Artykuł metodologiczny

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

DOI:

10.3791/56745

⸱

29 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Tumor Immunology, Radboud University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpuszczalne białka infuzyjne wrażliwe na N-etylomaleimid (NSF) są kluczowe dla transportu błonowego, ponieważ katalizują fuzję błon w komórkach eukariotycznych. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 różnych członków. Określone wewnątrzkomórkowe drogi transportowe są katalizowane przez określone zestawy 3 lub 4 białek SNARE, które w ten sposób przyczyniają się do specyficzności i wierności transportu błonowego. Jednak badanie dokładnej funkcji białek SNARE jest technicznie trudne, ponieważ SNARE są bardzo obfite i funkcjonalnie redundantne, przy czym większość SNARE ma wiele i nakładające się na siebie funkcje. W protokole tym opisano nową metodę wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w żywych komórkach. Metoda ta opiera się na ekspresji białek SNARE C-końcowych połączonych z białkami fluorescencyjnymi i pomiarze ich interakcji za pomocą rezonansowego transferu energii Förstera (FRET) przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM). Poprzez dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do wieloskładnikowego modelu rozpadu, FRET-FLIM umożliwia (pół)ilościowe oszacowanie frakcji tworzenia kompleksu SNARE w różnych pęcherzykach. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE na błonie plazmatycznej i w endosomalnych przedziałach w liniach komórkowych ssaków i pierwotnych komórkach odpornościowych, i może być łatwo rozszerzony do badania funkcji SNARE w innych organellach w komórkach zwierzęcych, roślinnych i grzybowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transportowanie błonowe jest główną cechą komórek eukariotycznych, gdzie pęcherzyki błonowe wyrastają z organelli dawcy, a następnie przemieszczają się do organelli docelowej i łączą się z nią1,2. Z wyjątkiem mitochondriów, wszystkie te etapy fuzji błonowej są katalizowane przez członków rodziny białek SNARE1,2. Rodzina białek SNARE składa się z około 36 członków w komórkach ssaków i około 20 członków w drożdżach2. Białka SNARE zawierają jeden lub dwa ~52 reszty, natywnie nieustrukturyzowane regiony, zwane motywami SNARE. Białka SNARE są często przywiązane do błon przez transbłonową helisę C-końcową1,2. SNARE można podzielić na kategorie na podstawie centralnych reszt, które wnoszą do kompleksu SNARE, na argininę (R) i glutaminę (Q) SNAREs1,2. Fuzja błonowa jest napędzana przez interakcję 3 lub 4 pokrewnych SNARE, które razem tworzą 4 motywy SNARE i są rozprowadzane zarówno na błonie donorowej, jak i akceptorowej1,2. Kompleks SNARE składa się z jednego motywu R-SNARE i trzech motywów Q-SNARE (określanych jako Qa, Qb i Qc). Tworzenie kompleksu rozpoczyna się na N-końcach motywów SNARE, tworząc tak zwany kompleks trans-SNARE, i postępuje w kierunku C-końców, tworząc ciasną α-spiralną wiązkę zwiniętą cewki zwaną kompleksem cis-SNARE. Złożone tworzenie nawet pojedynczego kompleksu SNARE ciągnie do siebie błony donorową i akceptorową i pokonuje barierę energetyczną dla fuzji membranowej3.

