Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56776

⸱

15 marca 2018

 , 
1CHU de Québec-Université Laval Research Center, Université Laval, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Bioinformatics, Université Laval

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Streszczenie

Obrazowanie wapnia (Ca2+) jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w dendrytach neuronalnych. Wahania Ca2+ mogą występować poprzez różne mechanizmy błonowe i wewnątrzkomórkowe i odgrywać kluczową rolę w indukcji plastyczności synaptycznej i regulacji pobudliwości dendrytycznej. W związku z tym możliwość rejestrowania różnych typów sygnałów Ca2+ w gałęziach dendrytycznych jest cenna dla grup badających, w jaki sposób dendryty integrują informacje. Pojawienie się mikroskopii dwufotonowej znacznie ułatwiło takie badania, rozwiązując problemy związane z obrazowaniem w żywych tkankach, takie jak rozpraszanie światła i fotouszkodzenia. Ponadto, dzięki połączeniu konwencjonalnych technik elektrofizjologicznych z dwufotonowym obrazowaniemCa2+, możliwe jest badanie lokalnych fluktuacji Ca2+ w dendrytach neuronalnych równolegle z zapisami aktywności synaptycznej w somie. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać tę metodę do badania dynamiki lokalnych stanów przejściowych Ca2+ (CaT) w dendrytach interneuronów hamujących GABA-ergicznych. Metoda może być również zastosowana do badania dendrytycznej sygnalizacji Ca2 + w różnych typach neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Wprowadzenie

Wkład neuronu w aktywność sieci jest w dużej mierze zdeterminowany przez dynamiczną naturę sygnałów synaptycznych, które otrzymuje. Tradycyjnie, dominująca metoda charakteryzowania aktywności synaptycznej w neuronach opierała się na somatycznych zapisach patch-clamp całych komórek prądów postsynaptycznych wywołanych przez elektryczną stymulację aksonów przejścia. Jednak w tym przypadku tylko aktywność synaps położonych proksymalnie jest podawana zgodnie z prawdą1. Ponadto, aby ocenić mechanizmy specyficzne dla synaps, wykorzystano nagrania z par neuronów i dendrytów w określonej lokalizacji, aby ukierunkować odpowiednio na synapsy będące przedmiotem zainteresowania i mechanizmy integracji dendrytycznej. Duży przełom w dziedzinie fizjologii synaps został osiągnięty dzięki mariażowi technik optycznych i elektrofizjologicznych. Laserowa mikroskopia skaningowa z wzbudzeniem dwufotonowym (2PLSM) w połączeniu z obrazowaniem Ca2 + i narzędziami optogenetycznymi może ujawnić ogromne szczegóły dynamicznej organizacji aktywności synaptycznej w określonych połączeniach neuronalnych w wycinkach mózgu in vitro i in vivo.

Kilka kluczowych zalet sprawiło, że 2PLSM wyróżnia się na tle konwencjonalnej, jednofotonowej mikroskopii wzbudzenia2: (1) ze względu na nieliniową naturę wzbudzenia dwufotonowego, fluorescencja jest generowana tylko w objętości ogniskowej, a wszystkie emitowane fotony reprezentują użyteczne sygnały (nie ma potrzeby stosowania otworków); (2) dłuższe fale, stosowane w 2PLSM, skuteczniej przenikają do tkanki rozpraszającej; Ponadto rozproszone fotony są zbyt rozcieńczone, aby wytworzyć wzbudzenie dwufotonowe i fluorescencję tła; (3) Fotouszkodzenia i fototoksyczność są również ograniczone do płaszczyzny ogniskowej. Dlatego, pomimo wysokich kosztów systemów 2-fotonowych w porównaniu z konwencjonalnymi mikroskopami konfokalnymi, 2PLSM pozostaje metodą z wyboru do wysokorozdzielczych badań struktury i funkcji neuronów w grubej żywej tkance.

