Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

DOI:

10.3791/56742

⸱

12 stycznia 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transpozon Śpiącej Królewny (SB) to niewirusowy system integrujący o udowodnionej skuteczności w transferze genów i genomice funkcjonalnej. Aby zoptymalizować maszynerię transpozonów SB, stosuje się transpozynę hiperaktywną regulowaną transkrypcją (SB100X) i transpozon oparty na T2. Zazwyczaj transpozaza i transpozon są dostarczane przejściowo przez transfekcję plazmidu, a ekspresja SB100X jest napędzana przez konstytutywny promotor. Tutaj opisujemy skuteczną metodę dostarczania składników SB do komórek ludzkich, które są odporne na kilka metod transfekcji fizycznej i chemicznej, w celu kontrolowania ekspresji SB100X i stabilnej integracji genu zainteresowania (GOI) poprzez mechanizm SB "wytnij i wklej". Ekspresja transpozazy nadaktywnej jest ściśle kontrolowana przez system Tet-ON, szeroko stosowany do kontroli ekspresji genów od 1992 roku. Interesujący gen jest otoczony odwróconymi powtórzeniami (IR) transpozonu T2. Oba składniki SB są upakowane w wadliwe wektory lentiwirusowe przejściowo wytwarzane w komórkach HEK293T. Komórki ludzkie, zarówno linie komórkowe, jak i pierwotne komórki z tkanki ludzkiej, są in vitro przejściowo transdukowane wektorami wirusowymi. Po dodaniu doksycykliny (analogu dox, tetracykliny) do pożywki hodowlanej, mierzy się precyzyjne dostrojenie ekspresji transpozazy, co skutkuje długotrwałą integracją genu będącego przedmiotem zainteresowania w genomie leczonych komórek. Metoda ta jest skuteczna i ma zastosowanie do linii komórkowej (np. komórek HeLa) i komórek pierwotnych (np. ludzkich keratynocytów pierwotnych), a zatem stanowi cenne narzędzie do inżynierii genetycznej i terapeutycznego transferu genów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiperaktywna transpozaza SB100X sprzężona z transpozonem opartym na T2 została już wykorzystana w przedklinicznych zastosowaniach terapii genowej1,2,3, modyfikacje genomu4,5, oraz przeprogramowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)6,7. Zazwyczaj składniki SB są przejściowo dostarczane przez transfekcję plazmidu, a silny promotor konstytutywny napędza ekspresję transpozazy. Jednak pomimo ulepszonych nowych metod transfekcji, dostarczenie systemu dwuskładnikowego pozostaje wyzwaniem dla wielu zastosowań. W związku z tym opracowanie nowego protokołu dostawy cieszy się coraz większym zainteresowaniem. Oprócz metod transfekcji dla plazmidu8 i mRNA9, dostarczanie wirusa oparte na adenoviral10,11, adenowirus związany (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 i wektory lentiwirusowe15 proponowano to w przeszłości. Warto zauważyć, że wybrany system musi gwarantować przejściowe dostarczanie składników SB bez integracji wektora wirusowego. Niemniej jednak konstytutywna ekspresja transpozazy budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa ze względu na ryzyko niekontrolowanego ponownego skakania transpozonu.

Dlatego pierwszym wyzwaniem jest regulacja transkrypcji SB100X za pomocą wyrafinowanego systemu Tet-ON. Zmodyfikowany promotor reagujący na Tet, uzyskany przez zastąpienie pierwotnie opracowanego minimalnego promotora wirusa cytomegalii (CMV) minimalnym promotorem (-81) genu kinazy bojaźliwej (TK) wirusa opryszczki pospolitej-1 (HSV-1)16, jest klonowany przed cDNA SB100X (pTetOTKSB100X). Zmutowany transaktywator odwróconej tetracykliny rtTA2s-M217 ulega ekspresji pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego (promotora fosfoglicerynianu, PGK) sklonowanego w innym plazmidzie (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Po dodaniu do pożywki hodowlanej, dox wiąże modulator rtTA2 s-M2 i wiąże kompleks promotora Tet lub, co skutkuje ściśle regulowaną indukcją SB100X expression18.

