Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego

Yasutaka Kitahama

doi:10.3791/56729

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56729

⸱

11 stycznia 2018

Yasutaka Kitahama¹

¹Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje analizę mrugającego, wzmocnionego powierzchniowo rozpraszania Ramana spowodowanego losowym chodzeniem pojedynczej cząsteczki po powierzchni srebra przy użyciu praw potęgowych.

Streszczenie

Z pojedynczej cząsteczki na styku nanoagregatów srebra obserwuje się mrugające, powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS). W tym miejscu przedstawiono protokół dotyczący przygotowania aktywnego nanoagregatu srebra SERS, nagrania wideo niektórych punktów na obrazie mikroskopowym oraz analizy statystyk mrugania. W tej analizie prawo potęgowe odtwarza rozkłady prawdopodobieństwa jasnych zdarzeń w stosunku do czasu ich trwania. Rozkłady prawdopodobieństwa dla ciemnych zdarzeń są dopasowane przez prawo potęgowe z funkcją wykładniczą. Parametry prawa potęgowego reprezentują zachowanie molekularne zarówno w stanach jasnych, jak i ciemnych. Można oszacować model losowego spaceru i prędkość cząsteczki na całej powierzchni srebra. Jest to trudne do oszacowania nawet przy użyciu średnich, funkcji autokorelacji i obrazowania SERS o wysokiej rozdzielczości. W przyszłości analizy praw potęgowych powinny być łączone z obrazowaniem spektralnym, ponieważ pochodzenia mrugania nie da się potwierdzić samą tą metodą analizy.

Wprowadzenie

Rozpraszanie Ramana wzmocnione powierzchniowo (SERS) to bardzo czuła spektroskopia Ramana z powierzchni metalu szlachetnego. Ponieważ widmo Ramana dostarcza szczegółowych informacji o strukturze molekularnej w oparciu o ostre pozycje pików, poprzez tryby wibracyjne grup funkcyjnych w cząsteczkach, informacje o pojedynczej cząsteczce na powierzchni metalu można badać za pomocą SERS¹^,²^,³. Z nanoagregatu srebra z adsorbatem na poziomie pojedynczej cząsteczki obserwuje się sygnał¹^,²^,^3,⁴^,^5,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, a zakres się zmienia¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Mruganie może być wywołane przez pojedynczą cząsteczkę, która losowo porusza się do i ze wzmocnionego pola elektromagnetycznego (EM) na złączu nanoagregatów srebra o rozmiarach nanometrów. Dlatego mruganie jest uważane za prosty dowód na wykrywanie pojedynczych cząsteczek, w porównaniu z techniką wykorzystującą rozkład Poissona intensywności SERS i bi-analit²^,³^,¹⁷. Jednak szczegółowe mechanizmy widma mrugającego i fluktuacyjnego, które może silnie zależeć od zachowania molekularnego na powierzchni Ag, są nadal kontrowersyjne.

W poprzednich badaniach, mrugający SERS był analizowany za pomocą funkcji autokorelacji, która może obliczyć współczynnik dyfuzji i stężenie cząsteczek poruszających się do i z ulepszonego pola EM¹²^,¹³^,¹⁴. Co więcej, znormalizowany wynik odchylenia standardowego, który reprezentuje niestabilność całkowitej intensywności, został uzyskany na podstawie profilu czasowego signal¹⁵. Jednak te podejścia analityczne mogą opierać się na zachowaniu kilku cząsteczek. W przeciwieństwie do tego, w obrazowaniu mrugającym SERS w superrozdzielczości, można zidentyfikować zachowanie pojedynczej cząsteczki w wzmocnionym polu EM¹⁶. Jednak techniki te mogą uzyskać takie parametry tylko w wzmocnionym polu EM. Losowe zachowanie pojedynczej cząsteczki w szerokim zakresie (na przykład w SERS) może być reprezentowane jako prawo potęgowe, a nie średnia⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹, podobnie jak fluorescencja z pojedynczej półprzewodnikowej kropki kwantowej (QD)¹⁸^,¹⁹. Korzystając z analizy prawa potęgowego⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,9^,^10,¹¹, zachowanie molekularne można oszacować zarówno w stanie jasnym (w rozszerzonym polu EM), jak i ciemnym¹⁰; Oznacza to, że można oszacować zachowanie cząsteczki na całej powierzchni srebra.