Pierwszym zastosowaniem 2PLSM w tkance rozpraszającej było zobrazowanie struktury i funkcji kolców dendrytycznych3. 2PLSM w połączeniu z obrazowaniem Ca2+ ujawniło, że kolce funkcjonują jako izolowane przedziały biochemiczne. Ponieważ w wielu typach neuronów istnieje zgodność jeden do jednego między kolcami a poszczególnymi synapsami4, dwufotonowe obrazowanie Ca2+ wkrótce stało się użytecznym narzędziem raportującym aktywność poszczególnych synaps w nienaruszonej tkance5,6,7,8. Co więcej, obrazowanie Ca2+ oparte na 2PLSM zostało z powodzeniem wykorzystane do monitorowania aktywności pojedynczych kanałów wapniowych i nieliniowych interakcji między przewodnictwem wewnętrznym i synaptycznym, a także do oceny zależnej od stanu i aktywności regulacji sygnalizacji Ca2+ w dendrytach neuronalnych5,6,7,8,9,10,11.

Wapń jest wszechobecnym wewnątrzkomórkowym drugim przekaźnikiem, a jego subkomórkowa organizacja czasoprzestrzenna determinuje kierunek reakcji fizjologicznych, od zmian w sile synaps do regulacji kanałów jonowych, wzrostu dendrytów i kręgosłupa, a także śmierci i przeżycia komórek. Endrytyczne podwyższenie Ca2+ następuje poprzez aktywację wielu szlaków. Potencjały czynnościowe (AP), rozchodzące się wstecznie do dendrytów, otwierają bramkowane napięciem kanały wapniowe12 i wytwarzają względnie globalne stany przejściowe Ca2+ (CaT) w dendrytach i kolcach13. Transmisja synaptyczna jest związana z aktywacją postsynaptycznych receptorów przepuszczalnych Ca2+ (NMDA, Ca2+-przepuszczalny AMPA i kainian), wyzwalając synaptyczne CaTs6,14,15. Wreszcie, supraliniowe zdarzenia Ca2+ mogą być generowane w dendrytach pod pewnymi warunkami11,12,13,16.

Obrazowanie dwufotonowe Ca2+ w połączeniu z zapisami elektrofizjologicznymi typu patch-clamp wykorzystuje syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+, które są zazwyczaj dostarczane przez elektrodę krosową podczas zapisów całych komórek. Standardowa metoda ilościowego oznaczania dynamiki Ca2+ opiera się na metodzie podwójnego wskaźnika17,18. Wykorzystuje ona dwa fluorofory z dobrze oddzielonymi widmami emisyjnymi (np. połączenie czerwonego barwnika niewrażliwego naCa2+ z zielonymi wskaźnikamiCa2+, takimi jak Oregon Green BAPTA-1 lub Fluo-4) i ma kilka zalet w porównaniu z metodą jednowskaźnikową. Po pierwsze, barwnik niewrażliwy na Ca2 + jest używany do zlokalizowania małych struktur zainteresowania (gałęzie dendrytyczne i kolce), w których zostanie przeprowadzone obrazowanie Ca2 +. Po drugie, stosunek między zmianą fluorescencji zielonej i czerwonej (ΔG/R) jest obliczany jako miara [Ca2+], która jest w dużej mierze niewrażliwa na zmiany podstawowej fluorescencji spowodowane wahaniami [Ca2+]017,18. Ponadto zmiany fluorescencji można skalibrować pod względem bezwzględnych stężeń Ca2+ 19.

Ogólnym problemem podczas przeprowadzania eksperymentów z obrazowaniem dwufotonowym Ca2+ w ostrych wycinkach jest zdrowie komórek i stabilność akwizycji obrazu ze względu na zazwyczaj używaną dużą moc lasera. Ponadto w eksperymentach obrazowania Ca2 + istnieje obawa o zaburzenia i znaczne przeszacowanie subkomórkowej dynamiki Ca2 + ze względu na fakt, że wskaźniki Ca2 + działają jak wysoce mobilne egzogenne Ca2 +. Tak więc wybór wskaźnika Ca2+ i jego stężenie zależy od typu neuronu, przewidywanej amplitudy CaT oraz od pytania eksperymentalnego.

