Artykuł metodologiczny

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

DOI:

10.3791/56722

⸱

17 stycznia 2018

 , 
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemiczne autoimmunologiczne zaburzenia tkanki łącznej charakteryzują się krążącymi przeciwciałami przeciwjądrowymi (ANA). Chociaż dostępnych jest kilka technologii badań przesiewowych ANA, immunofluorescencja pośrednia (IIF) przy użyciu substratu ludzkich komórek nabłonkowych-2 (HEp-2) pozostaje podstawową i zalecaną metodą ze względu na jej wyższą czułość. Substraty HEp-2 mogą wykrywać wiele wzorców wynikających z wiązania autoprzeciwciał z różnymi autoantygenami białek i kwasów nukleinowych rozmieszczonych w jądrze i cytoplazmie komórek. Duża różnorodność wzorców monospecyficznych i mieszanych wynikających z pozytywnych reakcji na podłożu HEp-2 również komplikuje interpretację i dokładność raportowania. Jednym z konkretnych przykładów, któremu ostatnio poświęcono najwięcej uwagi, jest gęsty, drobno nakrapiany wzór 70 (DFS70) wynikający z autoprzeciwciał, które specyficznie wiążą się z białkiem zwanym czynnikiem wzrostu pochodzącym z nabłonka soczewki (LEDGF). Brak wyraźnego związku z konkretną ogólnoustrojową chorobą autoimmunologiczną i wysoka częstość występowania w zdrowych populacjach sprawiły, że ważna jest dokładna interpretacja wzorca DFS70. Dokładne odróżnienie wzoru DFS70 od wzorców związanych z chorobą przy użyciu konwencjonalnego substratu HEp-2 jest wyzwaniem. Co więcej, częste współwystępowanie wzorca DFS70 wraz z wzorcami związanymi z chorobą, takimi jak jednorodne, nakrapiane i mieszane jednorodne wzorce nakrapiane, komplikuje interpretację IIF. Celem tego artykułu jest wykazanie użyteczności nowatorskiego inżynieryjnego substratu HEp-2 IIF, który zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego podłoża HEp-2, zapewniając jednocześnie możliwość rozróżnienia wzoru DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych pozytywnych przykładach ANA. Nowy substrat jest ponadto w stanie zdemaskować związane z chorobą wzorce ANA, które wcześniej były ukryte za wzorcem DFS70.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANA są znakiem rozpoznawczym autoimmunologicznych chorób tkanki łącznej o podłożu autoimmunologicznym1. Stosuje się kilka metod do badań przesiewowych i potwierdzania ANA. Technika IIF wykorzystująca podłoże HEp-2 pozostaje najczęściej stosowaną i najczęściej zalecaną metodą badania przesiewowego ANAs1,2. Pomimo postępów w metodologiach diagnostycznych w fazie stałej, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA), test immunoenzymatyczny (EIA), test immunologiczny chemiluminescencji (CLIA) i testy multipleksowe oparte na koralikach, IIF metodą HEp-2 jest najbardziej rozpowszechnioną metodą przesiewową ze względu na jej przydatność diagnostyczną i opłacalność1,2,3. Wyżej wymienione technologie oznaczania opierają się na ograniczonym zestawie oczyszczonych natywnych lub rekombinowanych autoantygenów, podczas gdy preparaty monowarstwowe komórek HEp-2 na szklanych zagłębieniach szkiełkowych prezentują szeroki wachlarz autoantygenów w ich naturalnej postaci, rozmieszczonych w jądrze i cytoplazmie, które reagują z autoprzeciwciałami z surowic pacjenta lub kontroli pozytywnych, co skutkuje wieloma wzorcami związanymi z różnymi chorobami autoimmunologicznymi. Wzorce te są klasyfikowane jako wzorce jądrowe, cytoplazmatyczne i mitotyczne w oparciu o lokalizację antygenu w komórkach. Każdy wzorzec i związane z nim antygeny/antygeny i stany chorobowe są dobrze scharakteryzowane4. W metodzie IIF surowice pacjenta i kontrolne są inkubowane na szklanych szkiełkach, które prezentują jednowarstwową hodowlę komórek HEp-2 odpowiednio utrwalonych, aby zachować wiele autoantygenów w ich naturalnej konfiguracji. Autoprzeciwciała w surowicy pacjenta lub kontrolach pozytywnych mogą wiązać się z autoantygenami prezentowanymi przez komórki HEp-2 na podłożu (studzienka szkiełka) podczas inkubacji. Po inkubacji niezwiązane przeciwciała są zmywane, a związane przeciwciała klasy IgG są wykrywane za pomocą sprzężonego odczynnika anty-ludzkiej IgG z izotiocyjanianem fluoresceiny/izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Niezwiązany koniugat raportowy jest wypłukiwany, a szkiełka nakrywkowe są montowane na szkiełkach za pomocą podłoża mocującego, które zachowuje reakcje i ułatwia obserwację pod mikroskopem fluorescencyjnym. Reakcje obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiednią kombinację filtrów wzbudzienia-emisji, która jest skonfigurowana zgodnie z zastosowanym reporterem (w przypadku reportera FITC mikroskop diagnostyczny zwykle wykorzystuje filtry o zakresie wzbudzenia 467 - 498 nm i zakresie emisji 513 - 556 nm). O obecności ANA świadczy jasnozielona fluorescencja określonych struktur w komórkach. W przeciwieństwie do zautomatyzowanych platform testowych, metodologia IIF opiera się na pracochłonnym procesie seryjnego rozcieńczania surowicy i wizualnie pozytywnym określaniu wzorów barwienia, co wymaga znacznej wiedzy użytkownika5,6. Pomimo tych ograniczeń, IIF by HEp-2 pozostaje najpowszechniej stosowaną i zalecaną metodą badania przesiewowego ANA ze względu na wysiłki standaryzacyjne w kierunku interpretacji i nomenklatury wzorców przez komitet Międzynarodowego Konsensusu w sprawie wzorców ANA (ICAP), zwiększoną dostępność rozwiązań automatyzacji do przetwarzania slajdów IIF oraz interpretację wyników3.