Drugim dużym wyzwaniem jest nieefektywna transfekcja ludzkich komórek pierwotnych za pomocą kilku metod fizycznych i chemicznych. Aby skutecznie dostarczać transpozazę do komórek ludzkich odpornych na transfekcję, kasety ekspresyjne SB100X i rtTA2s-M2 są pakowane w dwa wadliwe wektory lentiwirusowe (IDLVs)19: IDLVTKSB i IDLVrtTA2s-M2. Wektory wirusowe są przejściowo wytwarzane jako wektory trzeciej generacji w komórkach HEK293T20 i pseudotypowane glikoproteiną G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G), która nadaje szerokie spektrum infekcji. Cząstki wektorowe są zagęszczane przez ultrawirowanie i miareczkowane przez immunowychwytywanie HIV-1 Gag p24. Aby przetworzyć linie komórkowe i komórki pierwotne, cząstki wektorowe są skompleksowane z polibrenem i są inkubowane z komórkami docelowymi w obecności lub bez dox. Zależną od leku aktywację ekspresji SB100X w transdukowanych komórkach mierzy się za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR)18.

Po zademonstrowaniu regulowanej przez Tet ekspresji SB100X, transpozycja GOI (np. białka zielonej fluorescencji, GFP) do genomu komórki docelowej następuje zgodnie ze zdarzeniami molekularnymi wyraźnie opisanymi przez Baka i Mikkelsena21. Trzeci wektor IDLV zawierający kasetę ekspresyjną dla rządu Indii sklonowaną między transpozonami T2 IR (IDLVT2) musi zostać skonstruowany i zapakowany w sposób opisany powyżej. Wreszcie, trzy wektory IDLV mogą być wykorzystane do efektywnej transdukcji komórek ludzkich (np. pierwotnych keratynocytów) in vitro i integracji GOI w obecności doksycykliny18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wykorzystane plazmidy

UWAGA: Plazmid pCCL-PGKrtTA2 S-M2 został dzięki uprzejmości Prof. Zappavigna (Uniwersytet w Modenie i Reggio Emilia, Modena, Włochy). Plazmid pCMVSB100X przenoszący sekwencję kodującą transpozazę nadpobudliwą i plazmid transpozonu pT2/BH został udostępniony dzięki uprzejmości prof. Z. Ivicsa (Instytut Paula Ehrlicha, Langen, Niemcy) i prof. Z. Izvaka (Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrucka, Berlin, Niemcy).

  1. W przypadku wszystkich przypadków klonowania Escherichia coli (E. coli) należy postępować zgodnie z wybraną strategią klonowania i procedurą enzymu restrykcyjnego lub amplifikacją PCR fragmentu, który ma zostać sklonowany.
    UWAGA: Tabela 1 podsumowuje wszystkie plazmidy użyte w tym protokole. Podano opis i referencje dla każdego plazmidu.

2. Produkcja wektorów wirusowych

UWAGA: Wszystkie wektory wirusowe są produkowane w kapturze chroniącym przed zagrożeniem biologicznym na poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL2, zgodnie z zasadami i przepisami instytucjonalnymi.

