Artykuł metodologiczny

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56745

⸱

29 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Tumor Immunology, Radboud University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Streszczenie

Rozpuszczalne białka infuzyjne wrażliwe na N-etylomaleimid (NSF) są kluczowe dla transportu błonowego, ponieważ katalizują fuzję błon w komórkach eukariotycznych. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 różnych członków. Określone wewnątrzkomórkowe drogi transportowe są katalizowane przez określone zestawy 3 lub 4 białek SNARE, które w ten sposób przyczyniają się do specyficzności i wierności transportu błonowego. Jednak badanie dokładnej funkcji białek SNARE jest technicznie trudne, ponieważ SNARE są bardzo obfite i funkcjonalnie redundantne, przy czym większość SNARE ma wiele i nakładające się na siebie funkcje. W protokole tym opisano nową metodę wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na ekspresji białek SNARE C-końcowych połączonych z białkami fluorescencyjnymi i pomiarze ich interakcji za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM). Poprzez dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do wieloskładnikowego modelu rozpadu, FRET-FLIM umożliwia (pół)ilościowe oszacowanie frakcji tworzenia kompleksu SNARE w różnych pęcherzykach. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE na błonie plazmatycznej i w endosomalnych przedziałach w liniach komórkowych ssaków i pierwotnych komórkach odpornościowych, i może być łatwo rozszerzony do badania funkcji SNARE w innych organellach w komórkach zwierzęcych, roślinnych i grzybowych.

Wprowadzenie

Transportowanie błonowe jest główną cechą komórek eukariotycznych, gdzie pęcherzyki błonowe wyrastają z organelli dawcy, a następnie przemieszczają się do organelli docelowej i łączą się z nią1,2. Z wyjątkiem mitochondriów, wszystkie te etapy fuzji błonowej są katalizowane przez członków rodziny białek SNARE1,2. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 członków w komórkach ssaków i około 20 członków w drożdżach2. Białka SNARE zawierają jeden lub dwa ~52 reszty, natywnie nieustrukturyzowane regiony, zwane motywami SNARE. Białka SNARE są często przywiązane do błon przez transbłonową helisę C-końcową1,2. SNARE można podzielić na kategorie na podstawie centralnych reszt, które wnoszą do kompleksu SNARE, na argininę (R) i glutaminę (Q) SNAREs1,2. Fuzja błonowa jest napędzana przez interakcję 3 lub 4 pokrewnych SNARE, które razem tworzą 4 motywy SNARE i są rozprowadzane zarówno na błonie donorowej, jak i akceptorowej1,2. Kompleks SNARE składa się z jednego motywu R-SNARE i trzech motywów Q-SNARE (określanych jako Qa, Qb i Qc). Tworzenie kompleksu rozpoczyna się na N-końcach motywów SNARE, tworząc tak zwany kompleks trans-SNARE, i postępuje w kierunku C-końców, tworząc ciasną α-spiralną wiązkę zwiniętą cewki zwaną kompleksem cis-SNARE. Złożone tworzenie nawet pojedynczego kompleksu SNARE ciągnie do siebie błony donorową i akceptorową i pokonuje barierę energetyczną dla fuzji membranowej3.