Wśród wielu wzorców wykrytych metodą HEp-2 IIF, autoprzeciwciała skierowane przeciwko produktowi genu psip1 (określane również jako LEDGF/p75/DFS70), zyskały w ostatnich latach znaczne zainteresowanie z kilku powodów4,5,6,7,8,9,10. Autoprzeciwciała DFS70 są obecne w wysokich mianach u zdrowych osób z grupy kontrolnej, a dotychczasowe badania nie wykazały wyraźnego klinicznego związku między obecnością autoprzeciwciał DFS707,8,9,10,11,12,13. Wskaźniki zgłoszonych pozytywnych wyników dla autoprzeciwciał DFS70 w różnych stanach chorobowych i zdrowych kohortach różniły się znacznie między badaniami6,8,9,10,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Monospecyficzny wzór DFS70 dobrze różni się od wzoru jednorodnego lub nakrapianego, ale interpretacja mieszanych jednorodnych wzorów nakrapianych i przeciwciał anty-DFS70 współwystępujących z innymi ANA jest wyzwaniem nawet dla doświadczonych czytelników. Obecna generacja metod przesiewowych IIF i testów fazy stałej specyficznych dla DFS70 nie jest w stanie odróżnić monospecyficznej reakcji DFS70 od mieszanych wzorców (Rysunek 1A, żółty zacieniony obszar algorytmu). Błędna interpretacja wzorca DFS70 jako wzoru jednorodnego, nakrapianego lub mieszanego lub odwrotnie, może mieć poważne konsekwencje dla opieki nad pacjentem. Obecnie powszechnie stosowany protokół jest następujący: laboratoria kliniczne stosują szereg testów potwierdzających fazę stałą dla ANA związanych z chorobą i/lub metodę immunoadsorpcji dla DFS70 / LEDGF, gdy podejrzewa się gęsty wzór drobno nakrapiany (AC-2) (Rysunek 1A)4,5.

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie użyteczności nowatorskiego technologicznie zmodyfikowanego substratu HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), będzie określany jako HEp-2 ELITE), który zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego HEp-2 do badania przesiewowego ANA, jednocześnie wyróżniając wzór DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach ANA dodatnich (Rysunek 1B, Żółty zacieniony obszar algorytmu)5. Substrat HEp-2 ELITE składa się w przybliżeniu z mieszaniny niemodyfikowanych konwencjonalnych komórek HEp-2 i komórek inżynieryjnych pozbawionych antygenu LEDGF/p75/DFS70 w stosunku 1:95. Procedura IIF dla HEp-2 ELITE jest identyczna z konwencjonalną metodą HEp-2. Unikalna konfiguracja podłoża HEp-2 ELITE nie tylko zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego HEp2, ale może różnicować jednorodne, nakrapiane i mieszane wzorce reakcji od wzorca DFS70 podczas wstępnego badania przesiewowego lub testowania próbki (Rysunek 1B)5. Surowice pacjenta, które mają być poddane reakcji na szkiełkach z substratem HEp-2 IIF, należy rozcieńczyć w stosunku 1:40 z rozcieńczeniem przesiewowym lub zgodnie z indywidualnym kryterium laboratoryjnym. Specyficzna reakcja przy mianie 1:40 lub wyższym jest uważana za pozytywną.

