Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

13.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Streszczenie

Chociaż wirus związany z adenowirusem (AAV) jest powszechnie akceptowany jako atrakcyjny wektor dla terapii genowej, służy również jako wirus modelowy do zrozumienia biologii wirusa. W tym ostatnim aspekcie niedawne odkrycie niestrukturalnego białka AAV, określanego mianem białka aktywującego składanie (AAP), rzuciło nowe światło na procesy związane z składaniem białek VP kapsydu wirusa w kapsyd. Chociaż wiele serotypów AAV wymaga AAP do montażu, niedawno informowaliśmy, że AAV4, 5 i 11 są wyjątkami od tej reguły. Ponadto wykazaliśmy, że AAP i złożone kapsydy różnych serotypów lokalizują się w różnych przedziałach subkomórkowych. Ta nieoczekiwana heterogeniczność właściwości biologicznych i funkcjonalnych ról AAP wśród różnych serotypów AAV podkreśla znaczenie badań nad AAP pochodzącymi z różnych serotypów. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje prosty test punktowy do oznaczania ilościowego AAV i jego zastosowanie do oceny zależności od AAP i swoistości serotypu w składaniu kapsydu. Aby zademonstrować użyteczność tego testu dot blot, postanowiliśmy scharakteryzować składanie kapsydu i zależność od AAP Snake AAV, wcześniej niescharakteryzowanego AAV, a także AAV5 i AAV9, które wcześniej wykazano, że są odpowiednio serotypami niezależnymi od AAP i zależnymi od AAP. Test wykazał, że montaż kapsydu Snake AAV wymaga Snake AAP i nie może być promowany przez AAP z AAV5 i AAV9. Test wykazał również, że w przeciwieństwie do wielu powszechnych serotypów AAP, które promują heterologiczne składanie kapsydu przez komplementację krzyżową, Snake AAP nie sprzyja składaniu kapsydów AAV9. Ponadto pokazujemy, że wybór nukleazy znacząco wpływa na odczyt testu dot blot, a zatem wybór optymalnego enzymu ma kluczowe znaczenie dla skutecznej oceny miana AAV.

Wprowadzenie

Wirus związany z adenowirusem (AAV) to mały, bezotoczkowy, jednoniciowy wirus DNA o genomie około 4,7 kilozasad (kb). Genom AAV zawiera otwarte ramki odczytu (ORF) dla genów rep i cap. W 2010 roku Sonntag i wsp. odkryli wcześniej niezidentyfikowane niestrukturalne białko kodowane przez ORF z przesunięciem ramki +1 w genie kapu AAV2 i stwierdzili, że odgrywa kluczową rolę w składaniu białek monomeru AAV2 kapsydu VP w wirusowy kapsyd class1. To nowe białko zostało nazwane białkiem aktywującym montaż (AAP) ze względu na rolę, jaką odgrywa w promowaniu składania kapsydu1.

ORFy dla AAP zostały zidentyfikowane bioinformatycznie w genomach wszystkich parwowirusów z rodzaju Dependoparvovirus, ale nie w genomach wirusów różnych rodzajów z rodziny parwowirusów1,2. Badania funkcjonalne tego nowego białka początkowo koncentrowały się na AAP z prototypu AAV2 (AAP2), który ustalił istotną rolę AAP2 w kierowaniu niezmontowanych białek VP do jąderka w celu ich akumulacji i tworzenia w pełni złożone kapsydy1,3,4. Niezdolność kapsydów AAV2 do złożenia się przy braku wyrażenia AAP została niezależnie potwierdzona przez wiele grup, w tym naszą1,2,3,4,5. Późniejsze badania nad serotypami AAV 1, 8 i 9 potwierdziły krytyczną rolę AAP w składaniu kapsydu, ponieważ białka monomeru VP3 AAV1, 8 i 9 nie były w stanie utworzyć w pełni złożonego kapsydu przy braku koekspresji AAP2.

Niedawno, dzięki podejściu, które obejmuje użycie ilościowych testów punktowych, zbadaliśmy zdolność monomerów AAV1 do 12 VP3 do łączenia się w kapsydy przy braku ekspresji AAP oraz zdolność AAP1 do 12 do promowania składania monomerów VP3 z heterologicznych serotypów. Badanie to wykazało, że monomery AAV4, 5 i 11 VP3 mogą składać się bez AAP. Ponadto stwierdzono, że osiem z dwunastu badanych przez nas serotypów AAP (tj. wszystkie oprócz AAP4, 5, 11 i 12) wykazywało szeroką zdolność do wspierania składania kapsydów heterologicznych serotypów AAV, podczas gdy AAP4, 5, 11 i 12 wykazywały znacznie ograniczoną zdolność w tym zakresie6. Te cztery serotypy są filogenetycznie odległe od pozostałych serotypów AAP2,3. Co więcej, badanie ujawniło znaczną heterogeniczność w subkomórkowych lokalizacjach różnych AAPs6. Co więcej, badanie sugeruje, że ścisły związek AAP ze złożonymi kapsydami i jąderkiem, cechą charakterystyczną składania kapsydu AAV2, niekoniecznie może być rozszerzony na inne serotypy, w tym AAV5, 8 i 9, które wykazują wykluczenie jąderkowe złożonych kapsydów6. W związku z tym informacje uzyskane z badania konkretnego serotypu AAP nie mają szerokiego zastosowania do całej biologii AAP. Tak zagadkowa natura biologii AAP podkreśla potrzebę zbadania roli i funkcji każdego AAP zarówno z kanonicznych, jak i niekanonicznych serotypów AAV.

