Artykuł metodologiczny

Pobieranie i ekstrakcja próbek powietrza w miejscu pracy do analizy DNA grzybów

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56730

⸱

2 maja 2018

 ,  , 
1Allergy and Clinical Immunology Branch, Health Effects Laboratory Division, National Institute for Occupational Safety and Health, Centers for Disease Control and Prevention

W tym artykule

Podsumowanie

Określanie różnorodności grzybów w środowisku jest metodą wykorzystywaną w badaniach nad zdrowiem zawodowym do identyfikacji zagrożeń dla zdrowia. Protokół ten opisuje ekstrakcję DNA z próbek powietrza zawodowego w celu amplifikacji i sekwencjonowania regionów ITS grzybów. Takie podejście wykrywa wiele gatunków grzybów, które mogą zostać pominięte przez tradycyjne metody oceny.

Streszczenie

Tradycyjne metody identyfikacji ekspozycji na grzyby w środowisku pracy, takie jak hodowla i podejścia oparte na mikroskopii, mają kilka ograniczeń, które doprowadziły do wykluczenia wielu gatunków. Postępy w tej dziedzinie w ciągu ostatnich dwóch dekad skłoniły badaczy zajmujących się zdrowiem w miejscu pracy do zwrócenia się ku metodom molekularnym do identyfikacji zagrożeń grzybiczych. Metody te doprowadziły do wykrycia wielu gatunków w środowisku wewnętrznym i zawodowym, które nie zostały wykryte przy użyciu tradycyjnych metod. Protokół ten szczegółowo opisuje podejście do określania różnorodności grzybów w próbkach powietrza poprzez ekstrakcję genomowego DNA, amplifikację, sekwencjonowanie i identyfikację taksonomiczną regionów wewnętrznej transkrypcji grzybów (ITS). Sekwencjonowanie ITS prowadzi do wykrycia wielu gatunków grzybów, które albo nie są wykrywane, albo są trudne do zidentyfikowania na poziomie gatunku za pomocą hodowli lub mikroskopii. Chociaż metody te nie zapewniają ilościowych pomiarów obciążenia grzybami, oferują nowe podejście do identyfikacji zagrożeń i mogą być wykorzystywane do określania ogólnego bogactwa i różnorodności gatunków w środowisku pracy.

Wprowadzenie

Narażenie na grzyby w pomieszczeniach i miejscach pracy może powodować choroby układu oddechowego, w tym uczulenie alergiczne i astmę1. Identyfikacja zagrożeń ze strony grzybów jest ważna dla oceny ryzyka i zapobiegania narażeniu pracowników. Te zagrożenia grzybicze mogą być wynikiem zanieczyszczenia w pomieszczeniach, wtargnięcia powietrza na zewnątrz lub zakłóceń środowiskowych, które skutkują transportem materiałów grzybowych do obszarów, w których przebywają pracownicy2. Metody oceny narażenia na działanie grzybów obejmowały pobieranie próbek żywych kultur, a także mikroskopową identyfikację zarodników grzybów. Podejścia te mają kilka ograniczeń i często pomijają wiele gatunków grzybów, które mogą przyczyniać się do ogólnego obciążenia grzybami3. Podejścia oparte na kulturach mogą różnicować tylko te żywotne organizmy grzybowe, które mogą być hodowane na pożywkach. Identyfikacja zarodników grzybów na poziomie gatunku za pomocą mikroskopii może być zakłócona przez zarodniki o podobnej morfologii. Obie metody są w dużym stopniu zależne od mikologów w zakresie analizy i identyfikacji gatunków grzybów, z których wiele pozostaje niezidentyfikowanych.

