Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56699

⸱

21 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Nowatorskie strategie terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej serca wymagają obszernych i szczegółowych badań na dużych przedklinicznych modelach zwierzęcych, zanim będą mogły być rozważane do zastosowania u ludzi. W tym miejscu demonstrujemy technikę przezskórnego wstrzykiwania domięśniowego do mięśnia sercowego pod kontrolą echokardiografii kontrastowej u królików, która jest cenna dla hipotezy testującej skuteczność takich nowatorskich terapii.

Streszczenie

Terapia komórkowa i genowa to ekscytujące i obiecujące strategie w celu regeneracji serca w warunkach niewydolności serca ze zmniejszoną frakcją wyrzutową (HFrEF). Zanim będą mogły być brane pod uwagę do stosowania i stosowane u ludzi, wymagane są szeroko zakrojone badania przedkliniczne na dużych modelach zwierzęcych w celu oceny bezpieczeństwa, skuteczności i losu wstrzyknięcia (np. komórek macierzystych) po dostarczeniu do mięśnia sercowego. Małe modele gryzoni mają zalety (np. opłacalność, możliwość manipulacji genetycznej); Jednak biorąc pod uwagę nieodłączne ograniczenia tych modeli, wyniki w nich zawarte rzadko przekładają się na praktykę kliniczną. Z drugiej strony, duże modele zwierzęce, takie jak króliki, mają zalety (np. podobną elektrofizjologię serca w porównaniu z ludźmi i innymi dużymi zwierzętami), zachowując przy tym dobrą równowagę ekonomiczną. Tutaj pokazujemy, jak wykonać przezskórną technikę iniekcji domięśniowej serca pod kontrolą echokardiografii kontrastowej (IMI), która jest minimalnie inwazyjna, bezpieczna, dobrze tolerowana i bardzo skuteczna w celowanym dostarczaniu zastrzyków, w tym komórek, do kilku miejsc w mięśniu sercowym modelu królika. Do wdrożenia tej techniki wykorzystaliśmy również powszechnie dostępny system do echokardiografii klinicznej. Po zastosowaniu w praktyce opisanego tutaj protokołu, badacz posiadający podstawową wiedzę ultrasonograficzną stanie się kompetentny w wykonywaniu tej wszechstronnej i małoinwazyjnej techniki do rutynowego stosowania w eksperymentach, mających na celu testowanie hipotez dotyczących możliwości terapii regeneracyjnych serca w modelu królika. Po osiągnięciu kompetencji całą procedurę można wykonać w ciągu 25 minut po znieczuleniu królika.

Wprowadzenie

Terapie komórkowe i genowe są ekscytujące i stale rozwijają strategie regeneracji/naprawy uszkodzonego mięśnia sercowego w HFrEF. W kilku badaniach porównano skuteczność (np. wskaźnik retencji komórek) różnych dróg dostarczania komórek, które konsekwentnie wykazały wyższość IMI nad drogami dodonośnymi lub dożylnymi1,2,3,4,5. Nic więc dziwnego, że duża część badań nad translacyjnymi modelami terapii komórkami macierzystymi uszkodzonego mięśnia sercowego, dostarcza zastrzyk za pośrednictwem IMI wykonywany pod bezpośrednim widokiem w procedurze otwartej klatki piersiowej6,7. Podejście to ma jednak kilka ograniczeń, w tym inwazyjny charakter procedury, która niesie ze sobą ryzyko śmiertelności okołozabiegowej (często zaniżonej)8. Ponadto IMI w bezpośrednim widoku nie wyklucza możliwości przypadkowego wstrzyknięcia do jamy komorowej. W praktyce klinicznej IMI podczas operacji otwartej klatki piersiowej może być odpowiednią metodą dostarczania komórek terapeutycznych, np. podczas operacji pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG); jednak takie podejście może nie być odpowiednie do dostarczania komórek w kardiomiopatii globalnej pochodzenia nieniedokrwiennego (np. HFrEF wtórna do kardiomiopatii indukowanej antracyklinami (AICM)).

