Artykuł metodologiczny

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż wirus związany z adenowirusem (AAV) jest powszechnie akceptowany jako atrakcyjny wektor dla terapii genowej, służy również jako wirus modelowy do zrozumienia biologii wirusa. W tym ostatnim aspekcie niedawne odkrycie niestrukturalnego białka AAV, określanego mianem białka aktywującego składanie (AAP), rzuciło nowe światło na procesy związane z składaniem białek VP kapsydu wirusa w kapsyd. Chociaż wiele serotypów AAV wymaga AAP do montażu, niedawno informowaliśmy, że AAV4, 5 i 11 są wyjątkami od tej reguły. Ponadto wykazaliśmy, że AAP i złożone kapsydy różnych serotypów lokalizują się w różnych przedziałach subkomórkowych. Ta nieoczekiwana heterogeniczność właściwości biologicznych i funkcjonalnych ról AAP wśród różnych serotypów AAV podkreśla znaczenie badań nad AAP pochodzącymi z różnych serotypów. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje prosty test punktowy do oznaczania ilościowego AAV i jego zastosowanie do oceny zależności od AAP i swoistości serotypu w składaniu kapsydu. Aby zademonstrować użyteczność tego testu dot blot, postanowiliśmy scharakteryzować składanie kapsydu i zależność od AAP Snake AAV, wcześniej niescharakteryzowanego AAV, a także AAV5 i AAV9, które wcześniej wykazano, że są odpowiednio serotypami niezależnymi od AAP i zależnymi od AAP. Test wykazał, że montaż kapsydu Snake AAV wymaga Snake AAP i nie może być promowany przez AAP z AAV5 i AAV9. Test wykazał również, że w przeciwieństwie do wielu powszechnych serotypów AAP, które promują heterologiczne składanie kapsydu przez komplementację krzyżową, Snake AAP nie sprzyja składaniu kapsydów AAV9. Ponadto pokazujemy, że wybór nukleazy znacząco wpływa na odczyt testu dot blot, a zatem wybór optymalnego enzymu ma kluczowe znaczenie dla skutecznej oceny miana AAV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus związany z adenowirusem (AAV) to mały, bezotoczkowy, jednoniciowy wirus DNA o genomie około 4,7 kilozasad (kb). Genom AAV zawiera otwarte ramki odczytu (ORF) dla genów rep i cap. W 2010 roku Sonntag i wsp. odkryli wcześniej niezidentyfikowane niestrukturalne białko kodowane przez ORF z przesunięciem ramki +1 w genie kapu AAV2 i stwierdzili, że odgrywa kluczową rolę w składaniu białek monomeru AAV2 kapsydu VP w wirusowy kapsyd class1. To nowe białko zostało nazwane białkiem aktywującym montaż (AAP) ze względu na rolę, jaką odgrywa w promowaniu składania kapsydu1.

ORFy dla AAP zostały zidentyfikowane bioinformatycznie w genomach wszystkich parwowirusów z rodzaju Dependoparvovirus, ale nie w genomach wirusów różnych rodzajów z rodziny parwowirusów1,2. Badania funkcjonalne tego nowego białka początkowo koncentrowały się na AAP z prototypu AAV2 (AAP2), który ustalił istotną rolę AAP2 w kierowaniu niezmontowanych białek VP do jąderka w celu ich akumulacji i tworzenia w pełni złożone kapsydy1,3,4. Niezdolność kapsydów AAV2 do złożenia się przy braku wyrażenia AAP została niezależnie potwierdzona przez wiele grup, w tym naszą1,2,3,4,5. Późniejsze badania nad serotypami AAV 1, 8 i 9 potwierdziły krytyczną rolę AAP w składaniu kapsydu, ponieważ białka monomeru VP3 AAV1, 8 i 9 nie były w stanie utworzyć w pełni złożonego kapsydu przy braku koekspresji AAP2.

Niedawno, dzięki podejściu, które obejmuje użycie ilościowych testów punktowych, zbadaliśmy zdolność monomerów AAV1 do 12 VP3 do łączenia się w kapsydy przy braku ekspresji AAP oraz zdolność AAP1 do 12 do promowania składania monomerów VP3 z heterologicznych serotypów. Badanie to wykazało, że monomery AAV4, 5 i 11 VP3 mogą składać się bez AAP. Ponadto stwierdzono, że osiem z dwunastu badanych przez nas serotypów AAP (tj. wszystkie oprócz AAP4, 5, 11 i 12) wykazywało szeroką zdolność do wspierania składania kapsydów heterologicznych serotypów AAV, podczas gdy AAP4, 5, 11 i 12 wykazywały znacznie ograniczoną zdolność w tym zakresie6. Te cztery serotypy są filogenetycznie odległe od pozostałych serotypów AAP2,3. Co więcej, badanie ujawniło znaczną heterogeniczność w subkomórkowych lokalizacjach różnych AAPs6. Co więcej, badanie sugeruje, że ścisły związek AAP ze złożonymi kapsydami i jąderkiem, cechą charakterystyczną składania kapsydu AAV2, niekoniecznie może być rozszerzony na inne serotypy, w tym AAV5, 8 i 9, które wykazują wykluczenie jąderkowe złożonych kapsydów6. W związku z tym informacje uzyskane z badania konkretnego serotypu AAP nie mają szerokiego zastosowania do całej biologii AAP. Tak zagadkowa natura biologii AAP podkreśla potrzebę zbadania roli i funkcji każdego AAP zarówno z kanonicznych, jak i niekanonicznych serotypów AAV.