Dostosowaliśmy metodę obrazowania dwufotonowego Ca2+ do badania fluktuacji Ca2+ w dendrytach interneuronów GABAergicznych9,10,11,20,21,22. Podczas gdy większość wczesnych badań obrazowania Ca2 + przeprowadzono w głównych neuronach, interneurony hamujące wykazują dużą różnorodność funkcjonalnych mechanizmów Ca2 +, które różnią się od tych w komórkach piramidowych20,23,24. Te specyficzne dla neuronów mechanizmy (np. przepuszczalne receptory AMPA Ca2+) mogą odgrywać określone role w regulacji aktywności komórek. Podczas gdy dendrytyczna sygnalizacja Ca2 + w interneuronach jest kuszącym celem do dalszych badań, obrazowanie dwufotonowe Ca2 + w dendrytach tych komórek stanowi dodatkowe wyzwania, od cieńszej średnicy dendrytów i braku kolców po szczególnie wysoką endogenną zdolność wiązania Ca2 +. Ponieważ nasze zainteresowania badawcze koncentrują się na badaniu interneuronów hipokampa, poniższy protokół, choć ma zastosowanie do różnych populacji neuronów, został dostosowany do radzenia sobie z tymi wyzwaniami.

Ten protokół został wykonany za pomocą komercyjnego konfokalnego mikroskopu dwufotonowego, który był wyposażony w dwa zewnętrzne, niedeskanowane detektory (NDD), modulator elektrooptyczny (EOM) i kontrast gradientu skanowania Dodt (SGC) i zainstalowany na stole optycznym. Mikroskop był sprzężony z wielofotonowym laserem Ti:Sapphire z blokadą trybu 800 nm (> 3 W, 140 impulsów fs, częstotliwość powtarzania 80 Hz). System obrazowania został wyposażony w standardowe stanowisko do elektrofizjologii, w tym komorę perfuzyjną z kontrolą temperatury, platformę translacyjną z dwoma mikromanipulatorami, sterowany komputerowo wzmacniacz mikroelektrod, digitizer, jednostkę stymulacyjną i oprogramowanie do akwizycji danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt Komitetu Ochrony Zwierząt Uniwersytetu Laval oraz Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowania wstępne (Opcjonalnie: przygotować z 1-dniowym wyprzedzeniem)

  1. Przygotuj trzy rodzaje roztworu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (roztwór standardowy, sacharozowy oraz regeneracyjny, po 1 L każdego; patrz Tabela 1). Dostosuj osmolalność roztworów do poziomu 300 ± 10 mOsm25 i schłodź ACSF-sacharozę do temperatury bliskiej zamarzania (0-4 °C).
    UWAGA: Zastosowanie roztworu do wycinania o niskiej zawartości sodu (ACSF-sacharoza) pomaga zachować żywotność neuronów w powierzchownych warstwach ostrych skrawków26.
  2. Przygotuj 0,75 mL roztworu do patch-clampu zawierającego czerwony fluorofor (np. Alexa-594) oraz zielony syntetyczny wskaźnik wapnia (np. Oregon Green BAPTA-1; patrz Tabela 1). Dodaj biocytynę (patrz Tabela 1) do roztworu do patch-clampu, jeśli wymagana jest morfologiczna identyfikacja rejestrowanych komórek post hoc.
  3. Dostosuj osmolalność roztworu do 280 ± 5 mOsm oraz pH do 7,35 ± 0,5. Przechowuj roztwór przez cały czas w lodówce lub w lodzie.
    UWAGA: Wybór wskaźnika wapnia powinien opierać się na jego zakresie dynamicznym oraz charakterze badanych zdarzeń Ca2+.
  4. Używając wyciągacza mikropipet, przygotuj pipety do patch-clampu z kapilar borokrzemianowych (patrz Tabela materiałów) z końcówką o średnicy ≈ 2 µm (oporność pipety 3-5 MΩ) oraz pipety stymulujące z borokrzemianowych kapilar typu theta (patrz Tabela materiałów) z końcówką o średnicy 2-5 µm.
    UWAGA: Ustawienia wyciągacza pozwalające uzyskać pipety o określonej średnicy i kształcie będą zależeć od typu włókna wyciągacza oraz wyników testu rampy dla danego rodzaju szkła.

