Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56726

⸱

5 stycznia 2018

 , 
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Streszczenie

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) to adaptacyjny system immunologiczny u prokariontów, który został wykorzystany przez naukowców do generowania nukleaz kierowanych RNA, takich jak CRISPR-associated (Cas) 9 do edycji genomu eukariotycznego specyficznego dla miejsca. Inżynieria genomu Cas9 jest wykorzystywana do wydajnej, łatwej i solidnej modyfikacji endogennych genów w wielu istotnych z biomedycznego punktu widzenia liniach komórkowych i organizmach ssaków. Poniżej pokazujemy przykład, jak wykorzystać metodologię CRISPR/Cas9 do zrozumienia biologicznej funkcji określonych mutacji genetycznych. Modelujemy mutacje kalretykuliny (CALR) w mysich komórkach pro-B zależnych od interleukiny-3 (mIL-3) (Ba/F3) poprzez dostarczanie pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA) ukierunkowanych na endogenne locus Calr w określonym regionie, w którym mutacje CALR insercji i / lub delecji (indel) występują u pacjentów z nowotworami mieloproliferacyjnymi (MPN), rodzajem raka krwi. SgRNA tworzą podwójne pęknięcia nici (DSB) w docelowym regionie, które są naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), aby uzyskać indele o różnych rozmiarach. Następnie stosujemy standardowy test transformacji komórkowej Ba/F3, aby zrozumieć wpływ ekspresji mutacji Calr na poziomie fizjologicznym na hematopoetyczną transformację komórkową. Podejście to można zastosować do innych genów w celu zbadania ich funkcji biologicznej w różnych liniach komórkowych ssaków.

Wprowadzenie

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała ostatnio celowaną edycję genomu w żywych komórkach i organizmach. Stał się niezwykle potężnym narzędziem do badań biomedycznych i jest obecnie wykorzystywany jako potencjalna droga do terapii chorób genetycznych1. Podstawą wszystkich narzędzi do edycji genomu jest tworzenie indukowanego przez nukleazę dwuniciowego pęknięcia DNA (DSB) w locus genomu, które ma być modyfikowane. DSB mogą być naprawiane przez niehomologiczne łączenie końcowe (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR)2,3. Przewagą nukleazy Cas9 nad innymi nukleazami inżynierii genomu, takimi jak nukleazy z palcami cynkowymi (ZFN) i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALENs) jest jego zależność od RNA w celu ukierunkowania nukleazy na pożądaną sekwencję DNA, w porównaniu z interakcjami białko-DNA występującymi w ZFN i TALENs2,3.

Po odkryciu szlaku nukleazy CRISPR/Cas9 jako adaptacyjnego układu odpornościowego w komórkach prokariotycznych4,5, wiele wysiłku włożono w dostosowanie ścieżki do użycia w liniach komórkowych ssaków i organizmach modelowych2,3. Jako narzędzie do edycji genów, szlak CRISPR/Cas9 wykorzystuje dwa główne komponenty: nukleazę Cas9 pochodzącą ze Streptococcus pyogenes (Sp) i sgRNA ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania2,3. sgRNA składa się z 20 nukleotydów, które kierują Cas9 do określonego miejsca w genomie poprzez komplementarność par zasad RNA-DNA2,3. Miejsce docelowe sgRNA musi leżeć w sąsiedztwie miejsca sąsiadującego z protospacerem (PAM) w postaci 5' NGG, który jest rozpoznawany przez nukleazę SpCas9. Dzięki tym narzędziom Cas9 może być skierowany do dowolnej sekwencji DNA, projektując sgRNA, które celują w obszar zainteresowania. Oprócz Cas9 pochodzącego z Sp istnieją dodatkowe warianty Cas9 o różnych funkcjach w zależności od konkretnego zastosowania. Na przykład istnieją warianty Cas9 o wyższej swoistości do edycji na miejscu lub zdolności rozszczepiania pojedynczej nici do nacinania DNA6,7. Co więcej, katalitycznie nieaktywny Cas9 został niedawno opracowany do regulacji transkrypcji8. Naukowcy wykorzystali system CRISPR/Cas9 do różnych zastosowań, takich jak knockin i knockout genów do badania biologicznych funkcji genów9, screens biblioteki utraty funkcji i wzmocnienia funkcji10 oraz inżynierii genetycznej organizmów modelowych11.