Biologiczna rola AAP w tworzeniu kapsydu może być oceniona poprzez określenie w pełni upakowanych mian cząsteczek wirusa AAV wytwarzanych w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293, najczęściej używanej linii komórkowej do produkcji wektora AAV, z ekspresją białka AAP lub bez niej. Standardowymi metodami ilościowego oznaczania AAV są ilościowe testy oparte na PCR (qPCR)7,8 oraz ilościowe testy oparte na plamach punktowych9. Inne metody oznaczania ilościowego cząstek wirusa AAV, takie jak test immunoenzymatyczny 10,11 lub pomiar gęstości optycznej12 nie są idealne dla próbek pochodzących z wielu różnych serotypów AAV lub próbek zanieczyszczonych zanieczyszczeniami (surowe lizaty lub pożywki hodowlane), które często są próbkami wykorzystywanymi do badań AAV. Obecnie qPCR jest najczęściej stosowany do oznaczania ilościowego AAV; należy jednak wziąć pod uwagę potencjalne zastrzeżenia dotyczące testu opartego na qPCR, ponieważ test może skutkować błędami systemowymi i znacznymi zmianami miana13,14. Na testy oparte na PCR ma wpływ szereg potencjalnie mylących czynników, takich jak obecność kowalencyjnie zamkniętych końcowych spinek do włosów w matrycach PCR, które hamują amplifikację13. Nawet doświadczona osoba może nieświadomie wprowadzić potencjalne czynniki zakłócające do testu opartego na qPCR13. Natomiast ilościowe testy punktowe są klasyczną techniką biologii molekularnej, która nie obejmuje amplifikacji genomu i wykorzystuje znacznie prostszą zasadę przy minimalnym ryzyku błędów w porównaniu z testami opartymi na qPCR. Metoda jest mniej wymagająca technicznie; W związku z tym wyniki testów są w miarę powtarzalne nawet dla niedoświadczonych osób.

W tym raporcie opisujemy szczegóły metodologiczne ilościowego testu punktowego, którego rutynowo używamy do ilościowego oznaczania wektorów AAV, i podajemy przykład, jak zastosować test do badania promującej składanie roli AAP w popularnych serotypach (AAV5 i AAV9) oraz wcześniej niescharakteryzowanego AAP z Snake AAV14. W naturze białka AAV VP i białka AAP ulegają ekspresji w cis z pojedynczego genu (tj. Cis komplementacji VP-AAP), podczas gdy w opisanym tutaj teście białka VP i AAP są dostarczane w trans z dwóch oddzielnych plazmidów (tj. Transkomplementacja VP-AAP). Ponieważ każde białko VP lub AAP z różnych serotypów może ulegać ekspresji z każdego niezależnego plazmidu, możliwe staje się testowanie heterologicznych kombinacji VP-AAP pod kątem składania kapsydu (tj. komplementacji krzyżowej VP-AAP). Krótko mówiąc, AAV VP3 z różnych serotypów ulega ekspresji w komórkach HEK 293 przez transfekcję plazmidowego DNA w celu upakowania genomu wektora AAV w obecności lub braku pokrewnego serotypu AAP lub w obecności heterologicznego serotypu AAP. Po wyprodukowaniu pożywki hodowlane i lizaty komórkowe są poddawane testowi punktowemu w celu ilościowego określenia genomu wirusa w otoczce kapsydu. Pierwszym krokiem testu dot blot jest potraktowanie próbek nukleazą w celu usunięcia zanieczyszczających plazmidowych DNA i nieopakowanych genomów AAV w próbkach. Niezastosowanie się do tego spowodowałoby nasilenie sygnałów tła, w szczególności w przypadku oznaczania próbek nieoczyszczonych. Następnie stosuje się leczenie proteazą w celu rozbicia kapsydów wirusa i uwolnienia odpornych na nukleazy genomów wirusowych do roztworów próbek. Następnie genomy wirusów są denaturowane, osuszane na błonie i hybrydyzowane z sondą DNA specyficzną dla genomu wirusa w celu oceny ilościowej. W przedstawionym tutaj przykładowym teście pokazujemy, że Snake AAV VP3 wymaga Snake AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydów AAV9, w przeciwieństwie do wielu AAP pochodzących z serotypów zależnych od AAP, które mogą również promować składanie heterologicznych kapsydów serotypowych. Na koniec zgłaszamy ważne zastrzeżenie dotyczące testów ilościowych AAV opartych na qPCR lub dot blot, że wybór nukleazy znacząco wpływa na wyniki testu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przepisy dotyczące roztworów i potrzebnych dla tego protokołu znajdują się w Tabeli 1. Opisany poniżej protokół służy do testu punktowego z komplementacją krzyżową VP-AAP w celu zbadania ról białek AAP w składaniu kapsydu. Metoda bardziej ogólnego ilościowego testu igłowego do miareczkowania oczyszczonego wektora AAV została wyjaśniona w sekcji Reprezentatywne wyniki.