2. Przygotowanie skrawków hipokampa

  1. Zanurz mysz (P13-20; szczep i płeć myszy są określone przez badane pytanie eksperymentalne) w narkozie, podając 1 mL izofluranu naniesionego na ręcznik papierowy w komorze do narkozy inhalacyjnej. Gdy zwierzę zostanie głęboko znieczulone, co objawia się brakiem ruchu i spowolnionym oddechem, należy wyjąć je z komory i przeprowadzić dekapitację za pomocą gilotyny.
  2. Odsłoń czaszkę, rozcinając skórę małymi nożyczkami od tyłu czaszki w kierunku nosa. Użyj małych kleszczykostopów do kości, aby wykonać otwór na poziomie bregma. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj cięcie od strony ogonowej do rostralnej wzdłuż szwu strzałkowego. Kleszczykostopami chwyć tylną część każdej klapy czaszki i unieś ją do góry i na zewnątrz, aby usunąć pokrywę czaszki z każdej półkuli.
  3. Po pełnym odsłonięciu mózgu podetnij nerwy wzrokowe małą szpatułką. Wyjmij mózg z czaszki i umieść go w szalce Petri zawierającej stale napowietrzany, zimny ACSF-Sucrose (stężenie sacharozy znajduje się w Tabeli 1).
    1. Jeśli wymagana jest tkanka od starszych myszy, przed wyjęciem mózgu przeprowadź perfuzję wewnątrzsercową za pomocą strzykawki (25G) wypełnionej 20 mL lodowatego ACSF-Sucrose, aby uzyskać wysokiej jakości skrawki.
  4. Przygotuj skrawki hipokampa z wyjętego mózgu zwierzęcia.
    1. Pozostaw mózg do schłodzenia przez około 2 min. Połóż kawałek papieru filtrowanego na szalce Petri z lodem, a następnie przenieś mózg na papier filtracyjny. Rozdziel obie półkule.
    2. Przyklej rozdzielone półkule (orientacja jest określona przez cel eksperymentalny, aby uzyskać skrawki koronalne, poprzeczne lub poziome) do stołu wibratomu i zanurz je w kuwecie wibratomu wypełnionej lodowatym, napowietrzanym ACSF-Sucrose. Wykonaj skrawki o grubości 300 µm w temperaturze około 1 °C, korzystając z chłodziarki wibratomu lub umieszczając lód wokół kuwety wibratomu.
    3. Za pomocą płaskiego pędzla zbierz skrawki zawierające hipokamp (do 6 skrawków na półkulę) do kąpieli zawierającej napowietrzany ACSF-Recovery podgrzany do 37 °C.
    4. Pozostaw skrawki w kąpieli ACSF-Recovery na co najmniej 45 min.

