Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Podsumowanie

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Streszczenie

Bisfenole, takie jak bisfenol A (BPA) i bisfenol S (BPS) są powszechnie stosowanymi środkami polimeryzującymi w produkcji tworzyw sztucznych i licznych produktów codziennego użytku. Ze względu na ich strukturę chemiczną i właściwości biologiczne podobne do estradiolu zostały sklasyfikowane jako związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC). Długotrwałe narażenie na EDC, nawet w niskich dawkach, wiąże się z różnymi wadami zdrowotnymi, w tym rakiem, zaburzeniami zachowania i niepłodnością, przy czym większa podatność jest wskazywana we wczesnych okresach rozwojowych. Badania komórkowe i molekularne z genetycznie podatnym modelem nicieni Caenorhabditis elegans wykazały, że narażenie na BPA powoduje apoptozę, śmiertelność zarodka i zakłócenie mechanizmów naprawy DNA. Wcześniej informowaliśmy, że narażenie zarodków C. elegans na niskie dawki różnych bisfenoli zmniejsza płodność. Ponadto wykazaliśmy, że skutki ekspozycji na bardzo wczesnych etapach rozwoju utrzymują się do dorosłości, co stwierdzono poprzez ilościowe określenie zachowań habituacyjnych, formy uczenia się bez asocjacji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące ekspozycji zarodków na niskodawkowe EDC, a także związane z tym testy płodności i habituacji przedniego dotyku, wraz z reprezentatywnymi wynikami.

Wprowadzenie

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe, szczególnie te, które mają tendencję do zakłócania rozwoju, było w ostatnich latach przedmiotem dokładnej naukowej analizy. Ponad tysiąc substancji chemicznych w codziennym użyciu jest klasyfikowanych jako związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC)¹. Zauważono, że okresy szybkiego wzrostu i rozwoju, które obejmują etapy embrionalne, niemowlęce i dziecięce, są szczególnie podatne na szkodliwe skutki nawet niskich dawek EDC. Wykazano, że ich działanie powoduje zaburzenia rozrodcze i neurorozwojowe². Zgodnie z wytycznymi Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska i Narodowego Programu Toksykologicznego USA, niska dawka może być zdefiniowana jako dowolna dawka poniżej poziomu, która została zgłoszona jako powodująca obserwowalną zmianę biologiczną lub uszkodzenie³. Oprócz skutków niskich dawek poszczególnych EDC, mieszaniny różnych EDC występujące w niskich stężeniach w środowisku mogą potencjalnie powodować istotne skutki skumulowane⁴.

Bisfenol A (BPA lub 4,4'-(propan-2,2-diyl)) jest środkiem polimeryzującym znajdującym się w powszechnie używanych przedmiotach, takich jak butelki na wodę, paragony sklepowe, uszczelniacze dentystyczne oraz wyściółki puszek po napojach i żywności⁵. Ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do 17-β estradiolu (E₂) i powinowactwo do receptorów estrogenowych ERα i ERβ, BPA został sklasyfikowany jako substancja chemiczna zaburzająca gospodarkę hormonalną (EDC)^5,6. Wykazano, że powinowactwo BPA do receptorów estrogenowych, choć słabsze, wpływa na układ rozrodczy obu płci i zakłóca funkcje neuronalne w dawkach uważanych za bezpieczne^7,8. Zaobserwowano, że zmiany w metylacji DNA poprzez epigenetycznie regulowane mechanizmy powodują długotrwałe defekty neuronalne u myszy narażonych na BPA⁹. W szczególności BPA jest również uważany za możliwego winowajcę zwiększonych wskaźników nadpobudliwości, niedoboru uwagi i zwiększonej wrażliwości na leki z powodu wzrostu obserwowanego w receptorach dopaminy D1 w limbicznym przodomózgowiu myszy po przewlekłej ekspozycji9^,10. Znaczące dowody na szkodliwy wpływ EDC na zdrowie ludzi opierają się na badaniach korelacyjnych skupiających się głównie na przewlekłym narażeniu populacji na toksyczne czynniki środowiskowe nawet przy niskich dawkach⁵; Jednak ograniczenia we wnioskach z badań na ludziach i w manipulowaniu eksperymentalnymi kontrolami zostały zaakceptowane podczas odpowiadania na krytykę bezpodstawnego hype^11,12.