1. Budowa plazmidów eksprymujących VP3, AAP i AAV2 Rep

  1. Budowa pCMV-AAVx-VP3 (x = serotypy)
    1. Amplifikacja PCR całego VP3 ORF (1,6 kb) przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności i następującej pary starterów: VP3 do przodu, CTAA-RE1-CACC-N25 (pierwsze 25 nukleotydów VP3 ORF); Odwrócenie VP3, TCTT-RE2-N25 (ostatnie 25 nukleotydów VP3 ORF).
      UWAGA: RE1 i RE2 są miejscami enzymów restrykcyjnych (RE) do klonowania. CTAA i TCTT to końcowe tetranukleotydy 5' i 3' dodawane w celu ułatwienia trawienia enzymów restrykcyjnych w pobliżu końca dwuniciowego DNA. CACC jest sekwencją konsensusu Kozaka.
    2. Sklonuj ponownie strawione produkty PCR między odpowiednimi miejscami RE wektora ekspresji ssaków, który wykorzystuje ludzki wirus cytomegalii natychmiast wcześnie (CMV-IE) wzmacniacz-promotor do ekspresji na wysokim poziomie.
      UWAGA: W przypadku klonowania molekularnego należy trawić 5 μg plazmidowego DNA szkieletu za pomocą enzymu(ów) restrykcyjnego(-ych) o stężeniu 4 U/μg DNA przez 1 godzinę w optymalnej temperaturze. W przypadku fragmentów PCR należy zwiększyć liczbę użytych enzymów (np. 10 U/μg produktu VP3 ORF PCR o objętości 1,6 kb) i wydłużyć czas inkubacji (np. 4 godziny) ze względu na zwiększenie liczby miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych na jednostkę długości. Pomocne informacje na temat biologii molekularnej, enzymów i procedur klonowania, w tym transformacji bakteryjnej, można znaleźć gdzie indziej15,16,17.
  2. Budowa pCMV-FLAG-AAPx (x = serotypy)
    1. Amplifikacja PCR całego AAP ORF (0,6 kb) z wyjątkiem pierwszego aminokwasu przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności i następującej pary starterów: AAP do przodu, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACACAAA-N25 (25 nukleotydów z 4. nukleotydu w AAP ORF); Odwrócenie AAP, TCTT-RE2-N25 (ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF).
      UWAGA: GACTACAAGGACGACGATGACACAAA koduje znacznik FLAG, który, jak wykazano, nie ma szkodliwych skutków4,5, ale można go pominąć, jeśli nie jest to konieczne.
    2. Sklonuj ponownie strawione produkty PCR między odpowiednimi miejscami wektora ekspresji ssaków za pomocą wzmacniacza-promotora CMV-IE15,16,17.
  3. Budowa pHLP-Rep
    1. Trawić 5 μg plazmidu pAAV-RC2 (7,3 kb) z 20 jednostkami Xho I i Xcm I i oczyszczać DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA lub przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową.
      UWAGA: Usunięcie 1,8 kb fragmentu Xho I-Xcm I z plazmidu pAAV-RC2 o długości 7,3 kb powoduje utratę ekspresji białka VP kapsydu przy zachowaniu ekspresji białka Rep.
    2. Stępić DNA kończy się 6 jednostkami polimerazy DNA T4, w żelu agarozowym oczyść fragment DNA o wielkości 5,5 kb i samodzielnie poddać się samoligacji oczyszczonego fragmentu za pomocą 50 do 100 ng DNA i 400 jednostek ligazy DNA T4 zgodnie z zaleceniem producenta15.
    3. Postępuj zgodnie ze standardową procedurą transformacji bakteryjnej, o której mowa w kroku 1.1.2 Uwaga.
  4. Sprawdź konstrukcje plazmidu poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowanie15,18.
  5. Wykonaj miniprepy plazmidowe lub maxiprepy przy użyciu dostępnych na rynku zestawów, aby uzyskać wystarczającą ilość DNA plazmidu do dalszych eksperymentów produkcyjnych AAV.

2. Produkcja AAV w komórkach HEK 293 przez transfekcję plazmidowego DNA (test komplementacji krzyżowej)

  1. Hodowla komórek HEK 293 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokim poziomie glukozy (4,5 g / L) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% mieszanką penicyliny i streptomycyny oraz 1 mM L-glutaminy, w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2).
    UWAGA: Miana AAV różnią się znacznie w zależności od źródła komórek HEK 293.