Przypisywanie odrębnych kompleksów SNARE do konkretnych tras transportowych w komórkach jest często technicznie trudne. Chociaż SNARE wyraźnie przyczyniają się do specyfiki transportu błonowego, są one rozwiązłe, funkcjonalnie nadmiarowe, a ich funkcje nakładają się na siebie1,2. Z tego powodu eksperymenty perturbacyjne ukierunkowane na SNARE, takie jak nokaut genów, interferencja RNA, wprowadzenie przeciwciał blokujących lub rozpuszczalne fragmenty SNARE działające jako dominujące wartości ujemne, często nie prowadzą do uzyskania czystych fenotypów, ponieważ inne SNARE kompensują2,4. Co więcej, trudno jest odróżnić konkretne etapy fuzji membranowej od zdarzeń związanych z transportem poprzedzającym, ponieważ SNARE mogą być zaangażowane w wiele tras transportowych2. Badania lokalizacyjne SNARE za pomocą metod mikroskopowych, wykorzystujących znakowanie immunologiczne lub fuzję genetyczną z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, cierpią na problemy, które: (i) SNARE lokalizują się w wielu organellach, ponieważ często pośredniczą w wielu etapach transportu, oraz (ii) ich lokalizacje nie oznaczają automatycznie, że są funkcjonalnie zaangażowane w tworzenie kompleksu SNARE. Wreszcie, kompleksy SNARE można zidentyfikować za pomocą eksperymentów immunoprecypitacyjnych z użyciem jednego z SNARE jako przynęty, a innych SNARE jako celów, ale nie pozwala to na przypisanie tych kompleksów do określonych organelli lub szlaków transportowych. W związku z tym obecnie nie ma alternatywnej techniki wizualizacji kompleksów SNARE z rozdzielczością organellarną. Immunofluorescencja nie jest w stanie udowodnić interakcji SNARE, ale może wykazać tylko obecność lub brak kolokalizacji, podczas gdy immunoprecypitacja może tylko wykazać interakcje SNARE w całej populacji komórek, ale nie przypisać organelli, w których te interakcje występują.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, Verboogen et al. opracowali niedawno nowatorską metodę pozwalającą na ilościową wizualizację kompleksów SNARE w żywych komórkach z rozdzielczością organellar.5 Ta metoda opiera się na ekspresji par SNARE z widmowo przesuniętymi białkami fluorescencyjnymi połączonymi C-końcowymi z ich transbłonowymi helisami. Po zakończeniu fuzji błonowej i utworzeniu kompleksu cis-SNARE, te fluorofory na C-końcach helis transbłonowych są natychmiast zestawiane ze sobą. Fluorofory znajdują się wtedy w odległości Förstera (zwykle <5 nm), co skutkuje FRET od fluoroforu donorowego przesuniętego na zielono do fluoroforu akceptora przesuniętego ku czerwieni klasy akceptora 5,< klasa sup = "xref">6. FRET powoduje wygaszanie fluoroforu donorowego i zwiększoną emisję fluoroforu akceptorowego, którą można zmierzyć na podstawie stosunków emisji donora i akceptora (ratiometryczny FRET). Jednak ratiometryczny FRET między dwiema różnymi cząsteczkami jest trudny ze względu na przesłuch fluorescencyjny i różne poziomy SNARE donorowych i akceptorowych w różnych organellach i między komórkami7,8. FRET można również zmierzyć na podstawie czasu życia fluorescencji, który jest czasem między wzbudzeniem a emisją fotonu. Jeśli fluorofor dawcy może uwolnić swoją energię przez FRET, ten konkurencyjny proces powoduje pozorne skrócenie czasu życia fluorescencji. Można to zmierzyć za pomocą FLIM7,8. Żywotność FRET jest znacznie bardziej wytrzymała niż ratiometryczna FRET do pomiaru interakcji między dwiema różnymi cząsteczkami, ponieważ czas trwania fluorescencji jest wewnętrzną właściwością fluoroforu i jest niewrażliwy na jego stężenie. Co więcej, FRET jest w przybliżeniu ilościowy, ponieważ wydajność FRET jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi (zasadniczo funkcja krokowa). W związku z tym, dopasowując histogramy czasu życia fluorescencji zarejestrowane przez FLIM do modelu rozpadu dwuskładnikowego, FRET-FLIM pozwala na (pół)ilościowe oszacowanie frakcji cząsteczek SNARE zaangażowanych w tworzenie kompleksu SNARE5.

Ostatnio ta metoda FRET-FLIM została użyta przez Verboogen et al. do wizualizacji tworzenia kompleksu SNARE w pierwotnych komórkach dendrytycznych układu odpornościowego5. Wykazano, że po napotkaniu bodźca patogennego komórki dendrytyczne przekierowują transport błonowy, czemu towarzyszy zwiększone kompleksowanie białka błonowego związanego z pęcherzykami R-SNARE (VAMP) 3 ze składtaksyną Qa-SNARE 4 specyficznie na błonie plazmatycznej. To zwiększone tworzenie kompleksu SNARE jest prawdopodobnie wymagane, aby sprostać zwiększonej zdolności wydzielniczej do wydzielania cytokin zapalnych, takich jak interleukina-65. Protokół ten opisuje etapy eksperymentalne potrzebne do pozyskania danych FRET-FLIM do wizualizacji i (pół)ilościowego pomiaru kompleksów SNARE. Wyjaśniono, w jaki sposób dopasować histogramy czasu życia fluorescencji całej komórki do funkcji rozpadu mono- i dwuwykładniczego, co skutkuje pozornym czasem życia fluorescencji jako ilościowym oszacowaniem oddziaływań SNARE. W tym protokole jako przykład użyto szeroko stosowanej linii komórkowej HeLa, ale metodę można łatwo rozszerzyć o badanie kompleksów SNARE w innych komórkach eukariotycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek mikroskopowych