Nie ma wątpliwości, że choroba niedokrwienna serca (IHD) jest najczęstszą przyczyną HFrEF (~ 66%)9,10; jednak kardiomiopatia nieniedokrwienna, w tym AICM, nadal dotyka znaczną część pacjentów z HFrEF (33%)9. Rzeczywiście, ostatnie postępy w onkologii klinicznej spowodowały, że w samych Stanach Zjednoczonych ponad 10 milionów osób, które przeżyły raka11, z szacunkami podobnej liczby w Europie, co jest zgodne z ogólnym trendem w kierunku poprawy przeżywalności pacjentów z rakiem12,13. W związku z tym badanie korzyści płynących z nowych terapii, takich jak przeszczep komórek macierzystych w kardiomiopatii nieniedokrwiennej, a także testowanie skutecznej i minimalnie inwazyjnej drogi dostarczania komórek macierzystych ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę rosnącą liczbę pacjentów dotkniętych kardiotoksycznością wtórną do leków przeciwnowotworowych.

Warto zauważyć, że badania testujące hipotezy z wykorzystaniem terapii komórkami macierzystymi mającymi na celu naprawę/regenerację uszkodzonego mięśnia sercowego często obejmują użycie małych gryzoni (np. myszy i szczurów). Modele te często wymagają drogich systemów ultrasonograficznych wysokiej częstotliwości do oceny funkcji mięśnia sercowego, zwykle wyposażonych w przetworniki liniowe, które mają pewne nieodłączne powiązane ograniczenia (np. pogłos)14. Jednak inne modele, takie jak króliki, reprezentujące duży model przedkliniczny, mają pewne zalety w testowaniu hipotez terapii komórkami macierzystymi w HFrEF. Tak więc, w przeciwieństwie do szczurów i myszy, króliki utrzymują system transportu Ca+2 i elektrofizjologię komórkową, która przypomina system ludzi i innych dużych zwierząt (np. psów i świń)15,16,17,18,19. Kolejną zaletą jest możliwość wykonywania badań ultrasonograficznych serca przy użyciu stosunkowo niedrogich i powszechnie dostępnych systemów echokardiografii klinicznej wyposażonych w przetworniki fazowe o stosunkowo wysokiej częstotliwości, np. 12 MHz, takie jak często stosowane w kardiologii noworodków i dzieci. Systemy te umożliwiają doskonałe obrazowanie echokardiograficzne przy użyciu najnowocześniejszej technologii i wykorzystują przewagę obrazowania harmonicznego20. Ponadto szeroko zakrojone testowanie hipotez dotyczących potencjału terapii regeneracyjnych serca (np. terapii komórkami macierzystymi), ich bezpieczeństwa, skuteczności, potencjału kardiomiogennego, a także ocena losów iniekcji po podaniu do mięśnia sercowego, jest obowiązkowe, zanim będzie można rozważyć ich stosowanie u ludzi, i wymagają one użycia dużych przedklinicznych modeli zwierzęcych, takich jak rabbit17, 19. W tym miejscu opisujemy minimalnie inwazyjną technikę dostarczania komórek za pomocą przezskórnego IMI sterowanego echokardiografią kontrastową przy użyciu klinicznego systemu echokardiografii, który jest ukierunkowany na terapię opartą na przeszczepie komórek macierzystych w kardiomiopatii nieniedokrwiennej20. Opisujemy również korzyści płynące z atramentu India Ink (InI, znanego również jako China Ink) jako ultradźwiękowego środka kontrastowego i znacznika in situ wstrzyknięcia w serce królika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane w niniejszym dokumencie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Uniwersytetu w Murcii w Hiszpanii i przeprowadzono je zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE Komisji Europejskiej. Opisane etapy zostały wykonane zgodnie ze standardowymi protokołami operacyjnymi, które stanowiły część planu pracy i nie zostały przeprowadzone wyłącznie w celu nagrania filmu towarzyszącego niniejszej publikacji.

1. Przygotowanie komórek i ssaczego wektora ekspresyjnego

UWAGA: W tym miejscu krótko opisujemy protokół przygotowania i transfekcji linii komórkowej (ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293 (HEK-293)); należy jednak zoptymalizować odpowiednie protokoły specyficzne dla badanego typu komórek (np. komórek macierzystych).