    Ostrzeżenie: Chociaż AAV może być obsługiwany przy poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL1), hermetyzacja BSL2 jest zalecana do pracy z komórkami HEK 293.
  2. W dniu -1 (24 godziny przed transfekcją) płytka 6–7 x 105 HEK 293 komórek/basenik w 2 ml kompletnej pożywki opisanej w kroku 2.1 na 6-dołkowej płytce (płytkach). Zazwyczaj osiąga to ~90% konfluencji następnego dnia.
  3. Dzień 0: Transfekcja
    1. Przygotowanie do transfekcji DNA
      1. Upewnij się, że komórki osiągnęły ~90% konfluencji.
      2. Rozgrzej DMEM uzupełniony 1% mieszanką penicyliny i streptomycyny oraz 1 mM L-glutaminy, ale bez 10% FBS (tj. pożywki bez surowicy) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      3. Pozwól, aby roztwór polietylenininy (PEI) osiągnął temperaturę pokojową.
    2. Przygotowanie mieszaniny plazmidowego DNA
      1. Wymieszać plazmidy w 96 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez CaCl2 lub MgCl2 w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, jak wskazano w tabeli 2. Całkowita ilość DNA wynosi 2 μg/basenik.
        UWAGA: Objętości roztworu plazmidowego DNA można pominąć, jeśli są nominalne. Regulacja objętości jest zalecana, jeśli całkowita objętość roztworów plazmidowego DNA wynosi ≥10 μl.
    3. Transfekcja PEI
      1. Dodać 4 μl roztworu PEI (1 mg/ml) do mieszaniny PBS i plazmidowego DNA (przygotowanej jak wyżej). Ostateczna objętość wynosi około 100 μL (5% objętości pożywki). Krótko zawirować probówki i inkubować mieszaninę DNA:PEI przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Czekając na zakończenie 15-minutowej inkubacji, zastąp pożywkę hodowlaną wstępnie podgrzaną pożywką bez surowicy opisaną w kroku 2.3.1.2.
      3. Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji mieszaniny DNA: PEI, należy krótko obrócić probówki za pomocą mikrowirówki, aby zebrać płyn na dno probówek, a następnie dodać mieszaninę DNA: PEI kroplami do pożywki hodowlanej w każdym dołku płytki hodowlanej HEK 293. Delikatnie wymieszać płytki i umieścić je z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
      4. Utrzymuj komórki w tej pożywce do czasu zbiorów w 5 dniu (nie jest wymagana zmiana podłoża).
  4. W dniu 1 i 2 obserwuj komórki transfekowane plazmidem pCMV-GFP pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym, aby ocenić skuteczność transfekcji.
    UWAGA: Do mikroskopii fluorescencyjnej zastosowano obiektyw o aperturze numerycznej 10x/0,25 w połączeniu z okularem 10×, a także zastosowano filtr pasmowo-przepustowy wzbudzenia 450–490 nm i filtr emisyjny pasmowo-przepustowy 515–565 nm. Powyższy warunek zwykle daje ponad 70% wydajności transfekcji. Komórki mogą wykazywać pewne zmiany morfologiczne (np. komórki stają się szczupłe) ze względu na stan wolny od surowicy.
  5. W dniach 3–5 kontynuuj hodowlę transfekowanych komórek w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. W dniu 5 należy zebrać zarówno komórki, jak i pożywkę zawierającą wirusa do stożkowych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml, pipetując w górę i w dół lub skrobając je skrobakiem do komórek.
  7. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

3. Test punktowy do oznaczania ilościowego AAV

  1. Odzyskiwanie cząsteczek wirusa
    1. Zamrożone rurki szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Energicznie wiruj rurki przez 1 minutę, aby zmaksymalizować odzyskiwanie AAV z komórek.
    2. Osadzać resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 3 700 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Pobrać 200 μl supernatantu z każdej probówki i przenieść go do oznakowanej probówki wirówkowej z zakrętką do testu punktowego.
      UWAGA: Pozostałą supernatant przechylić na porcje do probówek do mikrowirówek i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Tutaj zastosowano polipropylenowe probówki do mikrowirówek mocowane za pomocą zakrętek i O-ringu. Wymagane jest szczelne uszczelnienie, aby zapobiec rozlaniu AAV i fenolu-chloroformu.
  2. Leczenie endonukleazą Serratia marcescens
    1. Przygotować odczynniki do mieszania A i mieszania B (tabela 3). Do każdej probówki dodać 10 μl mieszanki A i 10 μl mieszanki B. Wirować probówki przez 5 s, krótko obracać probówki, aby zebrać płyn na dno probówek i inkubować probówki w temperaturze 37 °C co najmniej przez 1 h.
