolu, a następnie wody destylowanej pod koniec każdego dnia eksperymentalnego.
    5. Powtarzaj kroki 3.2.1. - 3.2.4. przez kolejne dwa dni (w sumie 12 biegów), jak w Rysunek 2.
  3. Obliczanie współczynnika alternatywnego i wskaźnika preferencji bocznej
    1. Oblicz % alternacji i % preferencji bocznej, gdzie
      L: szczury wybierają lewą rękę
      R: szczury wybierają prawą rękę
      Prawidłowy wybór: 2bieg różni się od 1oczka w danym zestawie (każdy zestaw zawiera dwa biegi)
      Nieprawidłowy wybór: szczury wybierają to samo ramię, podobnie jak w poprzednim run
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      Przykład:
      Dzień 1: L L / L L
      Dzień 2: L L / L R
      Dzień 3: R L / L L
      Naprzemienność: 2 (poprawne wybory) / 6 (łączna liczba wykonanych setów) * 100 = 33,33%
      Preferencja boczna: 10 (L, preferowana strona) / 12 (łączna liczba wykonanych biegów) * 100 = 83,33%
  4. Opieka pooperacyjna:
    1. Podawać szczurom buprenorfinę (0,01 mg/kg IP) co 12 godzin przez 2 dni po zabiegu. Obserwuj szczury do 1 godziny po zatrzymaniu akcji serca.
    2. Podłącz szczury do respiratora i poduszki grzewczej, aż odzyskają wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia po operacji, należy umieścić szczura w inkubatorze dla niemowląt (ustawionym na 27 °C, 50% wilgotności).
    3. Przez pierwsze 24 godziny po zabiegu należy podawać zwierzętom zmiękczoną karmę (przygotowaną przez namoczenie w wodzie). Jeśli szczury nie piły wody, podawaj bakteriostatyczną sól fizjologiczną (100 ml / kg / dzień, IP) do momentu, gdy zwierzę wyzdrowieje i będzie swobodnie pić wodę.
    4. Podaj szczurom miejscowy antybiotyk ze środkiem przeciwbólowym (maść z bacytracyną i lidokainą) na wszystkie rany. Przenieś szczury z powrotem do obiektu dla zwierząt po tym, jak w pełni wyzdrowieją.
  5. Metoda eutanazji
    1. Użyj 5% izofluranu i 100%N2Odo eutanazji zwierząt pod koniec eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACA (globalne niedokrwienie mózgu) głównie powoduje deficyty pamięci roboczej (krótkotrwałej)28,29. Aby ocenić funkcję uczenia się i pamięci po ACA, użyliśmy zmodyfikowanego testu spontanicznej przemiany do oceny pamięci roboczej (krótkotrwałej)30. Wyniki testu spontanicznej przemiany sugerują, że wskaźnik naprzemienności z trzech kolejnych dni w grupie ACA (26,19 ± 4,96%) był znacznie niższy w porównaniu z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu dokonano modyfikacji w porównaniu z protokołem31 Deacona i Rawlinsa. Do zbudowania labiryntu w kształcie litery T wykorzystano drukarkę 3D. Druk 3D zapewnia niedrogą i opłacalną alternatywę dla skomercjalizowanego labiryntu T. Aby zmniejszyć niepokój szczurów podczas testu, labirynt w kształcie litery T został wykonany w ciemnym pomieszczeniu przy minimalnym oświetleniu. Gdy szczur wszedł w jedno z ramion bramki, delikatnie zablokowaliśmy ramię przeciwnika. Pozwala to uniknąć ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke grant 1R01NS096225-01A1, American Heart Association grants AHA-13SDG1395001413, AHA-17GRNT33660336, AHA-17POST33660174, Louisiana State University Grant in Aid research council, The Malcolm Feist Cardiovascular Research Fellowship oraz Evelyn F. McKnight Brain Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3DMakerBotReplicatorDrukarka
3DHatchboxPLA, średnica filamentu 1,75 mm
200 Proof Pure EthanolKoptecV1005SG
Sani-ChipsPJ Murphy-Forest ProductsRozmiar: od 8 do 20 oczek; 2,2 stopy sześciennej / opakowanie; worki autoklawowalne
Laboratoria RatCharles RiverBromek Sprague-Dawley
VecuroniumSun Pharmaceutical47335-931-4010 mg
EpinefrynaPar Pharmaceutical42023-103-01Roztwór chlorku adrenaliny 1 mg / ml, 1:1000
Chlorowodorek buprenorfiny do wstrzykiwańPfizer00409-2012-320,3 mg / ml
SketchUpTrimble Inc.Oprogramowanie do modelowania 3D
VentElite Small Animal VentilatorHarvard Apparatus55-7040Zwierzęta szalejące wielkością od myszy do świnki morskiej (10g do 1kg)
PowerLab 8/35AdinstrumentsPL3508analogowych kanałów wejściowych – 4 z nich mogą być używane w trybie różnicowym.