  1. Ekspresja składni Qa-SNARE 4 połączonej z mCytryną (składnia 4-mCytryny; fluorofor dawcy) i R-SNARE VAMP3 połączonej z mCherry (VAMP3-mCherry)
    UWAGA: Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor fluoroforów oddzielonych spektralnie (np. CFP-YFP).
    1. Wyhoduj komórki HeLa i podziel 900 000 komórek HeLa na trzy szklane naczynia o średnicy 35 mm nadające się do mikroskopii.
      UWAGA: Zasadniczo protokół ten można dostosować do innych typów komórek eukariotycznych i naczyń mikroskopowych.
      1. Utrzymuj hodowle komórek HeLa w kolbach T75 z 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Eagle's (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 1% antybiotyko-antybiotykiem (zawierającym amfoterycynę B, penicylinę i streptomycynę) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
      2. Uzupełniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i dziel komórki 1:10 raz w tygodniu lub gdy komórki osiągną 85-90% zbiegu do nowych kolb T75 (średnio 500 000 komórek/kolbę).
      3. Usuń DMEM i umyj monowarstwy HeLa dwukrotnie 8 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 3 minuty.
      4. Usunąć PBS i dodać 2 ml PBS z 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
      5. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych, a następnie lekko zamieszać kolbę w celu oddzielenia komórek HeLa od dna kolby.
      6. Przepłukać komórki 10 ml pożywki, przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml i usunąć 10 μl podwielokrotności do policzenia.
      7. Rozcieńczyć podwielokrotność 1:1 0,4% barwieniem błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru Bürkera9.
        UWAGA: Policz dwa kwadraty 4 x 4 i pomnóż liczbę komórek przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek/ml.
      8. Po zliczeniu komórek weź 900 000 komórek z probówki o pojemności 15 ml, podziel je na 3 naczynia ze szklanym dnem (patrz krok 1.1.1) i przygotuj się do transfekcji.
    2. Transfekcja komórek za pomocą elektroporacji10 (patrz Tabela materiałów) za pomocą syntaksyny konstruktu 4-mCitrine (tylko dawca, próbka #1), składni 4-mCitrine razem z VAMP3-mCherry (próbka #2) i składni 3 połączonej zarówno z mCitrine, jak i mCherry (próbka #3).
      UWAGA: Można również użyć innych metod transfekcji komórek11. Konstrukt tandemowy w próbce #3 jest kontrolą pozytywną służącą do oszacowania najkrótszego oczekiwanego czasu życia (tj. maksymalnego oczekiwanego FRET).
  2. Hodować komórki przez noc w DMEM o wysokim poziomie glukozy zaopatrzonym w 10% FCS i 1% antybiotyko-przeciwgrzybiczy w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  3. Odessać DMEM i przemyć komórki raz pożywką do obrazowania żywych komórek (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7,4, mOsm = 300; patrz Tabela Materiałów) przez 2 minuty, a następnie umieścić komórki w świeżym pożywce do obrazowania.

2. Zapis danych FLIM

  1. Umieść próbkę #2 pod mikroskopem konfokalnym FLIM w dziedzinie czasu z pulsacyjnym źródłem wzbudzenia dla fluoroforu dawcy (tj. mCytryny) i akwizycją danych w czasie rozdzielczym. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C na podgrzewanym etapie.
    UWAGA: Mikroskop konfokalny używany w tym protokole jest wyposażony w obiektyw 63X 1.20 NA zanurzony w wodzie, pulsacyjny laser światła białego (impuls impulsowy 80 MHz, czas trwania impulsu < 100 ps), lampę powielacza fotonów (PMT) oraz system zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych w czasie (TCSPC) (patrz Tabela materiałów dla konkretnej zastosowanej konfiguracji). Można również stosować inne mikroskopy FLIM (np. jednofotonowe diody lawinowe () zamiast PMT, lasery impulsowe o pojedynczej długości fali zamiast laserów impulsowych ze światłem białym).
  2. Wybierz komórkę z widoczną ekspresją białek SNARE znakowanych mCitrine i mCherry i zarejestruj obraz konfokalny o długości 256 × 256 pikseli z jednoczesnym wzbudzeniem obu fluoroforów przed każdym pomiarem FLIM. Należy zastosować krok piksela około 2-krotnie mniejszy niż ograniczona dyfrakcją rozdzielczość przestrzenna mikroskopu (~ 200 nm). W przypadku mcytrynu wzbudzić przy 516 nm i zebrać emisję z zakresu 521-565 nm; dla mCherry, wzbudzić przy 610 nm i zebrać emisję od 613-668 nm.
    UWAGA: Nie umieszczaj płaszczyzny obrazowania zbyt blisko dna naczynia (w odległości ~ 2 μm), ponieważ spowoduje to pik odbicia w histogramie czasu życia fluorescencji. Preferowane jest jednoczesne wzbudzenie fluoroforów donorowych i akceptorowych, ponieważ pozwala to przezwyciężyć potencjalny problem przemieszczania się próbki. Można jednak również zastosować wzbudzenie sekwencyjne
    3. .
  3. Nagraj obraz FLIM, klikając opcję Uruchom FLIM, gdy obraz FLIM zostanie zapisany z tymi samymi wymiarami i rozdzielczością przestrzenną, co obraz konfokalny zarejestrowany w kroku 2.2. Zapisz obraz z co najmniej 50 000 fotonów do analizy FLIM całej komórki lub co najmniej 400 fotonów/piksel. Wzbudzaj tylko fluorofor donorowy mCytryny, a nie fluorofor akceptora mCherry, a tym samym wzbudzaj przy 516 nm i zbieraj emisję od 521-565 nm.
  4. Powtórz kroki 2.1-2.3 dla wielu komórek i dla drugiej próbki #1 (tylko dawca) i próbki #3 (konstrukt tandemowy mCitrine-mCherry).
  5. Nagraj funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF). Dostrój monochromator detektora emisji do długości fali wzbudzenia (np. zarejestruj emisję z zakresu 510-550 nm), a następnie nagraj obraz FLIM z tylnym rozpraszaniem z czystego szkiełka nakrywkowego, klikając przycisk Uruchom FLIM. Użyj tej samej długości fali wzbudzenia (516 nm) i mocy lasera, które są używane do rejestrowania danych ogniwa w krokach 2.1-2.4.
    UWAGA: Jeśli w IRF widocznych jest wiele pików lub jeśli monochromatory emisyjne nie mogą być dostrojone, IRF można również zmierzyć roztworem barwnika fluorescencyjnego o ultrakrótkiej żywotności, na przykład przez wygaszanie fluorescencji barwnika organicznego w nasyconym wodnym roztworze jodku potasu. Co więcej, nie jest ściśle wymagane rejestrowanie IRF, ponieważ nachylenie zaniku histogramów fluorescencji można również dopasować bez dekonwolucji IRF. Jednak IRF umożliwia skorygowanie charakterystyki czasowej zastosowanego detektora fotonów, a tym samym sprawia, że dopasowania histogramów czasu życia są dokładniejsze.