Aby ulepszyć istniejące metodologie używane do identyfikacji ryzyka zawodowego i oceny narażenia, wielu badaczy zwróciło się ku technologiom opartym na molekularach. Oparte na sekwencjonowaniu podejścia do oceny różnorodności mikrobiologicznej w środowisku wewnętrznym i zawodowym ujawniły szersze spektrum napotkanych gatunków grzybów w porównaniu z metodami takimi jak mikroskopia i hodowla żywotna3,4,5. Przedstawiona tutaj metoda opisuje pobieranie próbek powietrza w środowisku pracy i ekstrakcję genomowego DNA w celu identyfikacji potencjalnych zagrożeń grzybiczych. Identyfikacja zagrożeń odbywa się poprzez sekwencjonowanie jądrowych rybosomalnych wewnętrznych transkrybowanych obszarów dystansowych (ITS), które są bardzo zmienne wśród grzybów i były powszechnie używane do różnicowania gatunków grzybów6,7,8,9. Wiele gatunków występujących w środowisku zawodowym, takich jak niektóre gatunki należące do gromady Basidiomycota, nie jest możliwych do zidentyfikowania w żywotnej kulturze i trudno je rozróżnić mikroskopowo. Grzyby te zaobserwowano w dużej względnej liczebności w środowiskach wewnętrznych i zawodowych, ocenianych za pomocą sekwencjonowania regionów ITS grzybów3,4,10. Sekwencjonowanie ITS dostarczyło większej wiedzy na temat różnorodności grzybów spotykanych w pomieszczeniach i miejscach pracy.

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metody używane do zbierania, ekstrakcji i amplifikacji regionów grzybów z bioaerozoli do analizy sekwencji. Podejście to wykorzystuje dwustopniowy próbnik aerozoli cyklonowych Narodowego Instytutu Bezpieczeństwa i Zdrowia (NIOSH) do zbierania cząstek stałych w powietrzu. Ten próbnik został opracowany do zbierania bioaerozoli i oddzielania cząstek respirabilnych (≤4 μm średnicy aerodynamicznej) i nierespirabilnych (>4 μm średnicy aerodynamicznej), co pozwala na identyfikację organizmów grzybowych w środowisku wewnętrznym, które najprawdopodobniej zostaną wdychane przez pracownika11. Na rynku dostępne są również inne próbniki powietrza, w tym próbniki cyklonowe, które mają możliwość zbierania cząstek w zakresie respirabilnym (<4 μm) za pomocą filtrów12,13. W przeciwieństwie do tego, dwustopniowy próbnik aerozoli cyklonowych NIOSH oddziela gatunki grzybów na podstawie ich średnicy aerodynamicznej do jednorazowych, polipropylenowych probówek, które można natychmiast przetworzyć do dalszych zastosowań14.

Procesy ekstrakcji genomowego DNA i amplifikacji regionów ITS grzybów są szczegółowo opisane w tym protokole. Przedstawione metodologie ekstrakcji zostały opracowane specjalnie do ekstrakcji genomowego DNA z grzybów i bakterii, ponieważ wiele komercyjnych zestawów jest ukierunkowanych na komórki ssaków, bakterie, a konkretnie drożdże15. Startery użyte w tym badaniu są wybierane na podstawie ich ogólnego pokrycia zarówno regionów grzyba ITS 1, jak i ITS 24,5. Sekwencjonowanie tych regionów pozwala na porównanie wielu zbankowanych sekwencji ITS, w tym tych, które sekwencjonują region ITS 1, region ITS 2 lub oba regiony ITS 1 i ITS 2. Pokazano różnorodność grzybów w próbkach powietrza pobranych w pomieszczeniach przy użyciu tych metod, ujawniając znaczną liczbę sekwencji umieszczonych w gromadzie Ascomycota i Basidiomycota, a także innych sekwencji należących do mniej dominującej gromady grzybów, takich jak Zygomycota. Duża różnorodność sekwencji grzybów zidentyfikowanych przy użyciu tego podejścia nie zostałaby uchwycona przy użyciu tradycyjnych metod identyfikacji zagrożeń, takich jak uprawa czy mikroskopia. Sekwencjonowanie regionów ITS grzybów zapewnia ulepszoną metodę identyfikacji zagrożeń grzybiczych i pozwala na lepsze zrozumienie narażenia na grzyby w pomieszczeniach i miejscach pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbnika aerozolu NIOSH

UWAGA: Próbnik aerozoli NIOSH to dwustopniowy próbnik aerozoli cyklonowych, który zbiera bioaerozole za pomocą dwóch probówek do pobierania próbek i filtra z politetrafluoroetylenu (PTFE).