Ze względu na zachowanie genów Caenorhabditis elegans w odniesieniu do ssaków, w tym genów receptorów hormonów steroidowych, naukowcy wykorzystali ten genetycznie wykonalny model laboratoryjny do rozwikłania funkcjonalnych i mechanistycznych efektów EDCs¹³. Eksperymenty z C. elegans wykazały, że te związki, takie jak BPA i BPS, mogą powodować apoptozę, śmiertelność embrionalną, zakłócenie mechanizmów naprawy pęknięć dwuniciowego DNA i funkcje neuronalne^14,15,16.

Nasze laboratorium wcześniej wykazało, że nawet niskie dawki ograniczone do wczesnej embriogenezy prowadzą do obniżenia płodności z deficytami behawioralnymi u ocalałych dorosłych¹⁵. Przyzwyczajenie do powtarzającego się bodźca jest formą uczenia się bez asocjacji w systemach modelowych, w tym C. elegans, a nasza metodologia wykorzystuje tę formę uczenia się bez asocjacji jako wynik behawioralny do oceny długoterminowych skutków ekspozycji embrionalnej na substancje toksyczne¹⁷ W szczególności zapewniamy szczegółowe protokoły badania ekspozycji BPA na C. elegans, w tym jego natychmiastowy wpływ na śmiertelność zarodków i długoterminowy wpływ na zachowanie dorosłych, z ogólnym schematem przedstawionym w Rysunek 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki testów płodności i uczenia się bez asocjacji, aby podkreślić skuteczność naszej metodologii.

Protokół

Poniższe protokoły zostały ustandaryzowane do testowania wpływu ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy i mogą być modyfikowane do użycia z BPS, BPF lub innymi EDC i toksycznymi substancjami na zarodkach C. elegans.

1. Ustawienia materiału

1. Przygotuj 500 ml pożywki do wzrostu nicieni (NGM)¹⁸ pożywki, rozpuszczając 1,5 g NaCl, 1,25 g peptonu i 8,5 g agaru w wodzie do 500 ml. Po sterylizacji w autoklawie (121 °C, 15 PSI, 20 min) dodać 0,5 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 0,5 ml 1 M_MgSO4, 0,5 ml 1 M CaCl₂ i 12,5 ml 1 M buforu fosforanu potasu, pH 7,4 (108,3 g KH₂PO₄, 35,6 g K₂HPO₄, woda do 1 l).
2. Przygotuj roztwór podchlorynu, mieszając 25 ml 1 N KOH, 4 ml wybielacza i 71 ml wody. Spraw, aby to rozwiązanie było świeże.
3. Przygotować bufor M9, mieszając 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, 5 ml 1 M_MgSO4 i wodę z 1 l.
4. Przygotuj bufor S Buffer¹⁸ mieszając 129 ml 0,02 M K₂HPO₄, 871 ml KH₂PO₄ i 5,85 g NaCl.
5. Sterylizuj M9 i S przez autoklawowanie.
6. Hoduj przez noc kulturę Escherichia coli (szczep OP 50) w 20 ml bulionu Luria (LB).
7. Rozpuść BPA w 10% etanolu, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM. Wykonać kolejne rozcieńczenia 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM i 10 μM w buforze S.
   UWAGA: Rozcieńczenie w wodnym buforze S znacznie zmniejsza stężenie etanolu; na przykład przy najwyższym stężeniu BPA opisanym w tym protokole (10 μM) stężenie etanolu wynosi 0,1% v/v.