W tym badaniu, dodatnie surowice dla jednorodnych, nakrapianych, centromerów, jąder, cytoplazmatycznych siateczkowych/AMA i DFS70, które wytwarzały średnio pozytywny sygnał (w stosunku do kontroli negatywnej i pozytywnej kontroli ANA dostarczonej przez zestaw) przy rozcieńczeniu przesiewowym 1:40, zostały wybrane do symulacji monospecyficznych i mieszanych wzorów na podłożach HEp-2 (konwencjonalnych i HEp-2 ELITE). Rozcieńczone w stosunku 1:40 surowice DFS70 dodatnio zmieszano z rozcieńczeniami 1:40 poszczególnych kontrolnych wzorców ANA związanych z chorobą (jednorodne, nakrapiane, centromerowe, jąderkowe lub cytoplazmatyczne siatkowe AMA) w różnych proporcjach (kontrola: DFS70 w 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i oceniane na substratach konwencjonalnych i HEp-2 ELITE zgodnie ze standardową procedurą IIF opisaną poniżej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach Trinity Biotech.

1. Przygotowanie próbki i substratu

  1. Pozwolić, aby woreczki zawierające szkiełka podstawowe (szkiełka podstawowe z 12 dołkami na każdym szkiełku zawierającym mieszaninę komórek HEp2 lub HEp-2+HEp2 KO) osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej w celu uzyskania optymalnej wydajności i zapobiegły kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka przed dodaniem próbki. Powinno to zająć około 10 - 15 minut.
  2. Po wyrównaniu do temperatury pokojowej ostrożnie usuń szkiełka podłoża palcami, nie dotykając ich boków torebki.
  3. Oznaczyć szkiełka i umieścić je w komorze inkubacyjnej (w temperaturze pokojowej) wyłożonej ręcznikami papierowymi zwilżonymi wodą, aby zapobiec wysuszeniu szkiełek podczas inkubacji próbki i koniugatu.
    UWAGA: Niespecyficzne barwienie może wynikać z suchych studni; Mokry ręcznik papierowy wewnątrz komory inkubacyjnej zapewnia wilgoć i dobrze zapobiega wysuszeniu.

2. Dodawanie kontroli i próbek

  1. Dozować około 50 μl kontroli ujemnej/dodatniej, kombinacji surowic DFS70-ANA dodatnich, jak opisano w tym badaniu, lub próbek surowicy pacjenta do indywidualnych studzienek szkiełkowych.
  2. Dozować kontrolę(-e) i próbki do każdego dołka na szkiełku.
  3. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu studni, należy unikać przepełniania studni. Nie przepełniając studni, należy zapewnić pełne pokrycie powierzchni studni i unikać pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Zalecana objętość to 50 μl zgodnie z krokiem 2.1.
  4. Umieścić pokrywkę na komorze inkubacyjnej i inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA (ANA), wiąże się ono z komórkami obecnymi w każdym dołku podczas tego okresu inkubacji.
  5. Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Przytrzymaj szkiełko na końcu wypustki i delikatnie płucz około 10 ml buforu do płukania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dostarczonego w zestawie, używając pipety lub w zlewce wypełnionej PBS przez 10 - 15 s. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i myj (moczyć) przez 10 minut. Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami.
    UWAGA: Umieszczając wiele szkiełek w słoiku Coplin, upewnij się, że strona komórki szkiełka nie styka się z innym szkiełkiem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie komórek przyklejonych do szkiełka.

3. Dodawanie koniugatu fluorescencyjnego

  1. Wyjmuj tylko jedno szkiełko na raz ze słoika Coplin. Aby usunąć nadmiar buforu do płukania PBS ze szkiełka, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręcznik papierowy. Każdy zestaw jest dostarczany z koniugatem fluorescencyjnym anty-ludzkiej IgG znakowanym przez FITC. Na każdą studzienkę delikatnie nałóż 1 kroplę (około 50 μl) dołączonego koniugatu.
  2. Inkubować szkiełka w zamkniętej komorze inkubacyjnej do barwienia przez 30 min.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie koniugatu IgG swoistego dla Fc. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA , koniugat zwiąże się z komórkami obecnymi w każdym studzienku podczas tego okresu inkubacji, co spowoduje specyficzną fluorescencję komórek obecnych w studzienkach. Koniugat jest wrażliwy na światło. Zamknięta komora inkubacyjna pomoże zapobiec interferencji światła z reakcją sprzężoną komórek obecnych w każdym dołku.
  3. Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Trzymać szkiełko na końcu wypustki i delikatnie spłukać około 10 ml PBS buforem do płukania dostarczonym w zestawie, za pomocą pipety lub w zlewce wypełnionej PBS. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i myj (moczyć) przez 10 minut. Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami.
    UWAGA: Umieszczając wiele szkiełek w słoiku Coplin, upewnij się, że strona komórki szkiełka nie styka się z innym szkiełkiem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie komórek przyklejonych do szkiełka.
  4. Umieść szkiełka nakrywkowe znajdujące się w zestawie na suchym ręczniku papierowym. Media montażowe są dostarczane z zestawem. Na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego nałóż od 3 do 4 kropli środka montażowego w linii.
  5. Wyjmować po jednym szkiełku ze słoika Coplin zawierającego bufor do mycia. Aby usunąć nadmiar buforu do mycia, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręczniku papierowym.
  6. Delikatnie opuść szkiełko na szkiełko nakrywkowe, przykładając dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego. Pozwala to na przepływ mediów montażowych znajdujących się na dolnej krawędzi szkiełka nakrywkowego do górnej krawędzi szkiełka i minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać odczyt każdej studzienki szkiełka.
    UWAGA: Do zamontowania prowadnicy pokrywy na prowadnicy na prowadnicy należy użyć minimalnego nacisku. Każde nadmierne ciśnienie może powodować boczne ruchy szkiełek nakrywkowych. Może to spowodować uszkodzenie jednowarstwowego przygotowania komórek i spowodować zniekształcenia.
  7. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C. Sprawdzić szkiełka zaraz po ich zamontowaniu lub w ciągu 48 godzin
    UWAGA: Dłuższe przechowywanie może spowodować pogorszenie wzoru i sygnału fluorescencyjnego.