W tym protokole łączymy metodologię CRISPR/Cas9 z testem transformacji komórkowej Ba/F3, aby zrozumieć biologiczną funkcję mutacji CALR. Komórki Ba / F3 to mysia linia komórek hematopoetycznych zależna od IL-3, która może być niezależna od IL-3 po ekspresji niektórych onkogenów, takich jak BCR-ABL12. Aby zrozumieć, czy zmutowana kalretykulina może przekształcać komórki B/F3 w wzrost niezależny od cytokin, skupiliśmy się na eksonie 9 endogennego locus Calr za pomocą CRISPR / Cas9 w celu wprowadzenia mutacji indelowych, a następnie wycofaliśmy IL-3 z komórek, aby zastosować dodatnią presję selekcyjną, w celu rekapitulacji wzmocnienia funkcji CALR mutacje stwierdzone u pacjentów z MPN. Protokół obejmuje projektowanie, klonowanie i dostarczanie sgRNA, rozwój stabilnych komórek wykazujących ekspresję Cas9 oraz badania przesiewowe w kierunku docelowej edycji genów CRISPR. Protokół ten może być stosowany do różnych genów i różnych linii komórkowych zależnych od cytokin i jest szczególnie cenny w modelowaniu i badaniu funkcji biologicznych genów zaangażowanych w raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie sgRNA za pomocą narzędzi online13

  1. Zaprojektuj sgRNA ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania, korzystając z ogólnodostępnych narzędzi internetowych.
    1. Skopiuj i wklej sekwencję referencyjną NCBI interesującego genu do narzędzia internetowego do projektowania sgRNA Broad Institute: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      UWAGA: To narzędzie identyfikuje sekwencje sgRNA z miejscami rozszczepienia w eksonach i tymi, które rozciągają się na granicy intron/ekson, ale nadal rozszczepiają się w eksonie.
    2. Pobierz i otwórz tekstowy plik wyjściowy w programie Excel.
    3. Skoncentruj się na kolumnach wypełnionych sekwencjami sgRNA i sekwencjami kontekstowymi sgRNA. Należy zauważyć, że sekwencje sgRNA nie zawierają motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), ale sekwencje kontekstowe tak.
    4. Należy pamiętać, że celowa ocena skuteczności zawiera przewidywany wynik wydajności rozszczepienia w skali od 0 do 1, gdzie wynik 1 oznacza wyższą skuteczność rozszczepienia.
    5. Użyj funkcji "sortuj" programu Excel, aby uporządkować cele według wyniku skuteczności lub według lokalizacji w genie celu za pomocą kolumny "Target Cut %".
      UWAGA: Sortowanie według lokalizacji w genie jest przydatne do identyfikacji sgRNA, które są ukierunkowane na określoną domenę lub ekson będący przedmiotem zainteresowania.
    6. Wybierz 3-6 sgRNA, które celują w obszar zainteresowania z wysokimi (>0,6) wynikami skuteczności na celu. Przydatne może być poznanie rodzajów mutacji, które mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp (Zobacz Rysunek 1 wyjaśniający strategię celowania zastosowaną dla kalretykuliny).
      UWAGA: sgRNA poniżej sugerowanego progu skuteczności 0,6 powinny być brane pod uwagę, gdy brakuje innych dobrych kandydatów.
    7. Użyj internetowego narzędzia do analizy gRNA MIT, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem potencjalnych efektów niedocelowych (http://crispr.mit.edu/). Dla każdego wybranego sgRNA uruchom sekwencję docelową (w tym PAM).
      UWAGA: Narzędzie internetowe do projektowania sgRNA Broad Institute może być również używane do badania przesiewowego pod kątem efektów niedocelowych (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Należy pamiętać, że narzędzie do analizy sgRNA MIT ocenia każde sgRNA w skali od 1 do 100, gdzie wynik 100 oznacza wyższą specyficzność. Wynik większy niż 70 jest idealny i reprezentuje sgRNA z minimalnymi efektami poza celem. Ta strona internetowa generuje również listę niedocelowych trafień wraz z ich lokalizacją w genomie i liczbą niezgodności, które każde z nich ma z przewodnikiem dla kandydatów.
        UWAGA: Niecelne trafienia z czterema lub więcej niezgodnościami są uważane za bezpieczne14. Niecelne trafienia z mniej niż czterema niezgodnościami mogą być problematyczne, jeśli mieszczą się w exons14.
    8. Wybierz 2-3 sgRNA, które są ukierunkowane na różne lokalizacje w regionie zainteresowania genu docelowego i które mają najwyższą wydajność sparowanego cięcia i wyniki poza celem (patrz tabela 1 dla sekwencji sgRNA ukierunkowanych na ekson 9 Calr).
      UWAGA: W zależności od celów eksperymentu, większy nacisk można położyć na różne wartości uzyskane z wymienionych narzędzi.