2. C. elegans Hodowla i synchronizacja

1. Wlej pożywkę NGM do płytek o średnicy 100 mm (około 25 ml/płytkę) i pozwól jej zastygnąć. Po zestaleniu wysiewaj płytki, rozprowadzając 150 μl E. coli OP50 z płynnej kultury wyhodowanej przez noc. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Następnego dnia przenieś robaki N2 na nowe płytki, krojąc przybliżoną płytę o powierzchni 1 cm kwadratowej. Pozostawić robaki do wzrostu przez 3 dni w temperaturze 20 °C, aż na płytce pojawią się dobrze odżywione, dojrzałe osobniki dorosłe zawierające widoczne zarodki.
3. Aby przeprowadzić synchronizację, umyj każdą płytkę, pipetując do 5 ml buforu M9 w poprzek płytki. Przenieść płyn do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Synchronizacja jest wykonywana w celu zabicia dorosłych robaków i zebrania zarodków, które są w stosunkowo tym samym stadium.
4. Wirować przy 3 000 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej w celu uzyskania luźnej osadki dorosłych robaków.
5. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml ostrożnie usunąć supernatant tak, aby pozostawić osad w stanie nienaruszonym. Dodaj 5 ml roztworu podchlorynu i delikatnie wymieszaj.
6. Wirować przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
7. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przemyć 7 ml buforu M9. Powtórz ten krok dwukrotnie.

3. Narażanie robaków na działanie BPA

1. Po ostatnim myciu z kroku 2.7 powyżej, zawiesić około 100 μl jaj za pomocą bufora M9. Przenieś około 50 μl jaj do probówek do mikrofuge o pojemności 2 ml, zawierających już BPA o odpowiednim stężeniu, rozcieńczonego w buforze S. Dostosuj ilość buforu S, aby zapewnić prawidłowe końcowe stężenie BPA (0,0 μM, 0,1 μM, 0,5 μM, 1,0 μM, 5,0 μM i 10 μM) na probówkę. Tabela 1 ilustruje jeden ze sposobów dokonywania tych rozcieńczeń.

Dla końcowego stężenia BPA	Zapas BPA (100 μM)	Bufor S	Zsynchronizowane robaki
0,1 μM	1 μL	949 μL	50 μL
0,5 μM	5 μL	945 μL	50 μL
1 μM	10 μL	940 μL	50 μL
5 μM	50 μL	900 μL	50 μL
10 μM	100 μL	850 μL	50 μL

Tabela 1: Zapasowe BPA, bufor S i zsynchronizowane robaki użyte do osiągnięcia pożądanych stężeń użytych w naszym badaniu.

2. Umieść probówki na wytrząsarce i delikatnie potrząsaj przez 4 godziny w temperaturze 20°C, przy 25 obr./min w przypadku wytrząsarki obrotowej lub 25 przechyleń/min w przypadku wytrząsarki kołyszącej.
3. Po 4 godzinach umieść probówki w uchwytach na probówki i pozwól robakom się uspokoić.
4. Wyrzuć supernatant i przenieś robaki na płytki z nasionami (płytki NGM z OP50 E. coli). Przygotować płynną kulturę OP50 E. coli, jak podano w ppkt 1.5 i wysiać płytki, jak podano w ppkt 2.1.
5. Pozwól robakom rosnąć przez 60 godzin w temperaturze 20 °C. Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zanieczyszczeń. Zanieczyszczone płytki NGM są zwykle odbarwione i towarzyszą im poszczególne kolonie. Sprawdź robaki pod mikroskopem pod kątem przeludnienia. Brak trawnika OP50 E. coli i skoncentrowane robaki w małych miejscach oznaczają przeludnienie.

