Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Summary

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Abstract

Immunoblotting stał się rutynową techniką w wielu laboratoriach do charakteryzacji białek z próbek biologicznych. Poniższy protokół zapewnia alternatywną strategię, kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (cIEF), z wieloma zaletami w porównaniu z konwencjonalnym immunoblottingiem. Jest to oparta na przeciwciałach, zautomatyzowana, szybka i ilościowa metoda, w której pełna procedura western blot odbywa się w ultracienkiej kapilarze. Technika ta nie wymaga przenoszenia żelu na błonę, usuwania plam ani filmów rentgenowskich, które są zwykle wymagane w przypadku konwencjonalnego immunoblottingu. Tutaj białka są rozdzielane zgodnie z ich ładunkiem (punkt izoelektryczny; pI), przy użyciu mniej niż mikrolitra (400 nL) całkowitego lizatu białkowego. Po elektroforezie białka są unieruchamiane na ścianach naczyń włosowatych przez obróbkę światłem ultrafioletowym, a następnie inkubację przeciwciał pierwotnych i wtórnych (sprzężonych z peroksydazą chrzanową (HRP)) przeciwciał, których wiązanie wykrywa się poprzez zwiększoną chemiluminescencję (ECL), generując sygnał świetlny, który może być przechwycony i zarejestrowany przez kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Obraz cyfrowy może być analizowany i określany ilościowo (obszar piku) za pomocą oprogramowania. Ta wysokowydajna procedura może obsłużyć 96 próbek jednocześnie; jest bardzo czuły, z wykrywaniem białek w zakresie pikogramów; i daje wysoce powtarzalne wyniki dzięki automatyzacji. Wszystkie te aspekty są niezwykle cenne, gdy czynnikiem ograniczającym jest ilość próbek (np. próbek tkanek i biopsji). Technika ta ma również szersze zastosowania, w tym badania przesiewowe leków lub przeciwciał, odkrywanie biomarkerów i cele diagnostyczne.

Introduction

Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne (cIEF) to zautomatyzowany, kapilarny test immunologiczny, który rozdziela białka na podstawie ich ładunku^1,2,3. Jest wysoce powtarzalny i zdolny do szybkiego i ilościowego rozdzielania białek i ich izoform modyfikowanych po translacji. Stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod, takich jak western blotting. Podczas gdy western blotting jest bardzo dobry do potwierdzania obecności obfitych białek w łatwo dostępnych próbkach; Zmienność, czasochłonność i dokładna ocena ilościowa stanowią wyzwanie, w szczególności podczas badania próbek tkanek biologicznych. Rzeczywiście, zmienność jest nieodłącznym problemem w western blot, ponieważ składa się z wielu etapów, takich jak ładowanie i uruchamianie żeli SDS-PAGE, przenoszenie białek na błonę, inkubacja z różnymi odczynnikami (np. przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi, ECL) oraz opracowywanie na kliszy rentgenowskiej⁴. Obecnie technika western blotting ulega poprawie wraz z wdrożeniem cyfrowego zapisu sygnałów chemiluminescencyjnych (digital westerns). Ostatnio opracowano zautomatyzowany system western blott, a mianowicie capillary western, który jest systemem bardziej bezdotykowym i bezżelowym. Cały test jest zautomatyzowany po załadowaniu płytki z próbką (próbki ze wszystkimi niezbędnymi odczynnikami) do systemu^3,4. Instrument wykona wszystkie etapy, takie jak separacja białek, immobilizacja białek na ścianie naczyń włosowatych, inkubacje przeciwciał, płukanie między różnymi etapami oraz rozwój i kwantyfikacja sygnałów chemiluminescencyjnych. Dzięki temu przedstawiona tutaj procedura cIEF zapewnia wyższą rozdzielczość i czułość.