  1. Komórki HEK293T przylegające do hodowli w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium firmy Dulbecco uzupełnione 10% surowicą HyClone, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM glutaminy.
  2. Dzień 0: Przygotuj pięć 15 cm płytek/preparatu wirusowego i wysiew 5,5x106 komórek w 30 ml pożywki.
  3. Dzień 1: Transfekcja
    1. Przed rozpoczęciem transfekcji należy przygotować 100 ml 2x bufor soli fizjologicznej HEPES (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 ml
      HEPESY (1 M) 10,0 ml
      Na2HPO4 (0,5 m) 0,3 ml
      Sterylna woda 84,1 ml
      Dostosuj do pH 7,1 z 37% HCl.
      UWAGA: 2x HBS można przechowywać w temperaturze 4 °C. Dokładne pH jest niezwykle ważne dla skutecznej transfekcji. Optymalny zakres pH to 7,10 do 7,12.
    2. Usuń pożywkę i dodaj 22,5 ml / płytkę świeżej pożywki 4 godziny przed transfekcją.
    3. Transfekcję komórek HEK293T z plazmidem transferowym, plazmidem pakującym pMD.Lg/pRRE.D64VInt, plazmidem kodującym otoczkę pMD2.G i pRSV-Rev (Tabela 1) zgodnie z następującą ilością / płytką:
      Plazmid transferowy 25,00 μg
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16,25 μg
      pMD2.G 8,75 μg
      pRSV-Rev 6,25 μg
      UWAGA: DNA plazmidu jest przygotowywane zgodnie z protokołem CsCl opisanym przez Maniatis22 lub przy użyciu zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn.
      1. Zawiesić ponownie 56,25 μg DNA (mieszanina 4 plazmidów) w 1,125 ml sterylnej wody i dodać 125 μl 2,5 M CaCl2 (roztwór A).
      2. Dodaj 1,250 ml 2x HBS do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (roztwór B).
      3. Dodawać kroplami roztwór A (1,250 ml) do B (1,250 ml), bulgocząc pipetą o pojemności 1 lub 2 ml (roztwór do transfekcji, całkowita objętość 2,500 ml).
      4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      5. Za pomocą mikropipety P1000 rozprowadź kroplami cały roztwór do transfekcji (2.500 ml) na monowarstwę komórki.
    4. Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Dzień 2: Usuń pożywkę i dodaj 15 ml świeżej pożywki (patrz krok 2.1).
  5. Dzień 3: Zebrać i zagęścić supernatant zawierający cząstki lentiwirusa.
    1. Zebrać supernatant (~70 ml) ze wszystkich (n = 5) transfekowanych płytek komórkowych, przefiltrować przez filtr PESS 0,45 μm i napełnić 2 probówki polialomerowe (1 cal x 3,5 cala) / preparat wirusowy.
    2. Zagęścić cząstki wektorowe przez ultrawirowanie przy 106 000 x g przez 2,5 godziny, w temperaturze 15 °C z hamulcem.
    3. Natychmiast po zatrzymaniu ultrawirowania (aby uniknąć ponownego zawieszenia osadu w probówce), delikatnie wlej supernatant do pojemnika zawierającego 10% wybielacza i zawieś 2 ledwo widoczne granulki w 100 μL 1x PBS (+1% BSA). Jest to normalne, ponieważ granulka jest przezroczysta i bardzo mała. Użyć świeżo przygotowanego koncentratu wektora lub podwielokrotności i przechowywać preparaty wirusowe w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Supernatant zawiera cząsteczki lentiwirusa, które MUSZĄ być dokładnie wybielone przed wyrzuceniem do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne.
  6. Do miareczkowania preparatu wektora wirusowego należy użyć zestawu do wychwytywania immunologicznego HIV-1 Gag p24 zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Aby ustandaryzować produkcję wektorów wirusowych, można zastosować odczynniki na bazie liposomów. Niemniej jednak miano wektora wirusowego jest w dużym stopniu zależne od skuteczności transfekcji i czystości plazmidowego DNA.

3. Transdukcja ludzkich linii komórkowych (np. komórek HeLa)

UWAGA: Komórki HeLa są hodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle's firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 100 U/ml penicyliny-streptomycyny i 2 mM glutaminy. Tabela 1 podsumowuje wszystkie wektory użyte w tym protokole. Dostępny jest opis każdego wektora. Transdukcja komórek HeLa pozwala na weryfikację regulacji transkrypcji transpozazy SB w najlepszej kombinacji dawek dwóch wektorów IDLV. Zmienność dawek IDLV może być związana z miareczkowaniem cząstek wektora i typem komórki docelowej.

  1. Dzień 0: Wysiewaj 2x105 komórek w 3 ml pożywki na każdą studzienkę 6-dołkowej płytki. Przygotuj 4 dołki.
  2. Dzień 1: Transdukcja komórek HeLa.
    1. Dla każdego warunku rozcieńczyć wektory lentiwirusowe do końcowej objętości 1 ml pożywki (patrz uwaga powyżej) w obecności 10 μl polibrenu (końcowe stężenie 8 μg/ml):
      Rozcieńczenie dla studzienki #1: pozorowane transdukowane komórki (kontrola ujemna).
      Rozcieńczenie dla studni #2: wektor IDLVTKSB (2,600 ng z p24).
      Rozcieńczenie dla studzienek #3, #4: wektor IDLVTKSB (2,600 ng p24) + wektor IDLVrtTA2s-M2 (9,600 ng p24).
    2. Usunąć pożywkę z każdej studzienki, w której posiano komórki HeLa w dniu 0 i dodać rozcieńczenia wektorów lentiwirusowych do odpowiedniego dołka.
    3. Spinokulować 6-dołkową płytkę w temperaturze 754 x g przez 45 minut w temperaturze 20-25 °C, a następnie przenieść 6-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Po 6 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wektory świeżą pożywką we wszystkich studzienkach i dodaj doksycyklinę do 1 μM w studzience #4. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 48 godzin.
  3. Dzień 3: Przygotowanie osadu komórkowego do ekstrakcji RNA.
    1. Przed odłączeniem komórek przygotuj roztwór roboczy trypsyny (1x):
      2,5% Trypsyna (10x) 5,0 ml
      500 mM EDTA (stężenie końcowe = 5 mM) 0,5 ml
      1x PBS 44,5 ml
    2. Przed użyciem rozgrzać roztwór roboczy trypsyny w temperaturze 37 °C. Roztwór roboczy trypsyny przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń pożywkę i umyj komórki 1x PBS. Dodać 0,5 ml wstępnie ogrzanego roztworu roboczego trypsyny o temperaturze 37 °C do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut (w inkubatorze do hodowli komórkowych).
    4. Po inkubacji dodaj 0,5 ml pożywki zawierającej surowicę do każdej studzienki, aby dezaktywować trypsynę i zebrać komórki w probówce wirówkowej. Przepłukać każdą studzienkę raz 3 ml 1x PBS i odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 240 x g.
    5. Przemyć komórki 5 ml 1x PBS, odwirować przez 5 minut przy 240 x g i odrzucić supernatant. Użyj świeżo zebranych granulek komórkowych lub przechowuj w temperaturze -80 °C. Ekstrahuj całkowite RNA z osadów, aby przeprowadzić półilościowy RT-PCR (patrz krok 6).