4. Test habituacji przedniego dotyku

1. Przenieś około 10 zsynchronizowanych młodych dorosłych robaków na nowe, niewysiewane płytki NGM za pomocą sterylizowanego ogniowo plastikowego drucianego szpikulca o wadze 30 G. Pozostaw robaki w spokoju przez 5 minut, aby miały czas na aklimatyzację do nowej płytki.
2. Aby uzyskać reakcję przyzwyczajenia, użyj włoska brwiowego przymocowanego do końca drewnianego szpikulca lub wykałaczki i sterylizuj, zanurzając w 70% etanolu. Wytrzyj czystą, niestrzępiącą się chusteczką i odczekaj 1 minutę, aż etanol odparuje. Delikatnie dotknij robaka na głowie (przed opuszką gardłową) za pomocą włosków brwiowych. Powtórz dotknięcia, pozostawiając 10 sekund między dotknięciami, aby robak mógł się zregenerować.
3. Kontynuuj dotykanie (pozostawiając 10-sekundowe przerwy między bodźcami), aż robak przestanie się cofać. W tym momencie robak przyzwyczaił się do bodźca. Zapisz liczbę dotknięć wymaganych do przyzwyczajenia się robaka.
4. Przeanalizuj różnicę między średnimi wskaźnikami habituacji osób z grupy kontrolnej leczonej i nieleczonej, używając jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya.

5. Test płodności robaków

1. Przenieś pojedyncze robaki L3 na świeży i wysiedlony talerz za pomocą platynowego kilofa. Upewnij się, że na każdej płytce znajduje się tylko jeden robak.
   UWAGA: Po stadium larwalnym L3 robaki rozwijają się w stadium larwalne L4 i dorosłość. Wczesne zbieranie ich jest wygodne, ponieważ są wystarczająco duże, aby można było przenieść pojedyncze zwierzęta, przy jednoczesnym zapewnieniu, że nie złożyły już żadnych jaj, które w przeciwnym razie zostałyby pominięte podczas liczenia.
2. Policz liczbę jaj składanych co 12–24 godziny. Po zliczeniu przenieś robaka rodzicielskiego na nową płytkę. Powtarzaj, aż robak przestanie składać jaja, zwykle po 5 dniach inkubacji w temperaturze 20 °C.
   UWAGA: Średnio robak typu dzikiego może złożyć do 300 jaj; Dlatego codzienne przenoszenie rodzica na nowy talerz zapobiega przepełnieniu.
3. Przeanalizuj różnicę między średnią liczbą jaj złożonych przez kontrole poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu substancji, używając jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu post hoc Tukeya.