Przypisywanie odrębnych kompleksów SNARE do konkretnych tras transportowych w komórkach jest często technicznie trudne. Chociaż SNARE wyraźnie przyczyniają się do specyfiki transportu błonowego, są one rozwiązłe, funkcjonalnie nadmiarowe, a ich funkcje nakładają się na siebie1,2. Z tego powodu eksperymenty perturbacyjne ukierunkowane na SNARE, takie jak nokaut genów, interferencja RNA, wprowadzenie przeciwciał blokujących lub rozpuszczalne fragmenty SNARE działające jako dominujące wartości ujemne, często nie prowadzą do uzyskania czystych fenotypów, ponieważ inne SNARE kompensują2,4. Co więcej, trudno jest odróżnić konkretne etapy fuzji membranowej od zdarzeń związanych z transportem poprzedzającym, ponieważ SNARE mogą być zaangażowane w wiele tras transportowych2. Badania lokalizacyjne SNARE za pomocą metod mikroskopowych, wykorzystujących znakowanie immunologiczne lub fuzję genetyczną z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, cierpią na problemy, które: (i) SNARE lokalizują się w wielu organellach, ponieważ często pośredniczą w wielu etapach transportu, oraz (ii) ich lokalizacje nie oznaczają automatycznie, że są funkcjonalnie zaangażowane w tworzenie kompleksu SNARE. Wreszcie, kompleksy SNARE można zidentyfikować za pomocą eksperymentów immunoprecypitacyjnych z użyciem jednego z SNARE jako przynęty, a innych SNARE jako celów, ale nie pozwala to na przypisanie tych kompleksów do określonych organelli lub szlaków transportowych. W związku z tym obecnie nie ma alternatywnej techniki wizualizacji kompleksów SNARE z rozdzielczością organellarną. Immunofluorescencja nie jest w stanie udowodnić interakcji SNARE, ale może wykazać tylko obecność lub brak kolokalizacji, podczas gdy immunoprecypitacja może tylko wykazać interakcje SNARE w całej populacji komórek, ale nie przypisać organelli, w których te interakcje występują.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, Verboogen et al. opracowali niedawno nowatorską metodę pozwalającą na ilościową wizualizację kompleksów SNARE w żywych komórkach z rozdzielczością organellar.5 Ta metoda opiera się na ekspresji par SNARE z widmowo przesuniętymi białkami fluorescencyjnymi połączonymi C-końcowymi z ich transbłonowymi helisami. Po zakończeniu fuzji błonowej i utworzeniu kompleksu cis-SNARE, te fluorofory na C-końcach helis transbłonowych są natychmiast zestawiane ze sobą. Fluorofory znajdują się wtedy w odległości Förstera (zwykle <5 nm), co skutkuje FRET od fluoroforu donorowego przesuniętego na zielono do fluoroforu akceptora przesuniętego ku czerwieni klasy akceptora 5,< klasa sup = "xref">6. FRET powoduje wygaszanie fluoroforu donorowego i zwiększoną emisję fluoroforu akceptorowego, którą można zmierzyć na podstawie stosunków emisji donora i akceptora (ratiometryczny FRET). Jednak ratiometryczny FRET między dwiema różnymi cząsteczkami jest trudny ze względu na przesłuch fluorescencyjny i różne poziomy SNARE donorowych i akceptorowych w różnych organellach i między komórkami7,8. FRET można również zmierzyć na podstawie czasu życia fluorescencji, który jest czasem między wzbudzeniem a emisją fotonu. Jeśli fluorofor dawcy może uwolnić swoją energię przez FRET, ten konkurencyjny proces powoduje pozorne skrócenie czasu życia fluorescencji. Można to zmierzyć za pomocą FLIM7,8. Żywotność FRET jest znacznie bardziej wytrzymała niż ratiometryczna FRET do pomiaru interakcji między dwiema różnymi cząsteczkami, ponieważ czas trwania fluorescencji jest wewnętrzną właściwością fluoroforu i jest niewrażliwy na jego stężenie. Co więcej, FRET jest w przybliżeniu ilościowy, ponieważ wydajność FRET jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (zasadniczo funkcja krokowa). W związku z tym, dopasowując histogramy czasu życia fluorescencji zarejestrowane przez FLIM do modelu rozpadu dwuskładnikowego, FRET-FLIM pozwala na (pół)ilościowe oszacowanie frakcji cząsteczek SNARE zaangażowanych w tworzenie kompleksu SNARE5.

Ostatnio ta metoda FRET-FLIM została użyta przez Verboogen et al. do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w pierwotnych komórkach dendrytycznych układu odpornościowego5. Wykazano, że po napotkaniu bodźca patogennego komórki dendrytyczne przekierowują transport błonowy, czemu towarzyszy zwiększone kompleksowanie białka błonowego związanego z pęcherzykami R-SNARE (VAMP) 3 ze składtaksyną Qa-SNARE 4 specyficznie na błonie plazmatycznej. To zwiększone tworzenie kompleksu SNARE jest prawdopodobnie wymagane, aby sprostać zwiększonej zdolności wydzielniczej do wydzielania cytokin zapalnych, takich jak interleukina-65. Protokół ten opisuje etapy eksperymentalne potrzebne do pozyskania danych FRET-FLIM do wizualizacji i (pół)ilościowego pomiaru kompleksów SNARE. Wyjaśniono, w jaki sposób dopasować histogramy czasu życia fluorescencji całej komórki do funkcji rozpadu mono- i dwuwykładniczego, co skutkuje pozornym czasem życia fluorescencji jako ilościowym oszacowaniem oddziaływań SNARE. W tym protokole jako przykład użyto szeroko stosowanej linii komórkowej HeLa, ale metodę można łatwo rozszerzyć o badanie kompleksów SNARE w innych komórkach eukariotycznych.