4. Identyfikacja pozytywnych i negatywnych wyników

  1. Obejrzyj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu zestawu filtrów FITC, umieszczonego w ciemnym pomieszczeniu.
  2. Zbadaj specyficzną jasnozieloną fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 200X lub większym, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzoru. Przestrzegać kontroli dodatniej i negatywnej.
    UWAGA: Kontrola pozytywna będzie wykazywać jasnozieloną fluorescencję w jądrze (Rysunek 2A, jednorodny). Kontrola ujemna nie będzie wykazywać specyficznej zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  3. Zapisz wynik pozytywny/ujemny dla każdej studzienki i dołącz wzór ANA dla przypadków pozytywnych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podłoże HEp-2 ELITE/DFS70 KO zachowuje klasyczne wzorce ANA i ułatwia wyraźne rozróżnienie wzoru DFS70:

Konwencjonalne i zmodyfikowane komórki na podłożu HEp-2 ELITE/DFS70 KO są identyczne, zachowując wszystkie autoantygeny z wyjątkiem LEDGF/p75. Kontrola ujemna zapewniana przez zestaw ustala podstawowy sygnał fluorescencyjny. Kontrole dodatnie dla jednorodnych, nakrapianych, centromerowych, jąderkowych i mitochondrialnych wzorców na HEp-2 ELITE wytwarzają wzór identyczny z oczekiwanymi wzorcami na konwencjonalnym podłożu HEp-2 IIF (Rysunek 2A). Te wzorce referencyjne zostały wcześniej szczegółowo opisane wraz z powiązaniem każdego wzorca z antygenem i chorobą4,29. Krótki opis wzorców zaobserwowanych w Rysunek 2A znajduje się w tabeli 1.

Wzór DFS70 na HEp-2 ELITE:

Około 10% komórek w każdym dołku wykazuje gęsty, drobno nakrapiany wzór (nomenklatura przypisana przez ICAP: AC-2), który można zaobserwować na jądrze interfazowym, a barwienie związane z chromatyną jest widoczne na jądrach mitotycznych (Rysunek 2B). Na konwencjonalnym podłożu HEp-2 wszystkie komórki będą miały ten wzór w reakcji z próbką dodatnią DFS70. Pozostałe ~ 90% komórek HEp-2 ma znokautowany gen psip1 kodujący antygen LEDGF i dlatego nie wytwarza sygnału ani wzoru w reakcji z monospecyficzną surowicą DFS70 dodatnią (Figura 2B). Jeśli 10% komórek HEp-2 ma jaśniejszą fluorescencję odpowiadającą wzorowi DFS70, a reszta komórek wykazuje dodatkowe wzorce (np. drobne plamki lub jąderka), oznacza to obecność mieszanych wzorów. Dokładniejsze zbadanie takich wzorców jest niezbędne, aby potwierdzić wszystkie specyficzne autoprzeciwciała, które są obecne oprócz wzorca DFS70. Aby zademonstrować możliwości substratu HEp-2 ELITE, stworzono panel próbek surowic o różnych stężeniach surowic kontroli pozytywnej DFS70 i ANA i przetestowano je zarówno na substratach konwencjonalnych, jak i HEp-2 ELITE przy użyciu standardowego protokołu IIF (Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7).

Interpretacja monospecyficznych i mieszanych reakcji DFS70 na podłożach konwencjonalnych i HEp-2 ELITE:

Dla każdego konkretnego wzorca ANA związanego z chorobą (Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7), można zaobserwować monospecyficzny wzorzec ANA na skrajnej lewej kolumnie i monospecyficzny wzorzec DFS70 na prawej skrajnej kolumnie. Trzy kolumny pośrodku reprezentują różne proporcje kontroli pozytywnych związanych z chorobą i wzorcem DFS70. Powstałe w ten sposób mieszane wzorce są trudne do rozpoznania na konwencjonalnym podłożu HEp-2 (Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7, górny rząd). Jednak w przypadku nowego substratu Hep-2 ELITE w większości próbek różnica w intensywności między komórkami niezmodyfikowanymi i zmodyfikowanymi jest wyraźna, co nie tylko potwierdza obecność autoprzeciwciał DFS70 (gdy stosunek jaśniejszych do mniej jasnych komórek wynosi 1:9), ale także ujawnia wtórny wzór ANA. W przypadku reakcji mieszanych jednorodnych DFS70 lub nakrapianych DFS70 niemożliwe jest pewne przewidzenie prawidłowego wzorca, co prowadzi do tego, że laboratoria decydują się na przeprowadzenie szeregu dodatkowych testów (Rysunek 1A). W przypadku reakcji mieszanych centromeru-DFS70 i jądra-DFS70 podejrzenie dodatniości DFS70 jest bardzo trudne (Rysunek 5, Rysunek 6). W przypadku reakcji jąderkowych i cytoplazmatycznych siatkowych/AMA wzór DFS70 nie jest dominujący, dopóki stosunek surowicy nie osiągnie 50%. We wszystkich przykładach podłoże HEp-2 ELITE może prezentować wzór DFS70 i leżący u jego podstaw wzór wtórny w szerszym zakresie poziomów intensywności, a tym samym ułatwia dokładniejszą interpretację ANA.

Aby dokładnie obserwować mieszane wzorce, wyniki dla różnych kombinacji 50:50 kontroli pozytywnych ANA i DFS70 zostały powiększone (Rysunek 8) zarówno dla substratów konwencjonalnych, jak i HEp-2 ELITE. Zaleca się obserwowanie zarówno barwienia interfazowego, jak i mitotycznego dla wszystkich wzorców ANA, w tym DFS70, na podłożach HEp-2 w celu poprawy interpretacji i dokładności zgłoszonego wzorca. Jednak w przypadku wzorców mieszanych wzór różnicowy prezentowany przez dzielące się jądra komórkowe może nie być wystarczający do ułatwienia dokładnej interpretacji. Czerwone strzałki (Rysunek 8) wskazują jądra mitotyczne zarówno w komórce konwencjonalnej, jak i inżynieryjnej. Można zaobserwować, że mieszane reakcje DFS70 na dzielących się komórkach nie są zgodne z ustalonym zestawem reguł interpretacji wzorców ANA związanych z chorobą. Żółte i niebieskie strzałki oznaczają odpowiednio niezmodyfikowane i zmodyfikowane (DFS70 KO) jądra komórek HEp-2. We wszystkich kombinacjach (Rysunek 8) obserwuje się wyraźną różnicę intensywności między niezmodyfikowanym barwieniem jądra komórki (~10%) a zmodyfikowanym wzorcem jądra komórki (~90%) w tym samym mikroskopowym polu widzenia, co umożliwia jednoczesne badanie przesiewowe i potwierdzenie wzorca DFS70.

Schemat algorytmów przesiewowych ANA z wykorzystaniem metod HEp-2, DFS70 IIF; ELISA, EIA do diagnostyki.
Rysunek 1: Algorytmy przesiewowe ANA wykorzystujące konwencjonalne metody HEp-2 i HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) Schemat ujawnia niedobór konwencjonalnego HEp-2 IIF w identyfikacji monospecyficznych i mieszanych dodatnich wzorców DFS70 na etapie badań przesiewowych (żółty zacieniony obszar) oraz jego niezdolność do wykluczenia wtórnego wzorca ANA związanego z chorobą, który może być ukryty przez wzór DFS70. Co więcej, obecna generacja testów potwierdzających specyficznych dla DFS70 w fazie stałej nie jest w stanie potwierdzić monospecyficznego dodatniego wyniku DFS70, co prowadzi do dodatkowych testów potwierdzających dla ANA. (B) Schemat przedstawia możliwości HEp-2 ELITE w zakresie badań przesiewowych ANA, jednoczesnego rozróżniania reakcji monospecyficznych i mieszanych DFS70 oraz eliminowania potrzeby przeprowadzania testów potwierdzających DFS70 w fazie stałej. Algorytm wykorzystujący HEp-2 ELITE znacznie upraszcza badania przesiewowe ANA i zmniejsza wymaganą liczbę testów potwierdzających. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza wzorca podłoża HEp-2 Ana; mikroskopia, identyfikacja wzorców, porównanie komórek DFS70.
Rysunek 2: Klasyczny wzór ANA i DFS70 na podłożu HEp-2 ELITE/DFS70 KO. (A) Podłoże HEp-2 ELITE/DFS70 KO zachowuje klasyczne wzory ANA. Klasyczną reakcję jednorodną i dodatnie reakcje DFS70 uzyskano przy użyciu kontroli dodatnich dostarczonych przez zestaw. Inne reakcje wyprowadzono przy użyciu wcześniej ustalonych dodatnich surowic kontrolnych dla reakcji nakrapianych, centromerowych, jąderkowych i cytoplazmatycznych siatkowych/AMA5. (B) Substrat HEp-2 ELITE/DFS70 KO zapewnia zarówno konwencjonalne, jak i inżynieryjne ogniwa, co ułatwia rozróżnienie wzoru DFS70. Schemat przedstawia wynikową reakcję monospecyficzną DFS70 oraz wzór barwienia na interfazowych i dzielących się jądrach komórkowych zarówno dla komórek konwencjonalnych, jak i zmodyfikowanych (DFS70-KO). Zmodyfikowane komórki HEp-2 są pozbawione antygenu LEDGF/p75/DFS70, co umożliwia jednoczesne wykrywanie wzorców wtórnych, które zwykle są ukryte w reakcji autoprzeciwciał DFS70 na konwencjonalnych podłożach HEp-2. Strzałki (żółte) wskazują przykłady mitotycznych jąder komórkowych. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna, porównanie barwienia komórek, komórki HEP-2, wykrywanie autoprzeciwciał DFS70.
Rysunek 3: DFS70 i jednorodne surowice w połączeniu. Surowice monospecyficzne DFS70 połączono z dodatnią kontrolą jednorodnego wzoru w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych i inżynieryjnych (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