2. Klonowanie sgRNA Oligos13

  1. Wygeneruj oligo do przodu
    1. Utwórz listę sekwencji sgRNA bez miejsca PAM.
    2. Dodaj G do końca 5' sekwencji, jeśli koniec 5' sekwencji sgRNA nie jest G.
      UWAGA: To G jest niezbędne do maksymalizacji poziomu transkrypcji sgRNA sterowanego przez U6. Dodanie G jest konieczne dla m1 sgRNA (Tabela 1).
    3. Dodać sekwencję "CACC" do końca 5' sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem G (bez PAM) (Tabela 2) w celu wygenerowania zwisów wymaganych do ligacji wyżarzonych oligonukleotydów do trawionego przez BsmBI wektora lentiGuide (patrz krok 3).
  2. Wygeneruj odwrócony oligo
    1. Odwrotne uzupełnienie sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem G (bez PAM).
    2. Dodaj sekwencję "AAAC" do końca 5' sekwencji prowadzącej zoptymalizowanej pod kątem odwrotnego uzupełnienia G (Tabela 2).
    3. Zamów zaprojektowane oligonukleotydy w firmie zajmującej się syntezą starterów.
  3. Oligonukleotydy wyżarzania i fosforylanu
    1. Dodać 1 μl oligo do przodu (100 μM), 1 μl odwróconego oligo (100 μM), 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) i 6,5 μlH2Odo probówki PCR (łącznie = 10 μL).
    2. Uruchom następujący program w termocyklerze: 37 °C przez 30 min, 95 °C przez 5 min, rampa od 95 do 25 przy 0,1 °C/s.
    3. Rozcieńczyć produkt reakcji w stosunku 1:250 wH2O.

3. Trawienie lentiGuide-Puro Vector13

  1. Skrót wektorowy lentiGuide-Puro
    1. Zebrać 50 μl reakcji trawienia z następującymi składnikami: 5 μg kolistego plazmidu, 2 μl (30 jednostek) enzymu restrykcyjnego BsmBI, 5 μl buforu enzymu restrykcyjnego i do 50 μlH2O.
    2. Prowadzić reakcję przez 2 godziny w temperaturze 55 °C. Po pierwszej godzinie dodaj 1 μl więcej enzymu restrykcyjnego BsmBI.
  2. Defosforylacja przeciętego kręgosłupa
    1. Do strawionego wektora dodać 7 μl buforu reakcyjnego fosfatazy i 2 μl enzymu fosfatazy.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. PCR oczyszcza cięty i defosforylowany szkielet za pomocą komercyjnego zestawu.
    UWAGA: Zastąp dostarczone różowe kolumny niebieskimi kolumnami zestawu miniprep, ponieważ mogą one lepiej pomieścić duże rozmiary plazmidów. Wydajność można zwiększyć, podgrzewając bufor elucyjny w bloku cieplnym o temperaturze 90 °C przed elucją, a następnie dwukrotnie eluując DNA z kolumny na końcu (wymyte DNA z pierwszej elucji przepuścić z powrotem przez drugi raz).

4. Podwiązanie wyżarzonych oligonukleotydów do strawionego szkieletu13

  1. Dodać 50 ng strawionego szkieletu, 1 μl wyżarzonego rozcieńczenia oligo, 1 μl 10x buforu do ligacji T4, 1 μl ligazy T4 i do 10 μlH2Odo probówki PCR. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej
  2. Przekształć komórki Stbl3 za pomocą 2 μl reakcji ligacji. Umieścić na płytce agarowej z bulionu lizogennego (LB) ze 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Wybierz 3 kolonie i zaszczep je w mini-kulturze przygotowawczej.
  4. Sprawdzanie poprawności insercji oligonugoligoscytów
    1. Wykonaj minipreparację dla każdej kultury i sekwencji przez miejsce insercji oligo, zaczynając od startera w promotorze U6 przy użyciu zestawu komercyjnego.
    2. Wykonaj midi-prep lub maxi-prep kultury zweryfikowanej pod kątem sekwencji.