  1. Hodować komórki HEK-293 w pożywce Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Po osiągnięciu przez komórki stanu subkonfluencji, przeprowadzić pasaż w stosunku 1:3.
  2. Rozpocząć pasażowanie komórek poprzez odessanie pożywki, a następnie jednokrotne przemycie sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Usunąć nadmiar PBS, a następnie inkubować z 2,5 mL 0,5x trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (5 min, 37 °C).
    1. Dodać taką samą objętość pożywki DMEM (uzupełnionej zgodnie z powyższym opisem), aby zatrzymać reakcję, a następnie odczepić komórki poprzez powolne i delikatne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety elektronicznej.
  3. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do odpowiedniego naczynia (np. stożkowej probówki wirówkowej 15-50 mL). Wirować w rotorze z koszyczkami (100 x g), odrzucić nadsącz i dwukrotnie przemyć osad sterylnym PBS.
  4. Resuspendować osad w świeżej pożywce DMEM i wysiać z odpowiednią gęstością komórek (np. 1 x 106 komórek w kolbie 75 cm2) do świeżych kolb hodowlanych lub dużych szalek, zgodnie z lokalnymi praktykami laboratoryjnymi.
    1. Wymieniać istniejącą pożywkę na świeżą co 2 dni.
      UWAGA: Wektor ekspresyjny został wyprowadzony z pIRES1hyg i stosowany zgodnie z instrukcjami producenta, jak opisano wcześniej21. p(EGFP) IRES1hyg został wygenerowany poprzez subklonowanie cDNA EGFP jako insertu BamHI + NotI z pEGFP-N1 do pIRES1hyg trawionego BamHI + NotI21.
  5. 1 dzień przed transfekcją wysiać komórki HEK-293 z gęstością 0,5 x 105 komórek/cm2 na 12- lub 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.
  6. W dniu transfekcji przygotować kompleksy odczynnika do transfekcji DNA-lipid w oddzielnych probówkach do mikrocentryfugi 1,5 mL (1 probówka na dołek).
    1. Zacząć od dodania 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy do każdej probówki, a następnie dodać 4 µg DNA (delikatnie wymieszać).
    2. Następnie do każdej probówki dodać 250 µL wcześniej przygotowanej mieszaniny 10 µL odczynnika do transfekcji lipidowej i 250 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy (ponownie delikatnie wymieszać).
    3. Na koniec przeprowadzić transfekcje, inkubując komórki HEK-293 z kompleksami odczynnika do transfekcji DNA-lipid przez 4 h, a następnie zastąpić pożywkę pożywką DMEM uzupełnioną zgodnie z powyższym opisem (krok 1.1) i inkubować przez kolejne 48 h. Przeprowadzić selekcję lekową stabilnych transfektantów za pomocą 100 µg/mL hygromycyny B.
  7. Odczepić komórki HEK-293 za pomocą trypsyny zgodnie z powyższym opisem (krok 1.2). Po przemyciu komórek sterylnym PBS, resuspendować w odpowiednim nośniku (np. 10% v/v InI w PBS), aby uzyskać końcowe stężenie komórek 5 x 106/mL.

2. Przygotowanie królika

UWAGA: Pozycjonowanie królika oraz przetwornika podczas IMI nie jest optymalne do oceny morfologii i funkcji serca zwierzęcia. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie pełnego badania echokardiograficznego20 przed IMI (patrz poniżej), a następnie w kolejnych punktach czasowych określonych w planie eksperymentalnym. Celem tych działań będzie ocena bazowych cech anatomicznych i funkcjonalnych serca u zwierzęcia, które otrzyma wstrzyknięcie, a także ocena wpływu IMI na funkcję serca.

  1. Przeprowadź badanie metodą ślepą, zgodnie z wytycznymi Komitetu Echokardiografii Amerykańskiego Kolegium Medycyny Wewnętrznej Weterynaryjnej oraz Amerykańskiego Towarzystwa Echokardiografii/Europejskiego Stowarzyszenia Obrazowania Serca i Naczyń22,23,24.
  2. Zapewnij jednoczesny zapis jednokanałowego elektrokardiogramu (EKG) przez cały czas trwania badania echokardiograficznego.
  3. Zanestezjuj królika za pomocą ketaminy w dawce 10 mg/kg w połączeniu z medetomidyną w dawce 200 µg/kg, podając preparaty w zastrzyku domięśniowym (I.M.).
  4. Sprawdź poziom znieczulenia po 10-20 min od podania leków anestetycznych.
  5. Używając maszynki do strzyżenia, usuń szeroko sierść z klatki piersiowej (np. od poziomu szyi do obszaru podmieczowatego) (Rysunek 1A).
  6. Wygolij dodatkowe obszary o powierzchni 1-2 cm2 na wewnętrznej stronie prawej kończyny przedniej (obszar przyśrodkowy stawu łokciowego) oraz obu kończyn tylnych (obszar przyśrodkowy stawu skokowego) (Rysunek 1B).
  7. Umieść przylepne elektrody EKG na wygolonych obszarach kończyn, aby synchronicznie monitorować rytm serca podczas procedury (Rysunek 1C).
  8. Umieść zwierzę w pozycji grzbietnej na kocu termicznym, z kończynami wyciągniętymi i przymocowanymi do stołu za pomocą taśmy chirurgicznej (Rysunek 1C).
    1. Upewnij się, że uszy są odgięte do tyłu za głową/grzbietem królika i znajdują się niżej niż kończyny przednie, ponieważ pomaga to utrzymać prawidłową pozycję klatki piersiowej zwierzęcia przez cały czas trwania procedury.
  9. Pozostaw zwierzę w oddychaniu spontanicznym, podając tlen przez maskę przez cały czas trwania procedury (100%, 2-3 L/min).