Protokół

1. Przygotowanie próbek do badania mikroskopowego

  1. Ekspresja Qa-SNARE syntaksyny 4 połączonej z mCitrine (syntaksyna 4-mCitrine; fluorofor donora) oraz R-SNARE VAMP3 połączonej z mCherry (VAMP3-mCherry)
    UWAGA: Można również stosować inne białka SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast pary mCitrine-mCherry można zastosować inne pary donor-akceptor fluoroforów rozdzielonych spektralnie (np. CFP-YFP).
    1. Hodować komórki HeLa i podzielić 90 0 komórek HeLa na trzy szalki z szklanym dnem o średnicy 35 mm, odpowiednie do mikroskopii.
      UWAGA: W zasadzie protokół ten można dostosować do innych typów komórek eukariotycznych i szalek do mikroskopii.
      1. Kultury komórek HeLa utrzymywać w kolbach T75 z 10 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% antybiotyku-antymykotyku (zawierającego amfoterycynę B, penicylinę i streptomycynę) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.
      2. Uzupełniać pożywkę dwa razy w tygodniu i pasażować komórki w stosunku 1:10 raz w tygodniu lub gdy komórki osiągną 85-90% konfluencji do nowych kolb T75 (średnio 50 00 komórek/kolba).
      3. Usunąć DMEM i dwukrotnie przemyć monowarstwy HeLa 8 mL sterylnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) przez 3 min.
      4. Usunąć PBS i dodać 2 mL PBS z 2 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
      5. Inkubować komórki przez 5 min w 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek, a następnie lekko potrząsnąć kolbą, aby oddzielić komórki HeLa od dna kolby.
      6. Wypłukać komórki 10 mL pożywki, przenieść zawiesinę do probówki 15 mL i pobrać 10 µL alikwotu do odliczania.
      7. Rozcieńczyć alikwot w stosunku 1:1 barwnikiem trypan blue 0,4% i odliczyć komórki za pomocą hemocytometru Bürkera9.
        UWAGA: Odliczyć dwie kratki 4 x 4 i pomnożyć liczbę komórek przez 10 0, aby uzyskać liczbę komórek/mL.
      8. Po odliczeniu komórek pobrać 90 0 komórek z probówki 15 mL, rozdzielić je na 3 szalki z szklanym dnem (patrz krok 1.1.1) i przygotować do transfekcji.
    2. Transfekować komórki metodą elektroporacji10 (patrz Tabela materiałów) konstruktem syntaksyny 4-mCitrine (tylko donor, próbka nr 1), syntaksyną 4-mCitrine wraz z VAMP3-mCherry (próbka nr 2) oraz syntaksyną 3 połączoną zarówno z mCitrine, jak i mCherry (próbka nr 3).
      UWAGA: Można zastosować inne metody transfekcji komórek11. Konstrukt tandemowy w próbce nr 3 służy jako kontrola pozytywna do oszacowania najkrótszego spodziewanego czasu życia (t.j. maksymalnego spodziewanego FRET).
  2. Hodować komórki przez noc w DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% FCS i 1% antybiotyku-antymykotyku w 37 °C przy 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórek.
  3. Odssać DMEM i przemyć komórki raz pożywką do obrazowania żywych komórek (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7,4, mOsm = 30; patrz Tabela materiałów) przez 2 min, a następnie umieścić komórki w świeżej pożywce do obrazowania.

2. Rejestracja danych FLIM

  1. Umieść Próbkę nr 2 pod konfokalnym mikroskopem FLIM w dziedzinie czasu z impulsowym źródłem wzbudzenia dla fluoroforu donora (t.j., mCitrine) oraz akwizycję danych w funkcji czasu. Przechowywać komórki w 37 °C z podgrzewanym stolikiem.
    UWAGA: Mikroskop konfokalny użyty w tym protokole jest wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 63X 1,20 NA oraz impulsowy laser białego światła (częstotliwość impulsacji 80 MHz, < czas trwania impulsu 100 ps), fotopowmnożnik (PMT) oraz system czasowo-skorelowanego liczenia pojedynczych fotonów (TCSPC) (patrz Tabela materiałów dla konkretnej zastosowanej konfiguracji). Można również użyć innych mikroskopów FLIM (np., fotodiody lawinowe pojedynczego fotonu (SPAD) zamiast PMT, impulsowe lasery jednofalowe zamiast impulsowych laserów białego światła).
  2. Należy wybrać komórkę z widoczną ekspresją białek SNARE znakowanych mCitrine i mCherry, a następnie przed każdym pomiarem FLIM zarejestrować obraz konfokalny o rozmiarze 256 × 256 pikseli przy jednoczesnym wzbudzeniu obu fluoroforów. Należy zastosować krok piksela około 2-krotnie mniejszy niż dyfrakcyjna rozdzielczość przestrzenna mikroskopu (~ 200 nm). W przypadku mCitrine należy wzbudzać przy 516 nm i zbierać emisję z zakresu 521–565 nm; w przypadku mCherry należy wzbudzać przy 610 nm i zbierać emisję z zakresu 613–68 nm.
    UWAGA: Nie należy ustawiać płaszczyzny obrazowania zbyt blisko dna naczynia (w odległości ok. 2 µm odległość), ponieważ spowoduje to pojawienie się piku refleksyjnego na histogramie czasu życia fluorescencji. Preferowane jest jednoczesne wzbudzanie fluoroforów donora i akceptora, gdyż pozwala to wyeliminować potencjalny problem przemieszczania się próbki. Można jednak zastosować również wzbudzanie sekwencyjne.
  3. Nagrać obraz FLIM, klikając Przeprowadź pomiar FLIM obraz FLIM należy zarejestrować z tymi samymi wymiarami i rozdzielczością przestrzenną, co obraz konfokalny zarejestrowany w kroku 2.2. Obraz należy rejestrować do uzyskania co najmniej 50 00 fotonów dla analizy FLIM całej komórki lub co najmniej 40 fotonów na piksel. Należy wzbudzać wyłącznie fluorofor donora mCitrine, a nie fluorofor akceptora mCherry; w związku z tym wzbudzanie należy przeprowadzić przy 516 nm, a emisję zbierać w zakresie 521–565 nm.
  4. Powtórz kroki 2.1–2.3 dla wielu komórek oraz dla drugiej Próbki nr 1 (tylko dawca) i Próbki nr 3 (tandemowy konstrukt mCitrine-mCherry).
  5. Zarejestruj funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF). Nastroj detektor emisji monochromatora na długość fali wzbudzenia (np., zarejestruj emisję z zakresu 510–50 nm), a następnie kliknij przycisk, aby zarejestrować obraz FLIM z rozproszenia wstecznego z czystego szkiełka przykrywkowego Przeprowadzenie pomiaru FLIMNależy zastosować tę samą długość fali wzbudzenia (516 nm) i moc lasera, które zostały użyte do rejestracji danych komórkowych w krokach 2.1-2.4.
    UWAGA: Jeśli w IRF widocznych jest wiele pików lub jeśli monochromatory emisji nie mogą zostać nastrojone, IRF można również zmierzyć przy użyciu roztworu barwnika fluorescencyjnego o ultrakrótkim czasie życia, na przykład poprzez wygaszanie fluorescencji barwnika organicznego w nasyconym wodnym roztworze jodku potasu. Ponadto rejestracja IRF nie jest ściśle wymagana, ponieważ nachylenie spadku histogramów fluorescencji można dopasować również bez dekonwolucji IRF. Jednakże IRF umożliwia korektę charakterystyki czasowej zastosowanego detektora fotonów, a tym samym zwiększa dokładność dopasowań histogramów czasu życia.