5. Generowanie linii komórkowych stabilnie wyrażających SpCas9

UWAGA: Ten protokół obejmuje dostarczenie plazmidu pLX_TRC311-Cas9 przez infekcję lentiwirusową. Protokół ten jest szczegółowo opisany dla mysich komórek pro-B (Ba/F3) zależnych od mysiej interleukiny-3 (mIL-3), zawiesinowej linii komórkowej i może być dostosowany do innych typów komórek przy użyciu preferowanych warunków hodowli dla każdego typu komórki. Pożywka hodowlana dla komórek Ba/F3 składa się z RPMI uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliny/streptomycyny/L-glutaminy i 10 ng/ml mysiej interleukiny 3.

  1. Transfekcyjne komórki HEK-293T
    1. Wysiew 3 x 106 komórek HEK-293T na 10 cm naczynie do hodowli tkankowej. Przechowuj wysiane komórki przez noc przed transfekcją.
      UWAGA: Komórki HEK-293T są przylegającą linią komórkową i są rutynowo wykorzystywane do produkcji wirusa. Komórki są utrzymywane w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną/L-glutaminą. Komórki powinny być zlewane w 80% w momencie transfekcji.
    2. Wstępnie podgrzej zredukowaną pożywkę surowicy (Opti-MEM) i pożywkę wzrostową.
    3. Dodać 500 μl zredukowanej pożywki surowicy, 7 μg konstruktu pLX_TRC311-Cas9, 4 μg plazmidu pakującego pCMV-VSV-G lentiwirusa i 4 μg plazmidu pakującego lentiwirusa psPAX2 do probówki
      UWAGA: Całkowite DNA na 10 cm naczynie komórek 293T wynosi 15 μg.
    4. Dobrze wymieszać DNA i dodać 45 μl odczynnika do transfekcji. Delikatnie wymieszaj i odstaw na 20 min.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać zredukowanej pożywki surowicy, ponieważ surowica będzie hamować tworzenie się kompleksu między odczynnikiem do transfekcji a plazmidowym DNA.
    5. Odessać starą pożywkę na płytce 293T i dodać 5 ml nowej pożywki wzrostowej.
    6. Dodaj mieszaninę odczynnika DNA i odczynnika do transfekcji w kroplach do płytki 293T. Delikatnie obracać i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
    7. Zbierz supernatanty wirusowe po 24 i 48 godzinach od transfekcji. Przepuścić przez filtr 0,22 μm i podwielokrotność do probówki kriowialnej (1,6 ml/probówkę i 1,5 ml zostanie użyte do infekcji).
    8. Przechowywać supernatant wirusowy w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: supernatant lentiwirusowy można zużyć w ciągu 6 miesięcy. Jeśli to możliwe, transdukcję infekcji należy wykonać świeżym wirusem).
  2. Infekcja lentiwirusowa komórek Ba/F3
    1. Rozmrozić wirusowy supernatant na lodzie, jeśli jest zamrożony.
    2. Odwirować komórki przy 300 x g przez 4 min.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 3 x 106 komórek/ml.
    4. Dodać 500 μl zawieszonych komórek, 1,5 ml supernatantu wirusa, 4 μl polibrenu (podstawa: 2 mg/ml) i 10 ng/ml m-IL3 do 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że dołączasz niezainfekowaną studzienkę z 1,5 ml pożywki zamiast supernatantu wirusowego jako kontrolę.
      UWAGA: Ilość dodanego supernatantu wirusa powinna odpowiadać wielokrotności infekcji (MOI) <1.
    5. Odwirować płytkę o sile 440 x g przez 120 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Wyjąć płytkę z wirówki i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 i pozostawić na noc do wzrostu.
    7. Po 24 godzinach odwirować komórki i ponownie zawiesić z 5 ml świeżej, ciepłej pożywki na płytce 6-dołkowej.
  3. Selekcja komórek zakażonych Cas9
    1. Odwiruj komórki i ponownie zamieszaj ze świeżym, ciepłym podłożem uzupełnionym 5 μg/ml blasticydyny, 48 godzin po infekcji.
    2. Wybierz komórki na 9 dni z blastycydyną lub do momentu, gdy niezakażone (negatywne) komórki kontrolne umrą.
    3. Po zakończeniu selekcji przenieś oporne komórki do podłoża o niższym stężeniu blasticydyny.