Przygotowanie zwierzęcia do badania USG, dłonie w rękawiczkach, ogolona skóra, głowica USG, procedura weterynaryjna.
Rycina 1. Przygotowanie królika do IMI. (A) Wystrzyganie włosów z klatki piersiowej; (B) Wystrzyganie włosów z kończyn; (C) Mocowanie elektrod i ułożenie królika z wyciągniętymi nogami na kocyku termicznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Technika IMI pod kontrolą przezskórnej echokardiografii kontrastowej u królika

  1. Oczyścić i zdezynfekować skórę klatki piersiowej roztworem na bazie chlorheksydyny.
    1. Przez cały czas trwania procedury należy stosować techniki aseptyczne, zgodnie z aktualnymi najlepszymi praktykami.
    2. W miarę możliwości i jeśli jest to racjonalnie wykonalne, należy przeprowadzić procedurę w warunkach pełnej sterylności, obejmującą w szczególności stosowanie materiałów sterylnych, takich jak fartuchy, rękawiczki, chirurgiczne obłożenia pola operacyjnego, sterylne podkłady na stół, a także sterylną osłonę przetwornika ultradźwiękowego i sterylny żel do USG. Pozwoli to zminimalizować ryzyko wprowadzenia patogenów do zwierzęcia poddawanego IMI i stanowi standardową praktykę w warunkach klinicznych (np., podczas punkcji serca).
      UWAGA: Zaleca się, aby zawsze postępować zgodnie z lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi badań na zwierzętach, obowiązującymi w danej instytucji oraz kraju, w którym prowadzona jest praktyka.
  2. Nanieś żel transmisyjny do USG na klatkę piersiową i/lub na przetwornik, a następnie, owijając kabel przetwornika wokół szyi eksperymentatora, wykonaj szybkie badanie przesiewowe serca zwierzęcia w oknie akustycznym, co często ułatwia wizualizację anatomii i planowanie procedury IMI.
  3. Umieść przetwornik ręcznie w pozycji 4th-6th przestrzeń międzyżebrowa, 2–3 cm od prawej linii przymostkowej pod kątem padania ok. 90° w odniesieniu do prawej strony ściany klatki piersiowej (Rycina 2A).
  4. Dostosuj położenie przetwornika względem przestrzeni międzyżebrowej, a także jego kąt przednio-tylny i grzbietowo-brzuszny, aby zoptymalizować zmodyfikowany przekrój w osi krótkiej na poziomie mięśni papilarnych. Zidentyfikuj w tym przekroju prawą komorę (RV), lewą komorę (LV), przegrodę międzykomorową (IVS), ścianę tylną (PW) oraz przednio-boczne (AL) i tylno-przyśrodkowe (PM) mięśnie papilarne (Rycina 2B).
    1. Uzyskaj szerokie pole widzenia poprzez znaczne zwiększenie głębokości za pomocą odpowiedniego sterownika w systemie (np., przycisk, pokrętło).
    2. Należy zwrócić szczególną uwagę na uzyskanie symetrycznego obrazu w tym rzucie, a także na odpowiednie zróżnicowanie konturów wsierdzia i osierdzia i w razie potrzeby skorygować je za pomocą elementów sterujących optymalizacją obrazu (np., wzmocnienie).
  5. Po uzyskaniu optymalnego obrazu echokardiograficznego (Rycina 2B), należy utrzymać tę pozycję przez cały pozostały czas trwania procedury, podczas gdy drugi operator wykonuje IMI (patrz poniżej).
    1. Podczas trzymania przetwornika należy unikać zasłaniania znacznika orientacji, który powinien być zawsze skierowany do przodu, co umożliwi jego wyrównanie z igłą w kolejnych krokach (Rycina 2A, C).