3. Konwersja rejestracji fotonów na obrazy FLIM

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie konwertujące PT32ICS5.
    UWAGA: Dane dotyczące czasu życia mogą być analizowane również za pomocą innego oprogramowania, w tym programów dostarczonych przez kilku producentów mikroskopów.
  2. Skonfiguruj oprogramowanie PT32ICS.
    1. Ustawie Rozmiar do rozmiaru obrazu 256 × 256 pikseli poprzez Ustawienia | Rozmiar.
    2. Ustaw Kanał Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 2 poprzez Ustawienia | Rozmiar.
      UWAGA: Kanał emisji mCitrine zależy wyłącznie od konfiguracji mikroskopu. Wybór niewłaściwego kanału spowoduje uzyskanie obrazu FLIM pozbawionego fotonów (tj., czarny obraz) i w rezultacie pusty plik „LifetimeTable.txt”. Właściwy kanał można zidentyfikować metodą prób i błędów.
    3. Zestaw Wynik Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. ImageJ (xyz) (lub TRI2 (xyt)) do generowania obrazów FLIM (krok 3.4).
  3. Naciśnij Konwertuj i wczytaj jeden lub więcej śladów fotonowych (pliki .pt3). Aby wybrać wiele śladów fotonowych, należy przytrzymać Kontrola naciśnięto klawisz.
    UWAGA: Nowszy 64-bitowy format .ptu może również zostać przekonwertowany.
  4. Należy upewnić się, że oprogramowanie PT32ICS generuje w tym samym folderze, w którym zapisano pliki .pt3, następujące pliki: jeden stos fotonów dla każdego śladu fotonowego .pt3 w standardowym formacie cytometrii obrazowej (.ics), jeden plik mapy bitowej dla każdego śladu fotonowego .pt3 (.bmp) oraz plik tekstowy dla każdej konwersji (_Report.txt) zawierający informacje o statystyce fotonów (t. j., całkowitą liczbę fotonów w każdym śladzie fotonowym .pt3, rozdzielczość czasową detektora) oraz drugi plik tekstowy dla każdej konwersji (_LifetimeTable.txt) zawierający całkowite histogramy czasu życia fluorescencji w formacie rozdzielonym tabulatorami dla każdego śladu fotonowego .pt3.
    UWAGA: Plik .ics może być wykorzystany do dopasowania pojedynczego piksela w celu wygenerowania obrazów FLIM, na przykład za pomocą oprogramowania TRI212,13 lub bibliotekę dopasowania krzywych SLIM w programie FIJI ImageJ14,15Plik ten może być również wykorzystany do analizy fazorowej.16na przykład za pomocą wtyczki Time Gated Phasor dla FIJI od firmy Spechron. Plik mapy bitowej nie zawiera informacji o czasie życia. Drugi plik tekstowy jest wykorzystywany do analizy FLIM całych komórek w kroku 4.

4. Dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji dla analizy FLIM całych komórek

UWAGA: Ten krok (dopasowanie dekonwolucyjne IRF) wymaga oprogramowania umożliwiającego dopasowanie z dekonwolucją. Dopasowanie nachyleń histogramów fluorescencji bez dekonwolucji IRF można przeprowadzić również przy użyciu innego oprogramowania.