mikroskopia fluorescencyjna komórek Hep-2; lokalizacja białek; wyniki eksperymentu; jądra komórkowe; nakrapiany wzór.
Rycina 4: DFS70 i surowice nakrapiane w połączeniu. Surowice monospecyficzne DFS70 połączono z dodatnią kontrolą wzoru nakrapianego w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych i inżynieryjnych (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna, komórki HEP-2, barwienie centromerami vs przeciwciałami DFS70, intensywność fluorescencji.
Rysunek 5: DFS70 i surowice centromerowe w połączeniu. Surowice monospecyficzne DFS 70 połączono z dodatnią kontrolą wzoru centromerów w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych i inżynieryjnych (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek HEP-2 z barwieniem jąderkowym DF570; wyniki eksperymentów i analiz.
Rycina 6: DFS70 i surowice jąderkowe w połączeniu. Surowice monospecyficzne DFS 70 połączono z dodatnią kontrolą wzoru jąderka w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych i zmodyfikowanych (DFS70-KO) substratach HEp-2. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Immunofluorescencja komórek Hep-2, cytoplazmatyczny wzór siatkowaty, przeciwciało DFS70, wyniki mikroskopowe.
Rycina 7: DFS70 i cytoplazmatyczna surowica siatkowa/AMA w połączeniu. Surowice monospecyficzne DFS70 połączono z dodatnią kontrolą wzorca mitochondrialnego w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych i zmodyfikowanych (DFS70-KO) substratach HEp-2. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównanie mikroskopii fluorescencyjnej komórek HEp-2 i DFS70-KO, analiza wzorców barwienia jądrowego.
Rysunek 8: Mieszane wzory (proporcje 50:50) wytworzone na podłożach konwencjonalnych i HEp-2 ELITE. Ujawniają się różnice między tymi dwoma podłożami. Czerwone strzałki wskazują jądra mitotyczne zarówno w konwencjonalnych, jak i zmodyfikowanych komórkach na obu podłożach. W przypadku tych kombinacji wzór różnicowy prezentowany przez dzielenie jąder komórkowych na konwencjonalnym substracie HEp-2 nie jest wystarczający do dokładnej interpretacji mieszanych wzorców. Można zaobserwować, że mieszane reakcje DFS70 na dzielących się komórkach mogą zaburzyć ustalony zestaw reguł interpretacji wzorców ANA związanych z chorobą. Żółte i niebieskie strzałki oznaczają odpowiednio niezmodyfikowane i zmodyfikowane (DFS70 KO) jądra komórek HEp-2. Wyniki uzyskane dla wszystkich kombinacji testowanych na zmodyfikowanym podłożu: zaobserwowano wyraźną różnicę intensywności między wzorcem jądrowym interfazowym należącym do komórek niezmodyfikowanych (~10%) a komórkami zmodyfikowanymi (~90%), co umożliwiło jednoczesne wykrycie i potwierdzenie wzorca DFS70. Podziałka skali reprezentuje 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzorzec ANAOpis
jednorodnyCałe jądro fluoryzuje równomiernie z rozproszonym wzorem barwienia.
NakrapianeDyskretne, grube lub drobne plamki fluorescencji w całym jądrze. Opisano drobne i grube plamki nakrapiane.
JądroJąderka plamią się jako wiele ciał stałych lub nakrapianych w jądrze. Podtypy zostały opisane wcześniej.
CentromerDuże plamki skończonej liczby. Reaktywny antygen segreguje się ze skondensowanymi chromosomami w komórkach przechodzących mitozę.
Siatka cytoplazmatyczna/AMACytoplazma wydaje się ziarnista z pozytywnym zabarwieniem mitochondriów.
DFS70•Konwencjonalne komórki HEp-2: Na jądrze interfazowym obserwuje się gęsty, drobno nakrapiany wzór, a na jądrach mitotycznych widoczne jest barwienie związane z chromatyną.
•Zmodyfikowane komórki KO DFS70: Przeciwciała anty-DFS70 wytwarzają ujemne barwienie
HEp-2 Elite/ DFS70 KO ma konwencjonalne i inżynieryjne (DFS70 KO) ogniwa w stosunku około 1:9. Konwencjonalne komórki wytwarzają typowy wzór DFS70, a komórki zmodyfikowane wytwarzają ujemny wzór w reakcji z monospecyficznymi/izolowanymi reakcjami dodatnimi DFS70.