4. Transdukcja ludzkich komórek pierwotnych (np. keratynocytów)

UWAGA: Ludzkie pierwotne keratynocyty są zasiewane na śmiertelnie napromieniowanych komórkach 3T3-J2 (warstwa zasilająca)23, miły prezent od Yana Barrandona (EPFL, Lozanna, Szwajcaria).

  1. Hoduj komórki 3T3-J2 myszy szwajcarskiej w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% surowicą bydlęcą dawcy, 50 U/ml penicyliny-streptomycyny i 4 mM glutaminy (pożywka 3T3).
  2. Hoduj keratynocyty posiane na śmiertelnie napromieniowanych komórkach 3T3-J2 w pożywce cFAD, zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle i mieszaninie pożywki F12 Hama (3:1) zawierającej płodową surowicę bydlęcą (10%), penicylinę-streptomycynę (1%), glutaminę (2%), insulinę (5 μg / ml), adeninę (0,18 mM), hydrokortyzon (0,4 μg / ml), toksynę (0,1 nM) i trójjodotyroninę (2 nM).
  3. Dzień 0: Wysiew 3x105 śmiertelnie napromieniowanych komórek 3T3-J2, uprzednio rozcieńczonych w pożywce 3T3 do końcowego stężenia 1X105 komórek/ml, w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Przygotuj 9 dołków.
  4. Dzień 1: Transdukcja keratynocytów pierwotnych
    UWAGA: Transdukcja keratynocytów umożliwia ilościowe określenie regulacji transkrypcji transpozazy SB w najlepszej kombinacji dawek dwóch wektorów IDLV (za pomocą qRT-PCR) oraz weryfikację integracji GOI (GFP) w komórkach docelowych (za pomocą analizy cytofluorymetrycznej).
    1. Przed odłączeniem komórek przygotuj roztwór roboczy trypsyny:
      0,5% Trypsyna-EDTA (10x) 5,0 ml
      500 mM EDTA (stężenie końcowe = 5 mM) 0,5 ml
      1x PBS 44,5 ml
    2. Przed użyciem rozgrzać roztwór roboczy trypsyny w temperaturze 37 °C. Roztwór roboczy trypsyny przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Aby odłączyć subkonfluentne keratynocyty w hodowli, usuń pożywkę, umyj komórki 1x PBS i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu roboczego trypsyny do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    4. Po inkubacji należy dokładnie zawiesić komórki studzienki i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej zawierającej 2 ml pożywki zawierającej surowicę (jeżeli wiele komórek jest nadal przyłączonych, inkubować przez dodatkową minutę w temperaturze 37 °C). Przepłukać każdą studzienkę raz 3 ml 1x PBS lub świeżej pożywki i dodać roztwór płuczący do probówki wirówkowej z zawiesiną komórek.
    5. Wirować przez 5 minut przy 580 x g i odrzucić supernatant.
    6. Przemyć komórki 5 ml 1x PBS, odwirować przez 5 minut przy 580 x g i odrzucić supernatant.
    7. W probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml rozcieńczyć 1,6x105 keratynocytów w 1 ml pożywki cFAD, po jednym rozcieńczeniu na każdy stan.
    8. Rozcieńczyć wektory lentiwirusowe w 1 ml pożywki cFAD w obecności 20 μl polibrenu (końcowe stężenie 8 μg/ml przy końcowej objętości 2 ml):
      Rozcieńczenia dla studzienek #1, #2, #3: pozorowane transdukowane komórki (kontrola ujemna bez wektorów).
      Rozcieńczenia dla studni #4, #5: wektor IDLVTKSB (13 000 ng p24) + wektor IDLVrtTA2 s-M2 (48 000 ng p24).
      Rozcieńczenia dla studni #6, #7, #8, #9: wektor IDLVTKSB (13 000 ng p24) + wektor IDLVrtTA2 s-M2 (48 000 ng p24) + wektor IDLVT2 (9 160 ng p24).
    9. Transdukcję komórek w zawiesinie przez dodanie każdego rozcieńczenia wektora lentiwirusowego (1 ml) do odpowiedniej zawiesiny keratynocytów (1,6x105 keratynocytów w 1 ml).
    10. Usunąć pożywkę ze śmiertelnie napromieniowanych komórek 3T3-J2 wysianych w dniu 0 i umieścić na nich transdukowane keratynocyty (1,6x105 keratynocytów w 2 ml). Po przeprowadzeniu studni przejdź do następnej.
    11. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 30 minut, a następnie przenieść komórki do temperatury 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 6 godzin
      UWAGA: Nie należy spinokulować pierwotnych keratynocytów, ponieważ będzie to miało duży wpływ na żywotność i proliferację.
    12. Po 6 godzinach dodać 1 ml pożywki cFAD do każdej studzienki. Dodaj 1 μM doksycyklinę (stężenie końcowe) do studzienek #5, #8 i #9. Przywrócić ogniwa do temperatury 37 °C.
  5. Dzień 2: Zastąp pożywkę cFAD 3 ml pożywki KC 10 ng/ml EGF.
  6. Dzień 3: Trypsynizuj i umyj komórki z dołków #1, #4 i #5, jak opisano wcześniej (patrz 4.4.1 do 4.4.6). Zamrażać granulki komórkowe w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji całkowitego RNA do analizy qRT-PCR (patrz krok 7).
  7. Trypsynizować komórki z dołka #2, #6 i #8 zgodnie z opisem w krokach 4.4.1 do 4.4.5 i przeprowadzić analizę cytofluorymetryczną pod kątem ekspresji GFP (patrz krok 5).
  8. Utrzymuj kulturę z dołków #3, #7 i #9 przez co najmniej 3-4 podwojenia, wystarczające do rozcieńczenia niezintegrowanego wektora IDLVT2 (5 dni dla ludzkich pierwotnych keratynocytów posianych na warstwie zasilającej).
  9. Dzień 6: Około 5 dni po transdukcji trypsynizuj komórki (patrz kroki 4.4.1 do 4.4.5) z dołków #3, #7 i #9, aby przeprowadzić analizę cytofluorymetryczną pod kątem ekspresji GFP (patrz krok 5).
    UWAGA: Czas eksperymentu i wydajność transdukcji są w dużym stopniu uzależnione od typu komórki pierwotnej i zmienności pobranych próbek.