3. Konwersja nagrań fotonowych na obrazy FLIM

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do konwersji PT32ICS5.
    UWAGA: Dane dotyczące okresu eksploatacji mogą być również analizowane przez inne oprogramowanie, w tym oprogramowanie kilku dostawców mikroskopów.
  2. Skonfiguruj oprogramowanie PT32ICS.
    1. Ustaw rozmiar obrazu na 256 × 256 pikseli za pomocą Ustawienia | Rozmiar.
    2. Ustaw kanał na 2 za pomocą opcji Ustawienia | Rozmiar.
      UWAGA: Kanał emisji mCitrine zależy wyłącznie od konfiguracji mikroskopu. Nieprawidłowy kanał spowoduje powstanie obrazu FLIM bez fotonów (np. obraz), a w rezultacie pusty plik 'LifetimeTable.txt'. Właściwy kanał można zidentyfikować metodą prób i błędów.
    3. Ustaw opcję Output (Wyjście) na ImageJ (xyz) (lub TRI2 (xyt)) w celu generowania obrazów FLIM (krok 3.4).
  3. Naciśnij przycisk Konwertuj i załaduj jeden lub więcej śladów fotonów (pliki .pt3). Aby zaznaczyć wiele śladów fotonów, przytrzymaj wciśnięty Ctrl.
    UWAGA: Można również przekonwertować nowszy 64-bitowy format .ptu.
  4. Upewnij się, że oprogramowanie PT32ICS generuje następujące pliki w tym samym folderze, w którym zapisane są pliki pt3: jeden stos fotonów na ślad fotonów .pt3 w standardowym formacie cytometrii obrazowej (.ics), jeden plik bitmapowy na ślad fotonowy .pt3 (.bmp), plik tekstowy na konwersję (_Report.txt) zawierający informacje o statystyce fotonów (tj., całkowitą liczbę fotonów w każdym śladzie fotonu .pt3, rozdzielczość czasową detektora) oraz drugi plik tekstowy na konwersję (_LifetimeTable.txt) zawierający histogramy całkowitego czasu życia fluorescencji w formacie rozdzielanym tabulatorami dla każdego śladu fotonów .pt3.
    UWAGA: Plik .ics może być używany do dopasowywania pojedynczych pikseli w celu generowania obrazów FLIM, na przykład za pomocą oprogramowania TRI212,13 lub biblioteki dopasowania krzywych SLIM w FIJI ImageJ14,15. Plik ten może być również używany do analizy Phasor16, na przykład z wtyczką Time Gated Phasor dla FIJI od Spechron. Plik bitmapowy nie zawiera żadnych informacji o okresie istnienia. Drugi plik tekstowy jest używany do analizy FLIM całej komórki w kroku 4.

4. Dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do analizy FLIM dla całych komórek

UWAGA: Ten krok (dekonwolucyjne dopasowanie IRF) wymaga oprogramowania zdolnego do dekonwolucyjnego dopasowania. Dopasowywanie nachyleń histogramów fluorescencji bez dekonwolucji IRF można również wykonać za pomocą innego oprogramowania.

