Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Podsumowanie

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Streszczenie

Zanik geograficzny (GA), późne stadium suchego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem charakteryzuje się utratą warstwy nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), co prowadzi do późniejszej degeneracji ważnych struktur siatkówki (np. fotoreceptorów), powodując poważne upośledzenie widzenia. Podobnie, utratę RPE i zmniejszenie ostrości wzroku obserwuje się w długoterminowej obserwacji pacjentów z zaawansowanym wysiękowym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) otrzymujących doszklistkowe leczenie czynnikiem wzrostu śródbłonka przeciwnaczyniowego (VEGF). Dlatego z jednej strony fundamentalne znaczenie ma efektywne pozyskiwanie komórek RPE z nieograniczonego źródła, które może służyć jako terapia zastępcza. Z drugiej strony ważna jest ocena zachowania i integracji pobranych komórek w modelu choroby obejmującym metody chirurgiczne i obrazowe jak najbardziej zbliżone do tych stosowanych u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół oparty na naszych poprzednich publikacjach, który opisuje generowanie przedklinicznego modelu GA przy użyciu oka królika albinosa, do oceny komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC-RPE) w klinicznie istotnych warunkach. Zróżnicowane hESC-RPE są przeszczepiane do oczu naiwnych lub oczu ze zwyrodnieniem siatkówki podobnym do GA wywołanym przez NaIO₃ przy użyciu techniki transszklistkowej pars plana 25 G. Ocena obszarów zwyrodniałych i przeszczepionych odbywa się za pomocą multimodalnego, nieinwazyjnego obrazowania w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje generowanie przedklinicznego modelu atrofii geograficznej (GA) o dużych oczach, który pozwala na ocenę integracji przeszczepionego hESC-RPE w przestrzeni podsiatkówkowej. Szczegółowo opisane tutaj metody zostały wykorzystane w 3 ostatnich publikacjach, które wykazują produkcję wzbogaconej, czystej i funkcjonalnej populacji komórek RPE z hESC¹, a także tworzenie zewnętrznego uszkodzenia siatkówki i fenotypu podobnego do GA indukowanego przez podsiatkówkowe wstrzyknięcie fizjologicznych roztworów soli (tj. BSS i PBS) lub NaIO₃ w klasie rabbit eye2^{, 3}. Wykazaliśmy ponadto, że przeszczepy zawiesiny podsiatkówkowej hESC-RPE tworzą rozległe funkcjonalne monowarstwy o zdolności ratunkowej fotoreceptorów².

Kilka zalet towarzyszy użyciu oka królika do generowania modelu choroby GA. Po pierwsze, rozmiar oka królika, który stanowi 70% objętości oka dorosłego człowieka, pozwala na klinicznie znaczący przeszczep przy użyciu gęstości komórek, która jest znacznie niższa niż rutynowo stosowana w małych oczach gryzoni (1000 komórek/μL vs. 50 000 komórek/μL)^4,5. Po drugie, operacja u gryzoni jest zwykle przeztwardówkowa przez naczyniówkę, co narusza barierę siatkówkową i potencjalnie wywołuje reakcję zapalną i możliwe odrzucenie⁶. Oba czynniki razem mogą prowadzić do wielowarstwowości i zlepiania się przeszczepionych komórek oraz ogólnej słabej integracji przeszczepionych komórek w zakłóconej natywnej tkance siatkówki. Jednak model królika o dużych oczach pozwala na wykonanie techniki chirurgicznej z oprzyrządowaniem identycznym jak w warunkach klinicznych. Po trzecie, model o dużych oczach umożliwia również obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości i monitorowanie przeszczepionych komórek i leżącej nad nimi siatkówki w czasie^1,2,3. W związku z tym opisujemy klinicznie istotny i opłacalny model przedkliniczny, który powinien być atrakcyjną alternatywą dla gryzoni dla każdego, kto jest zainteresowany badaniami nad normalną i chorą siatkówką oraz przestrzenią podsiatkówkową.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Karolinska Instituet dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach z udziałem nowozelandzkich królików albinosów (tabela materiałów) zostały zatwierdzone przez regionalną komisję etyki zwierząt (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (zezwolenie: dnr 56/15). Stosowanie hESC (dnr 2011/745-31/3) oraz transfer i manipulowanie hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) jest również zgodne ze szwedzkim ustawodawstwem i przepisami Karolinska Institutet oraz zostało zatwierdzone przez regionalną komisję ds. etyki człowieka (Regionala Etikprövningsnämnden i Sztokholm).