5. Analiza cytofluorymetryczna transdukowanych pierwotnych keratynocytów

UWAGA: Zastosowano cytometr przepływowy skonfigurowany z niebieskim laserem (488 nm), czerwonym laserem (633 nm) i filtrami do wykrywania fluorescencji GFP i APC (patrz Tabela materiałów).

  1. Aby odróżnić keratynocyty od warstwy zasilającej 3T3-J2, znakuj transdukowane keratynocyty oderwane w dniu 3 i dniu 6 (patrz kroki 4.7 i 4.9) mysim monoklonalnym przeciwciałem anty-feederowym sprzężonym z APC.
    1. Przygotować 4 ml buforu barwiącego dla każdej próbki:
      5% FBS 200 μL
      500 mM EDTA (stężenie końcowe = 2,5 mM) 20 μL
      PBS 1x 3780 μL
    2. Oderwane komórki przemyć 1 ml buforu barwiącego. Wirować przez 5 minut przy 580 x g i odrzucić supernatant.
    3. W probówce do akwizycji cytometrii przepływowej ponownie zawiesić5x10 4 komórki w 100 μl buforu barwiącego i dodać 2 μl przeciwciała Anti-Feeder (1:50). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut na lodzie w ciemności.
    4. Po 30 minutach przemyć 2 ml buforu barwiącyego. Wirować przez 5 minut przy 580 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić ponownie w 200 μl buforu barwiącego.
    5. Pozyskiwanie sygnałów APC i GFP za pomocą analizy cytofluorymetrycznej18. Frakcja komórek GFP+ w populacji komórek APC- wskazuje na transdukowane keratynocyty.
      UWAGA: W razie potrzeby utrwalić wybarwioną próbkę przed cytometrią przepływową za pomocą 2% paraformaldehydu w PBS 1x i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu przebiegu.
  2. Przeanalizuj dane cytometrii przepływowej, wykreślając stosunek między procentem komórek GFP+ w punkcie końcowym (5 dni) a odsetkiem komórek GFP+ 2 dni po transdukcji, znormalizowanym do poziomu resztkowego komórek transdukowanych IDLVT2.