3. Rejestracje patch-clamp w konfiguracji whole-cell

  1. Umieść skrawek hipokampa w komorze znajdującej się pod obiektywem (powiększenie: 40x, apertura numeryczna: 0,8) dwufotonowego mikroskopu skaningowego. Stale perfunduj komorę natlenionym ACSF-Normal podgrzanym do 30-32 °C z przepływem 2,5-3 mL/min.
  2. Użyj kontrastu interferencyjnego w podczerwieni (IR-DIC) lub mikroskopii Dodt-SGC, aby zlokalizować interesującą komórkę na podstawie jej wielkości, kształtu i położenia.
    UWAGA: W zależności od docelowej populacji neuronów można zastosować transgeniczny model mysi, aby łatwiej zlokalizować interesujące komórki. W takim przypadku krok ten można zastąpić użyciem fluorescencyjnego źródła światła.
  3. Napełnij pipetę stymulującą roztworem ACSF-Normal zawierającym czerwony fluorofor (np. Alexa-594).
  4. Ustaw pipetę stymulującą (podłączoną do jednostki stymulacji elektrycznej) nad skrawkiem tak, aby jej końcówka znajdowała się w tym samym obszarze co interesująca komórka.
  5. Po napełnieniu pipety patch roztworem do patchowania i przymocowaniu jej do głowicy (head stage), ustaw ją nad skrawkiem tak, aby końcówka znajdowała się bezpośrednio nad interesującą komórką.
  6. Zamocuj strzykawkę w trójdrożnym kurku i połącz ją z pipetą patch za pomocą plastikowej rurki. Za pomocą strzykawki wprowadź stałe nadciśnienie do pipety patch (≈ 0,1 mL). Pozostaw kurek w pozycji „zamkniętej”.
  7. Aktywuj moduł oprogramowania sterującego wzmacniaczem i przełącz na tryb clampowania napięcia (voltage-clamp), klikając przycisk „VC”. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych elektrofizjologicznych (np. clampex) w celu rejestracji sygnałów elektrofizjologicznych i kliknij ikonę „Membrane Test”, aby program stale wysyłał prostokątny impuls napięcia (5 mV, 10 ms), co jest niezbędne do monitorowania zmian oporności pipety.
  8. Obniżaj pipetę patch, aż znajdzie się ona bezpośrednio nad docelową komórką. Po zetknięciu z błoną komórkową zdejmij ciśnienie, przekręcając kurek do pozycji „otwartej”.
    UWAGA: Kontakt z błoną komórkową rozpoznaje się po niewielkim wzroście oporności pipety (≈ 0,2 MΩ) oraz powstaniu niewielkiego w wgłębienia w komórce wywołanego nadciśnieniem.
  9. Zastosuj lekkie podciśnienie w pipecie patch za pomocą pustej strzykawki zamocowanej w kurku, aż oporność pipety podawana przez oprogramowanie osiągnie 1 GΩ. W oknie „Membrane Test” oprogramowania do akwizycji danych ustaw clampowanie komórki na poziomie -60 mV.
  10. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż do otwarcia komórki i uzyskania konfiguracji whole-cell. Rozpoznanie tego stanu komórki opiera się na nagłej zmianie oporności pipety (z 1 GΩ do 70-500 MΩ w zależności od typu interneuronu) oraz pojawieniu się dużych przejściowych prądów pojemnościowych w oknie „Membrane Test”.