1. Podsiatkówkowe wstrzyknięcie jodanu sodu (NaIO₃) do wielkookiego modelu zwierzęcego

1. Znieczulenie zwierząt przez podanie domięśniowe w udo mieszaniną 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny w soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 30 G i rozszerzenie źrenic za pomocą miejscowych kropli do oczu przy użyciu mieszaniny 0,75% cyklopentolanu i 2,5% fenylefryny. Prawidłowe znieczulenie jest potwierdzone, jeśli zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie w tylną nogę.
2. Umieść królika pod mikroskopem chirurgicznym z głową skierowaną w stronę chirurga (Ryc. 1A). Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i błonę nictitans za pomocą sterylnej szmatki, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Używaj zbilansowanego roztworu soli (BSS), aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia w obu oczach.
3. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę 2-portową (lub opcjonalnie 3-portową) 25 G transvitralną pars plana z trokarami bez zaworu do wprowadzania narzędzi mikrochirurgicznych (Rysunek 1B). Wielofunkcyjna maszyna do witrektomii posiada porty do podłączenia kaniuli infuzyjnej, endoillumination, wirektoratu i endolasera. W przypadku iniekcji podsiatkówkowych obowiązkowe jest tylko endooświetlenie, co sprawia, że konfiguracja 2-portowa jest wystarczająca. Wprowadzić endoillumację przez górny lewy trokar i użyć górnego prawego trokaru do kaniuli do wstrzykiwań podsiatkówkowych.
   1. W przypadku konfiguracji 3-portowej użyj dolnego trokaru skroniowego do kaniuli infuzyjnej BSS. Jeśli używane są opcjonalne instrumenty (takie jak witrektor), włóż je przez prawy górny trokar.
   2. Włóż 2 górne trokary w odległości 1-2 mm od rąbka za pomocą szponiastych kleszczy, aby chwycić i przesunąć spojówkę leżącą nad miejscem wprowadzenia.
   3. Upewnij się, że trokary są włożone przeztwardówkowo pod kątem równoległym 30-45° rąbka i przejdź do środka końcówki trokaru. Następnie obróć trokar o 90° i wsuń się w oko, celując w tylny biegun oka. Ta procedura pozwoli uniknąć wycieku pooperacyjnego z powodu sklerotomii, a także zmniejszy ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej (tj. infekcji bakteryjnej w oku). Zobacz także Rysunek 2B dla pozycji trokarów.
   4. Umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę, z syntetycznymi łzami jako żelem kontaktowym między okiem a soczewką kontaktową (Rysunek 1A).
   5. Pobrać 500 μl NaIO₃ do strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do rurki przedłużającej (obsługiwanej przez asystenta) i kaniuli wielokońcówkowej 38 G (obsługiwanej przez chirurga).
   6. Przełóż sondę endoilluminacyjną przez górny lewy trokar, a kaniulę iniekcyjną przez prawy górny trokar i przesuń kaniulę przez przestrzeń ciała szklistego w kierunku siatkówki, kierując się na obszar tuż pod głową nerwu wzrokowego.
   7. Pozwól, aby końcówka kaniuli powoli dotykała siatkówki, aż do uzyskania widocznego ogniskowego wybielania. Samo wstrzyknięcie przeniknie do siatkówki, umożliwiając dostarczenie podsiatkówkowe. Nie pozwól, aby kaniula przeniknęła do siatkówki, ponieważ może to spowodować krwotok.
   8. Wstrzyknąć 50 μl NaIO₃ podsiatkówkowo przez okres 5 sekund. Ponieważ między siatkówką a leżącym pod nią naczyniówką znajduje się naturalna płaszczyzna rozszczepienia, podczas wstrzyknięcia powinien stopniowo tworzyć się wyraźnie widoczny półprzezroczysty pęcherzyk.
   9. Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks.
   10. Po usunięciu endoillumacji i kaniuli iniekcyjnej usuń trokary za pomocą kleszczy z pazurami i wywieraj lekki nacisk przez 30 s na samouszczelniające się sklerotomii bez szwów za pomocą końcówki lub końca kleszczy.
4. Po operacji podaj podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu. Nie podawaj pooperacyjnie miejscowo sterydów ani antybiotyków. Jako leki przeciwbólowe podawaj 0,5 ml buprenorfiny 0,3 mg/ml podskórnie po operacji, jak również dzień po operacji.
5. Po użyciu umyj wszystkie instrumenty, zanurzając je na kilka sekund, najpierw w 70% etanolu, następnie w 45% etanolu, a na końcu w wodzie destylowanej. Osusz je dokładnie ręcznikiem papierowym.
6. Opiekuj się zwierzętami, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności i umieść je wszystkie pojedynczo w klatce. W razie potrzeby (np. do celów immunohistochemicznych) należy poddać zwierzęta eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie 100 mg/kg pentobarbitalu (patrz tabela materiałów).
7. Odczekaj 7 dni, aby przystąpić do przeszczepu komórek hESC-RPE.