      UWAGA: Mieszanina A zawiera NaOH i optymalizuje pH do leczenia endonukleazą S. marcescens. Mieszanka B uzupełnia magnez. Stężenie endonukleazy S. marcescens w dostępnych na rynku stadach enzymów może się różnić. Objętość endonukleazy S. marcescens należy odpowiednio dostosować, aby uzyskać 200 U/ml po dodaniu mieszaniny A i mieszanki B do probówek w kroku 3.2.1.
      UWAGA: Dłuższy czas inkubacji, do 4 godzin, może zmniejszyć sygnały tła.
    2. Pod koniec inkubacji krótko zakręć probówkami za pomocą wirówki stołowej, aby zebrać kondensat i roztwór z góry i boków probówek.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
  3. Leczenie proteinazą K
    1. Przygotować odczynnik Mix C (Tabela 3). Do każdej probówki dodać 180 μl Mix C. Wirować probówki przez 5 s, krótko obracać probówki i inkubować probówki w temperaturze 55 °C przez 1 h.
      UWAGA: EDTA w odczynniku Mix C chelatuje wolne jony magnezu i inaktywuje endonukleazę S. marcescens.
    2. Pod koniec inkubacji pozwól próbkom osiągnąć temperaturę pokojową i krótko zakręć probówkami za pomocą wirówki stołowej, aby zebrać kondensację i roztwór z góry i boków probówek.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Aby wznowić protokół, należy inkubować probówki w temperaturze 55 °C przez 5–10 minut w celu całkowitego rozpuszczenia kryształów SDS zawartych w buforze.
  4. Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa i wytrącanie etanolu
    1. Dodać 200 μl chloroformu fenolowego do próbek i wirować je przez 1 minutę. Odwirować próbki w mikrowirówce w temperaturze ≥16,100 x g przez ≥5 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Z chloroformem fenolowym należy obchodzić się w dygestorium chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE; tj. rękawice nitrylowe, gogle lub osłonę twarzy oraz fartuch laboratoryjny z długimi rękawami).
    2. Przenieść 320 μl warstwy wodnej (160 μl dwukrotnie za pomocą pipety P200) do nowej standardowej probówki do mikrowirówki (80% objętości cieczy wodnej).
      UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby pobrać tę samą objętość roztworu wodnego między próbkami, w przeciwnym razie test straci dokładność ilościową.
    3. Przygotować odczynnik Mix D (Tabela 3). Do każdej probówki dodać 833 μl mieszanki D. Wirować probówki przez 5 s i inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez ≥20 min.
      UWAGA: Mieszanka D to mieszanina etanolu, octanu sodu i glikogenu do wygodnego wytrącania DNA etanolem. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C, a protokół może być później wznowiony.
    4. Próbki odwirować za pomocą mikrowirówki o temperaturze ≥16,100 x g w temperaturze 4 °C przez ≥15 min. Odlewać supernatant i raz osuszyć na czystym ręczniku papierowym. Do każdej probówki wlać około 500 μl 70% etanolu, wirować probówki przez 5 s i odwirować probówki za pomocą mikrowirówki stołowej w temperaturze ≥16,100 x g w temperaturze 4 °C przez ≥5 min.
    5. Odlej supernatant i osusz raz na czystym ręczniku papierowym. Suche granulki w temperaturze 65 °C; Granulki można całkowicie wysuszyć.
      UWAGA: Nie używaj pipety do usuwania nadmiaru etanolu, który pozostał po osuszeniu probówek. Granulki można również suszyć w temperaturze pokojowej przez noc. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a wysuszone granulki DNA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni z zamkniętą pokrywą probówki.
  5. Ponowne zawieszenie wirusowego DNA w buforze TE
    1. Rozpuść granulki DNA w 120 μl buforu TE, potrząsając każdą probówką przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Plama punktowa
    1. Przygotowanie wzorców plazmidowego DNA
      1. Rozcieńczyć DNA plazmidu genomu wektora AAV do 10 ng / μL w wodzie lub buforze Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Pobrać 25 μl tego rozcieńczenia i trawić odpowiednim enzymem restrykcyjnym przez 1 godzinę w celu linearyzacji plazmidowego DNA, w objętości reakcji 50 μl.
        UWAGA: Wykonujemy zduplikowany zestaw trawienia (patrz krok 3.6.4.1). Odpowiednim enzymem powinien być taki, który przecina plazmidowe DNA poza obszarem wiążącym sondę dot blot. Dla wygody rozcieńczony plazmidowy DNA można podzielić na porcje (25 μl/probówkę) i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości. Trawić plazmidowe DNA, podczas gdy probówki drżą, w kroku 3.5.1. Nie trawić nadmiernie wzorca plazmidowego DNA.
      2. Dodać 450 μl wody lub TE do probówki zawierającej wzorzec strawionego plazmidu DNA i dokładnie wymieszać. Przenieść 70 μl tej mieszaniny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 1,330 μl wody lub TE, aby uzyskać rozcieńczony wzorzec plazmidu (25 pg/μL).
      3. Postępuj zgodnie z tabelą 4, aby utworzyć zestaw dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych (600 μl/probówkę). Dokładnie wymieszaj rozcieńczenia, wirując przez 5 s.