  1. Przed montażem należy dokładnie sprawdzić próbnik. Sprawdź próbnik, aby upewnić się, że nie jest uszkodzony, wszystkie są na swoim miejscu i dobrze dopasowane, a taśma uszczelniająca wokół szwu utworzonego przez dwie połówki jest nienaruszona. Sprawdź O-ring próbnika, aby upewnić się, że nie ma żadnych wyszczerbień, pęknięć ani rozdarć oraz że ma bardzo cienką warstwę smaru silikonowego.
    UWAGA: Próbnik zawiera filtr PTFE 37 mm 3 μm w trzyczęściowej kasecie filtracyjnej z polistyrenu lub polipropylenu.
    1. Zamontuj kasetę filtra, umieszczając celulozową lub plastikową podkładkę podtrzymującą filtr (dołączoną do filtrów) na siatkowej powierzchni podstawy (patrz Rysunek 1). Użyj kleszczyków filtrujących, aby umieścić filtr na podkładce nośnej filtra stroną zbierającą skierowaną do góry.
    2. Uszczelnić kasety filtracyjne za pomocą prasy ręcznej lub pneumatycznej. Zamknięcie dłoni pozwoli na wyciek powietrza wokół filtra i zmniejszy skuteczność zbierania. Włóż element w kształcie pierścienia (osłonę przedłużającą) i użyj prasy, aby mocno i równomiernie docisnąć go w dół. Dociśnij osłonę przedłużającą do filtra na tyle mocno, aby powietrze nie wyciekało wokół filtra.
      UWAGA: Górna część kasety nie jest używana podczas próbkowania, ale powinna zostać zachowana, aby zakryć filtr po zakończeniu próbkowania.
    3. Zamontuj zmontowaną kasetę na górze próbnika i dociśnij ją tak daleko, jak to możliwe. Owiń kawałek taśmy o grubości 19 mm (3/4 cala) wokół zewnętrznej strony kasety filtracyjnej i próbnika, aby utrzymać kasetę filtra na miejscu i działać jako uszczelnienie zapasowe, aby zapobiec wyciekom.
    4. Przykręć każdą probówkę mocno i całkowicie do próbnika, aż osiągnie dno, a następnie owiń każdą probówkę taśmą uszczelniającą, aby działała jako wtórne uszczelnienie przed wyciekami.
      UWAGA: Pierwsza probówka, probówka polipropylenowa o pojemności 15 ml, zbiera nierespirabilne cząstki o średnicy aerodynamicznej >4 μm. Druga probówka, polipropylenowa probówka wirówkowa o pojemności 1,5 ml, zbiera cząstki wziewne o wielkości od 1 do 4 μm. Pozostałe mniejsze cząstki, <1 μm, są zbierane na filtrze PTFE (patrz Rysunek 2).
  2. Przed każdym użyciem skalibruj przepływ powietrza przez próbnik NIOSH za pomocą słoika kalibracyjnego, ponieważ różnice w filtrach i próbnikach spowodują zmiany przepływu powietrza.
    1. Aby użyć słoika kalibracyjnego, włóż złączkę Luer słoika do górnej części kasety filtracyjnej, umieść próbnik w słoiku i zamknij słoik.
    2. Podłączyć słoik kalibracyjny do przepływomierza kalibracyjnego i pompy do pobierania próbek. Włącz przepływomierz i pozwól mu się rozgrzać przez kilka minut. Należy pamiętać, że przepływomierz musi być zawsze wyposażony w filtr przymocowany do wlotu, aby uniknąć zanieczyszczenia przepływomierza i próbnika.
    3. Włączyć pompę do pobierania próbek i pozostawić ją na kilka minut, aby się rozgrzała i ustabilizowała.
    4. Wyreguluj pompę, aby ustawić prawidłowe natężenie przepływu na poziomie 3.5 l/min.
      UWAGA: Natężenie przepływu próbnika aerozolowego NIOSH jest zwykle ustawione na 3.5 l/min. Przy takim natężeniu przepływu próbnik spełnia kryteria ACGIH/ISO dotyczące pobierania próbek cząstek respirabilnych16. Można stosować inne natężenia przepływu, jeżeli pożądane są różne wielkości odcięcia lub w celu zmniejszenia poziomu hałasu, ale należy pamiętać, że w przypadku zastosowania innego natężenia przepływu próbnik nie będzie już spełniał kryteriów pobierania próbek respirabilnych.
    5. Po zakończeniu kalibracji wyłącz pompę i przepływomierz.