6. Półilościowy RT-PCR

UWAGA: Użyj termocyklera PCR.

  1. Ekstrahować całkowite RNA z komórek transdukowanych lub kontrolnych za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Całkowite RNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C.
  2. Zsyntetyzuj cDNA w reakcji 20 μl przy użyciu 100 ng całkowitego RNA i zestawu do odwrotnej transkryptazy, zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  3. Zaprojektuj startery specyficzne dla SB100X, rtTA2s-M2 i GAPDH (gen porządkowy).
    Sugerowane wzory:
    Podkład do przodu SB: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    Podkład odwrócony SB: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    Starter do przodu rtTAM2: 5'-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    Starter odwrotny rtTAM2: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    Podkład do przodu GAPDH: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    Podkład odwrotny GAPDH: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
  4. Przeprowadzić PCR w końcowej objętości reakcyjnej 50 μl. W szczególności należy umieścić w każdej probówce PCR następującą reakcję:
    cDNA (rozcieńczenie 1:5) (od kroku 6.2) 1,00 μL
    Podkład do przodu (zapas 10 μM) 1,00 μL
    Podkład odwrotny (zapas 10 μM) 1,00 μL
    dNTP (magazyn 10 μM) 1,00 μL
    Bufor (+ MgCl2) (10x podstawa) 5.00 μL
    Polimeraza Taq (zapas 5 U/μL) 0,25 μL
    Woda sterylna 40,75 μL
  5. Użyj następującego programu termocyklera: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie postępuj w 95 °C przez 30 s, 58 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s przez 34 cykle dla SB100X, 32 cykle dla rtTA2s-M2 i 25 cykli dla GAPDH.
  6. Przygotuj 1% żel agarozowy. Rozpuścić 1 g agarozy w 100 ml TBE 1x (10x bulion rozcieńczony w sterylnej wodzie), w zlewce lub kolbie. Rozpuść w kuchence mikrofalowej, mieszając co minutę, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Schłodzić stopioną agarozę do temperatury około 50 °C, a następnie dodać 5 μl bromku etydyny (10 mg/ml bulionu). Wlej stopioną agarozę do zmontowanej tacki na żel z grzebieniem do odlewania żelu.
  7. Załaduj próbki (po 10 μl każda) na żel agarozowy i wykonaj elektroforezę.
  8. W razie potrzeby należy pobrać obraz żelu i przeprowadzić analizę densytometryczną prążków PCR.

7. Ilościowy RT-PCR (qRT-PCR)

UWAGA: Stosowany jest komercyjny system wykrywania sekwencji. Startery PCR i sonda 6-karboksyfluoresceiny (FAM) do dehydrogenazy 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH) są kupowane w handlu.

  1. Aby uzyskać informacje na temat transkrypcji wstecznej, zobacz krok 6.2.
  2. Używanie oprogramowania do projektowania starterów i sond specyficznych dla SB100X.
    Sugerowany projekt:
    SB.2 podkład do przodu: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    Podkład odwrotny SB.2: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    sonda SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym na 96-dołkowych płytkach z mieszanką PCR Master Mix i mieszanką starterów + sondy, w końcowej objętości reakcji 25 μl. W szczególności należy wziąć pod uwagę następującą reakcję dla każdego dołka:
    cDNA (rozcieńczenie 1:10 w sterylnej wodzie) 1,00 μL
    2x Master Mix 12,50 μL
    Startery + 20x mieszanka sond 1,25 μL
    Sterylna woda 10,25 μL
    UWAGA: Wszystkie reakcje należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach. Aby zapobiec błędom w pipetowaniu, należy przygotować mieszaninę do co najmniej n+3 reakcji (bez cDNA). Porcjować za pomocą pipety wielokanałowej.
  4. Uruchom PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę i trzymaj w temperaturze 4 °C.
  5. Analizuj dane qRT-PCR, normalizując względną ekspresję (wartość RQ) SB100X do poziomu GAPDH tej samej próbki cDNA za pomocą kwantyfikacji 2-ΔΔ CT, przy użyciu typowego oprogramowania do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, trzy wektory IDLV przenoszące regulowane komponenty SB (SB100X, rtTA2S-M2 i transpozon T2-GFP) zostały spakowane i użyte do efektywnego dostarczania i ścisłej regulacji systemu SB w komórkach ludzkich. Rysunek 1A przedstawia schemat transdukcji in vitro komórek HeLa, który został przeprowadzony w celu oceny regulacji transkrypcji transpozazy SB przy użyciu najlepszej kombinacji dawek dwóch wektorów IDLV ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy szeroko dostępną metodologię stabilnej integracji GOI z genomem komórek docelowych poprzez transpozycję, w której pośredniczy Śpiąca Królewna. Chociaż system SB został opracowany w celu zapewnienia niewirusowej metody edycji genomu, konieczne jest efektywne dostarczanie maszynerii integracyjnej (transpozazy i transpozonu T2). W związku z tym, aby zastosować system SB na trudno przepuszczalnych komórkach pierwotnych, w ostatnich latach kontynuowano dostarczanie składników SB przez wirusa

