Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

DOI:

10.3791/56750

⸱

6 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Maine Medical Center Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zrębu szpiku kostnego (BMSC) stanowią populację komórek rutynowo używaną jako reprezentacja mezenchymalnych komórek macierzystych in vitro. Znajdują się one w jamie szpiku kostnego wraz z krwiotwórczymi komórkami macierzystymi (HSC), które mogą dawać początek czerwonym krwinkom, immunologicznym komórkom progenitorowym i osteoklastom. W związku z tym ekstrakcje populacji komórek ze szpiku kostnego powodują bardzo niejednorodną mieszankę różnych populacji komórek, co może stanowić wyzwanie w projektowaniu eksperymentalnym i zakłócać interpretację danych. W laboratoriach opracowano kilka technik izolacji i hodowli w celu uzyskania mniej lub bardziej jednorodnych populacji BMSC i HSC in vitro. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody izolacji BMSC i HSC z kości długich myszy: jedną metodę, która daje mieszaną populację BMSC i HSC, a drugą metodę, która próbuje oddzielić dwie populacje komórek na podstawie adherencji. Obie metody dostarczają komórek odpowiednich do eksperymentów różnicowania osteogennego i adipogennego, a także do testów funkcjonalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne mysie BMSC są powszechnie używane jako model in vitro mezenchymalnych komórek macierzystych od czasu ich odkrycia na początku lat 80-tych1. Rzeczywiście, w wielu badaniach hodowle komórek przylegających do plastiku wypłukanych z jamy szpiku kostnego kości długich zachowują zdolność do różnicowania się w osteoblasty, osteoklasty, chondrocyty lub adipocyty2,3,4,5. Jednak szpik kostny jest unikalną tkanką składającą się z wielu różnych populacji komórek, w tym między innymi BMSC, HSC, śródbłonka i komórek odpornościowych. W ten sposób techniki izolacji i hodowli mogą dać populacje komórek o różnej jednorodności. Stosowanie takich technik do badania potencjału różnicowania komórek może być trudne. Na przykład, porównując komórki myszy o różnych genotypach, rozpoczęcie od mieszanej populacji komórek ogranicza interpretację danych. I odwrotnie, uzyskanie jednorodnych populacji BMSC i HSC może być technicznie trudne i może nie być tak reprezentatywne dla modelu ex vivo.

W naszym laboratorium jesteśmy przede wszystkim zainteresowani wykorzystaniem BMSC ze względu na ich potencjał do różnicowania się na osteoblasty, osteoklasty i adipocyty. W niniejszej pracy przedstawiono techniki izolacji i hodowli BMSC i HSC stosowane do oceny osteoblastogenezy lub adipogenezy in vitro, a także hodowle HSC do różnicowania w osteoklasty. Jedna z metod wykorzystuje mieszaną populację komórek szpiku kostnego (BMC) zawierających BMSC i HSC bezpośrednio odpowiednie do adipogenezy, osteoblastogenezy i osteoklastogenezy (zwanych całkowitymi BMC). Metoda ta jest bliższym odwzorowaniem ex vivo niejednorodności występującej między komórkami mikrośrodowiska szpiku kostnego. Inna metoda polega na oddzieleniu komórek adherentnych od nieprzylegających w celu wyhodowania "czystszych" populacji BMSC i HSC (zwanych adherentnymi BMSC). Druga metoda pozwala na rozpoczęcie eksperymentów z hodowlą komórkową z dokładniejszą liczbą BMSC lub HSC i zmniejsza potencjał złożonych skutków pośrednich innych populacji komórek, które pozostają w hodowli. Obie metody zostały wcześniej opublikowane i wykorzystane do odpowiedzi na różne pytania badawcze6,7,8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Instytucie Badawczym Centrum Medycznego Maine.