6. Test reporterowy dla aktywności Cas915

  1. Transdukować komórki rodzicielskie i komórki stabilnie eksprymujące Cas9 za pomocą pXPR-011 przez zakażenie lentiwirusowe (patrz kroki 5.1-5.2).
    UWAGA: Ten wektor zawiera zarówno GFP, jak i przewodnik przeznaczony dla GFP. Komórki zawierające aktywny Cas9 spowodują zmniejszenie GFP ( Rysunek 2).
  2. Wybierz komórki przez 3 dni z 2 μg/ml puromycyny, 48 godzin po infekcji
    3. .
  3. Analizować próbki pod kątem ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Redukcja GFP o 50% lub więcej stanowi optymalną aktywność Cas9. Wyższe stężenie selekcji blasticydyny może być wykorzystane do zwiększenia aktywności Cas9, jeśli zaobserwuje się zmniejszenie o mniej niż 50%. Nie wszystkie linie komórkowe tolerują selekcję blasticydyny. W takim przypadku może być konieczne użycie wektorów Cas9 z innymi kasetami wyboru. Ponadto nie wszystkie linie komórkowe tolerują stabilną ekspresję Cas9. W takim przypadku można zastosować transfekcję przejściową Cas9.

7. Spinfekcja sgRNA do komórek eksprymujących Cas9

  1. Wykonaj kroki 5.1-5.2 w przypadku lentiwirusowego zakażenia sgRNA do komórek będących przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: W kroku 5.1.3 zamień konstrukcję pLX_TRC311-Cas9 na konstrukcję lentiGuide-Puro zweryfikowaną w sekcji 4.
  2. 48 godzin po infekcji wybierz komórki przez 3 dni za pomocą 2 μg/ml puromycyny.
  3. Przenieś oporne komórki do pożywki o niższym stężeniu antybiotyków i kontynuuj selekcję przez kolejne 4 dni, aby umożliwić wystarczającą edycję.

8. Transformacja komórkowa Ba/F3 i selekcja pozytywna za pomocą wycofania m-IL3

UWAGA: Ten test jest opisany dla komórek Ba/F3 zależnych od mIL-3, ale może być zastosowany do dowolnej linii komórkowej zależnej od cytokin.

  1. Zakręć wykładniczo rosnące komórki Ba/F3 ektopowo eksprymujące Cas9 i interesujące nas sgRNA.
  2. Odessać supernatant i przemyć komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Odwirować komórki i powtórzyć etap płukania w 8.2 cztery razy (ten krok zapewnia, że podłoże jest wolne od IL-3).
  4. Odessać PBS i ponownie zawiesić komórki w 5 ml świeżej pożywki bez IL-3.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub analizatora żywotności komórek.
  6. Wysiewać komórki w trzech egzemplarzach na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej o stężeniu 1 x 105 komórek/ml w całkowitej objętości 2 ml świeżej pożywki bez IL-3.
  7. Monitoruj i licz komórki co 2 dni, w sumie przez 8 dni.
    UWAGA: Komórki Ba/F3 pozbawione IL-3 zazwyczaj umierają 2 dni po głodzie IL-3. Ważne jest, aby w teście uwzględnić kontrolę ujemną (zazwyczaj jako kontrolę stosuje się przewodnik nieukierunkowany).