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych, które może pasować do dekonwolucji (Tabela materiałów) i zaimportuj plik tekstowy zawierający histogram dla każdego śladu fotonu (_LifetimeTable.txt) za pomocą opcji Plik | Import | Pojedynczy kod ASCII.
  2. Zreorganizuj tabelę w taki sposób, aby IRF znajdował się w drugiej kolumnie tabeli (za pomocą polecenia Kopiuj i Wklej). Umieść IRF w drugiej kolumnie B obok wartości czasu w pierwszej kolumnie A.
  3. Określ jakość zarejestrowanych śladów fotonów, zaznaczając wszystkie kolumny, naciskając Ctrl + A i wybierając pozycję Wykres | Wiele paneli | 9 paneli. Nie analizuj śladów fotonów o wysokim piku odbicia (Rysunek 4F).
  4. Za pomocą Ctrl wybierz wszystkie kolumny zawierające histogramy czasu życia o kontrolowanej jakości, które zostaną dopasowane, a także IRF w kolumnie B i załaduj dopasowanie nieliniowe za pomocą opcji Analiza | Dopasowanie | Dopasowanie krzywej nieliniowej | Otwórz okno dialogowe.
  5. Wczytać funkcję dopasowania zdekonwolucyjnego (dostępną w pliku uzupełniającym 1), dodając tę funkcję do oprogramowania analitycznego (za pomocą punktu menu Kategoria | Zdefiniowane przez użytkownika | Funkcjonować | Dodaj). Wybierz plik funkcji dopasowania 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Ta funkcja pasuje do histogramów czasu życia fluorescencji z funkcją rozpadu monowykładniczego zdekonwolucyjną za pomocą IRF (tj. drugiej kolumny B w tabeli) (równanie 1):
    figure-protocol-1 (Równanie 1)
    przy czym t jest czasem, τ jest pozornym czasem życia fluorescencji, A amplitudą, a y0 przesunięciem.
    UWAGA: Inną opcją jest dopasowanie histogramów czasu życia za pomocą dwuwykładniczej funkcji dopasowania (równanie 2):
    figure-protocol-2 (Równanie 2)
    Ustalając czas życia składnika wolnego (τ1) do warunku tylko dawcy (krok 1.1.2: próbka #1) i czasu życia składnika szybkiego (τ2) do konstruktu tandemowego (próbka #3), pozwala to na oszacowanie frakcji białek SNARE w kompleksie (F) na podstawie amplitud składników wolnych (A1) i szybkich (A2; patrz Dyskusja; równanie 3):
    figure-protocol-3 (Równanie 3)
    Plik funkcji dopasowania dla zdekonwolucyjnego dopasowania dwuwykładniczego "FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf" jest dostępny w pliku uzupełniającym 2.
  6. Wybierz opcję Dopasowane łuki | X Typ danych taki sam jak Dane wejściowe.
    UWAGA: Spowoduje to odpowiednie skalowanie osi x dopasowanych krzywych.
  7. Dopasuj krzywe, naciskając Fit.
    UWAGA: Spowoduje to przekonwertowanie dopasowania i wygenerowanie "arkusza raportu" w tablicy z tabelą zawierającą czasy życia fluorescencji, przesunięcia i amplitudy. Wygeneruje również arkusz danych z dopasowanymi krzywymi i pozostałościami dopasowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzasadnienie testu do pomiaru interakcji SNARE za pomocą FRET-FLIM jest pokazane w Rysunek 1. C-końce transbłonowych helis pokrewnych białek SNARE są połączone z parą spektralnie przesuniętych białek fluorescencyjnych (np. mCitrine i mCherry). Tworzenie kompleksu cis-SNARE po fuzji błonowej powoduje, że te fluorescencyjne białka natychmiast przeciwstawiają się sobie nawzajem i FRET. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne obrazy konfokalne komórek HeLa wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka SNARE. Pokazano komórkę wyrażającą syntaksynę 4-mCitrine (fluorofor dawcy) z VAMP3-mCherry (fluorofor akceptorowy), a także warunki kontrolne komórek wyrażających tylko konstrukt składniowy 4-mCytryny (tylko dawca; bez FRET) i syntaksynę 3 połączoną zarówno z mCytryną, jak i mCherry w tandemie (maksymalny oczekiwany FRET). Rysunek 3 pokazuje towarzyszący czas życia fluorescencji i obrazy FLIM wygenerowane przez dopasowanie histogramów życia każdego piksela do funkcji zaniku mono-wykładniczego (Rysunek 3A-B) i funkcji rozpadu dwuwykładniczego (Rysunek 3C-D). Rysunek 4A pokazuje IRF naszego zestawu mierzony przez rozpraszanie wsteczne szkła nakrywkowego mikroskopu. W Rysunek 4B-E pokazane są reprezentatywne histogramy czasu życia fluorescencji analizy FLIM całej komórki wraz z towarzyszącymi krzywymi dopasowania dla funkcji rozpadu mono-wykładniczego. Rysunek 4F pokazuje histogram czasu życia fluorescencji eksperymentu zobrazowany zbyt blisko powierzchni szkła nakrywkowego mikroskopu, co skutkuje wyraźnym szczytem odbicia. Rysunek 4G przedstawia histogram czasu życia z reprezentatywnym dopasowaniem z funkcją rozkładu dwuwykładniczego.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat uzasadnienia wizualizacji kompleksów SNARE za pomocą FRET. (A) Model strukturalny neuronalnych SNARE (baza danych białek 3HD717) białka błonowego związanego z pęcherzykami (VAMP) 2 (niebieski; R), składnia 1 (czerwona; Qa-SNARE) i SNAP25 (zielony; zawiera zarówno motyw Qb, jak i Qc-SNARE). C-koniec transbłonowej helisy syntaksyny-1 jest sprzężony z mCytryną (fluorofor donor; baza danych białek 3DQ118). C-koniec transbłonowej helisy VAMP2 jest sprzężony z mCherry (fluorofor akceptorowy; baza danych białek 2H5Q19). (B) Schemat fuzji błonowej za pośrednictwem SNARE prowadzącej do FRET. Po fuzji błonowej poprzez utworzenie kompleksu cis-SNARE, SNARE są natychmiast zestawiane ze sobą, co skutkuje FRET. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ekspresja białek SNARE połączonych z białkami fluorescencyjnymi. Pierwsza kolumna: fluorofor dawcy, wzbudzony przy 516 nm. Druga kolumna: fluorofor akceptorowy, wzbudzony przy długości fali 610 nm. (A) Warunek tylko dawcy. Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa eksprymującej syntaksynę 4-mCitrine (fluorofor donorowy; zielony w połączeniu). Kanał akceptorowy (druga kolumna) pokazuje przesłuch fluorescencyjny. B) Kontrola ujemna (bez FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wyrażającej zarówno składniówkę 4-mcytryny, jak i VAMP3-mCherry (fluorofor akceptorowy; magenta w połączeniu). C) Kontrola dodatnia (maksymalny oczekiwany FRET). Reprezentatywny obraz konfokalny komórki HeLa wyrażającej syntaksynę tandemowego konstruktu 3-mCitrine-mCherry. Należy zauważyć, że sygnał fluorescencyjny sygnałów mCitrine i mCherry nie pokrywa się całkowicie, prawdopodobnie z powodu niższej odporności mCitrine na degradację lizosomalną w porównaniu z mCherry (patrz sekcja Dyskusja). BF: jasne pole. Podziałka skali, 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Obrazy FLIM formowania się kompleksu SNARE. (A) Reprezentatywne obrazy czasu życia fluorescencji komórek pokazane na Rysunek 2. Obrazy zostały wygenerowane poprzez uprzednią konwersję śladów fotonów zarejestrowanych przez system TCSPC (.pt3) do standardu cytometrii obrazowej (.ics) przy użyciu oprogramowania PT32ICS. Obrazy czasu życia fluorescencji dopasowane do pojedynczego piksela zostały następnie wygenerowane za pomocą oprogramowania TRI2 12,13 z progowaniem od intensywności 15 do 100%, 7-pikselowym okrągłym binningiem i algorytmem dopasowania monowykładniczego (Marquardt). Kolor wskazuje średni pozorny czas życia fluorescencji. (B) Obrazy FLIM, na których obrazy czasu życia fluorescencji (pokazane w panelu A) były skręcone z intensywnością fluorescencji fluoroforu donorowego mCitrine (pokazane w Rysunek 2). Konwolucja została wykonana za pomocą FIJI ImageJ przy użyciu specjalnie przygotowanego makra (patrz tabela materiałów). (C) Czas życia fluorescencji i obrazy FLIM komórki HeLa wyrażające zarówno składnię 4-mCitrine, jak i VAMP3-mCherry z paneli A-B, ale teraz z dopasowaniem do krzywych rozpadu dwuwykładniczego (z czasem życia ustalonym do warunków kontrolnych; patrz krok 4.4 w protokole). Kolory pikseli wskazują szacowane ułamki F składni 4 w połączeniu z VAMP3 (równanie 3). (D) Taki sam jak panel B, ale dla dopasowania dwuwykładniczego. Konwolucja została wykonana za pomocą FIJI ImageJ przy użyciu specjalnie przygotowanego makra (patrz tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza FLIM całej komórki. (A) Funkcja odpowiedzi według wskazań przyrządów (IRF) konfiguracji. IRF mierzono za pomocą rozpraszania wstecznego na granicy faz szkło-woda (przy użyciu czystego szklanego naczynia mikroskopowego zawierającego wodę). (B-E) Histogramy życia całej komórki dla komórek pokazanych na Rysunek 2 i Rysunek 3. Wszystkie fotony obecne na obrazach zostały połączone. Krzywe zostały zdekonwolucyjne za pomocą IRF i wyposażone w monowykładnicze funkcje rozpadu (równanie 1). Dla tych komórek czas życia fluorescencji uzyskano na poziomie 2,82 ns (komórki wyrażające tylko syntaksynę 4-mCytryny; tylko dawca; panel B), 2,09 ns (komórki wykazujące współekspresję składtaksyny 4-mCytryny z VAMP3-mCherry; panel C) i 2,08 ns (komórki wyrażające konstrukt tandemowy 3-mCitrine-mCherry; maksymalna oczekiwana kontrola FRET; panel D). Inkrustacje pokazują te same wykresy, ale teraz ze skalowaniem logarytmicznym osi y. Panel E przedstawia nałożenie krzywych zaniku paneli B-D. (F) Przykład fluorescencyjnego histogramu czasu życia zarejestrowanego zbyt blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego mikroskopu. Powoduje to duży szczyt odbicia (przedstawiony przez żółty zacieniony obszar). (G) Taki sam jak panel C, ale teraz pasujący do krzywej rozpadu dwuwykładniczego z czasami życia ustalonymi do warunków kontrolnych (patrz krok 4.4 w protokole). Amplitudy składowych szybkich (A1) i wolnych (A2) wynosiły odpowiednio 14,42 i 0,01, co daje szacowany ułamek SNARE w kompleksie F równy 0,99 (równanie 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Plik funkcyjny FLIM_convoluted_IRF Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Plik funkcyjny FLIM_convoluted_IRF_biexp Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten demonstruje zastosowanie FRET-FLIM do wizualizacji interakcji SNARE między składnią 4 i VAMP3 w żywych komórkach HeLa. Syntaksyna 4 jest białkiem Qa-SNARE zlokalizowanym głównie w błonie plazmatycznej, gdzie pośredniczy w egzocytozie 1,2,20,21. VAMP3 jest R-SNARE, który jest głównie opisywany do lokalizacji w recyklingu przedziałów endosomalnych i pośredniczy w transporcie do innych endosomów, a także do błony komórkowej 1,2,20. Jednak test FRET-FLIM można łatwo dostosować do badania innych białek SNARE. Jedynym warunkiem jest to, że te SNARE zawierają C-końcową transbłonową helisę, co ma miejsce w przypadku większości białek SNARE zdecydowanie 1,2. Ponadto opisany tutaj protokół można dostosować do wizualizacji kompleksów SNARE w dowolnym typie komórek eukariotycznych, w tym w roślinach i drożdżach. W tym protokole wykorzystaliśmy skrócenie czasu życia fluorescencji fluoroforu dawcy jako miarę FRET. Jako podejście uzupełniające można zbadać czas życia fluoroforu akceptorowego, ponieważ uczulona emisja powoduje wyraźną fazę narastania, która dostarcza jednoznacznego dowodu na to, że zachodzi rezonansowy transfer energii.