1. Przygotowanie probówek zbiorczych

  1. Przygotuj pożywkę hodowlaną BMSC, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę α (MEM α) 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny.
  2. Umieść 100 μl pożywki hodowlanej BMSC w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. 3 kości zwykle mieszczą się w jednej probówce, więc odpowiednio się przygotuj.
  3. Przyciąć końcówki pipet o pojemności 200 μl na tyle, aby zmieściły się w probówkach wirówkowych. Włóż końcówki do tubek i upewnij się, że pokrywki mogą się zamknąć przed umieszczeniem probówek na lodzie.
    UWAGA: Alternatywnie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,75 ml z odciętymi końcami można włożyć do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.

2. Zbiór kości z myszy

  1. Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą CO2 , a następnie zwichnięciu szyjki macicy i spryskaj je 70% etanolem.
    UWAGA: Upewnij się, że wykorzystywane są zwierzęta tej samej płci i najlepiej w tym samym wieku. Rutynowo wykorzystujemy zwierzęta w wieku od 7 do 8 tygodni. Zalecamy łączenie komórek z co najmniej 3 zwierząt w każdej grupie eksperymentalnej, aby uzyskać lepiej reprezentatywną i odtwarzalną populację komórek.
  2. Umieść uśpioną mysz na plecach na desce sekcyjnej. Użyj kleszczy, aby stworzyć namiot ze skóry na brzuchu. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Oderwij skórę w kierunku kończyn i stóp od rozcięcia, aby odsłonić dolną część brzucha i nogi.
    1. Wytnij poniżej stawu skokowego, aby usunąć stopę. Przeciąć wzdłuż grzebienia biodrowego w biodrze, aby oddzielić głowę kości udowej od kości biodrowej. Gdy mysz jest jeszcze na grzbiecie, wykonaj nacięcie na środku kości biodrowej, aby oddzielić dwie kości biodrowe.
  3. Za pomocą niestrzępiących się chusteczek ostrożnie usuń mięsień z kości udowych, piszczelowych i biodrowych.
    UWAGA: Wycięcie jak największej ilości ścięgien i mięśni z kości sprawia, że czyszczenie jest szybsze i łatwiejsze dzięki niestrzępiącym się chusteczkom (np. chusteczkom kimwipes). Zachowaj ostrożność podczas manipulowania kośćmi, ponieważ mają one tendencję do łatwego łamania się, a ich kruchość może być zwiększona w przypadku niektórych genotypów.
  4. Po wycięciu wszystkich próbek umieścić je w PBS na lodzie i przenieść do sterylnego kaptura hodowlanego na pozostałe etapy izolacji.
    UWAGA: Praca w asepcie w jak największym stopniu zmniejszy ryzyko zanieczyszczenia kultur.
  5. Wykonaj małe nacięcia (około 1 do 2 mm) zarówno na bliższym, jak i dalszym końcu kości przed umieszczeniem ich w podzielonych na sekcje końcówkach w probówkach wirówkowych.
    Uwaga: Upewnij się, że pokroiłeś wystarczającą ilość, aby szpik mógł zostać odwirowany; Należy jednak zachować ostrożność, aby nie ciąć zbyt mocno, ponieważ populacje komórek mają tendencję do różnicowania się w zależności od odległości w przestrzeni szpikowej.
  6. Wirować przy 10 000 x g przez 15 s w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że cały szpik został przepłukany i granulowany na dnie probówki o pojemności 1,5 ml, podczas gdy kości znajdują się wewnątrz wkładek (końcówka pipety o pojemności 200 μl lub probówka do mikrowirówki o pojemności 0,75 ml). Po pobraniu całego szpiku należy usunąć wkładki z kośćmi z probówek.
    UWAGA: Jeśli cały szpik zostanie przepłukany, kości będą białe. Jeśli jednak szpik pozostanie w niektórych kościach, spróbuj ponownie obciąć końcówki i odwirować.

3. Zawieszenie komórek

  1. Za pomocą igły 25 G powoli pociągnij granulki komórek w górę i w dół, aby rozbić grudki i połącz wszystkie próbki w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej BMSC na 500 μl próbek.
  2. Umieść filtr 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przepuść zawiesinę komórek przez ten filtr w celu usunięcia ewentualnych fragmentów kości.