Biologiczna rola AAP w tworzeniu kapsydu może być oceniona poprzez określenie w pełni upakowanych mian cząsteczek wirusa AAV wytwarzanych w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293, najczęściej używanej linii komórkowej do produkcji wektora AAV, z ekspresją białka AAP lub bez niej. Standardowymi metodami ilościowego oznaczania AAV są ilościowe testy oparte na PCR (qPCR)7,8 oraz ilościowe testy oparte na plamach punktowych9. Inne metody oznaczania ilościowego cząstek wirusa AAV, takie jak test immunoenzymatyczny 10,11 lub pomiar gęstości optycznej12 nie są idealne dla próbek pochodzących z wielu różnych serotypów AAV lub próbek zanieczyszczonych zanieczyszczeniami (surowe lizaty lub pożywki hodowlane), które często są próbkami wykorzystywanymi do badań AAV. Obecnie qPCR jest najczęściej stosowany do oznaczania ilościowego AAV; należy jednak wziąć pod uwagę potencjalne zastrzeżenia dotyczące testu opartego na qPCR, ponieważ test może skutkować błędami systemowymi i znacznymi zmianami miana13,14. Na testy oparte na PCR ma wpływ szereg potencjalnie mylących czynników, takich jak obecność kowalencyjnie zamkniętych końcowych spinek do włosów w matrycach PCR, które hamują amplifikację13. Nawet doświadczona osoba może nieświadomie wprowadzić potencjalne czynniki zakłócające do testu opartego na qPCR13. Natomiast ilościowe testy punktowe są klasyczną techniką biologii molekularnej, która nie obejmuje amplifikacji genomu i wykorzystuje znacznie prostszą zasadę przy minimalnym ryzyku błędów w porównaniu z testami opartymi na qPCR. Metoda jest mniej wymagająca technicznie; W związku z tym wyniki testów są w miarę powtarzalne nawet dla niedoświadczonych osób.

W tym raporcie opisujemy szczegóły metodologiczne ilościowego testu punktowego, którego rutynowo używamy do ilościowego oznaczania wektorów AAV, i podajemy przykład, jak zastosować test do badania promującej składanie roli AAP w popularnych serotypach (AAV5 i AAV9) oraz wcześniej niescharakteryzowanego AAP z Snake AAV14. W naturze białka AAV VP i białka AAP ulegają ekspresji w cis z pojedynczego genu (tj. Cis komplementacji VP-AAP), podczas gdy w opisanym tutaj teście białka VP i AAP są dostarczane w trans z dwóch oddzielnych plazmidów (tj. Transkomplementacja VP-AAP). Ponieważ każde białko VP lub AAP z różnych serotypów może ulegać ekspresji z każdego niezależnego plazmidu, możliwe staje się testowanie heterologicznych kombinacji VP-AAP pod kątem składania kapsydu (tj. komplementacji krzyżowej VP-AAP). Krótko mówiąc, AAV VP3 z różnych serotypów ulega ekspresji w komórkach HEK 293 przez transfekcję plazmidowego DNA w celu upakowania genomu wektora AAV w obecności lub braku pokrewnego serotypu AAP lub w obecności heterologicznego serotypu AAP. Po wyprodukowaniu pożywki hodowlane i lizaty komórkowe są poddawane testowi punktowemu w celu ilościowego określenia genomu wirusa w otoczce kapsydu. Pierwszym krokiem testu dot blot jest potraktowanie próbek nukleazą w celu usunięcia zanieczyszczających plazmidowych DNA i nieopakowanych genomów AAV w próbkach. Niezastosowanie się do tego spowodowałoby nasilenie sygnałów tła, w szczególności w przypadku oznaczania próbek nieoczyszczonych. Następnie stosuje się leczenie proteazą w celu rozbicia kapsydów wirusa i uwolnienia odpornych na nukleazy genomów wirusowych do roztworów próbek. Następnie genomy wirusów są denaturowane, osuszane na błonie i hybrydyzowane z sondą DNA specyficzną dla genomu wirusa w celu oceny ilościowej. W przedstawionym tutaj przykładowym teście pokazujemy, że Snake AAV VP3 wymaga Snake AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydów AAV9, w przeciwieństwie do wielu AAP pochodzących z serotypów zależnych od AAP, które mogą również promować składanie heterologicznych kapsydów serotypowych. Na koniec zgłaszamy ważne zastrzeżenie dotyczące testów ilościowych AAV opartych na qPCR lub dot blot, że wybór nukleazy znacząco wpływa na wyniki testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Składy roztworów i buforów niezbędnych do wykonania tego protokołu znajdują się w Tabeli 1. Opisany poniżej protokół dotyczy testu dot blot z wykorzystaniem komplementacji krzyżowej VP-AAP w celu zbadania roli białek AAP w montażu kapsydu. Metoda bardziej ogólnego ilościowego testu dot blot do miareczkowania oczyszczonego wektora AAV jest wyjaśniona w sekcji Reprezentatywne wyniki.

1. Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych VP3, AAP oraz AAV2 Rep

  1. Konstrukcja pCMV-AAVx-VP3 (x = serotypy)
    1. Przeprowadzić amplifikację PCR całej ramki odczytu (ORF) VP3 (1,6 kb), stosując polimerazę DNA o wysokiej wierności oraz następującą parę starterów: VP3 forward, CTAA-RE1-CACC-N25 (pierwsze 25 nukleotydów ORF VP3); VP3 reverse, TCTT-RE2-N25 (ostatnie 25 nukleotydów ORF VP3).
      UWAGA: RE1 i RE2 to miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych (REs) służące do klonowania. CTAA i TCTT to terminalne tetranukleotydy 5' i 3' dodane w celu ułatwienia trawienia enzymem restrykcyjnym w pobliżu końca dwuniciowego DNA. CACC to konsensusowa sekwencja Kozaka.
    2. Sklonować produkty PCR po trawieniu enzymami restrykcyjnymi pomiędzy odpowiadające im miejsca RE wektora ekspresyjnego dla ssaków, który wykorzystuje enhancer-promotor wczesny (CMV-IE) ludzkiego cytomegalowirusa do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji.
      UWAGA: W przypadku klonowania molekularnego, 5 µg DNA plazmidowego szkieletowego należy trawić enzymem/enzymami restrykcyjnymi w stężeniu 4 U/µg DNA przez 1 h w temperaturze optymalnej. Dla fragmentów PCR należy zwiększyć liczbę jednostek użytych enzymów (np. 10 U/µg produktu PCR ORF VP3 o długości 1,6 kb) oraz wydłużyć czas inkubacji (np. 4 h) ze względu na zwiększoną liczbę miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych na jednostkę długości. Przydatne informacje dotyczące enzymów biologii molekularnej i procedur klonowania, w tym transformacji bakteryjnej, można znaleźć w innych źródłach15,16,17.
  2. Konstrukcja pCMV-FLAG-AAPx (x = serotypy)
    1. Przeprowadzić amplifikację PCR całej ORF AAP (0,6 kb), z wyjątkiem pierwszego aminokwasu, stosując polimerazę DNA o wysokiej wierności oraz następującą parę starterów: AAP forward, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 nukleotydów począwszy od 4. nukleotydu w ORF AAP); AAP reverse, TCTT-RE2-N25 (ostatnie 25 nukleotydów ORF AAP).
      UWAGA: Sekwencja GACTACAAGGACGACGATGACAAA koduje znacznik FLAG, o którym wykazano, że nie wywołuje on szkodliwych efektów4,5, jednak można go pominąć, jeśli nie jest on wymagany.
    2. Sklonować produkty PCR po trawieniu enzymami restrykcyjnymi pomiędzy odpowiadające im miejsca wektora ekspresyjnego dla ssaków z enhancer-promotorem CMV-IE15,16,17.
  3. Konstrukcja pHLP-Rep
    1. Strawić 5 µg plazmidu pAAV-RC2 (7,3 kb) za pomocą 20 jednostek każdego z enzymów Xho I i Xcm I, a następnie oczyścić DNA przy użyciu komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA lub metodą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej.
      UWAGA: Usunięcie fragmentu Xho I-Xcm I o długości 1,8 kb z plazmidu pAAV-RC2 (7,3 kb) prowadzi do utraty ekspresji białka kapsydu VP przy zachowaniu ekspresji białka Rep.
    2. Wyrównać końce DNA za pomocą 6 jednostek polimerazy DNA T4, oczyścić fragment DNA o długości 5,5 kb za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie przeprowadzić samoligację oczyszczonego fragmentu, stosując od 50 do 100 ng DNA i 400 jednostek ligazy DNA T4 zgodnie z zaleceniami producenta15.
    3. Postępować zgodnie ze standardową procedurą transformacji bakteryjnej opisaną w uwadze do kroku 1.1.2.
  4. Zweryfikować konstrukty plazmidowe poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi oraz sekwencjonowanie15,18.
  5. Przeprowadzić miniprep lub maxiprep plazmidów przy użyciu dostępnych komercyjnie zestawów, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA plazmidowego do dalszych eksperymentów z produkcji AAV.