Ta metoda jest wrażliwa, ponieważ sygnały mogą być generowane i określane ilościowo na podstawie pikogramów białek¹. Wysoka czułość i doskonała powtarzalność sprawiają, że technologia ta jest bardzo przydatna do analizy próbek klinicznych. Może wykrywać i rozróżniać modyfikacje potranslacyjne (np. różne fosforylowane izoformy białek) białek. Technologia ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy różnych szlaków sygnałowych^4,5 w badaniach klinicznych mających na celu opracowanie nowych terapii w raku³, i ma ogromny potencjał w zakresie biomarkerów białkowych i odkrywania leków.

Protocol

1. Hodowla komórkowa, stymulacja i liza

Uwaga: Ta metoda może być używana z wieloma typami komórek. Dla zobrazowania metody opisano przykład z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC).

1. Hodowla HUVEC na pokrytych żelatyną, 10 cm szalkach Petriego w pożywce bazowej komórek śródbłonka z odpowiednią suplementacją (patrz Tabela Materiałów), a także zawierająca 5% FCS, naskórkowy czynnik wzrostu (5 ng/ml), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF: 0,5 ng/ml), zasadowy FGF (10 ng/ml), insulinopodobny czynnik wzrostu (20 ng/ml), hydrokortyzon (0,2 μg/ml) i kwas askorbinowy (1 μg/ml).
2. Głodź komórki przez noc za pomocą podłoża podstawnego komórek śródbłonka uzupełnionego 1% FCS i bez suplementu czynnika wzrostu.
3. Odessać całą pożywkę, dodać 2 ml pożywki do hodowli komórek śródbłonka bez czynników wzrostu (pożywka głodowa) do jednego naczynia (kontrola), a następnie dodać 50 ng/ml VEGF do 2 ml pożywki do hodowli głodowej w drugim naczyniu na 7 minut.
4. Odessać pożywkę i przemyć komórki 2 razy 10 ml PBS o temperaturze pokojowej.
5. Upewnij się, że szalki Petriego znajdują się na lodzie i trzymaj je tam od tego kroku.
6. Dodać 250-400 μl lodowatego buforu do lizy (Bicine/CHAPS; patrz tabela materiałów) zawierającego wodną mieszaninę inhibitorów proteazy i mieszaninę inhibitorów DMSO (inhibitory fosfatazy; patrz tabela materiałów) do każdej płytki o długości 10 cm. Zakręć talerzem, aby zapewnić odpowiednie pokrycie i trzymaj go przez 10 minut na lodzie.
   UWAGA: Końcowe stężenie proteazy i mieszaniny inhibitorów DMSO powinno wynosić 1x.
7. Zeskrob komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do wstępnie schłodzonej probówki do mikrofuge. Pipetuj w górę i w dół 5 razy, aby zlizować komórki.
8. Krótko poddać sonikację komórek w temperaturze 4 °C. Ustaw sonikator w następujący sposób: liczba cykli = 5, moc = NISKA, WŁĄCZONA = 5 sekund, WYŁĄCZONA = 30 s. Ten krok ma na celu rozbicie kwasów nukleinowych, a nie lizę komórek.
   UWAGA: Sonikacja powinna być łagodna, aby zapobiec denaturacji białek.
9. Wiruj rurkę przez 5 s (nie w sposób ciągły), 2 s na raz (3 razy) i trzymaj na lodzie.
10. Klarować lizat przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie natychmiast przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrodymówki.
11. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek kwasu bicunchoninowego (BCA)⁴.
12. Przygotować 10 μl porcji, zamrozić błyskawicznie w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie mieszanki próbek (obliczenia dla mieszanki próbek 150 μL)