4. Dwufotonowe obrazowanie Ca2+

  1. W przypadku zainteresowania pobudzeniowymi odpowiedziami postsynaptycznymi, należy dodać do kąpieli ACSF bloker receptora GABAA gabazynę (10 µM) oraz bloker receptora GABAB CGP55845 (2 µM).
  2. W module oprogramowania sterującego wzmacniaczem należy ustawić konfigurację patch na clamp prądowy, klikając przycisk „CC”, a następnie zarejestrować wzorzec wyładowań komórki w odpowiedzi na somatyczne wstrzyknięcia prądu depolarzyzującego (0,8-1,0 nA, 1 s). Należy odczekać co najmniej 30 min, aby komórka wypełniła się wskaźnikami obecnymi w roztworze do patchowania.
    UWAGA: Wzorzec wyładowań i właściwości aktywne komórki mogą posłużyć do identyfikacji jej podtypu; np. komórek o szybkim tempie wyładowań (fast-spiking). Ważne jest, aby stężenie wskaźnika ustabilizowało się poprzez dyfuzję przed rozpoczęciem rejestracji CaTs (rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).
  3. CaTs wywołane potencjałami czynnościowymi (AP)
    1. Za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów należy rozpocząć pozyskiwanie obrazów. Wyznaczyć interesujący dendryt, korzystając z sygnału fluorescencji czerwonej. Aby zapewnić widoczną odpowiedź, należy najpierw wybrać dendryt proksymalny (≤ 50 µm), ponieważ wydajność wstecznej propagacji AP może znacząco spadać wraz z odległością w interneuronach GABAergicznych22.
    2. Używając „narzędzia prostokątnego” w oprogramowaniu do akwizycji obrazów, należy powiększyć docelowy obszar i przełączyć się na tryb „xt” (linescan). Pozycjonować skan w poprzek interesującej gałęzi dendrytycznej. Za pomocą kontrolerów intensywności lasera w oprogramowaniu akwizycyjnym ustawić laser dwufotonowy na minimalnym poziomie mocy, przy którym bazowa fluorescencja zielona jest ledwie widoczna, aby uniknąć fototoksyczności.
    3. W oknie „Protocol” oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych oraz w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy utworzyć próbę rejestracji o pożądanej czasie trwania, zawierającą somatyczne wstrzyknięcie prądu o żądanej amplitudzie.
      1. Używając oprogramowania do akwizycji obrazów, należy kliknąć przycisk „Start record” i rejestrować fluorescencję w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórzyć akwizycję obrazu 3-10 razy. Odczekać co najmniej 30 s między pojedynczymi skanami, aby uniknąć fotouszkodzeń. W przypadku pozyskiwania linescanów w wielu punktach wzdłuż dendrytu, należy wykonywać je w losowej kolejności, aby uniknąć efektów kolejności.
  4. CaTs wywołane synaptycznie
    1. Wyznaczyć interesujący dendryt, korzystając z sygnału fluorescencji czerwonej.
    2. Ustawić pipetę stymulującą na powierzchni skrawka powyżej interesującego dendrytu. Powoli opuścić pipetę stymulującą na miejsce, minimalizując ruchy, aby nie zakłócić konfiguracji whole-cell. Upozycjonować pipetę w odległości 10-15 µm od dendrytu.
    3. Aby zwizualizować lokalizację synaptycznych mikrodomen w dendrytach bezkolczystych, w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy przełączyć się na tryb „xt'” (linescan) i ustawić linię wzdłuż interesującej gałęzi dendrytycznej.
    4. W oknie „Protocol” (oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych) oraz w oprogramowaniu do akwizycji obrazów należy utworzyć próbę rejestracji, która uruchamia jednostkę stymulującą po rozpoczęciu próby.
    5. Używając oprogramowania do akwizycji, należy kliknąć przycisk „Start record”, aby skanować wzdłuż dendrytu w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórzyć akwizycję 3-5 razy, odczekując 30 s między skanami, aby zapobiec fotouszkodzeniom.
      UWAGA: Długość skanu można dostosować w zależności od kinetyki wywołanego zdarzenia, ale powinna być ona zminimalizowana, aby zapobiec fotouszkodzeniom (rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).
    6. Powtórzyć krok 4.5.5 w różnych warunkach (np. różna intensywność/długość stymulacji, wprowadzenie blokera farmakologicznego, itp.) w zależności od konkretnego stawianego pytania badawczego.
    7. Przerwać akwizycję, gdy komórka wykazuje oznaki pogarszającego się stanu: depolaryzacja poniżej -45 mV, wzrost bazowego poziomu Ca2+, pogorszenie morfologiczne dendrytów (np. pęcherzykowanie, fragmentacja; rozwiązywanie problemów patrz Tabela 2).
    8. Aby uzyskać wstępne informacje o morfologii komórki i zachować zapis lokalizacji pipety stymulującej, należy wykonać stos Z (Z-stack) komórki w kanale czerwonym. Używając oprogramowania do akwizycji w trybie „xyz'”, należy ustawić górną i dolną granicę stosu tak, aby zobrazować całą komórkę wraz ze wszystkimi wypustkami. Ustawić wielkość kroku („step size”) na 1 µm i rozpocząć akwizycję stosu przyciskiem „Start record”.
    9. Po zakończeniu akwizycji stosu Z należy użyć opcji „Maximum projection” w oprogramowaniu, aby nałożyć na siebie wszystkie płaszczyzny ogniskowe stosu i zweryfikować jakość akwizycji. Następnie należy powoli wycofać pipetę patchującą ze skrawka.
    10. Aby utrwalić skrawek do post hoc identyfikacji morfologicznej, należy szybko usunąć skrawek z kąpieli za pomocą płaskiego pędzla malarskiego i umieścić go między dwoma papierami filtrującymi w szalce Petri wypełnionej ACSF. Zastąpić ACSF 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) i pozostawić szalkę w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C lub w lodówce przez noc.