2. Produkcja AAV w komórkach HEK 293 poprzez transfekcję plazmidowego DNA (test komplementacji krzyżowej)

  1. Hodować komórki HEK 293 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy (4,5 g/l), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny & mieszanka streptomycyny oraz 1 mM L-glutaminy w 37 °C inkubator z 5% dwutlenkiem węgla (CO2)2).
    UWAGA: Miana AAV różnią się znacząco w zależności od źródła komórek HEK 293.
    Uwaga: Chociaż wirusy AAV mogą być przetwarzane w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL1), w przypadku pracy z komórkami HEK 293 zaleca się zachowanie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).
  2. Włączony Dzień -1 (24 h przed transfekcją), płytka 6–7 x 105 komórek HEK 293 na dołek w 2 ml pełnej pożywki opisanej w kroku 2.1 w płytce(ach) 6-dołkowej. Pozwala to zazwyczaj na osiągnięcie ~90% konfluencji następnego dnia.
  3. Dzień 0: Transfekcja
    1. Przygotowanie do transfekcji DNA
      1. Należy upewnić się, że komórki osiągnęły około 90% konfluencji.
      2. Podgrzać pożywkę DMEM uzupełnioną o 1% penicyliny & mieszanina streptomycyny i 1 mM L-glutaminy, ale bez 10% FBS (tj., pożywka bezsurowicza) w 37 °C łaźnia wodna
      3. Pozostawić roztwór polietylenoiminy (PEI) do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    2. Przygotowanie mieszaniny plazmidowego DNA
      1. Wymieszać plazmidy w 96 µL fosforanu soli buforowanej (PBS) bez CaCl22 lub MgCl22 w sterylnych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, zgodnie z treścią Tabela 2Całkowita ilość DNA wynosi 2 µg/well.
        UWAGA: Objętości roztworów DNA plazmidowego można pominąć, jeśli są one nominalne. Korektę objętości zaleca się w przypadku, gdy całkowita objętość roztworów DNA plazmidowego wynosi ≥10 µL.
    3. transfekcja z użyciem PEI
      1. Dodaj 4 µL roztworu PEI (1 mg/ml) do mieszaniny PBS i plazmidowego DNA (przygotowanej jak wyżej). Objętość końcowa wynosi około 100 µL (5% objętości pożywki hodowlanej). Krótko wymieszać probówki na wirówce typu vortex i inkubować mieszaninę DNA:PEI przez 15 min w temperaturze pokojowej.
      2. Podczas oczekiwania na zakończenie 15-minutowej inkubacji należy zastąpić pożywkę hodowlaną uprzednio ogrzaną pożywką bezsurowiczą opisaną w kroku 2.3.1.2.
      3. Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji mieszaniny DNA:PEI, krótko wiruj probówki w mikrocentry fudze, aby zgromadzić ciecz na dnie, a następnie dodawaj mieszaninę DNA:PEI kroplami do pożywki hodowlanej w każdym dołku płytki z hodowlą komórek HEK 293. Delikatnie potrząśnij płytkami i umieść je ponownie w 37 °C inkubator z 5% CO22.
      4. Utrzymywać komórki w tym medium do transfekcji aż do momentu zbioru w dniu 5. (wymiana medium nie jest konieczna).
  4. Włączony Dzień 1 i Dzień 2następnie należy zaobserwować komórki transfekowane plazmidem pCMV-GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym, aby ocenić wydajność transfekcji.
    UWAGA: Do mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystano obiektyw 10X o aperturze numerycznej 0,25 w połączeniu z okularem 10× oraz filtr pasmowy wzbudzenia 450–490 nm i filtr pasmowy emisji 515–565 nm. Powyższe warunki zazwyczaj pozwalają na uzyskanie wydajności transfekcji przekraczającej 70%. Komórki mogą wykazywać pewne zmiany morfologiczne (np. komórki stały się smukłe ze względu na warunki bezsurowicze.
  5. Włączony Dni 3–5następnie kontynuować hodowlę transfekowanych komórek w 37 °C inkubator z 5% CO22.
  6. Włączony Dzień 5należy zebrać zarówno komórki, jak i medium zawierające wirusy do 15 ml polipropylenowych probówek stożkowych, pipetując zawiesinę w górę i w dół lub zeskrobując komórki skrobaczką do komórek.
  7. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