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. Zappavignie, University of Modena i Reggio Emilia, Modena, Włochy za dostarczenie nam plazmidu pCCL-PGKrtTA2S-M2. Doceniamy również prof. Z. Ivicsa (Paul Ehlrich Institute, Langen, Niemcy) i prof. Z. Izvaka (Centrum Medycyny Molekularnej im. Maxa Delbrucka, Berlin, Niemcy) za plazmidy pCMVSB100X i pT2/BH. Prace te były wspierane przez DEBRA International oraz włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka z 4,5 g / l glukozy bez L-GlutaminyLonzaBE12-614FPożywka do hodowli komórkowych.
HyClone Płodowa surowica bydlęca (USA), scharakteryzowanaGE Healthcare Life SciencesSH30071.03Surowica stosowana HEK293T hodowli komórkowej do produkcji cząstek lentiwirusa.
Penicylina 10.000 UI/ml Streptomycyna 10.000 UI/mlLonzaDE17-602EOdczynniki do pożywki do hodowli komórkowych.
L-Glutamina 200mMLonzaBE17-605EOdczynnik do hodowli komórkowych.
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653Odczynnik do preparatu HBS 2X.
Bufor HEPES, 1M Zapas w soli fizjologicznejLonzaBE17-737EOdczynnik do przygotowania HBS 2X.
Wodorofosforan disodowy dwuwodny (Na2HPO4· 2H2O), 99.5%Merck106580Odczynnik do przygotowania HBS 2X.
Kwas solny - odczynnik ACS 37% (HCl)Sigma-Aldrich320331Odczynnik do preparatu HBS 2X.
Sterylna woda do wstrzykiwańFreseniusKabi-Odczynnikdo preparatu HBS 2X.
0,45 &mikro; m Filtr PESSWhatman10462100Filtry używane do usuwania resztek komórkowych z supernatantu wirusowego.
Poliallomer Rurki BeckmanCoulter326823Rurki do zagęszczania wektorów IDLV przez ultrawirowanie.
PBS-1X w/o Ca, MgLonzaBE17-516FBufor do przemywania komórek i resuspensji cząstek lentiwirusa.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153(opcjonalnie) Bufor do resuspensji cząstek lentiwirusa.
Zestaw do wychwytywania immunologicznego HIV-1 Gag p24Zestaw Perkin ElmerNEK50001KTdo miareczkowania cząstek IDLV.
PolybreneSigma-Aldrich107689Odczynnik zwiększający wydajność transdukcji.
Trypsyna (10X) 2,5% w HBSS bez Ca, MgGIBCOBE17-160EOdczynnik do oddzielania komórek HeLa (roztwór podstawowy, do rozcieńczenia).
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)100938BOdczynnik AnalaR BDHdo przygotowania roztworu roboczego trypsyny.
0,5% Trypsyna-EDTA, bez czerwieni fenolowej (10X)GIBCO15400-054Odczynnik do oddzielania keratynocytów (roztwór podstawowy, do rozcieńczenia).
Surowica bydlęca dawcy, pochodzenie z Nowej ZelandiiGIBCO16030-074Serum do hodowli komórek 3T3-J2 myszy szwajcarskiej (warstwa zasilająca).
Szynka" s F12 mediaGIBCO21765Pożywka dla keratynocytów.
Płodowa surowica bydlęcaLonzaDE14-801FSerum do pożywki do hodowli komórek HeLa.
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenie australijskieGIBCO10099-141Surowica do hodowli ludzkich pierwotnych keratynocytów.
Insulina z trzustki bydlęcejSigma-AldrichI5500Odczynniki do wzrostu keratynocytów.
AdeninaVWR1152-25Odczynniki do wzrostu keratynocytów.
HydrokortyzonVWR3867-1Odczynniki do wzrostu keratynocytów.
Toksyna z Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Odczynniki do wzrostu keratynocytów.
TrijodotyroninaSigma-AldrichT5516Odczynniki do wzrostu keratynocytów.
Ludzkie odczynniki EGFAustral BiologicalGF-010-9do wzrostu keratynocytów.
Mysie monoklonalne przeciwciało anty-feederowe sprzężone z APCMiltenyi Biotech130-096-099Do oznaczania warstwy podajnika.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Zestaw do oczyszczania RNA.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051Zestaw do odwrotnej transkryptazy.
Mieszanina deoksynukleotydów, 10 mM (dNTP)Sigma-AldrichD7295Odczynnik do półilościowego PCR.