5. Immunohistochemia do morfologicznej identyfikacji zarejestrowanych komórek post hoc

UWAGA: Po jednej nocnej fiksacji w PFA, skrawek można przechowywać w buforze fosforanowym (PB) z azotkiem sodu (0,5%) przez okres do 1 miesiąca.

  1. Umieścić skrawek w roztworze soli buforowanej Trisem (TBS) z Triton X-100 (0,3%) i przeprowadzić 4 przemycia (po 5-10 min każde).
  2. Umieścić skrawek w TBS-Triton 0,3% z 10% normalnym surowicą kozią (NGS) na 1 h.
  3. Umieścić skrawek w TBS-Triton 0,3% z 1% NGS i fluorochromem sprzężonym ze streptawidyną (np. streptawidyną sprzężoną z Alexa Fluor 546, 1:200) i inkubować przez noc.
  4. Przemyć 4 razy (po 5-10 min) w TBS.
  5. Zamontować skrawki na szkiełkach mikroskopowych i obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby uzyskać pełną rekonstrukcję komórki, należy zebrać stos Z-stack (wielkość kroku: 1 µm) przy użyciu obiektywu 20x. Do obrazowania znacznika sprzężonego z Alexa-546 należy użyć lasera 543 nm i zestawu filtrów detekcyjnych 515-560 nm.

6. Analiza CaTs

  1. Wyodrębnij wartości fluorescencji z obszarów zainteresowania (ROI) na obrazach linescan z kanałów czerwonego i zielonego, a następnie oblicz średnią wartości z wielu powtórzeń dla każdego warunku w celu redukcji szumów.
    UWAGA: Gdy akwizycja linescan jest przeprowadzana wzdłuż dendrytu, możliwe jest wyodrębnienie danych z wielu obszarów ROI, które mogą odpowiadać dendrytycznym mikodomenom (2-5 µm), co pozwala na badanie kompartymentacji sygnału Ca2+.
  2. Dla każdego ROI wyraź zmiany amplitudy Ca2+ jako:
    Równanie termodynamiczne ΔG/R = (G-G₀)/R dla analizy procesu chemicznego.
    UWAGA: W tym przypadku G to wartość fluorescencji z kanału zielonego; G0 to bazowa wartość fluorescencji z kanału zielonego w okresie przedstymulacyjnym; R to wartość fluorescencji z kanału czerwonego18. Ponieważ wzbudzenie dwufotonowe jest silnie zlokalizowane i nie generuje znaczącego tła, odejmowanie fluorescencji tła nie jest wymagane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawiony tutaj protokół, zarejestrowaliśmy sygnały CaTs wywołane wstrzyknięciem prądu do somy oraz stymulacją elektryczną dendrytów interneuronów warstwy oriens/alveus w obszarze CA1 hipokampa. Po wykonaniu patch-clampu neuronu, zidentyfikowanego na podstawie jego kształtu i położenia, wykonaliśmy skany liniowe wzdłuż proksymalnego dendrytu w wielu punktach w określonych odległościach od somy (Rysunek 1A). Zaobserwowaliśmy spadek amplitudy CaTs ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda pokazuje, w jaki sposób połączenie obrazowania dwufotonowego Ca2 + i elektrofizjologii patch-clamp może być wykorzystane do badania dendrytycznej sygnalizacji Ca2 + w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu. Metoda ta pozwala na monitorowanie zarówno lokalnych podwyższeń Ca2+ wywołanych stymulacją elektryczną lub wsteczną propagacją AP w segmentach dendrytycznych, jak i odpowiedzi somatycznej komórki. To sprawia, że jest to doskonałe narzędzie do badan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC Discovery Grant) oraz Fundację Savoy. OC było wspierane przez stypendium doktoranckie z NSERC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczep zwierzęcy: Mysz CD1Charles River022
IsofluraneAbbVie Corporation0B506-099
CGP 55845 chlorowodorekAbcamab120337
Chlorek wapnia Sigma-AldrichC4901
D-(+)-Glukoza Sigma-AldrichG8270
HEPESSigma-AldrichH3375
Chlorek magnezu Sigma-AldrichM8266
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-Aldrich230391
Proszek paraformaldehydowy, 95%Sigma-Aldrich158127
Chlorek potasu Sigma-AldrichP3911
Glukonian potasu Sigma-AldrichP1847
Azydek sodu Sigma-AldrichS2002
Wodorowęglan sodu Sigma-AldrichS8875
Chlorek sodu Sigma-AldrichS5886
Sacharoza Sigma-AldrichS9378
Triton X-100 Sigma-AldrichT9284
Podstawa Trizma Sigma-AldrichT1503
Chlorowodorek Trizma Sigma-AldrichT3253
Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny Sigma-Aldrich71643