  6. Za pomocą igły 24 G przymocowanej do strzykawki 1 ml umieść igłę blisko skóry lewej połowy klatki piersiowej, w pozycji symetrycznego odbicia względem przetwornika. Następnie ręcznie wyrównaj igłę z oznaczeniem orientacji przetwornika pod kątem ok. 90° (Rycina 2C), a następnie powoli przesuwaj igłę przez skórę do jamy klatki piersiowej.
    UWAGA: Przezskórne wprowadzenie igły w tej pozycji i orientacji ułatwia wizualizację igły w płaszczyźnie wiązki ultradźwięków (Rycina 2D, E), co umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym i, w razie potrzeby, korektę położenia igły względem docelowego obszaru mięśnia sercowego (Rycina 2G, H).
  7. Po umieszczeniu końcówki w docelowym miejscu, powoli podać wstrzykiwaną substancję (do 0,25 ml na miejsce wstrzyknięcia) w czasie od 10 do 30 s (Rysunek 2E), powoli i delikatnie wycofując igłę podczas wstrzykiwania, aby zwiększyć zakres opracowanego mięśnia sercowego.
    1. Do standaryzacji techniki oraz jako... należy użyć InI 10% (v/v) rozcieńczonego w PBS, a także jako... in situ znacznika w trakcie nabywania biegłości, a także w celu potwierdzenia skutecznego celowania we wszystkie cztery miejsca IMI w obrębie mięśnia sercowego za pomocą badania makroskopowego i histopatologicznego (patrz Reprezentatywne wyniki). Po osiągnięciu biegłości, InI można zastąpić odpowiednim komercyjnym środkiem kontrastowym do USG, jeśli jest to pożądane.
      UWAGA: Podanie do mięśnia sercowego 10% (v/v) InI rozcieńczonego w PBS, z komórkami lub bez, skutkuje transmuralną hiperechogenicznością (t.j., echogenny wygląd) w miejscu wstrzyknięcia (Rysunek 2E, F). Przejściowe spowolnienie lub przyspieszenie częstotliwości akcji serca, związane z dodatkowymi skurczami komór (np., pojedyncze, dublety i triplety) są często obserwowane już od pierwszego kontaktu igły z epicardium, a także w trakcie i/lub krótko po IMI. Jednakże nie rozwijają się arytmie zagrażające życiu, a ostre działania niepożądane są rzadko obserwowane przy zastosowaniu do 0,25 ml (1,25 x 106 komórek) preparatu do wstrzyknięcia na miejsce wstrzyknięcia domięśniowego (patrz Reprezentatywne wyniki i Dyskusja).
  8. W razie potrzeby wprowadź subtelne zmiany w kącie nachylenia igły, aby zakończyć iniekcje 0,25 ml do każdego z czterech docelowych miejsc IMI (trzech w wolnej ścianie lewej komory (LVFW) i jednego w IVS).
  9. Po zakończeniu procedury IMI prowadzonej pod kontrolą przezskórnej echokardiografii z kontrastem, należy ocenić rytm serca (np., za pomocą seryjnych zapisów EKG i/lub 24-godzinnego monitorowania Holterem), a następnie przeprowadzić seryjne badanie echokardiograficzne w oknie w celu zweryfikowania braku powikłań, aż do pełnego wybudzenia zwierzęcia z narkozy, a dopiero wtedy przenieść je do pomieszczenia z cyklem światła.
    1. W niniejszym badaniu zastosowano 24-godzinne monitorowanie EKG metodą Holtera w celu oceny wpływu IMI z InI na rytm serca w ciągu 24 h. W tym celu porównano grupę 6 królików o prawidłowym fenotypie (grupa kontrolna) oraz grupę 6 królików, którym podawano dożylnie doksorubicynę (kardiotoksyczny lek z grupy antracyklin, powszechnie stosowany w leczeniu nowotworów; grupa DOX) w dawce 2 mg/kg/tydzień przez 8 tygodni, a następnie obie grupy otrzymywały IMI z InI.