2. Podsiatkówkowe przeszczepienie komórek hESC-RPE u leczonych zwierząt

1. Podać 2 mg (100 μl) triamcynolonu doszklistkowego znieczulonym zwierzętom za pomocą igły iniekcyjnej o wadze 30 g umieszczonej w odległości 1-2 mm od rąbka w dolnym kwadrancie skroniowym na 1 tydzień przed przeszczepieniem hESC-RPE i podawać ponownie co 3 miesiące. Upewnij się, że końcówka jest skierowana w stronę tylnego bieguna oka, aby uniknąć dotknięcia soczewki.
2. Hodowla monowarstwy hESC-RPE zgodnie z wcześniejszym opisem¹.
3. Usunąć pożywkę różnicującą komórki (patrz tabela materiałów) z 24-dołkowej monowarstwy hESC-RPE i przemyć każdą studzienkę 500 μl PBS bez Ca²⁺ i Mg²⁺. Powtórz tę czynność jeszcze raz, w sumie 2 prania.
4. Odrzucić supernatant, dodać 500 μl trypsyny do dołka i inkubować przez 12 minut w temperaturze 37 °C.
5. Przechyl płytkę i ostrożnie usuń trypsynę (komórki powinny pozostać przyczepione do płytki). Zebrać komórki w 800 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej o temperaturze 37 °C, delikatnie pipetując lub nawet skrobając, jeśli to konieczne, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
   UWAGA: Użyj sitka komórkowego o wielkości 40 μm, jeśli zaobserwuje się grudki komórek.
6. Policz komórki w komorze hemocytometru za pomocą 0,2% błękitu trypanowego, zgodnie z instrukcjami producenta.
7. Dodać 5 ml pożywki różnicującej i odwirować komórki w temperaturze pokojowej, 300 x g przez 5 minut.
8. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżo wysterylizowanym PBS z filtrem (przepuszczonym przez filtr strzykawkowy 25 mm) do końcowego stężenia 1,000 komórek/μl.
9. Poprzednią zawiesinę komórkową podzielić na podwielokrotności o objętości 600 μl i przechowywać na lodzie do czasu i w trakcie zabiegu.
10. Znieczulać zwierzęta przez podanie domięśniowe w udo mieszaniną 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny w soli fizjologicznej za pomocą strzykawki 30 G. Rozszerz źrenice za pomocą miejscowych kropli do oczu, stosując amix 0,75% cyklopentolanu i 2,5% fenylefryny. Prawidłowe znieczulenie jest potwierdzone, jeśli zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie w tylną nogę.
11. Umieść królika z głową skierowaną w stronę chirurga. Użyj zwijacza powieki, aby usunąć powieki i błonę nictitans za pomocą sterylnej szmatki, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Użyj BSS, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia w obu oczach.
12. W przypadku mikrochirurgii należy zastosować technikę 2-portową (lub opcjonalnie 3-portową) 25 G transvitreal pars plana z trokarami umieszczonymi w tych samych pozycjach, jak opisano w kroku 1.3 i Rysunek 2. Jeśli poprzednie sklerotomia są widoczne, należy wykonać wprowadzenie trokaru tuż obok nich, ale nie przez nie, aby zminimalizować ryzyko przecieku pooperacyjnego.
    1. Umieść jednorazową płaską soczewkę kontaktową na rogówce, aby uwidocznić siatkówkę, z syntetycznymi łzami jako żelem kontaktowym między okiem a soczewką kontaktową (Rysunek 1A).
    2. Po prawidłowym ustawieniu końcówki (patrz kroki 1.3.5 i 1.3.6) wstrzyknąć podsiatkówkowo 50 μl delikatnie zmieszanej zawiesiny hESC-RPE (50 000 komórek). Celuj w środek obszaru wstępnie leczonego NaIO₃ wyróżniającego się charakterystycznym "metalicznym" odruchem endooświetlenia. Siatkówka neurosensoryczna powinna łatwo się rozdzielać, tworząc wyraźnie widoczny pęcherzyk. Przepłukać igłę sterylnym_H2Opomiędzy kolejnymi królikami/po użyciu, aby uniknąć zatkania igły z powodu zbrylenia komórek. Zmień igłę, gdy zauważysz zatkanie.
    3. Podczas wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę, ale upewnić się, że końcówka jest utrzymana w pęcherzyku, aby zminimalizować refluks.
    4. Po usunięciu endoillumacji i kaniuli iniekcyjnej usuń trokary za pomocą kleszczy z pazurami i wywieraj lekki nacisk przez 30 s na samouszczelniające się sklerotomii bez szwów za pomocą końcówki lub końca kleszczy.
13. Po operacji podawać podskórnie 10 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu. Nie należy podawać pooperacyjnych miejscowych sterydów ani antybiotyków. W przypadku leków przeciwbólowych podawać 0,5 ml buprenorfiny 0,3 mg/ml podskórnie po zabiegu, a także dzień po zabiegu.
14. Po użyciu umyj wszystkie instrumenty, zanurzając je na kilka sekund, najpierw w 70% etanolu, następnie w 45% etanolu, a na końcu w wodzie destylowanej. Osusz je dokładnie ręcznikiem papierowym.
15. Opiekuj się zwierzętami, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności i umieść je wszystkie pojedynczo w klatce. W razie potrzeby (np. do celów immunohistochemicznych) należy poddać zwierzęta eutanazji przez dożylne wstrzyknięcie 100 mg/kg pentobarbitalu.