2. Statyczne i osobiste pobieranie próbek aerozoli

  1. Skonfiguruj próbnik aerozoli NIOSH do pobierania próbek z obszaru osobistego lub statycznego.
    UWAGA: Pobieranie próbek statycznych odnosi się do używania próbnika aerozolowego, gdy jest on przymocowany do statywu lub innego urządzenia podtrzymującego (patrz Rysunek 3), w przeciwieństwie do pobierania próbek osobistych, gdy próbnik i pompa są zamontowane na badanej osobie (patrz Rysunek 4).
    1. W przypadku statycznego pobierania próbek z obszaru należy utrzymywać próbniki jak najbliżej określonego obszaru badanego. Próbniki należy trzymać z dala od wlotów powietrza, wejść do pomieszczeń i miejsc, które mogą znajdować się na drodze przepływu powietrza.
      UWAGA: Stężenia aerozolu mogą się znacznie różnić nawet na krótkich dystansach, zwłaszcza jeśli źródło aerozolu znajduje się w pomieszczeniu17.
    2. W przypadku pobierania próbek należy ustawić próbnik w strefie oddychania danej osoby. Przymocuj próbnik do klapy, ramienia lub klatki piersiowej i umieść pompę do pobierania próbek przy pasie lub w plecaku.
      UWAGA: Powszechnie przyjmuje się, że strefa oddychania to 30-centymetrowa półkula otaczająca nos osoby, z której większość powietrza jest pobierana podczas inhalacji17.
  2. Upewnij się, że rurka próbnika jest dobrze oddalona od wlotów próbnika i że nic nie zasłania wlotów ani nie zakłóca przepływu powietrza do próbnika. Rurka próbnika nie może być ściśnięta ani zagięta. Jakakolwiek blokada spowoduje zatrzymanie pompy.
  3. Włącz pompy. Po minucie lub dwóch sprawdź, czy pompy nadal pracują.
    UWAGA: Pobieranie próbek powietrza należy przeprowadzać w okresach od zaledwie 10 minut do pełnych 8 godzin zmiany roboczej, w zależności od środowiska10,18,19. Wyniki przedstawione w Rysunek 6 reprezentują 60-minutowy okres próbkowania w środowisku wewnętrznym.
  4. Po zakończeniu pobierania próbek powietrza należy pobrać probówki z próbkami i przefiltrować. Usuń taśmę uszczelniającą, odkręć rurki i zakryj je. Umieść trzeci kawałek kasety filtra nad filtrem. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do przetworzenia.