Schemat obrazowania ultradźwiękowego i rozmieszczenia sondy do analizy funkcji serca w modelu zwierzęcym.
Rycina 2. Przezskórne wstrzykiwanie domięśniowe w sercu królika pod kontrolą echokardiografii kontrastowej. (A) Rozmieszczenie przetwornika w prawym hemitoraksie pod kątem ~ 90°. (B) Reprezentacyjny obraz przekroju krótkiej osi przymostkowej (PSSX) serca na poziomie mięśni brodawkowych u królika. (C) Ustawienie igły pod kątem ~ 90° względem znacznika orientacji przetwornika. (D) Położenie igły w miejscu docelowym w widoku PSSX serca (należy zauważyć, że igła jest łatwo widoczna w płaszczyźnie wiązki ultradźwiękowej). (E i F) Demonstracja hiperechogeniczności w miejscu docelowym po wstrzyknięciu domięśniowym tuszu indyjskiego (groty strzałek wskazują transmuralną hiperechogeniczność). (G) Przypadkowe umieszczenie igły w jamie LV (groty strzałek wskazują trzon igły). (H) Repozycjonowanie igły do wolnej ściany LV (groty strzałek wskazują trzon igły). RV = prawa komora; LV = lewa komora; IVS = przegroda międzykomorowa; PW = ściana tylna; AL = mięsień brodawkowy przednio-boczny; PM = mięsień brodawkowy tylno-przyśrodkowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Analizy po IMI

  1. Przeprowadzić analizę histopatologiczną próbek tkanki serca królików.
    1. Utrwalić tkankę przez 24 h w 10% formaldehydzie, a następnie odwodnić w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu w następujący sposób:
      • 1x w 70% (60 min)
      • 1x w 95% etanolu/5% metanolu (60 min)
      • 1x w 100% (60 min)
      • 1x w 100% (90 min)
      • 1x w 100% (120 min)
      UWAGA: Wszystkie powyższe inkubacje przeprowadza się w temperaturze pokojowej (RT). Następnie dwukrotnie zastąpić ksylenem 100% (1 h, RT), a na koniec zalać parafiną w dwóch etapach (60 min, 58 °C)25.
    2. Wyciąć skrawki tkanki o grubości 4-5 µm przy użyciu mikrotomu25. Nanieść skrawki na szkiełka.
    3. Przeprowadzić barwienie metodą hematoksylino-eozyną oraz metodą trichromem Massona25,26,27.
  2. W skrawkach tkanki z przeszczepionych serc przeprowadzić immunohistochemię w celu wykrycia komórek EGFP(+) HEK-293 (np. stosując metodę kompleksu awidyna-biotyna (ABC)), w skrócie:
    1. Odparafinować skrawki serca o grubości 4-5 µm w ksylenie 100% (10 min, w RT). Rehydratyzować tkankę, płucząc w roztworach etanolu o malejącym stężeniu (2x w 100% (2 min); 2x w 95% (2 min); 1x w 70% (2 min); 1x w 50% (2 min); 1x w 30% (2 min); 1x ddH2O (2 min)) w RT.
    2. Przeprowadzić inhibicję endogennej peroksydazy, pokrywając skrawki 100 µL 3% H2O2 rozcieńczonego w metanolu (przygotowanego z 5 mL 30% roztworu stokowego H2O2 i dodania metanolu do całkowitej objętości 50 mL) (inkubować 30 min, RT), a następnie przemyć poprzez imersję w buforze solnym Tris (TBS; pH 7.6).
    3. Przeprowadzić odsłanianie antygenów poprzez traktowanie enzymatyczne, pokrywając skrawki 100 µL 0,1% Pronazy (przygotowanej z 0,01 g Pronazy rozpuszczonej w 10 mL TBS) (inkubować 12 min, RT), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).
    4. Inkubować w roztworze blokującym (normalna surowica kozia w stężeniu 10% w TBS), stosując 100 µL na szkiełko (30 min, RT), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).
    5. Inkubować z przeciwciałem przeciwko zielonemu białku fluorescencyjnemu (GFP) pochodzenia kurczego jako przeciwciałem pierwszorzędowym (1:500 w TBS) (1 h, 30 °C), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).
    6. Inkubować z biotynilowanym przeciwciałem wtórnym anty-IgG kurczym pochodzenia koziego (1:250 w TBS) (1 h, 30 °C), a następnie przemyć TBS (5 min, RT).
    7. Inkubować z kompleksem awidyna-biotyna (20 min, 30 °C), a następnie znakować przy użyciu tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Na koniec odwodnić, płucząc w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu (1x w 30% (2 min); 1x w 50% (2 min); 1x w 70% (2 min); 2x w 95% (2 min); 2x w 100% (2 min)) w RT, dobarwić skrawki metodą hematoksylino-eozyną25, a następnie przykryć szkiełka lamellkami. Uwzględnić kontrole pozytywne, negatywne oraz izotypowe.
      UWAGA: Powyższy skrócony protokół nie jest przeznaczony do ogólnego zastosowania w immunohistochemii; niezbędna jest optymalizacja dla danej tkanki i warunków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przezskórna IMI z użyciem InI pod kontrolą echokardiografii kontrastowej:

Stosując opisany powyżej protokół, po potwierdzeniu echokardiograficznie optymalnego ułożenia końcówki igły i rozpoczęciu wstrzykiwania, podczas podawania InI (10% v/v w PBS) zaobserwowano transmuralną hiperechogeniczność (Rysunek 2E), a także krótko po wykonaniu IMI w obszarze docelowym (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym celem było opracowanie minimalnie inwazyjnej techniki, która mogłaby być wykorzystana do dostarczania komórek macierzystych do mięśnia sercowego królików (duży przedkliniczny model zwierzęcy)17,18, przy jednoczesnym wykorzystaniu stosunkowo niedrogiego systemu obrazowania łatwo dostępnego w wielu ośrodkach klinicznych i badawczych. Tutaj pokazujemy, że przy użyciu klinicznego systemu echokardiografii i wspomaganego przez InI, powszechnie dostępny środek, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Sheili Monfort, Brendzie Martínez, Carlosowi Micó, Alberto Muñozowi i Manuelowi Molinie za doskonałe wsparcie podczas zbierania danych, oraz Carlosowi Bueno za dostarczenie komórek EGFP(+) HEK-293. Prace te były częściowo wspierane przez: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Hiszpania (JT) (numer grantu: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I+D+I 2008-2011 (Grant nr. RD12/0019/0001) (JMM), współfinansowany ze środków funduszy strukturalnych Unii Europejskiej (FEDER) (JMM); oraz University of Reading, Wielka Brytania (AG, GB) (Finansowanie Centralne). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System ultrasonograficzny HD11 XEechokardiograficzny 10670267 firmyPhilips
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz przetwornik matrycy fazowej
Żel do transmisji ultradźwięków (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  Cewnik naigłowy
Omnifix-F 1 ml strzykawkaBraun9161406V
Imalgene (Ketamina)MerialRN 9767Konieczna jest recepta weterynaryjna
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Konieczna jest recepta weterynaryjna
Poduszka
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99Indie (Chiny) Holter atramentowy
SyneflashEla medycznySF0003044S24-godzinny system Holter EKG.
Elektrody Niebieski Czujnik®Elektrody EKG HolterAmbu (NUMED)VLC-00-S
MikrotomLeica BiosystemsRM2155
MikroskopOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Zestaw kompleksu biotyny Avidin.
Przeciwciało anty-GFP kurczakaInvitrogenA10262Przeciwciało pierwszorzędowe.
Biotynylowane przeciwciało IgG przeciwko kurczakowiVector LaboratoriesBA-9010Przeciwciało wtórne.
Czterochlorowodorek 3,30-diaminobenzydyny (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Carl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter EKGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% płodowa surowica cielęca (FCS)Fisher Scientific11573397
0,05% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamina 2000 (odczynnik do transfekcji lipidów)Fisher Scientific11668019
Zredukowana pożywka surowicy (Opti-MEM)Fisher Scientific
Hygromycyna BCalbiochem (MERCK)400051
Ksylen (histologiczny)Fisher ScientificX3S-4
Roztwór nadtlenku wodoru (H2O2)SigmaH1009
Pronaza FisherScientific53-702-250KU
System .grzewcza.Mikroskop fluorescencyjny 31985070

Bibliografia

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23(2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342(2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149(2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594(2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566(2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902(2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja przezsk rnamodel kr likaprowadzenie pod kontrol ultrasonografiitkanka mi nia sercowegotusz indyjskikom rki eGFP dodatniemonitorowanie Holtera
Przezskórna iniekcja domięśniowa pod kontrolą echokardiografii z kontrastem i dostarczanie komórek w dużym modelu przedklinicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.