Wyniki

Wcześniejsze badania z C. elegans wykazały, że ciągłe narażenie na wysokie stężenia BPA (≥1 mM) w okresie rozwoju zarodka i dorosłości zmniejsza płodność¹⁴. Późniejsze badania opisane w naszym laboratorium wykazały, że zarodki, które były narażone na działanie BPA przez ograniczony okres 4 godzin w początkowych stadiach rozwoju, wykazały spadek liczby zdolnych do życia jaj złożonych jako dorosłe osobniki¹⁵ (Rysunek 2). Dwie kluczowe cechy metodologii polegały na tym, że (i) zastosowane stężenia BPA były znacznie niższe (zakres od 0,1 μM do 10 μM) oraz (ii) narażenie było ograniczone do wczesnego okresu embrionalnego. Oprócz zmniejszonej płodności nawet przy niższych dawkach, nasze testy habituacji wykazały, że robaki wystawione na działanie BPA jako zarodki wymagały więcej bodźców, aby się przyzwyczaić w porównaniu z robakami wystawionymi na działanie samego nośnika¹⁵ (Rysunek 3). Efekty te są godne uwagi, ponieważ opierają się na ekspozycji na niskie dawki BPA, zgodnie z założeniem, że subtelniejsze efekty na funkcje neuronów, które mogą nie być morfologicznie widoczne, mogą być dostrzegalne poprzez zmiany w zachowaniu. Krótko mówiąc, przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki podkreślają fakt, że szkodliwe skutki ekspozycji zarodka na BPA wpływają na jego rozwój, w tym na funkcje neuronów, które można ocenić za pomocą testów behawioralnych u dorosłych u C. elegans. Przedstawione tutaj protokoły mogą być wykorzystywane do testowania niskich, jak i długoterminowych skutków innych potencjalnych substancji toksycznych, w tym związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie projektu eksperymentalnego. Dojrzałe robaki zebrano i wystawiono na działanie roztworu podchlorynu w celu zebrania zsynchronizowanych zarodków. Zarodki były następnie wystawione na działanie różnych stężeń BPA przez 4 godziny. Odsłonięte zarodki przeniesiono na wysiewane płytki NGM, gdzie pozwolono im rosnąć przez 60 godzin w temperaturze 20 °C. W celu zbadania skuteczności ekspozycji we wczesnych stadiach rozwoju, robaki L4 przeniesiono na poszczególne płytki i przetestowano pod kątem płodności, a młodych dorosłych przetestowano z przyzwyczajeniem do dotyku przedniego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Płodność jest obniżana przez BPA. Narażenie na 1 μM i wyższe stężenia BPA znacznie zmniejszyło liczbę składanych jaj w porównaniu z kontrolą (reprezentowaną przez linię poziomą; n = 10, *p <0,05). Słupki błędów oznaczają SEM. Analiza wykonana przy użyciu ANOVA, testu post hoc Tukeya. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Mersha et al., 2015¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Długoterminowe skutki embrionalnej ekspozycji na BPA znajdują odzwierciedlenie w zachowaniu dorosłych. Zarodki narażone na stężenie BPA tak niskie jak 0,1 μM wpływa na nieasocjacyjne przyzwyczajenie do dotyku przedniego u dorosłych (n = 60, *p <0,05). Słupki błędów oznaczają SEM; ANOVA, test post hoc Tukeya. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Mersha et al., 2015¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Fazy szybkiego wzrostu i rozwoju, takie jak embriogeneza, są szczególnie podatne na szkodliwe działanie różnych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego, w tym BPA. Udostępniamy szczegółowe protokoły badania skutków narażenia na BPA lub inne substancje toksyczne w modelu bezkręgowców C. elegans , który umożliwia wygodne miareczkowanie zakresu stężeń w celu oceny jego wpływu na żywotność zarodka (ryc. 2). Dalsze eksperymenty behawioralne na ocalałych dorosłych, które rozwijają się z zarodków, które były narażone na niskie dawki BPA, pozwalają na określenie długoterminowego wpływu na funkcję neuronów (ryc. 3). Główną ideą tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów wystawiania embrionów na działanie różnych substancji toksycznych we wczesnym okresie embriogenezy w modelu C. elegans; pierwsze 4-godzinne okno 11,5-godzinnego okresu rozwoju embrionalnego (w temperaturze 20 °C) odpowiada okresowi proliferacji, po którym następuje organogeneza. W tym celu przeprowadziliśmy walidację punktów końcowych za pomocą testów płodności i uczenia się bez asocjacji. Podczas gdy mechanistyczne podstawy działania BPA i innych bisfenoli są świętym Graalem, do którego zmierzają badania w tej dziedzinie, nie próbowaliśmy zaoferować mechanistycznego wyjaśnienia działania BPA w tym artykule skoncentrowanym na metodologii. Chcielibyśmy jednak zwrócić uwagę, że model C. elegans oferuje idealny system do dalszej analizy mechanizmu działania. Na przykład w ramach przyszłych prac nad rozszyfrowaniem mechanizmów działania BPA mutanty C. elegans mogą zostać wygenerowane i przebadane pod kątem odporności na działanie BPA, a tym samym utorować drogę do rozszyfrowania szlaku. Ponadto nasz artykuł towarzyszący zajmuje się wpływem BPA na poziomie synchronizacji sieci neuronowych u kręgowców, zapewniając kolejną drogę do zrozumienia podstaw do badania potencjalnych mechanizmów działania toksycznego¹⁹.