1. Najpierw przygotuj mieszaninę rozcieńczalników do próbek, dodając 1 μl mieszaniny inhibitorów DMSO (zapas 50x) i 2 μl inhibitorów proteazy (zapas 25x) do 47 μl rozcieńczalnika do próbki (patrz tabela materiałów), tak aby końcowe stężenie inhibitorów DMSO i inhibitorów proteazy wynosiło 1x. Następnie rozcieńczyć lizaty białkowe za pomocą mieszanki rozcieńczalników do próbek, aby uzyskać pożądane stężenia (patrz krok 2.3).
2. Przygotować mieszaninę amfolitu/drabiny/inhibitora proteazy/inhibitora DMSO, dodając 3,325 μl standardowej drabinki (patrz tabela materiałów; zapas 60x), 6 μl inhibitora proteazy (25x), 3 μl inhibitora DMSO (50x) do 137,675 μl premiksu amfolitu (patrz tabela materiałów). Wiruj rurkę przez co najmniej 15 sekund, po 5 sekund na raz (3-4 razy) i trzymaj na lodzie.
3. Wymieszaj roztwory z kroków 2.1 i 2.2 w stosunku 1:3, tak aby końcowe stężenia DMSO, inhibitorów proteazy i drabiny standardowej pI osiągnęły 1X, a białka w kapilarze osiągnęły ostateczne pożądane stężenia (np. 50 μg/ml użyto dla Rysunek 2).
   UWAGA: Stężenie białka w naczyniach włosowatych i studzienkach jest takie samo.
4. Załaduj 10 μl mieszanki próbek do odpowiedniego dołka, zgodnie z układem szablonu do oznaczania płytek 384-dołkowych (patrz krok 3 i Rysunek 1) i trzymaj płytkę na lodzie.
5. Rozcieńczyć pierwszorzędowy (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1:100; HSP 70, 1:500) i przeciwciała drugorzędowe (1:300) z rozcieńczalnikiem przeciwciał (patrz tabela materiałów) i odpipetować 10 μl przeciwciał pierwszorzędowych i 15 μl przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, do testów cIEF wymagane jest wyższe stężenie przeciwciał w porównaniu z konwencjonalnymi zachodnimi plamami.
6. Wymieszaj ze sobą Luminol i nadtlenek XDR (w stosunku 1:1; patrz Tabela Materiałów) i odpipetuj 15 μl do każdej studzienki.
   UWAGA: Mieszaj te roztwory świeże za każdym razem przed użyciem i trzymaj na lodzie.
7. Po odpipetowaniu próbek i wszystkich odczynników do płytki, należy odwirować płytkę o stężeniu 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu odwirowania cieczy i usunięcia pęcherzyków. Jeśli bąbelki nadal występują, usuń je ręcznie za pomocą cienkiej końcówki pipety.
   UWAGA: Nie ładuj więcej niż 20 μl próbki lub odczynników na studzienkę; W przeciwnym razie pipety instrumentalnej nie będzie można prawidłowo umyć. Upewnij się, że postępujesz zgodnie z instrukcją obsługi producenta, aby przygotować wszystkie odczynniki.

3. Projektowanie nowego szablonu testu za pomocą oprogramowania systemowego (Rysunek 1)

1. Otwórz oprogramowanie systemowe i kliknij "nowy" w menu Plik.
2. Przejdź do okienka układu i przypisz lokalizacje odczynników i próbek na płytce 384-dołkowej. Użyć maksymalnie 96 dołków na płytkę 384-dołkową.
3. Dokonaj przypisania odczynnika, klikając dołek w dowolnym miejscu bloku. Wybierz blok wiersza z 12 dołkami każdy. Studnie np. z zakresu 1-12 lub 13-24 są domyślnie przypisywane jako blok.
4. Przejdź do paska narzędzi panelu układu i wstaw pusty blok wierszy lub blok wiersza próbnego, podstawowego, pomocniczego lub luminolu. Każdy blok ma przypisany inny kolor, dzięki czemu można je łatwo odróżnić.
   UWAGA: Po kliknięciu studni można zobaczyć czarną ramkę wokół bloku, w którym nowy blok zostanie wstawiony w okienku. Blok wierszy można również usunąć.
5. Przejdź do okienka protokołu i wybierz lokalizację odczynnika na tabliczce. Następnie kliknij komórkę w kolumnie próbki i wybierz odczynnik z menu rozwijanego.
6. W ten sam sposób wybierz lokalizacje odczynników dla podstawowego, wtórnego i luminolu dla każdego cyklu.
7. Kliknij komórki, pojedynczo, w kolumnie przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych i w razie potrzeby zmień czas inkubacji.
   UWAGA: Można również dodać uwagi do każdego cyklu.
8. Dodaj cykle, klikając przycisk "dodaj" w sekcji protokołu. 1 cykl, 4 cykle lub wszystkie cykle (do protokołu można dodać maksymalnie 8 cykli).
   UWAGA: Możliwe jest skopiowanie i wklejenie informacji o cyklu w tym kroku: wybierz cykl, przejdź do edycji, a następnie skopiuj i wklej.
9. Wprowadź informacje dotyczące próbki, takie jak tożsamość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, ich numery katalogowe i rozcieńczenia itp., w okienku szablonu. Jest to opcjonalny krok, który jest przydatny podczas analizy po uruchomieniu.
10. Zapisz nowy plik testu. Przed kliknięciem przycisku "start" szybko sprawdź układ, aby upewnić się, że wszystko jest poprawne.