Obecnie technika FRET-FLIM może nie być w stanie uwidocznić kompleksów SNARE w przedziałach lizosomalnych. W przypadku konstruktu tandemowego składniowego 3-mCitrine-mCherry fluorescencja mCherry często jest bardziej skumulowana w obszarze przyjądrowym, który prawdopodobnie odpowiada przedziałom lizosomalnym, podczas gdy sygnał mCitrine jest bardziej obfity na obrzeżach komórkowych5. Zaobserwowano podobną akumulację mCherry w porównaniu z mCytryną, gdy te same białka SNARE połączone z tymi białkami fluorescencyjnymi ulegały koekspresji5. Lizosomy charakteryzują się wyjątkowo niskim pH (< 4) i wysoką aktywnością enzymów proteolitycznych. Akumulacja mCherry jest prawdopodobnie spowodowana wyższą odpornością fluoroforu mCherry na degradację lizosomalną w porównaniu z fluoroforem mCitrine. Nie jest to spowodowane wygaszaniem pH mCytryny, ponieważ akumulacja mCherry w zestawieniach zachodzi również po utrwaleniu komórek5. W związku z tym technika FRET-FLIM zaniża ilość FRET w przyjądrowych (lizosomalnych) regionach, a to wymagałoby innych fluorescencyjnych białek reporterowych, które przetrwają trudne warunki w świetle lizosomów.