Ultraczysty odczynnik do wody destylowanej bez DNaz / RNaz(dowolny)do półilościowego PCR i do qRT-PCR.
GoTaq G2 Gorący start PolimerazaPromegaM740BPolimeraza Taq.
Agaroza, do biologii molekularnejSigma-AldrichA9539Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym.
UltraPure TBE Buffer, 10XInvitrogen15581028Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym, do rozcieńczenia (1X) w ddH2O.
Bromek etydynySigma-AldrichE1510Odczynnik do elektroforezy w żelu agarozowym.
DoksycyklinaSigma-AldrichD-9891lek do indukowania ekspresji transpozazy w komórkach HeLa i keratynocytach
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix wraz ze starterami i sondą.
Probówka wirówkowa z polipropylenu o wysokiej przejrzystości 15 ml, stożkowe dno, z nakrętką z uszczelką kopułkową, sterylne352096 Falcon Corningdo zbierania komórek i przygotowania rozcieńczania wektorów.
Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm poddane działaniu TC z siatką 20 mm, sterylnedo hodowli komórkowych Falcon Corning353025do produkcji wirusów.
6 Dobrze przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem poddawana działaniu TC, z pokrywką, indywidualnie pakowana, sterylnado hodowli komórkowej Falcon Corning353046do transdukcji HeLa i ludzkich pierwotnych keratynocytów.
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, pojemność 1,5 mlEppendorf0030 120.086Probówki do przygotowania rozcieńczalnika.
Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, pojemność 2 mlEppendorf0030 120.094Probówki do przygotowania rozcieńczalnika.
Probówki PCR o pojemności 0,2 ml z płaskimi nakrętkami, probówkami wolnymi od RNazy, DNazy, DNA i inhibitorów PCRdowolnymi)do półilościowego PCR.
MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym, 0,1 mlApplied Biosystem434690696-dołkowa do qRT-PCR.
5 ml rurka polistyrenowa z okrągłym dnem, bez nasadkiProbówki BD Falcon352052do akwizycji cytometrii przepływowej.
Jednorazowe pipety serologiczne, polistyrenowe, pakowane pojedynczo, sterylne (różne objętości)(dowolne)-pipety do sterylnych zastosowań w hodowli tkanek.
Końcówki filtrujące, sterylne i wolne od RNaz, DNaz, DNA i pirogenów (różne objętości)(dowolne)-Końcówki filtrujące do zastosowań w sterylnych tkankach i biologii molekularnej.
pH-metr(dowolny)-Sprzęt do pomiaru pH HBS 2X.
PCR Termocykler(dowolny)-Sprzęt do półilościowego PCR.
Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym(dowolny)-Sprzęt do elektroforezy w żelu agarozowym półilościowego PCR.
Cytometr przepływowyBD FACS Canto II 2LSR 4/2BD.
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymZastosowany Biosystem7900HTSprzęt do qRT-PCR.
Wirówki stołowe do wydajnego przetwarzania próbek w hodowlach komórkowych, chłodzone, z wiadrami na mikropłytki.(dowolna)-Wirówka do przetwarzania kultur komórkowych i spinokulacji.
Ultrawirówka Optima L-90K wyposażona w wirnik SW32TIBeckman Coulter-Ultrawirówkado produkcji cząstek lentiwirusowych.
Sprzęt do laboratorium hodowli komórkowych i biologii molekularnej (np. okap laminarny klasy II przeznaczony do pracy z materiałami BSL2, inkubator kultur komórkowych, lodówki i zamrażarki (+4 & C, -20 &stopnie; C, -80 ° C), mikropipety i pomoce do pipetowania).
Ochronne fartuchy laboratoryjne, rękawice, środki ochrony twarzy zgodnie z regulaminem Instytutu, w szczególności w zakresie wytwarzania i transdukcji cząstek lentiwirusa.
przez probówki naczynie płytka (

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sleeping Beauty SystemTranscriptional RegulationIntegration Defective Lentiviral VectorGene Of InterestHyperactive TransposaseTet ON SystemPrimary KeratinocytesFlow CytometryReal Time PCRDoxycycline Induction

Powiązane artykuły