3. Obrazowanie in vivo siatkówki i podsiatkówki

1. Należy użyć urządzenia do optycznej tomografii koherentnej w domenie spektralnej (SD-OCT) wraz z dołączonym oprogramowaniem (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać przekrojowe skany b leczonych zwierząt, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uniknąć rozmycia obrazu, upewnij się, że rogówka jest wilgotna, spłukując ją miejscową solą fizjologiczną co 30-60 s.
   1. Umieść znieczulone zwierzęta z rozszerzoną źrenicą (patrz kroki 1.1 i 2.10) w regulowanym uchwycie, aby uzyskać niezakłóconą drogę od źródła światła instrumentu do siatkówki królika.
   2. Uzyskać co najmniej 3 skany OCT z jednoczesnymi obrazami referencyjnymi odbicia laserowej oftalmoskopii skaningowej w podczerwieni (IR-cSLO) reprezentujących górną, środkową i dolną część wstrzykniętego obszaru.
   3. Uzyskaj obrazy dna oka z odpowiednio niebieskim, zielonym, podczerwonym i wielokolorowym odbiciem laserowym cSLO (tj. wieloma jednoczesnymi kolorami lasera).
   4. Rejestruj obrazy autofluorescencji światła niebieskiego (BAF) za pomocą lasera wykorzystującego niebieskie światło urządzenia SD-OCT.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy in vivo BAF, IR-cSLO i SD-OCT normalnej siatkówki królika albinosa są pokazane w Rysunek 2. Zwróć uwagę na różne warstwy siatkówki z ich charakterystycznymi poziomami odbicia światła uchwyconymi przez instrument SD-OCT.

W Rysunki 1A i Rysunek 1B, pokazano ustawienie do tworzenia pęcherzyków podsiatkówkowych: zw...

Dyskusja

W niniejszym protokole opisano generowanie wielkookiego modelu GA i jego przedkliniczne zastosowanie do oceny integracji hESC-RPE in vivo .

W celu przekształcenia terapii regeneracyjnych w GA i chorobach pokrewnych do kliniki⁷ ważne jest opracowanie i optymalizacja metod, które wiernie oddają kliniczne metody transplantacji i obrazowania. Królik jest pod tym względem atrakcyjny: ma stosunkowo duże oko, które pozwala na operację wewnątrzgałkową i zastosowanie st...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka różnicująca hESC XF NutriStem – bFGF oraz – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS bez Ca2+ i Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Sitko do komórek 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Igła 30 G 0,5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Filtr strzykawkowy	Acrodisc	PN4612
0,4% błękit trypanowy	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Stosować przy 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% etanolu	Solveco AB	1047
Ketaminol, 100 mg/ml	Intervet, Boxmeer	511519	Stosować 35 mg/kg ketaminy
Rompun vet, 20 mg/ml	Bayer Animal Health	22545	Stosować 5 mg/kg ksylazyny
Triescence, 40 mg/mL	Alcon Nordic A/S	412915	2 mg dowiterialnie
Cyklopentolat-fenylefryna, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Stosować 1 kroplę do każdego oka
Viscotears	Laboratoires Thé a	597562
Sól fizjologiczna do stosowania miejscowego	Apotea AB	7053249369080
Allfatal weterynarz 100 mg/ml	Omnidea	77168	Użyj 100 mg/ml pentobarbitalu
Rurka przedłużająca (młotek)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G Kaniula podsiatkówkowa wielokońcówkowa	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Jednorazowa płaska soczewka	Volk
Zwijacz pokrywy Barraquer Colibri	AgnTho's AB	42-020-030
Trokary bez zaworów	Alcon Nordic A/S	8065751448
Kleszcze pazurowe	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Urządzenie do witrektomii	Alcon Nordic A/S	8065740238
Witrektomia Accurus 25+ Gauge TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Użyj Heidelberg Eye Explorer w wersji 1.9.10.0
24-dołkowe płytki	Sarstedt	83.3922
Hemocytometr Neubauera	VWR	631-0925
Nowozelandzkie króliki albinosy	Lidkö pings Rabbit Farm, Szwecja
		hESC-RPE	Patrz numer referencyjny 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Stosować podskórnie 0,5 ml buprenorfiny