FRET-FLIM w zasadzie pozwala na uzyskanie (pół)ilościowego oszacowania frakcji SNARE w kompleksie5. Jak wyjaśniliśmy w tym protokole, wymaga to dopasowania histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu podwójnie wykładniczego (równanie 2), gdzie amplituda szybkiej składowej jest proporcjonalna do frakcji SNARE w kompleksie (równanie 3). Jednak takie dopasowanie do modelu dwukomponentowego jest technicznie trudne. Dopasowanie z wieloma parametrami swobodnego dopasowania (dwa czasy życia fluorescencji i dwie amplitudy) wymaga bardzo dużej liczby fotonów, zwłaszcza, że parametry będą na siebie wpływać, a małe błędy w czasie życia będą wpływać na amplitudy i odwrotnie. Aby przezwyciężyć te problemy z dopasowaniem, czasy życia fluorescencji składnika powolnego można ustalić na czas życia warunku tylko dawcy (tj. brak FRET; obecna jest tylko mCytryna), a czas życia składnika szybkiego na czas życia konstruktu tandemowego (maksymalny oczekiwany FRET). Należy to jednak również interpretować z ostrożnością, ponieważ czas życia fluorescencji może nie być taki sam jak w tych stanach kontrolnych i może się różnić z wielu powodów (samowygaszanie, orientacja dipolowa, zmiany w mikrośrodowisku). Wiele kompleksów SNARE w bliskiej odległości (< 10 nm) może powodować FRET zależny od odległości, tę samą zasadę, która pozwala na użycie FRET jako "linijki molekularnej", ale w tym przypadku zaciemnia kwantyfikację kompleksów SNARE. Co więcej, oszacowanie ilościowe nie zawsze jest miarodajne, ponieważ oznaczone SNARE konkurują z endogennymi (nieoznakowanymi) SNARE. W związku z tym poziom ekspresji SNARE znakowanego mCherry jest głównym wyznacznikiem procentowej zawartości FRET5. Ze względu na wszystkie te zastrzeżenia zaleca się dopasowanie histogramów czasu życia fluorescencji do funkcji rozpadu monowykładniczego (równanie 1). Ma to tę zaletę, że nie wymaga żadnej wiedzy a priori na temat czasów życia, a wynikający z tego pozorny średni czas życia fluorescencji stanowi solidną miarę dla kompleksowania SNARE5.