    2. Denaturacja wzorców i próbek DNA wirusa
      1. Dodać 600 μl 2x roztworu alkalicznego do każdego standardowego rozcieńczenia. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 do 10 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
      2. Dodaj 120 μl 2x roztworu alkalicznego do każdej próbki DNA wirusa. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 do 10 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Ustawianie aparatu do igłów punktowych
      1. Za pomocą nożyczek przyciąć membranę do bibuły (np. sondy zeta) do rozmiaru odpowiedniego dla liczby próbek i wzorców. Namocz membranę w wodzie przez 10 minut przed umieszczeniem jej na aparacie do plam punktowych. Przykryj nieużywane studzienki na aparacie membranowym.
        UWAGA: Z membraną należy obchodzić się czystą pęsetą. Aby przykryć puste studzienki, można użyć jasnoniebieskiego arkusza ochronnego, który jest dołączony do membrany. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany przed związaniem próbek i wzorców. Więcej informacji na temat montażu i użytkowania urządzenia można znaleźć w instrukcji obsługi19.
      2. Dodaj wodę do studni, do których zostaną załadowane próbki. Zastosuj podciśnienie i przeciągnij wodę przez studzienki, aby sprawdzić, czy nie ma błędów i ponownie przetestować po naprawieniu. Ponownie dokręć, jednocześnie stosując podciśnienie, aby zapewnić szczelne uszczelnienie.
        UWAGA: Niepełne uszczelnienie może spowodować wyciek próbki między studzienkami.
      3. Po całkowitym przeciągnięciu wody całkowicie zwolnij podciśnienie (tj. kolektor podciśnienia powinien być otwarty na ciśnienie powietrza).
    4. Ładowanie wzorców i próbek do aparatu do igłowania punktowego
      1. Nałożyć 400 μl każdego rozcieńczonego wzorca plazmidowego DNA do każdej studzienki i uruchomić cztery pasy standardowych rozcieńczeń. Użyj dwóch oddzielnych podwielokrotności standardowego skrótu i załaduj każdą z nich w dwóch egzemplarzach. Zastosować 200 μl/basenik z każdej próbki DNA wirusa.
        UWAGA: Korzystając z pozostałych ~40 μl zdenaturowanych próbek, można przygotować rozcieńczone próbki (np. 10-krotnie rozcieńczone próbki przy użyciu 20 μl próbki plus 180 μl 1x roztworu alkalicznego) i w razie potrzeby osuszyć.
      2. Zastosuj delikatne podciśnienie, aby przeciągnąć roztwory DNA przez studzienkę.
        UWAGA: Podciśnienie należy wyregulować, częściowo otwierając zawór trójdrogowy, tak aby ciśnienie podciśnienia było przykładane do aparatu do plam punktowych, a także do atmosfery (tj. z ramionami kranu ustawionymi pod kątem około 45°, gdzie wydaje głośniejszy dźwięk ssania).
      3. Po opróżnieniu wszystkich studzienek uwolnij podciśnienie, regulując zawór trójdrogowy. Dodaj 400 μl 1x roztworu alkalicznego do każdej studzienki, która zawierała wzorce i próbki. Odczekaj 5 minut przed ponownym zastosowaniem próżni w celu opróżnienia studzienek.
      4. Ponownie zastosuj podciśnienie w ten sam sposób (patrz krok 3.6.4.2).
      5. Zdemontuj aparat do igłów punktowych pod próżnią, usuń membranę i przepłucz ją 2x SSC. Umieść membranę na czystym ręczniku papierowym stroną związaną z DNA skierowaną do góry, aby usunąć nadmiar 2x SSC.
      6. Sieciowanie UV oplamionego DNA z błoną za pomocą odpowiedniego środka sieciującego UV; błona jest teraz gotowa do hybrydyzacji.
        UWAGA: Do sieciowania UV można stosować mokre membrany. Wysuszone, usieciowane promieniami UV membrany mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów.
  7. Hybrydyzacja i mycie
    1. Rozgrzej bufor hybrydyzacyjny w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.
    2. Enzymatycznie oznacz sondę DNA radioaktywnym α-32P dCTP i oczyść ją za pomocą dostępnych na rynku zestawów zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Używamy sondy o długości 0,5–2,0 kb z regionu wzmacniającego-promotora lub sekwencji kodującej białko w genomie wirusa. Chociaż protokół ten wykorzystuje 32sondy radioaktywne znakowane P do wykrywania sygnałów, można również użyć nieradioaktywnych sond chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych (patrz sekcja Dyskusja).
    3. Umieść membranę w butelce do hybrydyzacji stroną związaną z DNA do góry, przepłucz membranę 5 ml wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i wyrzuć bufor. Następnie dodać 10 ml podgrzanego buforu do hybrydyzacji i umieścić butelkę w obrotowym piecu do hybrydyzacji ustawionym na 65 °C. Obracać przez ≥5 min.