4. Posiew i hodowla mieszanych populacji komórek szpiku kostnego (całkowite BMC)

UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

  1. Obliczyć liczbę komórek i pokryć je w pożywce hodowlanej w proporcji 1,0 x 106 komórek/cm2. Odczekać, aż 72 godziny mieszanej kultury się przyłączą.
    UWAGA: Zalecamy rozcieńczenie zawiesiny komórek 20x w pożywce hodowlanej i ponowne rozcieńczenie w błękicie trypanowym przed zliczeniem komórek za pomocą hemocytometru. W przypadku 7-tygodniowych samców myszy C57Bl6 / J rutynowo uzyskujemy liczbę komórek około 50 x 106 komórek, ale wiek, płeć i szczep mogą znacznie wpływać na liczbę komórek.
    UWAGA: Mieszana populacja komórek powinna dobrze przylegać na dnie kultury.
  2. Po 72 godzinach wyjmij nośnik i zastąp go nowym nośnikiem. Kontynuuj zmianę nośnika co drugi dzień i sprawdzaj, czy nie ma zbiegów. Kiedy komórki osiągną 80-100% zbieżności, są gotowe do różnicowania.
    UWAGA: Ponieważ ta kultura jest mieszana zarówno z BMSC, jak i HSC, może być bezpośrednio stosowana do osteoblastogenezy, adipogenezy, a także osteoklastogenezy.

5. Poszycie i kultura podzielonej populacji BMSC (adherentnych BMSC)

UWAGA: Komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

  1. Umieść wszystkie komórki pobrane z kości udowych, piszczelowych i biodrowych jednej myszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (55cm2 obszaru hodowlanego).
    UWAGA: Podczas łączenia 2-3 myszy C57BL/6J, zazwyczaj umieszczamy tę "całkowitą" populację szpiku kostnego w kolbieo średnicy 150 cm2.
  2. Po 48 godzinach mieszanej hodowli usunąć pożywki hodowlane (zawierające nieprzylegające HSC). Jeśli ma być przeprowadzone doświadczenie osteoklastogenezy, należy odłożyć tę populację komórek nieprzylegających na bok (patrz punkt 7), jeśli nie, odessać i wyrzucić te komórki.
  3. Ostrożnie umyć płytkę/kolbę PBS, aby nie naruszyć przyczepionych komórek.
  4. Usuń PBS i podnieś komórki, dodając 0,25% trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C przez 1-3 minuty. Ugasić trypsynę, dodając pożywkę komórkową do zawiesiny komórkowej. W tym momencie BMSC, które są teraz podniesione, mogą zostać policzone (jak to wcześniej zrobiono w kroku 4.1) i posiane do przyszłych eksperymentów.
  5. Oblicz liczbę komórek potrzebnych do poszycia. Odwirować wymaganą objętość zawiesiny komórek przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Komórki są zwykle platerowane na podstawie eksperymentów z punktami końcowymi. Na przykład, jeśli białko / RNA ma zostać wyizolowane, zwykle płytkujemy o większej gęstości (~ 1,0-2,0 x 106 komórek / dołek na płytce 6-dołkowej).
  6. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki hodowlanej potrzebnej do posiewu. Umieść komórki w pożywkach hodowlanych zgodnie z doświadczeniami i pozwól im się przyczepić na kilka dni. Gdy BMSC osiągną zbieg, przystąp do przeprowadzenia różnicowania.