Bio AmpsAdinstrumentsFE132Bio Amp to izolowany galwanicznie, wysokowydajny biowzmacniacz różnicowy zoptymalizowany do pomiaru szerokiej gamy sygnałów biologicznych, takich jak zapisy EKG, EMG i EEG.
Quad Bridge AmpAdinstrumentsFE224Czterokanałowy, nieizolowany wzmacniacz mostkowy zaprojektowany, aby umożliwić PowerLab podłączenie do większości przetworników mostka DC.
LabChart 8Adinstruments
ABL80 FLEX CO-OX analizator parametrów krytycznychRadiometerpH / p CO2 / p O2
SURFLO Teflonowy cewnik dożylnyTerumosc-361556Używaj wyłącznie elastycznego cewnika cienkościennego (o długości 49 mm) Igła
pipety/infuzjiHamilton7748-0317-gauge; 93 mm długości; Kąt 10 stopni
Klasyczny waporyzator T3SurgiVetVCT302Classic T3 Napełnianie lejka izofluranowego
ENVIRO-PURE Kanister na węgiel drzewnySurgiVet32373B10Przeznaczony do pochłaniania odpadowych gazów znieczulających
Przepływomierz pojedynczy O2SurgiVet32375B10-1000 mL
N2O PrzepływomierzVetEquip4017210-4LPM
Adapter Clay Adams Intramedic Luer-Stub (sterylny)Mikrokleszcze Becton Dickinson42756523 mm
Czarno-czarne chirurgiczneB3FRC-18 RM-87 1/4" (18 cm), 8mm RH, przeciwwaga z trzpieniem prowadzącym 2mm, platforma 6 x .3 mm, zakrzywiony.
Kleszczyki do komarów HalsteadRobozRS-7111zakrzywione; 5" Długość, 1,3 mm średnica końcówki, 2,1 mm szerokość szczęk
Kleszcze mieszająceRobozRS-72915,25" Zakrzywione bardzo delikatne, końcówki 1,1 mm
Castroviejo Micro Nożyczki sprężynowe do preparowaniaRobozRS-5650Proste, Ostre Końcówki; 9 mm Krawędź tnąca; 0.15 mm Szerokość końcówki; 3 1/2" Długość całkowita
NożyczkiMayo-StilleRobozRS-68915,5-calowe
okrągłe zakrzywione kleszcze Dumont #5RobozRS-505845 stopni Rozmiar końcówki Dumoxel .10 x .06 mm
Olsen-Hegar Kombinowany uchwyt nożycowy i igłyRobozRS-7884Końcówka do ząbkowania krzyżowego; 5.5"
Długość Kleszcze MoloneyRobozRS-8254Ząbkowane; Niewielka krzywa; Długość 4,5 cala
piątej generacji Filament 8 do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
  2. Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
  3. Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
  4. Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
  5. Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
  6. Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
  7. Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F. Selective vulnerability of the hippocampus in brain ischemia. Neuroscience. 40, 599-636 (1991).
  8. Corkin, S. What's new with the amnesic patient H.M.? Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
  9. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
  10. Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
  11. Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
  12. Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
  13. Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
  14. Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
  15. Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
  16. Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108(2016).
  17. Lee, R. H., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. Porto, L. F. , Nova Science Publishers, Inc. 1-15 (2014).
  18. Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
  19. Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
  20. Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
  21. Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
  22. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
  23. Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. Assessment of spatial memory in mice. Life Sci. 87, 521-536 (2010).
  24. Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
  25. Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
  26. Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
  27. Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
  28. Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
  29. Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
  30. Spontaneous alternation behavior. Dember, W. N., Richman, C. L. , (1989).
  31. Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
  32. Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
  33. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
  34. Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
  35. Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
  36. Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
  37. McDonald, J. H. Handbook of biological statistics. 2, Sparky House Publishing. Baltimore, MD. (2009).
  38. Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
  39. Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spontaniczna naprzemiennopami kr tkotrwa aniedokrwienie m zgufunkcja hipokampatest behawioralnymodel gryzoniocena pami cimodel niedokrwienia

Powiązane artykuły