3. Ekstrakcja genomowego DNA z próbek powietrza

  1. Wyodrębnij genomowe DNA (gDNA) z każdego etapu próbnika NIOSH BC251. Probówki do pobierania próbek powietrza i filtr należy przetwarzać oddzielnie, aby umożliwić oznaczenie respirabilnych i nierespirabilnych aerozoli mikrobiologicznych w próbce.
    UWAGA: Alternatywnie, trzy etapy można połączyć i wyekstrahować, jeśli inokulum próbki jest zbyt małe.
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II lub czystej ławce z przepływem laminarnym należy aseptycznie wyjąć filtr. Wytrzyj kasetę do pobierania próbek przy użyciu 70% etanolu i podważ kasetę do pobierania próbek za pomocą narzędzia do otwierania kasety. Użyj podnośnika filtra, aby popchnąć filtr i podkładkę nośną do góry. Chwyć filtr za pomocą kleszczyków filtracyjnych i umieść go na sterylnej szalce Petriego. Pokrój filtr na 6 równych kawałków i umieść je w wzmocnionej probówce o pojemności 2 ml zawierającej 300 mg szklanych kulek (0,2 - 0,5 mm).
    2. Rurkę zawierającą filtr należy umieścić w ciekłym azocie na 30 s i natychmiast umieścić w homogenizatorze młynka perełkowego ustawionym na 4,5 m/s na 30 s.
    3. Powtórz krok 3.1.2 raz lub dwa razy, aż filtr zostanie rozdrobniony. Mogą pozostać małe kawałki nienaruszonego filtra. Dodać 0,5 ml buforu do lizy (4 M mocznik, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 7,4).
    4. Dodać 0,3 ml buforu do lizy do probówek z próbką powietrza o pojemności 15 ml i 1,5 ml. Obracaj rurkę przez 10-15 s w pozycji pionowej, a następnie kolejne 10-15 s w pozycji odwróconej. Przenieść zawartość każdej probówki do wzmocnionych probówek o pojemności 2 ml zawierających kulki szklane 300 mg.
      UWAGA: Większość materiału zebranego w każdej probówce z próbnikiem gromadzi się w pobliżu górnej części probówki.
    5. Przetwarzać wszystkie probówki w homogenizatorze w młynku perełkowym z prędkością 4,5 m/s przez 30 s i odwirowywać je przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 22 °C. Przenieść supernatanty do sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować probówki przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 22 °C. Powtórzyć ten krok.
  2. Dodać 30 μl odczynnika do lizy (patrz tabela materiałów) do każdej probówki i inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  3. Dodać 0,2 ml buforu wiążącego (10 M mocznika, 6 M guanidyno-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4,4) i proteinazy K (100 μg/ml) do każdej probówki i inkubować probówki w temperaturze 70 °C przez 10 min. Dodać 100 μl izopropanolu do każdej probówki.
  4. Przenieść roztwory ekstraktu do probówek filtracyjnych z włókna szklanego (pojemność 700 μl) umieszczonych w probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml i odwirować probówki zbiorcze o sile 20 000 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C. Wyrzucić probówki zbiorcze i umieścić probówki filtracyjne w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml.
  5. Dodać 0,5 ml buforu do usuwania inhibitora (5 M guanidyno-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, 38% etanolu) do każdej probówki i odwirować probówki zbiorcze przy 20 000 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C. Wyrzucić probówki zbiorcze i umieścić probówki filtrujące w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml.
  6. Dodać 0,5 ml buforu płuczącego (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% etanolu) do każdej probówki i odwirować probówki zbiorcze przy 20 000 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C. Wyrzucić probówki zbiorcze i umieścić probówki filtrujące w nowych probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml. Powtórz ten proces.
  7. Odwirować probówki zbiorcze o sile 20 000 x g przez dodatkową 1 minutę w temperaturze 22 °C w celu usunięcia resztek buforu do płukania. Wyrzuć probówki zbiorcze i umieść probówki filtrujące w nowych probówkach zbiorczych.
  8. Dodać 100 μl ciepłego (≥70 °C) buforu elucyjnego (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) do każdej probówki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 minuty. Odwirować probówki zbiorcze przy 20 000 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C. Przenieść puste probówki filtracyjne do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie nałożyć eluaty z kroku 3.8. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 minuty. Wirować przy 20 000 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C.
    UWAGA: Eluaty można zużyć natychmiast w kroku 4 lub przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Genomowe DNA może być przechowywane przez okres do roku w temperaturze -20 °C. Zaleca się przechowywanie DNA w temperaturze -80 °C, jeżeli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.