6. Zróżnicowanie BMSC

  1. Osteoblasty
    1. Wykonać pożywkę różnicującą osteoblasty, dodając 800 μl 1 M fosforanu β-glicerolu w PBS i 200 μl 0,5 M kwasu askorbinowego w PBS do 99 ml pożywki BMSC (patrz krok 1.1 w celu zapoznania się ze składem pożywki BMSC).
      1. Gdy kultury BMSC (albo całkowite BMC z kroku 4.3, albo przylegające BMSC z kroku 5.6) zlewają się, różnicuj je w osteoblasty, zmieniając pożywki hodowlane na pożywki różnicujące osteoblasty.
    2. Pożywki różnicujące należy wymieniać co drugi dzień. Komórki zaczynają wytwarzać białe guzki mineralizacji. Wizualizuj je gołym okiem na dnie studni; Proces ten może nastąpić w ciągu kilku dni do 3 tygodni.
      1. W celu oceny osteoblastogenezy należy przeprowadzić barwienie fosfatazą alkaliczną i/lub barwienie metodą von Kossa na studzienkach, jak opisano w sekcji 8.
        UWAGA: Ostrożnie zmieniaj pożywkę, przechylając płytki pod niewielkim kątem, aby uniknąć przerwania monowarstwy ogniwa.
  2. Adipocyty
    1. Przygotuj pożywkę bazową adipocytów, mieszając ze sobą 90 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej, 1 ml penicyliny/streptomycyny, 100 μl 20 mM rozyglitazonu i 100 μl 2 mM insuliny. W razie potrzeby należy przechowywać tę pożywkę w temperaturze 4 °C przez tydzień podczas eksperymentu różnicowania.
    2. Przygotuj pożywkę do indukcji adipocytów, dodając 200 μl 62,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 25 μl 1 mM deksametazonu do 25 ml pożywki zasadowej adipocytów.
    3. Gdy posiewy BMSC (całkowite BMC z kroku 4.3 lub przylegające BMSC z kroku 5.6) zlewają się, zmień pożywkę na pożywkę do indukcji adipocytów. Zastanówmy się nad tym Dniem 0 zróżnicowania.
    4. Po 48 godzinach usunąć pożywkę i odświeżyć kulturę za pomocą pożywki do indukcji adipocytów.
    5. W dniu 4 należy przejść na pożywkę z zasadą adipocytów.
      UWAGA: Kropelki lipidów mogą zacząć pojawiać się już w dniu 2 lub 4.
    6. W dniu 7 obserwuj, że komórki zgromadziły maksymalną ilość kropelek lipidów i wykazują fenotyp podobny do dojrzałych adipocytów. Nie należy hodować powyżej tego punktu, ponieważ może to spowodować śmierć/oderwanie komórki.

7. Różnicowanie HSC na osteoklasty

  1. Wykonaj pożywkę różnicującą osteoklasty, dodając 50 μl 25 μg/ml aktywatora receptora liganda NFKB (RANKL) i 15 μl 25 μg/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (mCSF) do 25 ml pożywki hodowlanej BMSC.
  2. Po przyłączeniu wszystkich BMC (z kroku 4.3) lub komórek nieprzylegających (z kroku 5.2) do studzienki, pożywki hodowlane można przełączyć na pożywki różnicujące osteoklasty. Uzupełniaj pożywki różnicujące co drugi dzień.
  3. Obserwuj kultury osteoklastów każdego dnia pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu. Obserwuj, że osteoklasty łączą się i tworzą komórki wielojądrowe, zwykle około 5-7 dnia różnicowania.