Do tej techniki używane są koloidalne nanoagregaty srebra⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Te nanoagregaty wykazują różne zlokalizowane pasma powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR), które silnie wpływają na wzmocnione pola elektromagnetyczne, gdy są wzbudzane na określonych długościach fal. W ten sposób aktywne nanocząstki srebra SERS występują w zawiesinie koloidalnej, a niektóre dane można natychmiast uzyskać. W przypadku prostych nanostruktur, które mają określone rozmiary, kształty i układy, zależność LSPR od mrugania SERS może ukrywać inne zależności⁷; Mianowicie, jeśli zastosuje się dobrą lub złą nanostrukturę do LSPR, parametry będą stałe, a zatem inne zależności będą ukryte. Analiza prawa potęgowego została wykorzystana do odkrycia różnych zależności SERS od koloidalnych nanoagregatów srebra⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbek

Przygotowanie koloidalnych nanocząsteczek srebra²⁰
1. Aby wytworzyć koloidalne nanocząstki srebra, rozpuścić 0,030 g azotanu srebra i 0,030 g cytrynianu trisodu dwuwodnika w 150 mL wody w kolbie okrągłodennej o pojemności 200 mL.
2. Wyposażyć kolbę w chłodnicę zwrotną (Dimrotha).
3. Mieszać roztwór w kolbie za pomocą mieszadła magnetycznego i Magnetycznego mieszadełka. Następnie podgrzewać mieszany roztwór w kolbie w łaźni olejowej w temperaturze 150 °C przez 60 min.
  UWAGA: Roztwór zmieni kolor na żółty, a następnie na mlecznoszary.
4. Schłodzić zawiesinę do temperatury pokojowej, a następnie przechowywać zawiesinę w kolbie owiniętej folią aluminiową w lodówce.
  UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół. Koloidalne nanocząstki, po przechowywaniu w lodówce, należy wykorzystać w ciągu jednego miesiąca.
Przygotowanie próbki do wielobarwnej emisji migoczącej¹¹
1. Aby przygotować szkiełko mikroskopowe, umyć ręcznie szklaną płytkę mydłem i opłukać ją wodą.
2. Nanieść na szklaną płytkę 0,1% wodny roztwór poli-L-lizyny, a następnie usunąć nadmiar roztworu za pomocą gruszki dmuchawki.
3. Nanieść na szklaną płytkę koloidalną zawiesinę srebra i usunąć nadmiar zawiesiny za pomocą gruszki dmuchawki.
4. Wyznaczyć obszar kropli na szklanej płytce za pomocą płynnego markera do blokowania.
5. Nanieść kroplę wody destylowanej na szklaną płytkę i przykryć ją drugą szklaną płytką, aby stworzyć preparat mikroskopowy i zapobiec parowaniu wody.
Przygotowanie próbki do jednobarwnego migoczącego SERS⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰
1. Aby przygotować szkiełko mikroskopowe, umyć ręcznie szklaną płytkę mydłem i opłukać ją wodą.
2. Wymieszać koloidalną zawiesinę srebra z barwnikiem tiacyjaninowym lub tiakarbocyjaninowym (odpowiednio 25 lub 4 µM) oraz wodnym roztworem NaCl (10 mM) w stosunku objętościowym 2:1:1.
3. Nanieść zawiesinę próbki na szklaną płytkę i usunąć nadmiar zawiesiny za pomocą gruszki dmuchawki.
4. Wyznaczyć obszar kropli na szklanej płytce za pomocą płynnego markera do blokowania.
5. Nanieść wodny roztwór NaCl (1 M) na szklaną płytkę w celu unieruchomienia nanocząsteczek srebra i przykryć go drugą szklaną płytką, aby stworzyć preparat mikroskopowy i zapobiec parowaniu roztworu.