4. Amplifikacja rybosomalnego DNA grzyba

  1. Użyj uniwersalnych starterów grzybów, aby amplifikować regiony ITS 1 i 2 z wyekstrahowanego gDNA.
    UWAGA: W przypadku tego protokołu para starterów Fun18Sf (5'-TTGCTCTCTCAACGAGGAAT-3')/ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') jest używana w celu zapewnienia największego pokrycia regionów ITS4,5. Można stosować inne zestawy starterów, takie jak te, które same amplifikują regiony ITS1 lub ITS2.
    1. Ustawić łańcuchowe reakcje polimerazy (PCR) dla każdej próbki w potrójnych reakcjach po 50 μl w sterylnych probówkach do PCR o pojemności 0,5 ml lub 96-dołkowych płytkach PCR w następujący sposób: 5 μl wyekstrahowanego matrycowego DNA (z kroku 3), 33,3 μl wody klasy PCR, 5 μl 10x buforu PCR, 1,5 μL 50 mM MgCl2, 1 μl 10 mM 2'-deoksynukleozydu 5'-trifosforanów, 0,5 μl 20 μM startera do przodu Fun18Sf, 0,5 μl 20 μM startera odwrotnego ITS4R i 0,2 μl polimerazy DNA Taq.
    2. Przeprowadzić reakcje w termocyklerze: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 min; 6 cykli denaturacji (96 °C, 30 s), wyżarzanie (50 °C, 45 s) i przedłużanie gruntu (72 °C, 3 min); 20 cykli denaturacji (96 °C, 30 s), wyżarzania (50 °C, 45 s) i przedłużania podkładu (72 °C), 1 min); i przedłużanie podkładu w temperaturze 72 °C przez 10 min. Mieszaniny reakcyjne należy przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego etapu.
  2. Połączyć potrójne reakcje PCR, oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania na bazie membrany krzemionkowej.
    UWAGA: Ta procedura pozwala na usunięcie składników PCR (starterów, dNTP, enzymów, soli itp.) i innych zanieczyszczeń z preparatów amplifikowanego DNA.
    1. Połączyć trzy reakcje dla każdej próbki (łącznie 150 μl) w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać bufor wiążący (5 M guanidyno-HCl, 30% izopropanolu) o 5-krotnej objętości (750 μL) i wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół dziesięć razy.
    2. Dodać 450 μl mieszaniny do kolumn wirowych umieszczonych w probówkach zbiorczych i odwirować probówki przy 17 900 x g przez 30 s. Wyrzucić filtraty. Dodać pozostałe 450 μl do kolumn i odwirować w temperaturze 17 900 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Kolumny wirujące zawierają membranę krzemionkową, która pozwala na adsorpcję DNA do kolumn.
    3. Odrzucić filtraty i dodać 750 μl buforu płuczącego (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% etanolu) do kolumn wirowych. Odwirować kolumny przy 17 900 x g przez 30 s w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Proces ten usuwa zanieczyszczenia z wyżej wymienionej reakcji PCR.
    4. Odrzucić filtrat i odwirować puste kolumny przy 17 900 x g przez 1 minutę w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie wszelkich resztek bufora myjącego, który może zakłócać dalsze zastosowania.
    5. Przenieś kolumny wirujące do sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 45 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odwirować kolumny wirujące o stężeniu 17 900 x g przez 1 minutę w temperaturze 22 °C.
    6. Wyluzowane DNA należy natychmiast zużyć w krokach 4 i 5 lub przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowe do użycia.
      UWAGA: Amplikony mogą być przechowywane przez okres do roku w temperaturze -20 °C. Zaleca się przechowywanie DNA w temperaturze -80 °C, jeżeli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.

5. Weryfikacja amplifikacji ITS grzybów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym

  1. Odleć 1% żel agarozowy zawierający 1 μg/ml bromku etydyny. Rozpuść agarozę we wrzącym 1x bufor tris-octanu-EDTA (TAE). Gdy roztwór ostygnie do temperatury około 50 °C, dodać bromek etydyny i wlać do odlewu żelowego.
  2. Po zestaleniu się żelu agarozowego zanurz żel w 1x TAE i przygotuj amplikony do naładowania na żel. Do 8 μl amplifikowanego DNA dodaj 2 μl buforu 5x ładującego.
    UWAGA: Objętości te można regulować w zależności od stężenia żądanego bufora załadowczego.
  3. Załaduj próbki, wszystkie 10 μl, na żel wraz z drabinką DNA w celu odniesienia rozmiaru. Uruchom żel pod napięciem 75 V (6 V/cm) przez około 90 minut i wizualizuj pasma, zwykle widoczne między 750 a 1000 par zasad, za pomocą światła ultrafioletowego (patrz Rysunek 5).