8. Barwienie

  1. Osteoblasty
    UWAGA: Do barwienia fosfatazą alkaliczną (AP) często używamy zestawu do barwienia AP (patrz Tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi.
    1. Barwienie AP należy wykonać, postępując zgodnie z wytycznymi producenta zestawu.
      1. Odessać pożywkę i przepłukać komórki PBS. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 12 minut w temperaturze pokojowej.
      2. W międzyczasie przygotuj roztwór AP za pomocą odczynników z zestawu do barwienia AP, dodając 500 μl azotynu sodu do 500 μl roztworu alkalicznego FRV i delikatnie mieszając; odstawić na 2 minuty. Dodać 22,5 ml dH2O i 500 μl Naphthol AS-BI Alkaliczny. Delikatnie wymieszaj.
        Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
      3. Po utrwaleniu komórek przepłucz PBS i dodaj roztwór AP do każdej studzienki (1 do 2 ml na studzienkę). Przykryj folią aluminiową i pozostaw plamę na 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Zassać roztwór, przemyć wodą destylowaną i pozostawić płytkę do wyschnięcia.
    2. Zdobądź obrazy barwionych kolonii za pomocą kamery, aby obserwować dodatnie komórki fosfatazy alkalicznej.
    3. Alternatywnie wykonaj barwienie Von Kossa zamiast fosfatazy alkalicznej. W tym celu należy dokładnie umyć studzienki wodą destylowaną, ponieważ wszelkie pozostałe PBS wytrącą się azotanem srebra.
      1. Utrwal komórki za pomocą 4% PFA w PBS przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj tyle 5% roztworu azotanu srebra, aby przykryć studnię i wystawić na działanie silnego światła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń roztwór azotanu srebra i spłucz każdą studzienkę wodą destylowaną. Dodaj 5% roztwór tiosiarczanu sodu do komórek i odstaw na 3 minuty.
    5. Odessać tiosiarczan sodu i przemyć wodą destylowaną. Pozostaw płytkę do wyschnięcia i gołym okiem obserwuj osad mineralny zabarwiony na ciemnobrązowy/kolor.
  2. Adipocyty
    1. W przypadku barwienia czerwienią olejową O (ORO) utrwal komórki za pomocą 10% neutralnej buforowanej formaliny przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. W międzyczasie przygotuj roztwór podstawowy ORO, rozpuszczając 0,035 g w 10 ml izopropanolu. Jest to wystarczające dla płytki 6-dołkowej. Wymieszać i przepuścić roztwór za pomocą jednej bibuły filtracyjnej (wielkość porów 11 μm).
    3. Przygotować roztwór roboczy ORO, rozcieńczając 9 ml roztworu podstawowego ORO z 6 ml wody destylowanej. Pozostaw roztwór na kołysce, aż będzie gotowy do użycia.
    4. Przygotuj 60% izopropanolu w wodzie destylowanej (przygotuj tyle, aby przykryć każdą studzienkę).
    5. Po utrwaleniu komórek usuń utrwalacz i przemyj raz wodą destylowaną. Zastąp wodę 60% roztworem izopropanolu na 1 min.
      UWAGA: Dodawaj płyn powoli, przechylając talerz; Adipocyty bardzo łatwo się przemieszczają.
    6. Usuń izopropanol i dodaj tyle roztworu roboczego OR, aby pokryć wszystkie komórki. Inkubować przez 15 minut na wolnoobrotowym bujaku w temperaturze pokojowej. Usunąć ORO i przemyć dwukrotnie wodą destylowaną.
      UWAGA: W tym momencie pod mikroskopem można uwidocznić kropelki lipidów wybarwione ORO.
    7. Aby określić ilościowo ORO, należy odbarwić ORO, dodając 1 ml 100% izopropanolu do każdej studzienki i powoli kołysząc przez 10 minut.
    8. W międzyczasie przygotuj serię rozcieńczeń, aby utworzyć krzywą wzorcową na podstawie następujących 8 wzorców, używając roztworu roboczego ORO (2 100 μg/ml) i izopropanolu jako rozcieńczalnika: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 i 0 μg/ml.
    9. Załadować 200 μl wzorców i odbarwione próbki w trzech egzemplarzach na płytkę i odczytać absorbancję przy 490 nm.
      1. Określić stężenie ORO dla każdej próbki na podstawie krzywej wzorcowej.
        Uwaga: Zalecamy normalizację stężenia ORO do liczby komórek. Liczbę komórek można określić ilościowo za pomocą barwienia fioletem krystalicznym lub ilości DNA.
  3. Osteoklasty
    UWAGA: Gdy wszystko będzie gotowe, sugerujemy barwienie osteoklastów pod kątem kwasowej fosfatazy odpornej na winian (TRAP) za pomocą zestawu do barwienia TRAP (patrz Tabela materiałów).
    1. W przypadku barwienia TRAP utrwal komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego w PBS. W międzyczasie przygotuj roztwór TRAP, mieszając ze sobą 50 μl roztworu bazowego Fast Garnets, 50 μl azotynu sodu, 4,55 ml wody destylowanej, 50 μl naftolu AS-Bifosforanu, 200 μl roztworu octanu i 100 μl roztworu winianu.
    2. Odessać utrwalacz i dwukrotnie przepłukać komórki PBS przed dodaniem roztworu TRAP przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. Umyj wodą destylowaną przed policzeniem osteoklastów pod mikroskopem (powiększenie 10X). Komórki TRAP+ wydają się fioletowe z 3 lub więcej jądrami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd kultur komórkowych
Te dwie techniki hodowli pozwalają na ocenę zróżnicowania w mieszanej populacji BMC składającej się z BMSC i HSC (Total BMCs, Rysunek 1A) lub populacji BMSC oddzielonej od HSC (Adherent BMSC, Rysunek 1B). 48 godzin po wyizolowaniu i posianiu komórek ze szpiku (Ryc. 1C), szybko przyczepiają się do dna plastikowej płytki hodowlanej i mają tendencję do tworzenia monowarstwy. Gdy komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono dwie metody hodowli BMSC wraz z ich zaletami i ograniczeniami. Izolowanie komórek pochodzących ze szpiku kostnego jest procesem stosunkowo łatwym w użyciu. Jednak uzyskanie populacji komórek reprezentatywnych dla mezenchymalnych komórek macierzystych lub osteoklastycznych komórek progenitorowych może być trudne ze względu na zróżnicowane środowisko komórkowe jamy szpiku.