  1. Otwórz program do analizy danych umożliwiający dopasowanie z dekonwolucją (Tabela materiałów) i zaimportuj plik tekstowy zawierający histogram dla każdego śladu fotonowego (_LifetimeTable.txt) za pomocą Plik | Importuj | Pojedynczy ASCII.
  2. Zreorganizuj tabelę w taki sposób, aby IRF znajdował się w drugiej kolumnie tabeli (korzystając z Kopia i Wklej). Umieść IRF w drugiej kolumnie B, obok wartości czasu w pierwszej kolumnie A.
  3. Określ jakość zarejestrowanych śladów fotonowych, zaznaczając wszystkie kolumny poprzez naciśnięcie Ctrl + A oraz wybieranie Wykres | Wielopanelowy | 9 paneliNie analizować śladów fotonowych z wysokim pikiem odbicia (Rysunek 4F).
  4. Wybierz wszystkie kolumny zawierające poddane kontroli jakości histogramy czasów życia, które zostaną dopasowane, a także IRF w kolumnie B, używając Kontrola klucz i wczytaj dopasowanie nieliniowe za pomocą Analiza | Dopasowanie | Niedopasowanie krzywej | Otwórz okno dialogowe.
  5. Wczytaj funkcję dopasowania z dekonwolucją (dostępną w Plik uzupełniający 1) poprzez dodanie tej funkcji do oprogramowania analitycznego (za pomocą Kategoria | Zdefiniowana przez użytkownika | Funkcja | Dodaj). Wybierz plik funkcji dopasowania „FLIM_convoluted_IRF.fdf”. Funkcja ta dopasowuje histogramy czasu życia fluorescencji za pomocą funkcji rozpadu mono-wykładniczego po dekonwolucji z IRF (t.j., druga kolumna B w tabeli) (Równanie 1):
    Wzór całkowy zaniku wykładniczego dla analizy spektroskopii przejściowej absorpcji.        (Równanie 1)
    z t czas, τ pozorny czas życia fluorescencji, A amplituda i y0 przesunięcie.
    UWAGA: Inną opcją jest dopasowanie histogramów czasu życia za pomocą funkcji dopasowania bieksponecyjnego (Równanie 2):
    Równanie wykładniczego zaniku ze splotem funkcji odpowiedzi impulsowej (IRF), analityczna metoda analizy danych.        (Równanie 2)
    Poprzez ustalenie czasu życia komponentu wolnego (τ1) do warunku wyłącznie dawcy (krok 1.1.2: próbka nr 1) oraz komponentu szybkiego (τ2) do konstrukcji tandemowej (próbka nr 3), co pozwala na oszacowanie frakcji białek SNARE w kompleksie (F) z amplitud fal wolnych (A1) i komponentów szybkich (A2; patrz Dyskusja; Równanie 3):
    Wzór na frakcję sygnału; wyrażenie matematyczne dla stosunku w analizie optycznej.        (Równanie 3)
    Plik funkcji dopasowania dla bi-wykładniczego dopasowania z dekonwolucją „FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf” jest dostępny w Plik uzupełniający 2.
  6. Wybierz Krzywe dopasowane | Typ danych X jako Taka sama jak dane wejściowe.
    UWAGA: Doprowadzi to do uzyskania odpowiedniego Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.skalowanie osi dopasowanych krzywych.
  7. Dopasuj krzywe, naciskając Dopasowanie.
    UWAGA: Operacja ta przekształci dopasowanie i wygeneruje w tablicy „arkusz raportu” z tabelą zawierającą czasy życia fluorescencji, przesunięcia oraz amplitudy. Zostanie również wygenerowany arkusz danych z dopasowanymi krzywymi i residuami dopasowania.

Wyniki

Koncepcja testu do pomiaru oddziaływań SNARE metodą FRET-FLIM przedstawiona jest na Rysunku 1. Końce C helis transbłonowych pokrewnych białek SNARE są połączone z parą przesuniętych widmowo białek fluorescencyjnych (np. mCitrine i mCherry). Powstanie kompleksu cis-SNARE podczas fuzji błon powoduje natychmiastowe zbliżenie tych białek fluorescencyjnych do siebie i wystąpienie zjawiska FRET. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy konfokalne komórek HeLa wykazujących ekspresję znakowanych fluorescencyjnie białek SNARE. Przedstawiono komórkę wykazującą ekspresję syntaksyny 4-mCitrine (fluorofor donora) z VAMP3-mCherry (fluorofor akceptora), a także warunki kontrolne komórek wykazujących ekspresję jedynie konstruktu syntaksyny 4-mCitrine (tylko donor; brak FRET) oraz syntaksyny 3 połączonej tandemowo z mCitrine i mCherry (maksymalny oczekiwany FRET). Rysunek 3 przedstawia towarzyszące obrazy czasu życia fluorescencji i obrazy FLIM, wygenerowane poprzez dopasowanie histogramów czasu życia każdego piksela do funkcji zaniku mono-wykładniczego (Rysunek 3A-B) oraz funkcji zaniku bi-wykładniczego (Rysunek 3C-D). Rysunek 4A przedstawia IRF naszego układu, zmierzoną poprzez wsteczne rozproszenie z krawędzi szkiełka podstawowego mikroskopu. Na Rysunku 4B-E przedstawiono reprezentatywne histogramy czasu życia fluorescencji z analizy FLIM całej komórki wraz z towarzyszącymi krzywymi dopasowania dla funkcji zaniku mono-wykładniczego. Rysunek 4F przedstawia histogram czasu życia fluorescencji z eksperymentu obrazowanego zbyt blisko powierzchni szkiełka podstawowego mikroskopu, co spowodowało pojawienie się wyraźnego piku odbicia. Rysunek 4G przedstawia histogram czasu życia z reprezentatywnym dopasowaniem do funkcji zaniku bi-wykładniczego.