6. Sekwencjonowanie i analiza regionów grzybowych ITS

  1. Zsekwencjonuj wyekstrahowane gDNA lub amplifikowane regiony ITS grzyba i przeanalizuj sekwencje przy użyciu obecnych i odpowiednich metod.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozkład gatunków w środowisku można ocenić za pomocą względnej obfitości, określając liczbę klonów każdego OTU zidentyfikowanego w próbkach powietrza. Rysunek 6 przedstawia wykres Krona obrazujący gatunki przypisane taksonomicznie w środowisku wewnętrznym po 60 min pobierania próbek powietrza. Można zauważyć, że środowisko to zawiera różnorodne gatunki należące do dwóch głównych typów grzybów, Ascomycota i Basidiomycota, a także gatunki należące do typu Zygom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Określenie różnorodności grzybów w środowisku zawodowym przy użyciu podejść opartych na sekwencjonowaniu poprawiło identyfikację zagrożeń grzybowych i ocenę narażenia. Zastosowanie tego podejścia pozwoliło na wykrycie wielu dodatkowych gatunków grzybów, które często nie są wykrywane za pomocą hodowli lub metod oceny opartych na mikroskopii. Przedstawiono metodę pobierania próbek bioaerozoli ze środowisk zawodowych i wewnętrznych oraz ekstrakcji genomowego DNA z próbek powietrza w celu amplifikacji i sekwencjonowania ITS....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Narodowego Instytutu Bezpieczeństwa i Zdrowia w Pracy, Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez międzyagencyjną umowę między NIOSH i NIEHS (AES12007001-1-0-6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Próbnik cyklonów bioaerozolowych NIOSH BC251PróbnikBC251Próbnik NIOSH nie jest jeszcze dostępny na rynku. Prosimy o kontakt z dr Williamem Lindsleyem (wlindsley@cdc.gov) w celu uzyskania informacji na temat uzyskania próbnika NIOSH
Sterylne probówki do mikrowirówek Fisherbrand z nakrętkamiFisher Scientific02-681-373Probówki do mikrowirówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml do pobierania próbek powietrza; gwintowanie musi pasować do gwintu próbnika NIOSH
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlCorning35209615 ml probówki polipropylenowe do pobierania próbek powietrza
Taśma winylowa do pomieszczeń czystych, łatwa do usunięcia, szerokość 1/4"Taśma uszczelniającaMcMaster-Carr76505A1
Kaseta filtracyjna, przezroczysty styren, 37 mmSKC Inc.225-3LF3-częściowa kaseta do pobierania próbek (bez filtra). Zawiera: podstawę kasety, osłonę przedłużającą, nasadkę kasety i korki wlotowe/wylotowe
Hydrofobowe filtry membranowe fluoroporowe PTFE, 3,0 i mikro; m, 37 mmEMD MilliporeFSLW03700Zawiera: 37 mm, 3.0 i mikro; m Filtry PTFE i podkładki nośne
Kleszcze filtracyjne Fisherbrand KleszczefiltracyjneFisher Scientific09-753-50
Model 502 Precyzyjnaprasa kasetowa PanaPress Pneumatyczna prasa kasetowa PanaVise 502 jest zbudowana z tej precyzyjnej prasy trzpieniowej
Taśma izolacyjna winylowa Scotch Super 33+McMaster-Carr76455A21Taśma 19 mm
Uniwersalny słoik kalibracyjny, dużySKC Inc.225-112słoik kalibracyjny
Uniwersalna pompa do próbek PCXR4 SKCInc.224-PCXR4pompa do pobierania próbek
Przepływomierz masowy 4140TSI Inc.Przepływomierz4140
Roche High Pure PCR Template KitDiagnostics11796828001Kit służy do ekstrakcji genomowego DNA. Zawiera: Bufor do lizy, Bufor wiążący, Proteinaza K, Bufor do usuwania inhibitorów, Bufor do płukania, Bufor elucyjny, Probówki filtracyjne z włókna szklanego i 2 ml probówki
zbiorcze Fisherbrand 2 ml Wzmocnione rurki z polipropylenu Fisherbrand 2 ml z nakrętkamiFisher Scientific15340162Wzmocnione probówki 2 ml do homogenizacji kulek
Kulki szklane, myte kwasem, 212-300 i mikro; mKoraliki szklaneSigma-AldrichG1277
Homogenizator Fisher Scientific Bead Mill 24 HomogenizatorFisher Scientific15-340-163Odczynnik
lizy komórek B CelLytic, 10XOdczynnik do lizySigma-AldrichC8740
Polimeraza Platinum TaqInvitrogen10966-018Zawiera: polimerazę Platinum Taq, 10X bufor PCR (bez MgCl2), 50 mM MgCl2, przedłużacz KB
dNTP MixInvitrogen18427-08810 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106Zestaw służący do oczyszczania amplikonów grzybów. Zawiera: Bufor PB (bufor wiążący), Bufor PE (bufor myjący), Bufor EB (bufor elucyjny), Barwnik wskaźnikowy pH (opcjonalnie) oraz barwnik załadowczy GelPilot
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis SystemThermo FisherB1 lub B2
TrackIt 1 KB Plus Drabinka DNAThermo Fisher10488-085
NIOSH Roche do

Bibliografia

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28(2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629(2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863(2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189(2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja DNA grzyb wzawodnicze pobieranie pr bek powietrzawewn trzny transkrybowany spacerpr bnik aerozoli NIOSHhomogenizator kuleczkowyliza szklanymi kuleczkamiamplifikacja regionu ITSidentyfikacja gatunk w grzyb wmolekularne wykrywanie grzyb wanaliza grzyb w w powietrzu

Powiązane artykuły