Hodowla całej zawartości szpiku kostnego zapewnia dokładne odwzorowanie mikrośrodowiska in vivo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ujawniają, że nie mają finansowego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
200μ Końcówki do pipet L Probówki17014401
1,5 mlUSA Scientific1615-5500
Probówka stożkowa 15 ml VWR89039-668
Rurka stożkowa 50 mlVWR89039-660
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Sigma-Aldrich21-040-CM
EtanolFisher Science04-355-451
Narzędzia
70 μ m filtryBD Falcon352350
0,25% trypsynaGibco25200
KimwipeVWR82003-820
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Science15710
Zestaw fosfatazy alkalicznejSigma-Aldrich86R
Azotan srebraSigma-AldrichS6506
Tiosiarczan soduSigma-AldrichS7026
Olej czerwony OSigma-AldrichO0625
IzopropanolSigma-Aldrich190764
10% neutralna buforowana formalinaSigma-AldrichF5554-4L
Filtr Whatman klasy 1Sigma-AldrichZ274852
Zestaw kwasowej fosfatazyodpornej na winianSigma-Aldrich387A
Aldehyd glutarowyelektron16220
MEM&alfa;Gibco12571
Surowica bydlęca płoduVWR97068-085
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15140-122
β-fosforan gliceroluSigma-AldrichG9891
Kwas askorbinowySigma-AldrichA4544
DMEM Wysoki poziom glukozy Sigma-AldrichD5796
RozyglitazonKajman Chemiczny717410
InsulinaSigma-AldrichI6634
IBMXSigma-AldrichI5879
DeksametazonSigma-AldrichD4902
RANKLPeprotech310-01
mCSFPeprotech315-02
Mikroskop inwerterowy Axio ObserverZeiss
wirówkowe Rainin do preparowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9(2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60(2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40(2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rekhodowla kom rkowar nicowanie osteogenner nicowanie adipogennehematopoetyczne kom rki macierzystefrakcja naczyniowo stromalnar nicowanie kom rekr nicowanie osteoklast w

Powiązane artykuły