    4. Denaturacja termiczna 20 μl 10 mg/ml roztworu DNA nasienia śledzia lub łososia i sonda 32znakowana P (≥10,7 cpm) przez 5 minut, umieszczając probówki na bloku grzewczym ustawionym na 100 °C. Następnie schładzaj je na lodzie przez ≥2 minuty, krótko wiruj i trzymaj na lodzie do użycia.
      Uwaga: W przypadku radioaktywnych sond DNA należy używać probówek o pojemności 1,5 ml z zakrętką i O-ringiem.
    5. Szybko dodaj zdenaturowane DNA plemnika i radioaktywną sondę do buforu hybrydyzacyjnego w butelce do hybrydyzacji i potrząsaj butelką przez 10 sekund, aby wymieszać. Umieścić butelkę z powrotem w piekarniku o temperaturze 65 °C i inkubować butelkę, obracając ją w temperaturze 65 °C przez ≥4 godziny.
    6. Po zakończeniu hybrydyzacji zatrzymaj rotację, wyjmij butelkę do hybrydyzacji, a następnie wlej roztwór sondy radioaktywnej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z szczelną zatyczką. Przechowuj sondę w odpowiednim pojemniku umieszczonym w lodówce przeznaczonej do materiałów radioaktywnych.
      UWAGA: Zużyty bufor hybrydyzacyjny z sondą przechowywaną w temperaturze 4 °C może być ponownie użyty co najmniej 5 razy, umieszczając stożkową probówkę o pojemności 50 ml z szczelną zatyczką uszczelniającą, która zawiera bufor hybrydyzacyjny, w łaźni wodnej o temperaturze 100 °C na 5 minut.
    7. Przemyć membranę buforem do płukania podgrzanym do 65 °C. Dodaj 20 do 30 ml buforu do płukania do butelki do hybrydyzacji i obracaj przez 5 minut. Powtórz to pranie jeszcze 2 razy.
      UWAGA: Zmierz radioaktywność roztworów płuczących i zapisz ją, jeśli jest to wymagane przez lokalny instytut.
    8. Podczas mycia membrany umieść ekran obrazowania luminoforowego na gumce obrazu na 5 minut.
    9. Po trzecim praniu wyjmij membranę z butelki do hybrydyzacji, usuń nadmiar buforu z membrany ręcznikami papierowymi i umieść membranę w przezroczystym plastikowym uchwycie papierowym. Sprawdź sygnały radioaktywne na membranie za pomocą licznika Geigera. Wystaw wymazany ekran obrazowania luminoforowego na membranie na 10 minut do nocy, w zależności od intensywności sygnału.
    10. Zeskanuj ekran za pomocą systemu skanowania obrazu luminoforowego i uzyskaj dane o natężeniu sygnału każdej kropki.
  8. analiza danych
    1. Narysuj krzywą standardową za pomocą arkusza kalkulacyjnego i oprogramowania do analizy danych (np. Excel).
      UWAGA: Do narysowania krzywej standardowej użyto regresji liniowej logarytmicznej.
    2. Określić ekwiwalent nanogramów (ng-eq) dla każdej z próbek DNA wirusa przez interpolację. Ng-eq to ilość plazmidowego DNA użyta do narysowania krzywej standardowej, która jest równoważna liczbie cząsteczek wirusowego DNA. Gdy długość plazmidowego DNA wynosi 8 000 pz, 1 ng-eq jednoniciowego DNA wirusa AAV odpowiada 2,275 x 108 cząstek.
      UWAGA: Ekwiwalent ng-eq można przeliczyć na liczbę cząstek wirusa za pomocą następujących równań:
      Równanie do obliczania jednoniciowych cząstek AAV; Kwantyfikacja DNA; formuła genetyki molekularnej.
      Równanie do obliczania dwuniciowych cząstek AAV przy użyciu długości plazmidu; formuła naukowa.
      Liczba cząstek AAV jest konwencjonalnie wyrażana jako "vg" (genomy wektorowe) lub "DRP" (cząstki oporne na DNazę I).
    3. Obliczyć stężenia AAV w materiałach wyjściowych. Ponieważ plamiste wirusowe DNA stanowi 66,7% Procentowy wzór obliczeniowy: (320/400 × 200/240 × 100%) do analizy danych. wirusowego DNA w materiałach wyjściowych, 1 ng-eq odpowiada 1,7 x 109 cząstek/ml równanie matematyczne, wzór obliczeniowy, podział stosunków, mnożenie, notacja naukowa.