Tabela 1: Opis wzorców ANA.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoprzeciwciała przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym są bardzo rozpowszechnione w układowych chorobach autoimmunologicznych. Chociaż żaden pojedynczy test nie zapewnia najlepszej możliwej czułości i swoistości, IIF za pomocą HEp-2 jest powszechnie uważany za wysoce czułą i opłacalną metodę badań przesiewowych w kierunku układowych chorób autoimmunologicznych 2,3,4. Pomimo rozpowszechnienia protokołu IIF od ponad 50 lat, dokładność testu IIF w dużym stopniu zależy od umiejętności technika, starannego wykonania poszczególnych kroków protokołu i dokładnej interpretacji wyników przy użyciu dobrze utrzymanego mikroskopu fluorescencyjnego. Rozpoznanie układowej choroby autoimmunologicznej nie powinno opierać się na wynikach pojedynczego testu serologicznego, takiego jak IIF za pomocą HEp-2.

Odtworzenie odczynników przy użyciu wysokiej jakości wody (destylowanej/dejonizowanej), użycie znormalizowanych składników zestawu (szkiełka z monowarstwami komórek HEp-2, rozcieńczalnik do próbek, kontrole dodatnie i ujemne, wstępnie rozcieńczony zoptymalizowany koniugat FITC i podłoże montażowe) mają pozytywny wpływ na wyniki. Pominięcie dodawania próbek kontrolnych lub próbek na odwiertach może zachęcać do fałszywie negatywnych interpretacji. Wysuszenie szkiełek w dowolnym momencie po dodaniu próbki lub kontroli może spowodować fałszywe reakcje fałszywie dodatnie i/lub niewłaściwe wzorce. Zbyt duża ilość bufora do płukania pozostawiona na szkiełku lub wysuszenie wgłębień szkiełka przed dozowaniem medium montażowego może spowodować powstawanie artefaktów. Dodanie niewystarczającej ilości podłoża montażowego lub wytworzenie pęcherzyków na powierzchni szkiełka przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego może spowodować reakcje, które wyglądają na rozmyte lub nieostre, gdy są obserwowane pod mikroskopem. Zamontowane szkiełka muszą być przechowywane w temperaturze 2 - 8 °C i analizowane w zalecanym przedziale czasowym, aby zminimalizować wyniki fałszywie ujemne lub zniekształcone.

Korzystanie z dobrze utrzymanego mikroskopu epifluorescencyjnego, w którym znajduje się odpowiednie źródło światła LED/Hg/ksenonowe oraz czyste elementy optyczne, w tym filtry wzbudzenia i emisji, które nie są uszkodzone, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych wyników IIF. Szkolenie użytkowników końcowych w zakresie rozróżniania intensywności reakcji pozytywnych/negatywnych i interpretacji wzorców ma kluczowe znaczenie. Testy HEp-2 IIF są podatne na brak standaryzacji procedur, konfiguracji mikroskopu oraz szkolenia lub umiejętności użytkowników końcowych. Uzgodniona nomenklatura oraz reprezentatywne wzorce i przykłady obrazów uzyskanych przy użyciu różnych producentów są udostępniane przez ICAP () w celach edukacyjnych4. Drzewo klasyfikacji wzorców komórek HEp-2 dostarczone przez ICAP dla różnych wzorców jądrowych, cytoplazmatycznych i mitotycznych jest cennym źródłem do poznania subtelnych różnic między różnymi wzorcami, które mogą wyglądać podobnie dla niewprawnych oczu4. Jednym z głównych przykładów trudnego wzorca jest DFS70, który również nie ma wyraźnego związku ze stanem autoimmunologicznym, a jak omówiono w poprzednich sekcjach, wzorzec ten jest bardzo rozpowszechniony w zdrowych populacjach5.

W zależności od badania, częstość występowania autoprzeciwciał anty-DFS70 różni się między zdrowymi kohortami, populacjami przesiewowymi ANA i osobami z dodatnim wynikiem ANA bez dowodów na układową chorobę autoimmunologiczną 9,16,20,30,31. Doniesiono, że autoprzeciwciała DFS70 występują w izolacji, a także z innymi wzorcami ANA związanymi z chorobą. Izolowany lub monospecyficzny wzorzec DFS70 zgłasza się u 2 - 22% zdrowych osób z grupy kontrolnej, ale w mniej niż 1% przypadków z autoimmunologiczną chorobą reumatyczną32. Opierając się na tych trendach, monododatni wzór DFS70 został zaproponowany jako kryterium wykluczenia w autoimmunologicznych chorobach reumatycznych przez komitet ICAP 3,31,32. Komitet ICAP, ustanowiony w celu promowania harmonizacji nomenklatury testów na autoprzeciwciała i interpretacji wyników HEp-2 IIF, zaleca zgłaszanie dodatniego wyniku DFS70 podczas raportowania wyników badań przesiewowych ANA4.