Fosforan sodu jednozasadowy
monohydrat 		Sigma-AldrichS9638
BiocytynaSigma-AldrichB4261
Alexa Fluor 594 HydrazydThermoFisherScientific A10438
SR95531 (Gabazyna) Abcamab120042

Adenozynotrifosforan (ATP)-Tris		Sigma-AldrichA9062

Guanozyna (GTP)-Na+		Sigma-AldrichG8877

Oregon Green BAPTA-1		ThermoFisher ScientificO6812

Sól dwu(trisowa) fosfokreatyny		Sigma-AldrichP1937

Alexa-546 sprzężona ze streptawidyną ThermoFisher		Scientific S11225

Łatka Kapilary ze szkła borokrzemianowego		Światowe instrumenty precyzyjne1B100F-4

Kapilary ze szkła borokrzemianowego Theta		Instrument SutterBT-150-10

P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet		Sutter Instrument

Konfokalny mikroskop wielofotonowy TCS SP5		Leica Microsystems

Chameleon Ultra II Ti:Szafirowy laser wielofotonowy 
Spójne oprogramowanie do akwizycji obrazowania LAS AF KontrolerLeica Microsystems

TC-324B		Warner Instruments

MultiClamp 700B Wzmacniacz		Urządzenia molekularne

Digidata 1440A Digitizer		Urządzenia

Konfokalne Tłumacz		Siskiyou

Mikromanipulator		Siskiyou

pClamp Oprogramowanie do akwizycji danych		Urządzenia molekularne

A365 Izolator bodźców prądu stałego		Świat Precision Instruments

Wibraplane Stół optyczny Systemy		kinetyczne
temperatury molekularne

Bibliografia

  1. Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  3. Yuste, R., Denk, W. Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration. Nature. 375, 682-684 (1995).
  4. Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Structure and Function of Dendritic Spines. Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).
  5. Sabatini, B. L., Svoboda, K. Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis. Nature. 408, 589-593 (2000).
  6. Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated. Nature. 399, 151-155 (1999).
  7. Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Plasticity of calcium channels in dendritic spines. Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).
  8. Carter, A. G., Sabatini, B. L. State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons. Neuron. 44, 483-493 (2004).
  9. Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons. J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).
  10. Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons. J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).
  11. Camiré, O., Topolnik, L. Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons. J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).
  12. Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons. Nature. 357, 244-246 (1992).
  13. Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials. Neuron. 24, 727-737 (1999).
  14. Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons. J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).
  15. Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics. J Physiol. 551, 67-78 (2003).
  16. Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting. J Physiol. 558, 465-478 (2004).
  17. Oertner, T. G. Functional imaging of single synapses in brain slices. Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).
  18. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 219, pl5(2004).
  19. Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing. Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).
  20. Camiré, O., Topolnik, L. Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons. Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).
  21. Guet-McCreight, A., Camiré, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus. eNeuro. 3, 1-26 (2016).
  22. Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons. J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).
  23. Topolnik, L. Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons. Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).
  24. Camiré, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors. Front Physiol. 3, 259(2012).
  25. Bourque, C. W. Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation. Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).
  26. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
  27. Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors. Neuron. 19, 465-471 (1997).
  28. Salomé, R., et al. Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors. J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).
  29. Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector. Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Patch clamp w konfiguracji whole cellprzej ciowe zmiany st enia wapniasygnalizacja dendrytycznaplastyczno synaptycznarejestracja elektrofizjologicznamikroskopia skaningowa laserowaobrazowanie fluorescencyjne
Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.