Niemniej jednak oczekuje się, że ilościowe obrazowanie FRET-FLIM za pomocą dwuskładnikowych modeli dopasowania będzie miało w przyszłości potężne zastosowania. Geny kodujące SNARE w chromosomie mogą być łączone z fluorescencyjnymi białkami reporterowymi, na przykład za pomocą CRISPR/CAS9. Powoduje to fluorescencyjne znakowanie endogennych białek SNARE, z endogennymi poziomami białek i bez tła nieznakowanych SNARE, a tym samym pozwala na miarodajne ilościowe oszacowanie frakcji kompleksów SNARE przez FRET-FLIM. Podczas gdy poziomy ekspresji endogennych SNARE mogą być dość niskie i dawać stosunkowo niskie sygnały fluorescencyjne, oczekuje się, że można uzyskać wystarczającą liczbę fotonów, szczególnie dla całej komórki FLIM (która wymaga tylko kilku 1000 fotonów). Co więcej, te pomiary FRET-FLIM mogą być wykonywane za pomocą bardziej czułych detektorów fotodiod lawinowych, co również spowoduje wyższe sygnały fluorescencji i lepsze statystyki fotonów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez stypendium Hypatia z Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud, Nagrodę Rozwoju Kariery od Human Frontier Science Program, Program Grawitacji 2013 od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; ICI-024.002.009), grant VIDI z NWO (ALW VIDI 864.14.001) oraz grant na rozpoczęcie działalności od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (umowa o grant nr 336479).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plazmidowa "syntaksyna 4-mCytryny"AddgeneID 92422Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).
Plazmidowe DNA 'VAMP3-mCherry'AddgeneID 92423Można również stosować inne SNARE z białkami fluorescencyjnymi połączonymi z ich C-końcowymi helisami transbłonowymi. Zamiast mCitrine-mCherry można również zastosować inne pary donor-akceptor spektralnie oddzielonych fluoroforów (np. CFP-YFP).
Plazmidowa DNA "syntaksyna 3-mCitrine-mCherry"AddgeneID 92426Kontrola pozytywna dla maksymalnego osiągalnego FRET.
Hela cells
35 mm naczynia ze szklanym dnem Willco WellsHBST-3522Inne komory do obrazowania żywych komórek będą działać jako substytut
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco, Life Technologies31966-021
Surowica cielęca płoduGreiner Bio-one758093
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczyGibco, Life Technologies15240-062Pen/Strep będzie działać jako substytut
Obrazowanie żywych komórek średniThermo Fisher ScientificA14291DJKażde inne rozwiązanie do obrazowania żywych komórek będzie działać, o ile uniemożliwi się fluorescencję z pożywki
Mikroskop konfokalny Leica SP8 z obiektywem 63x 1.20 NA do zanurzenia w wodzieLeicaSP8Można również stosować inne mikroskopy konfokalne z technologią FLIM w dziedzinie czasu
Laser pulsacyjny ze światłem białymLeicaSP8Można również zastosować
System zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC)Oprogramowanie
Dostępne w sekcji "Oprogramowanie" www.membranetrafficking.com
Wykonane na zamówienie makro Fiji ImageJ do konwolucji obrazu FLIM z intensywnościąFiji ImageJDostępne w sekcji "Oprogramowanie" w www.membranetrafficking.com
Bü rker HemocytometrVWR630-1541
Ogniwa HeLaATCCATCC  CCL-2
PBSB Braun Melsungen  AG362 3140
EDTA 2 mMMerck108417CAS: 60-00-4
Probówki 15 mlGreiner Bio-one188271
Trypan niebieskiSigma Aldrich93595CAS: 72-57-1
Urządzenie do elektroporacji ogniw neonowychThermo Fisher ScientificMPK5000S
inne impulsowe źródła lasera do konwersji PT32ICS PicoQuant PicoHarp 300 program do analizy danych zdolny do dekonwolucji Originlabs OriginPro 2016 Fiji ImageJ

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs - engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).
  2. Hong, W. SNAREs and traffic. Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).
  3. van den Bogaart, G., Jahn, R. Counting the SNAREs needed for membrane fusion. J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).
  4. Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking. Traffic. 10 (10), Copenhagen, Denmark. 1543-1559 (2009).
  5. Verboogen, D. R. J., González Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation. eLife. 6, (2017).
  6. Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses. J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).
  7. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  8. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  9. JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2017).
  10. Thermo Fisher Scientific. NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM. Proc. SPIE. 5700, 171(2005).
  13. Barber, P., et al. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).
  14. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. Biosensor Förster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).
  17. Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane. Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).
  18. Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift. PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).
  19. Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).
  20. Veale, K. J., Offenhäuser, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration. Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).
  21. Gómez-Jaramillo, L., et al. Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells. J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka SNAREanaliza FRET FLIMhistogramy czasu ycia fluorescencjitransport b onowyobrazowanie ywych kom rekmikroskopia konfokalnaanaliza ladu foton wdopasowanie nieliniowefunkcja odpowiedzi przyrz du

Powiązane artykuły