3. Analiza Dot Blot do oznaczania ilości AAV

  1. Odzyskiwanie cząsteczek wirusowych
    1. Szybko rozmrozić zamrożone probówki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Energicznie mieszać probówki na vortexie przez 1 min, aby zmaksymalizować odzysk AAV z komórek.
    2. Zgradientować pozostałości komórkowe poprzez wirowanie przy 3 700 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Odpiąć 200 µL supernatantu z każdej probówki i przenieść go do opisanej probówki do mikrocentryfugi z zakrętką śrubową do analizy dot blot.
      UWAGA: Pozostały supernatant podzielić na alikwoty do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia. W tym przypadku zastosowano polipropylenowe probówki do mikrocentryfugi z zakrętkami śrubowymi i pierścieniem uszczelniającym O-ring. Szczelne zamknięcie jest wymagane, aby zapobiec wyciekom AAV oraz fenolu i chloroformu.
  2. Opracowanie endonukleazą Serratia marcescens
    1. Przygotować odczynniki Mix A i Mix B (Tabela 3). Dodać 10 µL Mix A i 10 µL Mix B do każdej probówki. Mieszać probówki na vortexie przez 5 s, krótko wirować, aby zebrać ciecz na dnie probówek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h.
      UWAGA: Mix A zawiera NaOH i optymalizuje pH dla obróbki endonukleazą S. marcescens . Mix B dostarcza magnezu. Stężenie endonukleazy S. marcescens w komercyjnie dostępnych zapasach enzymów może się różnić. Objętość endonukleazy S. marcescens należy odpowiednio dostosować, aby uzyskać stężenie 200 U/mL po dodaniu Mix A i Mix B do probówek w kroku 3.2.1.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji, do 4 h, może zmniejszyć sygnały tła.
    2. Po zakończeniu inkubacji krótko wirować probówki w wirówce laboratoryjnej, aby zebrać kondensat i roztwór z górnej i bocznych ścianek probówek.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Próbki można przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
  3. Obróbka proteinazą K
    1. Przygotować odczynnik Mix C (Tabela 3). Dodać 180 µL Mix C do każdej probówki. Mieszać probówki na vortexie przez 5 s, krótko wirować i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 h.
      UWAGA: EDTA w odczynniku Mix C chelatuje wolne jony magnezu i dezaktywuje endonukleazę S. marcescens .
    2. Po zakończeniu inkubacji pozwolić próbkom osiągnąć temperaturę pokojową, a następnie krótko wirować probówki w wirówce laboratoryjnej, aby zebrać kondensat i roztwór z górnej i bocznych ścianek probówek.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Próbki można przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Aby wznowić protokół, inkubować probówki w temperaturze 55 °C przez 5 do 10 min, aby całkowicie rozpuścić kryształy SDS zawarte w buforze.
  4. Ekstrakcja fenol-chloroformowa i precypitacja etanolem
    1. Dodać 200 µL fenolu i chloroformu do próbek i mieszać na vortexie przez 1 min. Wirować próbki w mikrocentryfudze przy ≥16 100 x g przez ≥5 min w temperaturze pokojowej.
      OSTROŻNIE: Fenol i chloroform należy obsługiwać w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE; t.j. rękawice nitrylowe, gogle lub przyłbicę oraz fartuch laboratoryjny z długimi rękawami).
    2. Przenieść 320 µL warstwy wodnej (dwukrotnie po 160 µL za pomocą pipety P200) do nowej standardowej probówki do mikrocentryfugi (80% objętości cieczy wodnej).
      UWAGA: Jest niezwykle ważne, aby pobrać taką samą objętość roztworu wodnego dla wszystkich próbek, w przeciwnym razie analiza straci dokładność ilościową.
    3. Przygotować odczynnik Mix D (Tabela 3). Dodać 833 µL Mix D do każdej probówki. Mieszać probówki na vortexie przez 5 s i inkubować w temperaturze -80 °C przez ≥20 min.
      UWAGA: Mix D to mieszanina etanolu, octanu sodu i glikogenu służąca do wygodnej precypitacji DNA etanolem. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C na tym etapie i wznowić protokół później.
    4. Wirować próbki w mikrocentryfudze przy ≥16 100 x g w temperaturze 4 °C przez ≥15 min. Odlać supernatant i raz osuszyć czystym ręcznikiem papierowym. Wlać około 500 µL 70% etanolu do każdej probówki, mieszać na vortexie przez 5 s i wirować w mikrocentryfudze laboratoryjnej przy ≥16 100 x g w temperaturze 4 °C przez ≥5 min.
    5. Odlać supernatant i raz osuszyć czystym ręcznikiem papierowym. Suszyć osady w temperaturze 65 °C; osady mogą być suszone całkowicie.
      UWAGA: Nie używać pipety do usuwania nadmiaru etanolu, który pozostał po osuszaniu probówek. Osady można również suszyć w temperaturze pokojowej przez noc. Protokół można w tym miejscu przerwać, a wysuszone osady DNA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni przy zamkniętej zakrętce probówki.
  5. Resuspensja wirusowego DNA w buforze TE
    1. Rozpuścić osady DNA w 120 µL buforu TE w każdej probówce poprzez wstrząsanie każdej probówki przez 30 min do 1 h w temperaturze pokojowej.
  6. Dot blot
    1. Przygotowanie standardów plazmidowego DNA