2. Obserwacja migotania nanocząsteczek srebra

Oświetlenie próbki
1. Umieścić szklaną płytkę z próbką przygotowaną zgodnie z protokołem 1.2 lub 1.3 na stole mikroskopu odwróconego.
2. Oświetlić szklaną płytkę z próbką światłem białym poprzez kondensor ciemnego pola i ustawić ostrość na kolorowe plamki (niebieskie, zielone, żółte i czerwone) na płytce szklanej przy użyciu obiektywu (60X).
3. Oświetlić szklaną płytkę z próbką za pomocą osłabionej wiązki z lasera DPSS (diode pumped solid state) w trybie ciągłym (cw), dostarczanej pod kątem 30° względem powierzchni próbki przez filtr interferencyjny.
4. Aby wykorzystać oświetlenie laserowe do obserwacji nanoagregatów srebra jako jednobarwnych plamek w otoczeniu o tym samym kolorze, przesunąć obszar oświetlenia laserowego na środek pola widzenia i ustawić ostrość na plamki na płytce szklanej poprzez regulację stołu w kierunku z.
Obserwacja migotania
1. Wstawić filtr długoprzepustowy za obiektywem i oświetlić szklaną płytkę z próbką wiązką lasera DPSS cw dostarczaną pod kątem 30° względem powierzchni próbki przez filtr interferencyjny.
2. Znaleźć migoczące plamki, jak pokazano na Rysunku 1 (patrz również Rysunek S1 w materiale uzupełniającym), przesuwając stół w kierunkach x i y.
3. Nagrywać wideo migoczących plamek mikroskopem odwróconym sprzężonym z chłodzoną cyfrową kamerą CCD o rozdzielczości czasowej 61 – 120 ms przez 20 min.