4. Protokół ustawień przyrządów cIEF

1. Ustaw warunki separacji kapilarnej izoelektrycznej elektroforezy ogniskowej. Powinny one wynosić 15 000 μW i 40 min, a czas unieruchomienia UV powinien wynosić 80 s. Jednak czas immobilizacji UV można ustawić w zakresie 80-140 s i może być konieczne zoptymalizowanie go pod kątem interesującego białka.
   UWAGA: Punkt czasowy immobilizacji UV można ustawić dla każdego cyklu, ale nie dla każdej kapilary.
2. Ustaw mycie od 1 do 2 prań, przez 150 s każde pranie (domyślnie) i inkubację przeciwciał pierwotnych przez 120 minut.
3. Ustaw mycie na 2 do 2 prań, przez 150 s każde mycie (domyślnie) i wtórną inkubację przeciwciał przez 60 minut.
4. Ustaw pranie 3, co powinno oznaczać 2 prania, na 150 s każde pranie (domyślnie).
5. Ustaw czasy ekspozycji, w których zostanie wykryta chemiluminescencja; powinny to być 30, 60, 120, 240, 490 i 960 s. Wszystkie kroki (1-8) zostaną przeprowadzone w jednej kapilarze.

5. Uruchamianie pliku testowego

1. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij start, aby rozpocząć bieg. Oprogramowanie poprosi Cię o usunięcie odpadów, ponowne napełnienie wody i kapilary, dodanie anolitu i katolitu do tacy zasobów, dodanie bufora do płukania i wreszcie załadowanie płytki do schłodzonej tacki na próbki.
   UWAGA: Zdejmij pokrywkę z pudełka kapilarnego, ale nie zdejmuj pokrywki z płytki testowej. W razie potrzeby pokrywka z płyty może zostać automatycznie zdjęta przez instrument. Pomaga to zapobiec parowaniu odczynników.
2. Kilka minut po rozpoczęciu biegu na ekranie komputera zostanie wyświetlony pasek stanu instrumentu. Komunikaty o stanie i paski postępu są widoczne w zależności od aktualnego etapu instrumentu.
   UWAGA: Początkowo przyrząd sprawdzi, czy wszystko jest w porządku, zanim przystąpi do pipetowania anolitu i katolitu do tacki separacyjnej, pobrania pierwszego bloku 12 kapilarn, zdjęcia pokrywki płytki i umieszczenia próbek z płytki próbki w kapilarnach, a następnie w komorze separacji w celu elektroforezy.
3. Kliknij ekran podsumowania uruchamiania, aby wyświetlić dwa okienka: stan i separacja. Użytkownicy mogą przeglądać postęp przebiegu, a filmy z separacji (12 kapilar każdego cyklu) mogą być przechowywane po zakończeniu etapu elektroforezy każdego cyklu. Aby obserwować separację metodą elektroforezy w kapilarze, odtwórz film z separacją dla tej kapilary, klikając żądany cykl, a następnie przycisk odtwarzania na panelu sterowania.
4. Plik uruchamiania może być przechowywany automatycznie po zakończeniu przebiegu.