      1. Rozcieńczyć plazmidowe DNA genomu wektora AAV do stężenia 10 ng/µL w wodzie lub buforze Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Odpiąć 25 µL tego rozcieńczenia i trawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym przez 1 h w celu linearyzacji plazmidowego DNA, w objętości reakcyjnej 50 µL.
        UWAGA: Przygotowujemy podwójny zestaw trawienia (patrz krok 3.6.4.1). Odpowiedni enzym powinien być taki, który tnie plazmidowe DNA poza regionem wiązania sondy dot blot. Dla wygody rozcieńczone plazmidowe DNA można podzielić na alikwoty (25 µL/probówka) i przechowywać w zamrożeniu w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Trawienie plazmidowego DNA należy przeprowadzić podczas wstrząsania probówek w kroku 3.5.1. Nie należy nadmiernie trawić standardu plazmidowego DNA.
      2. Dodać 450 µL wody lub buforu TE do probówki zawierającej strawiony standard plazmidowego DNA i dokładnie wymieszać. Przenieść 70 µL tej mieszaniny do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 330 µL wody lub buforu TE, aby przygotować rozcieńczony standard plazmidowy (25 pg/µL).
      3. Zgodnie z Tabelą 4 przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń szeregowych (600 µL/probówka). Dokładnie wymieszać rozcieńczenia na vortexie przez 5 s.
    2. Denaturacja standardów i próbek wirusowego DNA
      1. Dodać 600 µL 2x roztworu zasadowego do każdego rozcieńczenia standardu. Dobrze wymieszać na vortexie przez 5 do 10 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      2. Dodać 120 µL 2x roztworu zasadowego do każdej próbki wirusowego DNA. Dobrze wymieszać na vortexie przez 5 do 10 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    3. Konfiguracja aparatury dot blot
      1. Za pomocą nożyczek wyciąć membranę do blottingu (np. zeta-probe) do odpowiedniego rozmiaru, dopasowanego do liczby próbek i standardów. Namoczyć membranę w wodzie przez 10 min przed umieszczeniem jej w aparaturze dot blot. Zakryć niewykorzystane dołki w aparaturze do membran.
        UWAGA: Membranę obsługiwać za pomocą czystej pęsety. Do zakrycia pustych dołków można użyć jasnoniebieskiej arkusza ochronnego dołączonego do membrany. Nie dopuszczać do wyschnięcia membrany przed związaniem próbek i standardów. Więcej szczegółów dotyczących montażu i użytkowania aparatury znajduje się w instrukcji obsługi19.
      2. Dodać wodę do dołków, do których będą ładowane próbki. Zastosować próżnię i przepuścić wodę przez dołki, aby sprawdzić błędy i powtórzyć test po ich naprawieniu. Ponownie dokręcić śruby podczas stosowania próżni, aby zapewnić szczelność.
        UWAGA: Niedokładne uszczelnienie może spowodować wyciek próbek między dołkami.
      3. Po całkowitym przepuszczeniu wody całkowicie zwolnić próżnię (t.j. kolektor próżniowy powinien być otwarty na ciśnienie atmosferyczne).
    4. Ładowanie standardów i próbek do aparatury dot blot
      1. Nanieść 400 µL każdego rozcieńczonego standardu plazmidowego DNA do każdego dołka, prowadząc cztery ścieżki rozcieńczeń standardu. Użyć dwóch oddzielnych alikwotów strawionego standardu i nanieść każdy w dwóch powtórzeniach. Nanieść 200 µL/dołek każdej próbki wirusowego DNA.
        UWAGA: Wykorzystując pozostałe ok. 40 µL zdenaturowanych próbek, można przygotować próbki rozcieńczone (np. próbki rozcieńczone 10-krotnie, używając 20 µL próbki i 180 µL 1x roztworu zasadowego) i nanieść je na membranę, jeśli jest to konieczne.
      2. Zastosować delikatną próżnię, aby przepuścić roztwory DNA przez dołek.
        UWAGA: Ciśnienie próżni należy dostosować poprzez częściowe otwarcie zaworu trójdrożnego, tak aby ciśnienie próżni było przykładane zarówno do aparatury dot blot, jak i do atmosfery (t.j. z ramionami kurka ustawionymi pod kątem około 45°, co powoduje głośniejszy dźwięk ssania).
      3. Po opróżnieniu wszystkich dołków zwolnić próżnię, regulując zawór trójdrożny. Dodać 400 µL 1x roztworu zasadowego do każdego dołka, który zawierał standardy i próbki. Odczekać 5 min przed ponownym zastosowaniem próżni w celu opróżnienia dołków.
      4. Ponownie zastosować próżnię w ten sam sposób (patrz krok 3.6.4.2).
      5. Zdemontować aparaturę dot blot pod próżnią, wyjąć membranę i wypłukać ją 2x SSC. Położyć membranę na czystym ręczniku papierowym stroną związaną z DNA do góry, aby usunąć nadmiar 2x SSC.
      6. Unieruchomić DNA na membranie za pomocą sieciowania UV przy użyciu odpowiedniego urządzenia do sieciowania UV; membrana jest teraz gotowa do hybrydyzacji.
        UWAGA: Do sieciowania UV można używać mokrych membran. Wysuszone, sieciowane UV membrany można przechowywać w temperaturze pokojowej. Dalsze informacje znajdują się w Tabeli Materiałów.
  7. Hybrydyzacja i płukanie
    1. Podgrzać bufor do hybrydyzacji w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C.