3. Analiza migotania SERS

Wyznaczanie profilu czasowego z nagrania wideo
1. W oprogramowaniu sterującym kamerą CCD otwórz plik wideo.
2. Aby zaznaczyć migoczące punkty i obszar ciemny, przeciągnij obszary osobno pokrywające regiony z punktami i bez punktów na obrazie wideo.
3. Aby wyznaczyć profile czasowe intensywności sygnału z migoczących punktów i obszarów ciemnych w nagraniu wideo, wybierz Temporal Analysis w menu Analysis, a następnie kliknij Calculate w oknie Temporal Analysis.
4. Zapisz dane jako plik tekstowy.
Analiza profilu czasowego
1. Wypłaszcz linię bazową profilu czasowego poprzez odjęcie profilu czasowego z obszaru ciemnego i/lub dopasowanie funkcji wielomianowej, jak pokazano na rycinach 2A i 2B.
2. Wyznacz średnią intensywność linii bazowej składającą się z około 2000 punktów, I_base, oraz odchylenie standardowe intensywności linii bazowej, σ, jak pokazano na rycinach 2C i 2D.
3. Odróżnij zdarzenia jasne od ciemnych, przyjmując wartości intensywności wyższe niż próg I_base + 3σ, i zapisz czas trwania każdego zdarzenia. Na przykład na rycinie 3 zapisz zdarzenie od 0 do 3,5476 s jako zdarzenie ciemne (o czasie trwania t = 3,5476 s), a zdarzenie od 3,5476 do 4,0981 s zapisz jako zdarzenie jasne (o czasie trwania t = 0,5505 s). Powtórz procedurę zgodnie z tabelą 1.
4. Policz liczbę zdarzeń jasnych i ciemnych dla każdego czasu trwania, zgodnie z pierwszym i drugim wierszem tabeli 2.
5. Zsumuj liczbę zdarzeń dla każdego czasu trwania, z wyjątkiem zdarzeń krótszych niż czas t. Na przykład, zgodnie z drugim i trzecim wierszem tabeli 2, zsumuj liczbę zdarzeń dla każdego czasu trwania (z wyjątkiem zdarzeń dla t = 0,0612 s) jako 41 + 18 + 9 + …; wynik równy jest sumie dla t = 0,1223 s, t.j. 103.
6. Podziel sumy przez odpowiedni czas trwania, a następnie je znormalizuj. Na przykład, zgodnie z tabelą 2, podziel sumę dla czasu trwania t = 0,0612 s przez czas 0,0612 s. Wynik wynosi 3,351.5791. Następnie podziel ten wynik przez sumę wyników w czwartym wierszu tabeli 2. Wyznaczony rozkład prawdopodobieństwa wynosi 0,64494.
7. Przedstaw rozkłady prawdopodobieństwa dla zdarzeń jasnych P_on(t) w funkcji ich czasu trwania t na wykresie logarytmicznym i dopasuj Log₁₀P_on(t) do Log₁₀(), aby wyznaczyć wykładnik prawa potęgowego α_on dla konkretnego migoczącego punktu. Jeśli P_on(t) jest dopasowane do , dopasowana linia odbiega od punktów pomiarowych przy małych wartościach P_on(t), co pokazano linią przerywaną na rycinie 4A.
8. Przedstaw rozkłady prawdopodobieństwa dla zdarzeń ciemnych P_off(t) w funkcji ich czasu trwania t na wykresie logarytmicznym i dopasuj Log₁₀P_off(t) do Log₁₀(), aby wyznaczyć wykładnik prawa potęgowego α_off oraz czas obcięcia τ dla tego samego migoczącego punktu. Jeśli P_off(t) jest dopasowane do , dopasowana krzywa odbiega od punktów pomiarowych przy małych wartościach P_off(t).
9. Powtórz kroki od 3.2.1 do 3.2.8 dla pozostałych migoczących punktów w nagraniu wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W przypadku nanoagregatów srebra z poli-L-lizyną przygotowanych zgodnie z protokołem 1.2 obserwuje się wielokolorowe migoczące plamki w SERS i fluorescencji wzmocnionej powierzchniowo, co przedstawiono na Rysunku 1¹¹. W przeciwieństwie do tego, dla nanoagregatów srebra z cząsteczkami barwnika przygotowanych zgodnie z protokołem 1.3⁷^,⁸^,⁹^,<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sygnał SERS jest emitowany z złączy nanoagregatów srebra. W związku z tym należy przygotować nanoagregaty, a nie koloidalne nanocząstki pokryte anionami cytrynianu. Agregaty srebra powstają w wyniku efektu wysalania wywołanego dodaniem poli-L-lizyny, która posiada grupę -NH₃⁺ i jest źródłem SERS, lub kationów Na⁺ z NaCl, jak pokazano na Rysunku S2 w materiale uzupełniającym. Ponadto, aby oświetlić wiele punktów na szerokim obszarze, niefokusowana wiązka lasera jest dostar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Autor dziękuje Prof. Y. Ozaki (Uniwersytet Kwansei Gakuin) i Dr. T. Itoh (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) za owocną dyskusję na temat tej pracy. Prace te były wspierane przez KAKENHI (Grant-in-Aid for Scientific Research C) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (nr 16K05671).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Azotan srebra, 99,8%	Wako	194-00832
Cytrynian trisodowy dwuwodny, 99. %	Wako	191-01785
Wodny roztwór poli-L-lizyny, 0,1%	Sigma-Aldrich	P8920
3,3'-disulfopropylotiacyjanina, trietyloamina	Hayashibara Laboratoria Biochemiczne	NK-2703	rodzaj barwników tiacyjaninowych
Sól jodowa 3,3'-dietylo-5,5'-dichloro-9-metylotiakarbocyjaniny	Hayashibara Laboratoria Biochemiczne	SMP-9	rodzaj barwników tiakarobocyjaninowych
Chlorek sodu, 99,5%	Wako	191-01665
Skraplacz Dimroth	Iwaki	61-9722-22	wyprowadzony z AS ONE
Mieszadło magnetyczne	Corning	DC-420D
Kąpiel olejowa	Advantech	OS-220
Szklana płytka	Matsunami	S-1112	Szkiełko mikroskopowe
Dmuchawa	Hozan	Z-288	Pył powietrzny
Długopis blokujący płyn	Daido Sangyo		LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Gotowy do użycia hydrofobowy długopis barierowy przeznaczony do zastosowań immunohistochemicznych
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX-70
Soczewka obiektywowa	Olympus	LCPlanFl 60 razy;	NA 0.7
Kondensor ciemnego pola	Olympus	U-DCD	NA 0.8– 0.92
Chłodzona cyfrowa kamera CCD	Hamamatsu	ORCA-AG	sterowana za pomocą oprogramowania Aqua Cosmos
Software dla chłodzonej cyfrowej kamery CCD	Hamamatsu	AquaCosmos	służy również do wyznaczania profili czasowych z punktów na filmie
Kolorowa kamera CCD	ELMO	TNC-C920	nie służy do analizy
laserowy system laserowy DPSS	RGB	NovaPro532-75	λ = 532 nm; 60 mW (odpowiada gęstości mocy 600 W/cm2)
Filtr interferencyjny	Semrock	LL01-532-12.5
Filtr długoprzepustowy	Semrock	BLP01-532R-25
Oprogramowanie do rozróżniania i zliczania jasnych/ciemnych zdarzeń	pokojówka		zaprogramowana przez C++
Oprogramowanie do montażu według prawa mocy	LightStone	Origin6.1

Bibliografia

Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).
Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).
Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).
Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

miganie SERS nanogregaty srebra analiza prawa pot gowego model b dzenia losowego analiza czasu trwania zdarze mikroskopia fluorescencyjna obrazowanie kamer CCD na wietlanie laserem pow oka z poli L lizyny

Obserwacja i analiza mrugającego powierzchniowego rozpraszania Ramana wzmocnionego