6. Analizuj dane (Rysunek S1)

1. Otwórz plik uruchamiania i wybierz zakładkę ekranu analizy. W Rysunek S1A, dane pokazane (piki) na wykresie próbki pochodzą z wybranej kapilary (tj. ^4-tej kapilary z cyklu 1).
2. Kliknij edytuj, a następnie analizę (Rysunek S1B). Na tym etapie użytkownicy mogą zmienić zakres pI, zastosować odpowiedni standard pI dla danego eksperymentu, dodać dopasowanie piku i dodać nazwę piku.
   UWAGA: W przypadku stosowania premiksu amfoliitowego o pH 5-8 (jak ma to miejsce w tym przypadku), zalecaną standardową drabiną do użycia jest drabina z peptydami znakowanymi fluorescencyjnie o pIs 4,9, 6,0, 6,4, 7,0 i 7,3, a w przypadku stosowania premiksu o pH 3-10 zalecana drabina to drabina o pIs 4,0, 4,9, 6,0, 6,4 i 7,3. ²
3. Wyniki są wyświetlane w zakładce Peaks; wartości wyświetlane dla próbek to Position, pI, Peak Height and Area, % Area, Peak Width oraz Signal to noise (S/N) (Rysunek S1C). Wybierz dane, które chcesz użyć, i wyeksportuj je do dalszej analizy.
   UWAGA: Dane można eksportować tylko po oznaczeniu piku (Rysunek S1C).

Results

Projekt nowego testu: Układ płytki testowej jest pokazany w Rysunek 1A. Maksymalnie można użyć 96 dołków z płytki 384-dołkowej w blokach po 12 dołków dla każdego warunku (przeciwciała). Każdy blok 12 odwiertów może zaczynać się od A1-A12 lub A13-A24. Rzędy oznaczone kolorami pozwalają odróżnić od siebie próbki lub odczynniki. W szablonie testu (Rysunek 1B) można przechowywać informacje istotne dla tego konkretnego testu, k...

Discussion

Czułość i rozdzielczość białek mają kluczowe znaczenie dla badań proteomicznych próbek biologicznych. Możliwość wykrywania białek, które są obecne w niewielkich ilościach w komórkach, ma ogromną wartość. cIEF może oferować lepszą czułość i rozdzielczość wykrywania białek i ich izoform⁴.

Technologia ta została z powodzeniem wykorzystana w wielu raportach z badań proteomicznych ^5,6,7

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5– 8 (zagnieżdżony) gradient separacji, pH 2– 4 wtyczka	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO	ProteinSimple	040-510	Inhibitory fosfatazy; do cIEF 1:50 rozcieńczenie
Awaterous Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Inhibitor proteazy; do cIEF 1:25
stosuje się standardową drabinkę pI 3	ProteinSimple	040-646	Do cIEF stosuje się rozcieńczenie 1:60
Próbka rozcieńczalnik	ProteinSimple	040-649
Rozcieńczalnik przeciwciał	ProteinSimple	040-309
Koncentrat do prania	ProteinSimple	041-108
Anolyte Refill	ProteinSimple	040-337
Catholyte Refill	ProteinSimple	040-338
Nadtlenek XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Kapilary-Separacja ładunków (1 opakowanie) dla	ProteinSimple	CBS700
Płytka/zestaw pokrywek do testów	ProteinSimple	040-663
Peroksydaza-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	Do cIEF używany (1: 300)
Peroksydaza-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-035-150	Do zastosowania cIEF (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	Do zastosowania cIEF (1: 50)
Sygnalizacja komórek	przeciwciała pierwotnego Pan Erk	9102	Do cIEF (1: 100)
Oprogramowanie Compass	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& nbsp; C-22221	Pożywka dla komórek
śródbłonka Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	Suplementacja do MV2 powyżej
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulinopodobny czynnik wzrostu
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
Białko BCA Zestaw do testów	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Membrana Immobilon PVDF	Millipore	IPVH00010
Wirówka
Wirówka Adapter
płytki do mikromiareczkowania do pipet wirówek
Porady
Lód