    2. Oznaczyć enzymatycznie sondę DNA radioaktywnym α-32P dCTP i oczyścić ją za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Stosujemy sondę o długości 0,5–2,0 kb z regionu enhancera-promotora lub sekwencji kodującej białko w genomie wirusa. Chociaż w tym protokole do detekcji sygnału wykorzystuje się sondy radioaktywne znakowane 32P, można również stosować nie-radioaktywne sondy chemiluminescencyjne lub fluorescencyjne (patrz sekcja Dyskusja).
    3. Umieścić membranę w butelce do hybrydyzacji stroną związaną z DNA do góry, wypłukać membranę 5 mL podgrzanego buforu do hybrydyzacji i odlać bufor. Następnie dodać 10 mL podgrzanego buforu do hybrydyzacji i umieścić butelkę w rotacyjnym inkubatorze do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C. Rotować przez ≥5 min.
    4. Zdenaturować termicznie 20 µL roztworu pofragmentowanego DNA z nasienia śledzia lub łososia o stężeniu 10 mg/mL oraz sondę znakowaną 32P (≥107 cpm) przez 5 min, umieszczając probówki w bloku grzewczym ustawionym na 100 °C. Następnie gwałtownie schłodzić je na lodzie przez ≥2 min, krótko wirować i przechowywać na lodzie do momentu użycia.
      Ostrożnie: Dla radioaktywnych sond DNA należy używać probówek 1,5 mL z zakrętką śrubową i pierścieniem uszczelniającym O-ring.
    5. Szybko dodać zdenaturowane DNA nasienne i radioaktywną sondę do buforu do hybrydyzacji w butelce i wstrząsnąć butelką przez 10 s, aby wymieszać. Włożyć butelkę z powrotem do inkubatora 65 °C i inkubować z rotacją w temperaturze 65 °C przez ≥4 h.
    6. Po zakończeniu hybrydyzacji zatrzymać rotację, wyjąć butelkę do hybrydyzacji, a następnie przelać roztwór radioaktywnej sondy do 50 mL probówki stożkowej z nieprzeciekającą zakrętką. Przechowywać sondę w odpowiednim pojemniku umieszczonym w lodówce przeznaczonej dla materiałów radioaktywnych.
      UWAGA: Zużyty bufor do hybrydyzacji z sondą przechowywany w 4 °C może być użyty ponownie co najmniej 5 razy, umieszczając 50 mL probówkę stożkową z nieprzeciekającą zakrętką zawierającą bufor do hybrydyzacji w kąpieli wodnej 100 °C przez 5 min.
    7. Wypłukać membranę buforem do płukania podgrzanym do 65 °C. Dodać od 20 do 30 mL buforu do płukania do butelki do hybrydyzacji i rotować przez 5 min. Powtórzyć to płukanie jeszcze 2 razy.
      UWAGA: Pomiar radioaktywności roztworów płuczących i zapisywanie wyników należy przeprowadzić, jeśli wymagają tego przepisy lokalnego instytutu.
    8. Podczas płukania membrany umieścić ekran obrazujący fosforowy w kasowniku obrazów na 5 min.
    9. Po trzecim płukaniu wyjąć membranę z butelki do hybrydyzacji, usunąć nadmiar buforu z membrany za pomocą ręczników papierowych i umieścić membranę w przezroczystym plastikowym uchwycie na papier. Sprawdzić sygnały radioaktywne na membranie za pomocą licznika Geigera. Naświetlać wykasowany ekran fosforowy membraną od 10 min do całej nocy, w zależności od intensywności sygnału.
    10. Zeskanować ekran za pomocą systemu skanowania obrazów fosforowych i uzyskać dane o intensywności sygnału każdego punktu.
  8. Analiza danych
    1. Wykreślić krzywą wzorcową za pomocą arkusza kalkulacyjnego i oprogramowania do analizy danych (np. Excel).
      UWAGA: Do wykreślenia krzywej wzorcowej zastosowano liniową regresję log-log.
    2. Wyznaczyć ekwiwalent nanogramowy (ng-eq) dla każdej z próbek wirusowego DNA poprzez interpolację. ng-eq to ilość plazmidowego DNA użytego do wykreślenia krzywej wzorcowej, która odpowiada liczbie cząsteczek wirusowego DNA. Gdy długość plazmidowego DNA wynosi 8 000 bp, 1 ng-eq jednoniciowego wirusowego DNA AAV odpowiada 2,275 x 108 cząsteczkom.
      UWAGA: ng-eq można przeliczyć na liczbę cząsteczek wirusowych za pomocą następujących równań:
      Równanie do obliczania jednoniciowych cząsteczek AAV; biologia molekularna, analiza terapii genowej.
      Równanie dla dwuniciowych cząsteczek AAV, 0,91×ng/długość(bp)×10¹², obliczenia formuły.
      Liczba cząsteczek AAV jest konwencjonalnie wyrażana jako „vg” (geny wektora) lub „DRP” (cząsteczki odporne na DNazę I).
    3. Obliczyć stężenia AAV materiałów wyjściowych. Ponieważ nany naniesiony wirusowy DNA stanowi 66,7% Formuła obliczania wydajności procentowej; równanie; zastosowanie w matematyce edukacyjnej. wirusowego DNA w materiałach wyjściowych, 1 ng-eq odpowiada 1,7 x 109 cząsteczkom/mL Formuła matematyczna: ((2,275/0,667) ÷ 0,2) × 1 × 10^8; proces obliczeń numerycznych..
