Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i oznaczania ilościowego Plasmodium falciparum w zakażonych czerwonych krwinkach wodnych za pomocą spektrometru podczerwonego o całkowitym odbiciu i wielowymiarowej analizy danych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Plasmodium falciparum w wodnych krwinkach czerwonych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z osłabionym całkowitym odbiciem i wieloczynnikowej analizy danych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Demonstrujemy metodę kwantyfikacji i wykrywania pasożytów w krwinkach czerwonych (RBC) za pomocą prostego spektrometru ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared) w połączeniu z Multivariate Data Analysis (MVDA). 3D7 P. falciparum zostały wyhodowane do 10% pasożytów w stadium pierścieniowym parazytemii i użyte do zwiększenia świeżych krwinek czerwonych izolowanych od dawcy w celu stworzenia serii rozcieńczeń między 0-1%. Umieszczono 10 μL każdej próbki na środek okna diamentowego ATR, aby uzyskać widmo. Dane próbki poddano obróbce w celu poprawy stosunku sygnału do szumu i usunięcia udziału wody, a następnie zastosowano drugą pochodną w celu rozwiązania cech spektralnych. Dane zostały następnie przeanalizowane przy użyciu dwóch typów MVDA: najpierw analizy głównych składowych (PCA) w celu określenia wszelkich wartości odstających, a następnie częściowej regresji metodą najmniejszych kwadratów (PLS-R) w celu zbudowania modelu kwantyfikacji.
Wprowadzenie
Malaria jest jedną z najbardziej niszczycielskich chorób naszych czasów; ponad połowa populacji żyje zagrożona w regionach endemicznych i nieproporcjonalnie obciąża biednych1,2,3,4. Dużą częścią problemu są bezobjawowi nosiciele i pacjenci we wczesnym stadium choroby, którzy działają jak rezerwuary dla wektorów komarów5, powodując gwałtowne wzrosty infekcji w porze deszczowej i pozwalając im utrzymywać się w społecznościach. Malaria jest wywoływana przez pięć pasożytów Plasmodium, z których najbardziej śmiert....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Proszę zapoznać się z odpowiednimi Kartami Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) i zasięgnąć odpowiedniego szkolenia w zakresie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wszystkie etapy hodowli muszą być wykonywane w komorze BSL-2 przy użyciu techniki aseptycznej, co oznacza, że istnieje ryzyko narażenia na szkodliwe promieniowanie UV z etapów dekontaminacji, zranień igłą oraz potencjalnego narażenia biologicznego i infekcji, jeśli kultura pasożyta dostanie się do jakichkolwiek obrażeń. Co więcej, krew z banków krwi jest badana pod kątem tylko niektórych chorób, a potencjalne ryzyko rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez krew stanowi potenc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykres częściowych najmniejszych kwadratów (PLS-R) oraz powiązany z nim wektor regresji, odpowiednio na rysunku 1a i 1b, wykazują, że sygnał pochodzący od pasożytów jest na tyle odróżnialny od sygnału RBC, że można go wykorzystać do stworzenia modelu regresji liniowej służącego do przewidywania obecności pasożytów w przyszłych zestawach danych.
Stworzono odporny, liniowy model PLS-R.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Model PLS-R jest nadzorowaną metodą wielowymiarową, która znajduje liniową zależność, Y=bX+E, między zmiennymi predykcyjnymi X (w tym przypadku absorbancja dla każdej liczby falowej) a zmienną ciągłą Y (w tym przypadku poziom parazytemii). Krótko mówiąc, model łączy zmienne w X, aby utworzyć nowy zestaw zmiennych utajonych (LV), które przechwytują wariancję X skorelowaną z Y, i oblicza wektor regresji (b), który pomnożony przez nowe widmo daje oszacowanie wartości y. Siłę modelu można określić na podstawie dwóch wartości.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Finansowanie dla autorów zostało zapewnione przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (Future Fellowship FT120100926 do BRW), National Health and Medical Research Council of Australia (grant programowy i Senior Research Fellowship dla JGB; Stypendia na początku kariery JSR; Dotacja w ramach programu wsparcia infrastruktury dla instytutów badawczych dla Instytutu Burnet) oraz dotacja na wsparcie infrastruktury operacyjnej rządu stanu Wiktoria dla Instytutu Burneta. Dziękujemy Panu Finlayowi Shanksowi za wsparcie instrumentalne.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Krew dawcy | - | musi być pobrana przez przeszkolonego lekarza | |
| Krew zapasowa | Australijski Czerwony Krzyż' | - | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | Burnet | Institute-Laboratory | Odpowiednik dzikiego szczepu |
| RPMI-1640 z L-hepes bez wodorowęglanu sodu | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Porcję do probówek sokoła o pojemności 50 ml i przechowuj w zamrażarce |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | Aldrich S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Należy przefiltrować przed użyciem w hodowli |
| Probówki do pobierania krwi (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Olejek immersyjny | Thermofisher | M3004 | |
| 50 ml Naczynia hodowlane | Falcon | 353025 | |
| 25 ml Końcówki do pipet | Falcon | 357515 | |
| 10 ml | Szkiełka | 357530 | |
| Sigma Aldrich | S8902 | ||
| Probówki wirówkowe 50 ml | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automatyczny kontroler pipet | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Wirówka Sorvall Legend X1R | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Inkubatory CO2 z bezpośrednim ciepłem | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Mikroskop lornetkowy | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | Przy zakupie upewnij się, że soczewka 100x jest olejem obiektyw zanurzeniowy |
| Spektrometr Ft-IR Bruker Alpha z szybkozłączką ATR | Bruker | 9308-3700 | Pamiętaj, aby poprosić o przystawkę "Eco-ATR" przy zakupie |
| Matlab | Mathworks Inc | Oprogramowanie do analizy danych wielowymiarowych | |
| Unscrambler X | CAMO | Multivariate oprogramowanie do analizy danych | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | Graficzny interfejs użytkownika dla Matlaba |
Bibliografia
- Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. , Arnold. Great Britain. 361(1998).
- World Health Organization. World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W. Chapter 105. Manual....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