Fuzja błon pośredniczona przez białka SNARE, schemat metody opartej na FRET, znakowanie mCherry i mCitrine, interakcja pęcherzyków.
Rysunek 1: Schemat uzasadnienia wizualizacji kompleksów SNARE za pomocą FRET. (A) Model strukturalny neuronalnych białek SNARE (baza danych białek 3HD717) białko błonowe związana z pęcherzykami (VAMP) 2 (niebieski; R), syntaksynę 1 (czerwony; Qa-SNARE) oraz SNAP25 (zielony; zawiera motywy Qb-SNARE i Qc-SNARE). Koniec C-końcowy helisy transbłonowej syntaksyny-1 jest sprzężony z mCitrine (fluorofor donora; baza białek 3DQ118). Koniec C-końcowy helisy transbłonowej VAMP2 jest sprzężony z mCherry (fluorofor akceptorowy; baza białek 2H5Q19). (B) Schemat fuzji błon pośredniczonej przez białka SNARE prowadzącej do zjawiska FRET. Po fuzji błon w wyniku powstania cis- w kompleksie SNARE białka SNARE znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie, co prowadzi do wystąpienia zjawiska FRET. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna oddziaływań białkowych, Stx4-mCitrine, VAMP3-mCherry, nałożenie obrazów, obrazy BF.
Rysunek 2: Ekspresja białek SNARE połączonych z białkami fluorescencyjnymi. Pierwsza kolumna: fluorofor donora, wzbudzany przy 516 nm. Druga kolumna: fluorofor akceptora, wzbudzany przy 610 nm. (A) Warunek tylko donora. Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję syntaktyny 4-mCitrine (fluorofor donorowy; kolor zielony na obrazie scalonym). Kanał akceptora (druga kolumna) pokazuje przeplot fluorescencyjny. (B) Kontrola negatywna (brak FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję zarówno syntaksyny 4-mCitrine, jak i VAMP3-mCherry (fluorofor akceptorowy; kolor magenta na obrazie scalonym). (C) Kontrola pozytywna (maksymalny oczekiwany FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wykazującej ekspresję tandemowej konstrukcji syntaxina 3-mCitrine-mCherry. Należy zauważyć, że sygnały fluorescencji mCitrine i mCherry nie pokrywają się całkowicie, co prawdopodobnie wynika z niższej odporności mCitrine na degradację lizosomalną w porównaniu z mCherry (patrz sekcja Dyskusja). BF: pole jasne. Paski skali, 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) białek SNARE, schemat przedstawiający czas życia i intensywność.
Rycina 3: Obrazy FLIM z procesu tworzenia kompleksu SNARE. (A) Reprezentatywne obrazy czasu życia fluorescencji komórek przedstawionych w Rysunek 2Obrazy wygenerowano, najpierw konwertując ślady fotonów zarejestrowane przez system TCSPC (.pt3) do standardu cytometrii obrazowej (.ics) za pomocą oprogramowania PT32ICS. Następnie, przy użyciu oprogramowania TRI2, wygenerowano obrazy czasu życia fluorescencji z dopasowaniem do pojedynczych pikseli.12,13 przy progowaniu od 15% do 10% intensywności, kołowym binowaniem o promieniu 7 pikseli i algorytmie dopasowania monoeksponencjalnego (Marquardta). Kolor wskazuje średni pozorny czas życia fluorescencji. (Bobrazy FLIM, w których obrazy czasu życia fluorescencji (pokazane na panelu A) zostały splotowane z intensywnością fluorescencji fluoroforu donora mCitrine (pokazane w Rysunek 2). Splot wykonano w programie FIJI ImageJ przy użyciu stworzonego na specjalne zamówienie makra (patrz Tabela materiałów). (C) Czas życia fluorescencji i obrazy FLIM komórki HeLa wykazującej ekspresję zarówno syntaxyny 4-mCitrine, jak i VAMP3-mCherry z paneli A-B, lecz obecnie z dopasowaniem dwuwykładniczych krzywych zaniku (z czasami życia ustalonymi zgodnie z warunkami kontrolnymi; patrz krok 4.4 w protokole). Kolory pikseli wskazują szacowane frakcje F syntaksyny 4 w kompleksie z VAMP3 (Równanie 3). (D) Analogicznie jak w panelu B, ale dla dopasowania bieksponecjalnego. Splot wykonano w programie FIJI ImageJ przy użyciu makra wykonanego na zamówienie (patrz Tabela materiałów). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krzywe zaniku zliczania fotonów; analiza czasu życia fluorescencji; wykres spektroskopii rozdzielczej w czasie.
Rycina 4: Analiza FLIM całych komórek. (A) Funkcja odpowiedzi przyrządu (IRF) układu. Funkcję IRF zmierzono, wykorzystując rozpraszanie wsteczne na granicy szkło-woda (przy użyciu czystej szklanej szalki mikroskopowej wypełnionej wodą). (B-E) Histogramy czasu życia całych komórek dla komórek przedstawionych w Rycina 2 i Rysunek 3Wszystkie fotony obecne na obrazach zostały zgromadzone. Krzywe poddano dekonwolucji z funkcją odpowiedzi instrumentu (IRF) i dopasowano do funkcji jednoeksponencjalnego zaniku (Równanie 1). Dla tych komórek uzyskano czasy życia fluorescencji wynoszące 2,82 ns (komórki wykazujące ekspresję tylko syntaxyny 4-mCitrine; tylko donator; panel B), 2,09 ns (komórki wykazujące koekspresję syntaxyny 4-mCitrine z VAMP3-mCherry; panel C) oraz 2,08 ns (komórki wykazujące ekspresję tandemowej konstrukcji syntaxyny 3-mCitrine-mCherry; kontrola maksymalnego oczekiwanego FRET; panel D). Wstawki przedstawiają te same wykresy, jednak z zastosowaniem skali logarytmicznej na osi Y. Panel E przedstawia nałożone na siebie krzywe zaniku z paneli B-D. (F) Przykład histogramu czasu życia fluorescencji zarejestrowanego zbyt blisko powierzchni szkiełka przedmiotowego mikroskopu. Skutkuje to powstaniem dużego piku odbicia (przedstawionego przez żółty obszar zacieniowany). (G) Tak jak na panelu C, ale tym razem z dopasowaniem do krzywej zaniku bieksponecjalnego z czasami życia ustalonymi zgodnie z warunkami kontrolnymi (patrz krok 4.4 w protokole). Amplitudy komponentu szybkiego (A1) i powolne (A2składniki wynosiły odpowiednio 14,42 oraz 0,01, co pozwoliło oszacować frakcję białek SNARE w kompleksach F wynoszącego 0,9 (Równanie 3). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 1. Plik funkcji FLIM_convoluted_IRF Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Plik funkcji FLIM_convoluted_IRF_biexp Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten demonstruje zastosowanie FRET-FLIM do wizualizacji interakcji SNARE między składnią 4 i VAMP3 w żywych komórkach HeLa. Syntaksyna 4 jest białkiem Qa-SNARE zlokalizowanym głównie w błonie plazmatycznej, gdzie pośredniczy w egzocytozie 1,2,20,21. VAMP3 jest R-SNARE, który jest głównie opisywany do lokalizacji w recyklingu przedziałów endosomalnych i pośredniczy w transporcie do innych endosomów, a także do błony komórkowej 1,2,20. Jednak test FRET-FLIM można łatwo dostosować do badania innych białek SNARE. Jedynym warunkiem jest to, że te SNARE zawierają C-końcową transbłonową helisę, co ma miejsce w przypadku większości białek SNARE zdecydowanie 1,2. Ponadto opisany tutaj protokół można dostosować do wizualizacji kompleksów SNARE w dowolnym typie komórek eukariotycznych, w tym w roślinach i drożdżach. W tym protokole wykorzystaliśmy skrócenie czasu życia fluorescencji fluoroforu dawcy jako miarę FRET. Jako podejście uzupełniające można zbadać czas życia fluoroforu akceptorowego, ponieważ uczulona emisja powoduje wyraźną fazę narastania, która dostarcza jednoznacznego dowodu na to, że zachodzi rezonansowy transfer energii.