Przed wykluczeniem ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej opartej na monopozytywności DFS70, konieczne jest dokonanie przeglądu stanu obecnych metod badań przesiewowych i potwierdzenia (szczególnie tych specyficznych dla DFS70). Zgodność między dodatnim wynikiem DFS70 przez HEp-2 IIF a testami potwierdzającymi w fazie stałej, a mianowicie metodami ELISA, CLIA i testem immunologicznym linii/dot blot) różniła się znacznie między różnymi badaniami 13,22,25,33. Interpretacja IIF i parametry testu potwierdzającego, które przyczyniają się do tej rozbieżności, zostały omówione wcześniej 5,13,34. Niedawno zaproponowane podejście immunoadsorpcyjne do potwierdzania przeciwciał anty-DFS70 rozwiązuje niektóre braki w obecnych testach fazy stałej (dla DFS70), ale wymaga od laboratoriów wykonania dodatkowego kroku w procedurze IIF na podejrzanych próbkach, co zwiększa koszt i czas realizacji raportowania wyników13. Ten dodatkowy krok nie jest wymagany, gdy komórki HEp-2 ELITE/DFS70 KO są używane do rutynowych badań przesiewowych ANA. Zmniejsza to całkowity koszt, a ponadto nie ma wpływu na czas realizacji, ponieważ wzór DFS70 jest rozpoznawany w początkowym kroku27 przesiewania. Dodatkową wadą stosowania konwencjonalnej metody HEp-2 IIF jest to, że nie jest ona w stanie odróżnić wzorca DFS70 współwystępującego z innymi wzorcami ANA na etapie badań przesiewowych. Wadę tę można jednak przezwyciężyć dzięki zastosowaniu ogniw HEp-2 ELITE/DFS70 KO27.

Ocena porównawcza konwencjonalnego HEp-2 i nowego HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) przy użyciu kontroli pozytywnej ANA i ich kombinacji z monododatnią kontrolą DFS70 wykazuje użyteczność zdolności nowego substratu do jednoczesnego badania przesiewowego ANA i potwierdzania wzorca DFS70 (Rysunek 1). Protokół IIF dla nowego podłoża jest identyczny z konwencjonalną metodą HEp-2 IIF. Schemat interpretacji dla wszystkich wzorców ANA związanych z chorobą jest identyczny, z wyjątkiem wzorca DFS70 (Tabela 1). Interpretacja zarówno mono-dodatnich, jak i mieszanych wzorców DFS70 była stosunkowo łatwiejsza przy użyciu nowej metody i nie wymaga dodatkowych testów (Figura 1B). Wdrożenie tej nowej metody w laboratorium klinicznym upraszcza wyzwanie związane z interpretacją wzorca DFS70 i poprawia ogólną dokładność badań przesiewowych ANA poprzez dalsze ujawnianie związanych z chorobą wzorców ANA, które wcześniej były ukryte przez DFS70 (wzorce mieszane).

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy, Kishore Malyavantham i Lakshmanan Suresh, są pracownikami Trinity Biotech, USA.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Andrew Zengerowi za przeprowadzenie eksperymentów IIF i zebranie obrazów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Zjeżdżalnia studzienna zgrzewana pojedynczo w woreczkuTrinity Biotechczęść zestawu# 1108, 1108-120, 1108-240
Kontrola pozytywna ANATrinity Biotech część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Przeciwciało DFS70 kontrola dodatniaTrinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240
Kontrola ujemnaTrinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anty-ludzki koniugat IgG FITC zawierający niebieski barwnik przeciwstawny EvanaTrinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Rozcieńczalnik buforowy do surowicyTrinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Trinity Biotechczęść zestawu# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Medium montażoweTrinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Szkiełka nakrywkowe Trinity Biotechczęść zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed indywidualnie w woreczkuTrinity Biotechczęść zestawu # 1103, 1103-240
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały użyte w badaniu, ale niedostarczone w zestawach
Diagnostyczny mikroskop fluorescencyjnyNikon Eclipse 50iWyposażony w punktową kamerę cyfrową, model 2.2.1
n/aOgólne materiały laboratoryjne
Woda destylowana/dejonizowananie dotyczyOgólne materiały laboratoryjne
Komora inkubacyjna Trinity Biotech przewidziana dla klientów (brak katalogu #)Słoik z kopiny nie dotyczy Ogólne wyroby laboratoryjne Ręczniki papierowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412(2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10(2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671(2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1(2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356(2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759(2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

G sty drobnoziarnisty obraz plamisty 70pod o e HEp 2po rednia immunofluorescencjawzorce monospecyficznewzorce mieszanemikroskopia fluorescencyjnaprzeciwcia a przeciwj drowechoroby autoimmunologiczne

Powiązane artykuły