      UWAGA: Ta korekta nie jest konieczna, jeśli całe wirusowe DNA zawarte w materiale wyjściowym jest oblepione błoną bez strat (patrz Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywny wynik ilościowych plam punktowych do ilościowego oznaczania oczyszczonych wektorów AAV wyprodukowanych na dużą skalę jest pokazany w Rysunek 1. Za pomocą tego testu dot blot określono miano dwuniciowego wektora AAV2G9-CMV-GFP. Wektor został oczyszczony przez dwie rundy ultrawirowania chlorku cezu (CsCl) z gradientem gęstości, a następnie dializę, jak opisano wcześniej20. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku oczyszczonych z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano przydatność ilościowych testów punktowych do badania AAV AAP i ich roli w składaniu kapsydu. Wiedza uzyskana z tych badań może dostarczyć szczegółowych informacji na temat wrodzonych różnic w procesie składania kapsydu AAV oraz funkcjonalnej roli AAP między różnymi serotypami. W związku z tym test punktowy z komplementacją krzyżową AAV VP3-AAP ujawnił, że Snake AAV VP3 wykazywał ścisłą zależność od koekspresji pokrewnego AAP do składania kapsydu i że Snake AAP nie promuje składania kapsydu h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Xiao Xiao z Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill za dostarczenie nam plazmidu pEMBL-CMV-GFP. Dziękujemy Christopherowi Chengowi i Samuelowi J. Huangowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty Publicznej Służby Zdrowia (NIH R01 NS088399 i T32 EY232113).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BenzonazaMilliporeSigma1016970001określana jako endonukleaza Serratia marcescen w tekście głównym.
DNaza IRoche4716728001określana w tekście głównym jako enzym A DNazy I.
DNase IInvitrogen18047019określany w tekście głównym jako DNase I Enzym B.
DNase INew England BiolabsM0303LOkreślany jako DNase I Enzym C w tekście głównym.
1,5 ml Dołączone rurki do mikrowirówek z o-ringiemCorning430909
1,5 ml Probówki do mikrowirówekThermo Fisher Scientific05-408-129
15 ml polipropylenowa rurka stożkowaCorning352097
3 m octan soduTeknovaS0298
50 ml polipropylenowa rurka stożkowaCorning430291
Komórki AAV-293Agilent240073linia komórkowa HEK-293 zoptymalizowana pod kątem pakowania wirionów AAV.
AccuGENE 0,5 M roztwór EDTALonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Aparat Bio-DotBio-Rad1706545
Albumina surowicy bydlęcejMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ChloroformMilliporeSigma372978
Zestaw do ekstrakcji DNAWako Pure Chemical Industries295-50201Służy do ilościowych plam punktowych na oczyszczonym wirusie. Używamy tylko połowy objętości wszystkich odczynników w każdym kroku zalecanym dla Schematu Protokołu 2 w instrukcji dostarczonej przez producenta.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-wysoki poziom glukozy (4,5 g / L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Płodowa surowica bydlęcaVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095określana jako polisacharoza 400.
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxiovert 40 CFL
GlikogenRoche10901393001
Śledzie Plemniki DNAInvitrogen15634-017
Probówki do hybrydyzacjiThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Nauki przyrodniczeImageQuant TL
L-glutamina 200 mMLonza17-605E
Sześciowodny chlorek magnezuMilliporeSigmaM0250
Elektroporator MicroPulserBio-Rad1652100
Mini szybkie obracające się kolumny DNAMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
Penicylina/Streptomycyna 10K/10KLonza17-602E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLonza17-516F
Kaseta ekspozycyjna do fosforowaniaGE Healthcare Life SciencesRóżne
ekrany fosforowaniaGE Healthcare Life SciencesRóżne
zestawy plazmidowe MaxiQIAGEN12162
Platynowa polimeraza DNA PfxInvitrogen
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PoliwinylopirolidonMiliporeSigmaP5288
Prime-It II Zestaw do losowego etykietowania starterówAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 nukleotydy z 4. nukleotydu w AAP ORF, RE1 jest miejscem enzymu restrykcyjnego do klonowania): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 to miejsce enzymu restrykcyjnego do klonowania): TCTT-RE2-N25MilliporeNiestandardowypodkład
SigmaStarter VP3 Forward (N25 pierwsze 25 nukleotydów VP3 ORF, RE1 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer Primer
VP3 Reverse (N25 to ostatnie 25 nukleotydów AAP ORF, RE2 jest enzymem restrykcyjnym do klonowania): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaNiestandardowy starter
Proteinaza K RoztwórInvitrogen25530-049
Enzymy restrykcyjneNew England BiolabsRóżne
plemniki łososia DNAInvitrogen15632011
Pipety serologiczneThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Chlorek soduThermo FisherScientific S271-10
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodnymiliporeSigmaC8532
T4 Polimeraza DNANew England BiolabsM0203L
Eppendorf6321000515
6-dołkowa płytka poddana działaniu hodowli tkankowejCorning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Nasączony fenolemInvitrogen15513-047
CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Stosowany jest optymalny tryb sieciowania, zapewniający dawkę energii UV 120 mJ/cm2.
Membrana Zeta-ProbeBio-Rad162-0165
11708013353046 UV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bia ko aktywuj ce montamonta kapsyduoznaczanie ilo ci AAVtraktowanie nukleazodzyskiwanie cz steczek wirusastandardy plazmidowego DNAbufor do hybrydyzacjidetekcja licznikiem Geigera

Powiązane artykuły