Obecnie technika FRET-FLIM może nie być w stanie uwidocznić kompleksów SNARE w przedziałach lizosomalnych. W przypadku konstruktu tandemowego składniowego 3-mCitrine-mCherry fluorescencja mCherry często jest bardziej skumulowana w obszarze przyjądrowym, który prawdopodobnie odpowiada przedziałom lizosomalnym, podczas gdy sygnał mCitrine jest bardziej obfity na obrzeżach komórkowych5. Zaobserwowano podobną akumulację mCherry w porównaniu z mCytryną, gdy te same białka SNARE połączone z tymi białkami fluorescencyjnymi ulegały koekspresji5. Lizosomy charakteryzują się wyjątkowo niskim pH (< 4) i wysoką aktywnością enzymów proteolitycznych. Akumulacja mCherry jest prawdopodobnie spowodowana wyższą odpornością fluoroforu mCherry na degradację lizosomalną w porównaniu z fluoroforem mCitrine. Nie jest to spowodowane wygaszaniem pH mCytryny, ponieważ akumulacja mCherry w zestawieniach zachodzi również po utrwaleniu komórek5. W związku z tym technika FRET-FLIM zaniża ilość FRET w przyjądrowych (lizosomalnych) regionach, a to wymagałoby innych fluorescencyjnych białek reporterowych, które przetrwają trudne warunki w świetle lizosomów.

FRET-FLIM w zasadzie pozwala na uzyskanie (pół)ilościowego oszacowania frakcji SNARE w kompleksie5. Jak wyjaśniliśmy w tym protokole, wymaga to dopasowania histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu podwójnie wykładniczego (równanie 2), gdzie amplituda szybkiej składowej jest proporcjonalna do frakcji SNARE w kompleksie (równanie 3). Jednak takie dopasowanie do modelu dwukomponentowego jest technicznie trudne. Dopasowanie z wieloma parametrami swobodnego dopasowania (dwa czasy życia fluorescencji i dwie amplitudy) wymaga bardzo dużej liczby fotonów, zwłaszcza, że parametry będą na siebie wpływać, a małe błędy w czasie życia będą wpływać na amplitudy i odwrotnie. Aby przezwyciężyć te problemy z dopasowaniem, czasy życia fluorescencji składnika powolnego można ustalić na czas życia warunku tylko dawcy (tj. brak FRET; obecna jest tylko mCytryna), a czas życia składnika szybkiego na czas życia konstruktu tandemowego (maksymalny oczekiwany FRET). Należy to jednak również interpretować z ostrożnością, ponieważ czas życia fluorescencji może nie być taki sam jak w tych stanach kontrolnych i może się różnić z wielu powodów (samowygaszanie, orientacja dipolowa, zmiany w mikrośrodowisku). Wiele kompleksów SNARE w bliskiej odległości (< 10 nm) może powodować FRET zależny od odległości, tę samą zasadę, która pozwala na użycie FRET jako "linijki molekularnej", ale w tym przypadku zaciemnia kwantyfikację kompleksów SNARE. Co więcej, oszacowanie ilościowe nie zawsze jest miarodajne, ponieważ oznaczone SNARE konkurują z endogennymi (nieoznakowanymi) SNARE. W związku z tym poziom ekspresji SNARE znakowanego mCherry jest głównym wyznacznikiem procentowej zawartości FRET5. Ze względu na wszystkie te zastrzeżenia zaleca się dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu monowykładniczego (równanie 1). Ma to tę zaletę, że nie wymaga żadnej wiedzy a priori na temat czasów życia, a wynikający z tego pozorny średni czas życia fluorescencji stanowi solidną miarę dla kompleksowania SNARE5.