      UWAGA: Korekta ta nie jest wymagana, jeśli cały wirusowy DNA zawarty w materiale wyjściowym zostanie naniesiony na membranę bez strat (patrz Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny wynik ilościowych analiz dot blot służących do oznaczania stężenia oczyszczonych zapasów wektora AAV wytworzonych na dużą skalę przedstawiono na Rysunku 1. Za pomocą tej metody dot blot określono miano zapasu dwuniciowego wektora AAV2G9-CMV-GFP. Wektor oczyszczono za pomocą dwóch rund ultrawirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu (CsCl), a następnie poddano dializie zgodnie z wcześniejszym opisem20. Generalnie, w pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisano przydatność ilościowych testów punktowych do badania AAV AAP i ich roli w składaniu kapsydu. Wiedza uzyskana z tych badań może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wrodzonych różnic w procesie składania kapsydu AAV oraz funkcjonalnej roli AAP między różnymi serotypami. W związku z tym test punktowy z komplementacją krzyżową AAV VP3-AAP ujawnił, że Snake AAV VP3 wykazywał ścisłą zależność od koekspresji pokrewnego AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydu h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Xiao Xiao z Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill za dostarczenie nam plazmidu pEMBL-CMV-GFP. Dziękujemy Christopherowi Chengowi i Samuelowi J. Huangowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty Publicznej Służby Zdrowia (NIH R01 NS088399 i T32 EY232113).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BenzonazaMilliporeSigma1016970001określana jako endonukleaza Serratia marcescen w tekście głównym.
DNaza IRoche4716728001określana w tekście głównym jako enzym A DNazy I.
DNase IInvitrogen18047019określany w tekście głównym jako DNase I Enzym B.
DNase INew England BiolabsM0303LOkreślany jako DNase I Enzym C w tekście głównym.
1,5 ml Dołączone rurki do mikrowirówek z o-ringiemCorning430909
1,5 ml Probówki do mikrowirówekThermo Fisher Scientific05-408-129
15 ml polipropylenowa rurka stożkowaCorning352097
3 m octan soduTeknovaS0298
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaCorning430291
Komórki AAV-293Agilent240073linia komórkowa HEK-293 zoptymalizowana pod kątem pakowania wirionów AAV.
AccuGENE 0,5 M roztwór EDTALonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Aparat Bio-DotBio-Rad1706545
Albumina surowicy bydlęcejMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ChloroformMilliporeSigma372978
Zestaw do ekstrakcji DNAWako Pure Chemical Industries295-50201Służy do ilościowych plam punktowych na oczyszczonym wirusie. Używamy tylko połowy objętości wszystkich odczynników w każdym kroku zalecanym dla Schematu Protokołu 2 w instrukcji dostarczonej przez producenta.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-wysoki poziom glukozy (4,5 g / L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Płodowa surowica bydlęcaVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095określana jako polisacharoza 400.
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxiovert 40 CFL
GlikogenRoche10901393001
Śledzie Plemniki DNAInvitrogen15634-017
Probówki do hybrydyzacjiThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Nauki przyrodniczeImageQuant TL
L-glutamina 200 mMLonza17-605E
Sześciowodny chlorek magnezuMilliporeSigmaM0250
Elektroporator MicroPulserBio-Rad1652100
Mini szybkie obracające się kolumny DNAMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Penicylina/Streptomycyna 10K/10KLonza17-602E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLonza17-516F
Kaseta ekspozycyjna do fosforowaniaGE Healthcare Life SciencesRóżne
ekrany fosforowaniaGE Healthcare Life SciencesRóżne
zestawy plazmidowe MaxiQIAGEN12162
Platynowa polimeraza DNA PfxInvitrogen
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PoliwinylopirolidonMiliporeSigmaP5288
Prime-It II Zestaw do losowego etykietowania starterówAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 nukleotydy z 4. nukleotydu w AAP ORF, RE1 jest miejscem enzymu restrykcyjnego do klonowania): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 to miejsce enzymu restrykcyjnego do klonowania): TCTT-RE2-N25MilliporeNiestandardowypodkład
SigmaStarter VP3 Forward (N25 pierwsze 25 nukleotydów VP3 ORF, RE1 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer Primer
VP3 Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaNiestandardowy starter
Proteinaza K RoztwórInvitrogen25530-049
Enzymy restrykcyjneNew England BiolabsRóżne
plemniki łososia DNAInvitrogen15632011
Pipety serologiczneThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Chlorek soduThermo FisherScientific S271-10
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnymiliporeSigmaC8532
T4 Polimeraza DNANew England BiolabsM0203L
Eppendorf6321000515
6-dołkowa płytka poddana działaniu hodowli tkankowejCorning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Nasączony fenolemInvitrogen15513-047
CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Stosowany jest optymalny tryb sieciowania, zapewniający dawkę energii UV 120 mJ/cm2.
Membrana Zeta-ProbeBio-Rad162-0165
11708013353046 UV

Bibliografia

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

białko aktywujące montażmontaż kapsyduoznaczanie ilości AAVtraktowanie nukleaząodzyskiwanie cząsteczek wirusastandardy plazmidowego DNAbufor do hybrydyzacjidetekcja licznikiem Geigera
Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.