W metodologii opisanej w tym artykule, niektóre z krytycznych kroków, które należy wykonać bardzo ostrożnie, obejmują: Wybór płytki z dobrze odżywionymi dorosłymi osobnikami C. elegans z dojrzałymi jajami widocznymi pod mikroskopem preparacyjnym ma kluczowe znaczenie, a niewykonanie tego kroku spowoduje niewystarczającą wielkość próbki zarodków do eksperymentu z ekspozycją na EDC. Ważne jest również, aby upewnić się, że roztwór podchlorynu jest świeży, aby uniknąć uzyskania niezsynchronizowanej populacji, która będzie zakłócać zdolność do przeprowadzenia ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy. Bardzo ważnym krokiem jest również mycie granulek M9 (po ekspozycji na podchloryn). Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, wysokie stężenie wybielacza może spowodować śmierć zarodków. Dodatkowo po 4 godzinach należy przenieść zarodki na płytki wysiewane metodą NGM. Jeśli zarodki zostaną pozostawione w roztworze BPA przez dłuższy czas, prawdopodobnie rozwiną się w długowieczne larwy dauer. Będzie to znacząco kolidować zarówno z testem płodności, jak i testami behawioralnymi. Jeśli którykolwiek z tych kroków zostanie pominięty, zaleca się rozpoczęcie procedury od samego początku. Jeśli z jakiegokolwiek powodu płytka NGM z robakami jest zanieczyszczona lub nie ma wystarczającej ilości pożywienia, spowoduje to dodatkowy stres u robaków, zniekształcając w ten sposób zebrane dane. Takie płytki należy wyrzucić i nie używać ich w doświadczeniu.

Wcześniej w niezwykłym badaniu z powodzeniem wykorzystano model C. elegans, aby wykazać, że nieprawidłowości chromosomowe spowodowane przez BPA wynikają z rozpadu maszynerii naprawy DNA w linii zarodkowej¹⁴. Warto jednak zauważyć, że w powyższym projekcie badania wykorzystano ciągłą ekspozycję C. elegans na BPA na wysokie dawki BPA przez cały okres jego życia. Nasza metodologia została zaprojektowana do badania ekspozycji na niskie dawki BPA podczas wczesnej embriogenezy, aby ocenić jej wpływ na żywotność zarodka i subtelniejsze długoterminowe skutki dla osób, które przeżyły. O ile nam wiadomo, nie opracowano żadnej metodologii pozwalającej na narażenie zarodków we wczesnym stadium rozwoju na bardzo niskie dawki BPA ograniczone do określonego okresu czasu; Tym samym sprawia, że prezentowana tu metoda jest nowatorska.

Ponadto przedstawione tutaj protokoły można łatwo dostosować do badania wpływu innych EDC podczas fazy proliferacji embriogenezy. Jednakże, aby badać późne stadia embrionalne, protokół będzie wymagał kluczowych modyfikacji krytycznego okna czasowego rozwoju, na którym się skupiamy. Co więcej, nasz protokół nie będzie odpowiedni dla eksperymentów wymagających dłuższego czasu ekspozycji na toksyny, ponieważ otwiera możliwość alternatywnej ścieżki rozwoju skutkującej długotrwałym zatrzymaniem dauera w drugim cyklu linienia, który jest odporny na trudne warunki²⁰. Konieczne będą dalsze modyfikacje i udoskonalenia w celu wydłużenia czasu ekspozycji poprzez suplementację źródłem żywności, które nie ma potencjału do metabolizowania substancji toksycznej lub EDC , np. autoklawizowanej E. coli. Podsumowując, nasza metodologia może być wykorzystana do oceny wpływu różnych substancji chemicznych zaburzających gospodarkę hormonalną na płodność i funkcję neuronów w systemie modelowym bezkręgowców C. elegans.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl	Fisher	7647-14-5
Pepton	Fisher	S25761B
Agar	Fisher	BP1423-500
Cholesterol	Alfa	Aesar A11470
MgSO4	Fisher	7487-88-9
CaCl2	Fisher	C79-500
KH2PO4	Fisher	P286-1
K2HPO4	Fisher	7758-11--4
KOH	Fisher	1310-58-3
Wybielacz	Clorox	n/a
Na2HPO4	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
CGC		E.coli OP50	w U of Minnesota
Robaki N2 (dziki typ C. elegans)	CGC		w U z Minnesoty
Platynowy wykalek	Genesee Scientific	59-AWP
Płytki Petriego	Fisher	07-202-011
Mikroskop preparacyjny	AmScope	SM-2TYY