Niemniej jednak oczekuje się, że ilościowe obrazowanie FRET-FLIM za pomocą dwuskładnikowych modeli dopasowania będzie miało w przyszłości potężne zastosowania. Geny kodujące SNARE w chromosomie mogą być łączone z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, na przykład za pomocą CRISPR/CAS9. Powoduje to fluorescencyjne znakowanie endogennych białek SNARE, z endogennymi poziomami białek i bez tła nieznakowanych SNARE, a tym samym pozwala na miarodajne ilościowe oszacowanie frakcji kompleksów SNARE przez FRET-FLIM. Podczas gdy poziomy ekspresji endogennych SNARE mogą być dość niskie i dawać stosunkowo niskie sygnały fluorescencyjne, oczekuje się, że można uzyskać wystarczającą liczbę fotonów, szczególnie dla całej komórki FLIM (która wymaga tylko kilku 1000 fotonów). Co więcej, te pomiary FRET-FLIM mogą być wykonywane za pomocą bardziej czułych detektorów fotodiod lawinowych, co również spowoduje wyższe sygnały fluorescencji i lepsze statystyki fotonów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez stypendium Hypatia z Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud, Nagrodę Rozwoju Kariery od Human Frontier Science Program, Program Grawitacji 2013 od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; ICI-024.002.009), grant VIDI z NWO (ALW VIDI 864.14.001) oraz grant na rozpoczęcie działalności od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (umowa o grant nr 336479).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plazmidowa "syntaksyna 4-mCytryny"AddgeneID 92422Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).
Plazmidowe DNA 'VAMP3-mCherry'AddgeneID 92423Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).
Plazmidowa DNA "syntaksyna 3-mCitrine-mCherry"AddgeneID 92426Kontrola pozytywna dla maksymalnego osiągalnego FRET.
Hela cells
35 mm naczynia ze szklanym dnem Willco WellsHBST-3522Inne komory do obrazowania żywych komórek będą działać jako substytut
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco, Life Technologies31966-021
Surowica cielęca płoduGreiner Bio-one758093
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyGibco, Life Technologies15240-062Pen/Strep będzie działać jako substytut
Obrazowanie żywych komórek średniThermo Fisher ScientificA14291DJKażde inne rozwiązanie do obrazowania żywych komórek będzie działać, o ile uniemożliwi się fluorescencję z pożywki
Mikroskop konfokalny Leica SP8 z obiektywem 63x 1.20 NA do zanurzenia w wodzieLeicaSP8Można również stosować inne mikroskopy konfokalne z technologią FLIM w dziedzinie czasu
Laser pulsacyjny ze światłem białymLeicaSP8Można również zastosować
System zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC)Oprogramowanie
Dostępne w sekcji "Oprogramowanie" www.membranetrafficking.com
Wykonane na zamówienie makro Fiji ImageJ do konwolucji obrazu FLIM z intensywnościąFiji ImageJDostępne w sekcji "Oprogramowanie" w www.membranetrafficking.com
Bü rker HemocytometrVWR630-1541
Ogniwa HeLaATCCATCC  CCL-2
PBSB Braun Melsungen  AG362 3140
EDTA 2 mMMerck108417CAS: 60-00-4
Probówki 15 mlGreiner Bio-one188271
Trypan niebieskiSigma Aldrich93595CAS: 72-57-1
Urządzenie do elektroporacji ogniw neonowychThermo Fisher ScientificMPK5000S
inne impulsowe źródła lasera do konwersji PT32ICS PicoQuant PicoHarp 300 program do analizy danych zdolny do dekonwolucji Originlabs OriginPro 2016 Fiji ImageJ

Bibliografia

  1. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).
  2. Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).
  3. van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).
  4. Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
  5. Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
  6. Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).
  7. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  8. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  9. JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2017).
  10. Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171(2005).
  13. Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).
  17. Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).
  18. Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).
  19. Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).
  20. Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).
  21. Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Białka SNAREanaliza FRET-FLIMhistogramy czasu życia fluorescencjitransport błonowyobrazowanie żywych komórekmikroskopia konfokalnaanaliza śladu fotonówdopasowanie nieliniowefunkcja odpowiedzi przyrządu
Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.