9. Selekcja pod kątem edycji CRISPR na miejscu

  1. Zaprojektuj startery przesiewowe CRISPR przed i za miejscem cięcia sgRNA
    UWAGA: należy stosować startery co najmniej 100 pz od przewidywanego miejsca rozszczepienia, aby upewnić się, że duża insercja i/lub delecja (indel) w miejscu docelowym sgRNA nie wpłynie na wykrywanie.
  2. Wyizoluj genomowe DNA (gDNA) z transformowanych komórek (na końcu krzywej wzrostu) oraz z komórek przed wycofaniem cytokin.
    UWAGA: Zawsze dołączaj komórki z nadekspresją przewodnika niedocelowego jako kontrolę do edycji genów. Wyizolowanie gDNA z komórek przed i po transformacji pozwoli zidentyfikować klony, które zostały pozytywnie wyselekcjonowane i mają przewagę proliferacyjną.
  3. Zbierz 50 μl PCR z następującymi składnikami: 25 μl mieszanki 2x PCR, 1 μl startera do przodu (10 μM), 1 μl startera odwrotnego (10 μM), 50-100 ng gDNA i H2Odo 50 μL.
    UWAGA: W kroku 9.3 można zastosować wiele polimeraz o wysokiej wierności.
  4. Badaj próbki w termocyklerze, stosując następujące parametry: 95°C przez 1 min, 30 cykli (94 °C przez 1 min, 52 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s) i 72 °C przez 10 min. Ten PCR jest zoptymalizowany pod kątem starterów Calr wymienionych w tabeli 3. Zoptymalizuj warunki PCR dla pary starterów zaprojektowanej w kroku 9.1 na podstawie testowania jej na gDNA.
  5. Umieścić 5 μl próbek w 2% żelu agarozowym przy 10 V/cm przy użyciu 1x buforu tris-octano-EDTA (TAE). Zbadaj próbki pod kątem obecności/braku amplifikowanego prążka odpowiadającego wielkością genowi będącemu przedmiotem zainteresowania.
  6. Pozostałą część reakcji PCR (45 μl) należy wykorzystać do przeprowadzenia oczyszczania PCR.
  7. Sklonuj amplikony za pomocą zestawu do klonowania PCR do wektora plazmidowego. Na przykład zwykle używane są wektory pGEM T-easy.
  8. Przekształć plazmid w komórki Stbl3 lub inne kompatybilne komórki i umieść je na płytkach agarowych LB z odpowiednim antybiotykiem. Wybierz 10-20 kolonii, przygotuj każdą z nich i poddaj każdy klon sekwencjonowaniu Sangera, aby scharakteryzować indele utworzone w wyniku edycji CRISPR/Cas9.
    UWAGA: W razie potrzeby sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją pojedynczych komórek (FACS) można przeprowadzić na zbiorczo edytowanej populacji w celu wyizolowania klonu z określonym indelem. Co więcej, metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) mogą być wykorzystane do bardziej niezawodnej kwantyfikacji edycji na miejscu przy użyciu głębokiego sekwencjonowania amplikonów PCR obejmujących region docelowy sgRNA. Na przykład, Tracking of Indels by Decomposition lub TIDE może być użyty zamiast subklonowania do precyzyjnego określenia spektrum i częstotliwości docelowych mutacji generowanych w puli komórek (https://tide.nki.nl/#about)16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisaną tutaj metodę, celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie efektów funkcjonalnych wprowadzenia mutacji typu indel do endogennego Calr locus transformacji komórek krwiotwórczych. System CRISPR/Cas9 jest wykorzystywany jako narzędzie do tworzenia endogennych Calr mutacje w komórkach Ba/F3. Wybrano dwa sgRNA w celu nakierowania na egzon 9 Calr (Rysunek 1), w regionie, w którym zazwyczaj występują mutacje insercyjne i/l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy zastosowanie edycji genów CRISPR/Cas9 do badania biologicznej funkcji mutacji CALR w komórkach krwiotwórczych. Sukces tego protokołu w dużym stopniu zależy od wielu czynników. Po pierwsze, ważne jest, aby wiedzieć, jakie rodzaje mutacji mogą być odpowiedzialne za pożądany fenotyp. W tym protokole odczytem jest transformacja komórek Ba/F3 do niezależności mIL-3, a typami mutacji są indele w eksonie 9 CALR. Jeśli jednak pożądaną mutacją jest substytucja pojedynczej pary zasad, wówczas pre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH (R01HL131835), nagrodę dla badacza klinicznego Damona Runyona oraz Starr Cancer Consortium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BsmBINew England BiolabsR0580L
BlasticidinSigma Aldrich15025
PuromycinLife TechnologiesA1113803
Komórki Stbl3Life TechnologiesC737303
TransIT-LT1Thermo Fisher ScientificMIR2300
Opti-MEMLife Technologies
RPMIThermo Fisher ScientificMT10040CV
DMEMThermo Fisher Scientific10-017-CV
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Omega ScientificFB-11
Penicylina/streptomycyna/L-glutaminaLife Technologies10378016
mIL-3Peprotech213-13
psPAX2AddgeneN/A
pCMV-VSV-GAddgeneN/A
pLX_TRC311-Cas9AddgeneN/A
polybreneSigma AldrichH9268
pXPR-011AddgeneN/A
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Genessee Scientific25-507
BuforTAEThermo Fisher ScientificFERB49
LentiGuide-PuroAddgenePlazmid #52963
PNKNew England BiolabsM0201S
T4 ligazaNew England BiolabsM0202S
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28104
Zestaw do miniprepuQiagen27104
51985034

Bibliografia

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360(2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074(2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168(2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118(2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutacje kalretikulinytest transformacji kom rek Ba F3projektowanie pojedynczych gRNAkonstrukcja wektora lentiwirusowegoniehomologiczne czenie ko c wanaliza cytometrycznatest ywotno ci kom rekmurza interleukina 3

Powiązane artykuły