Method Article

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

DOI:

10.3791/56799

⸱

January 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest obowiązkowym aspektem gojenia się ran. Tworzenie sztucznych ran na badanych modelach zwierzęcych często skutkuje kosztownymi i skomplikowanymi procedurami eksperymentalnymi, a jednocześnie potencjalnie brakuje precyzji. Hodowla in vitro nabłonkowych linii komórkowych stanowi odpowiednią platformę do badań nad zachowaniami migracyjnymi komórek w procesie gojenia się ran oraz wpływem leczenia na te komórki. Fizjologia komórek nabłonkowych jest często badana w warunkach niezlewających się; Jednak takie podejście może nie przypominać naturalnych warunków gojenia się ran. Naruszenie integralności nabłonka za pomocą środków mechanicznych pozwala uzyskać realistyczny model, ale może utrudnić zastosowanie technik molekularnych. W związku z tym techniki oparte na mikroskopii są optymalne do badania migracji komórek nabłonka in vitro. W tym miejscu szczegółowo opisujemy dwie konkretne metody, test sztucznego zadrapania rany i test sztucznego frontu migracji, które mogą uzyskać odpowiednio dane ilościowe i jakościowe dotyczące wydajności migracji komórek nabłonkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migracja komórek jest niezbędna do gojenia się ran, ponieważ jest odpowiedzialna za ostateczne zamknięcie szczeliny nabłonkowej i przywrócenie uszkodzonej powierzchni1. Wykonywanie sztucznych ran na modelach zwierzęcych pozwala na odtworzenie tego złożonego procesu w warunkach zbliżonych do fizjologicznych2. Jednak takie podejście często prowadzi do kosztownych i skomplikowanych procedur eksperymentalnych, które potencjalnie nie są precyzyjne w badaniu różnych procesów, ze względu na skomplikowany charakter procesu gojenia się ran.

Hodowla in vitro linii komórkowych nabłonka stanowi pomocną alternatywę dla modeli zwierzęcych do badania roli, jaką te komórki odgrywają w gojeniu się ran i wpływu leczenia na zachowania migracyjne komórek. Fizjologia komórek nabłonkowych jest często badana za pomocą technik molekularnych przy użyciu kultur niezlewających się3,4,5,6; Jednak naruszenie integralności nabłonka jest zwykle osiągane przez drobne nacięcia mechaniczne. W hodowli komórkowej oznacza to, że znikoma liczba komórek może być narażona na przerwę w ranie i stanowią one zbyt małą próbkę dla technik biologii molekularnej. Jednak zmiany te można badać w skali mikroskopowej, wykorzystując wrodzone właściwości migracyjne niektórych linii komórek nabłonkowych, takich jak komórki nabłonkowe płuc norek (Mv1Lu) lub spontanicznie unieśmiertelnione linie komórkowe ludzkich keratynocytów (HaCaT).

Tutaj opisaliśmy metodę mikroskopii, która jest odpowiednia do uzyskania danych ilościowych na temat migracji komórek nabłonka w kontekście gojenia się ran3,4,7,8. Ponadto przedstawiamy dodatkowe metody, które są pomocne w badaniu jakościowo zmian molekularnych i morfologicznych zachodzących na monowarstwach nabłonka podczas migracji. Ogólnie rzecz biorąc, metody te stanowią ramy do badania zarówno dynamiki, jak i zmian morfologicznych związanych z zachowaniem komórek nabłonka i reakcją na leczenie podczas gojenia się ran.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test sztucznego zadrapania ran do badań ilościowych

  1. Przygotowanie monowarstwy komórek
    1. Pracując w sterylnych warunkach, wysiewaj i hoduj komórki nabłonkowe Mv1Lu lub HaCaT w kolbach hodowlanych przy użyciu pożywki uzupełnionej surowicą. Odświeżaj podłoże raz na 24-48 godzin. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odłącz komórki za pomocą odpowiedniej metody, tj. trypsynizacji9.
      UWAGA: Linie komórek nabłonka Mv1Lu i HaCaT są hodowane przy użyciu odpowiednio pożywki hodowlanej EMEM i DEMEM, uzupełnionej 2 mM L-glutaminą i inkubowane w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze 5% CO2 . Każda linia komórkowa musi zostać dokładnie przetestowana w celu określenia stężenia komórek i czasu wymaganego do osiągnięcia pełnej konfluencji. Typowo dla komórek Mv1Lu lub HaCaT, odpowiednio 2-4 x 104 lub 4-6 x 104 komórki / studzienkę wysiewa się w kolbie hodowlanej o średnicy 175 cm2, a przy 80% konfluencji daje się do 35 x 106 Mv1Lu lub 1 x 107 komórek HaCaT.
    2. Na 12-dołkowej lub 24-dołkowej płytce hodowlanej wysiewać w każdym dołku 2 ml komórek. Odświeżaj podłoże raz na 24-48 godzin. Upewnij się, że liczba komórek jest wystarczająco wysoka, aby osiągnąć 100% konfluencji po 2 lub 3 dniach.
    3. Po tym, jak komórki osiągną zbieżność, usuń pożywkę uzupełnioną surowicą i przemyj dwukrotnie świeżą pożywką bez surowicy. Przechowywać komórki w podłożu wolnym od surowicy przez 24 godziny przed drapaniem.
      UWAGA: Komórki Mv1Lu lub HaCaT nie mają specjalnych wymagań dotyczących substratów; jednak w przypadku linii komórkowych podatnych na spontaniczne odklejanie się w warunkach braku surowicy należy rozważyć wstępne pokrycie powierzchni płytki hodowlanej roztworem poli-L-lizyny10.
  2. Drapanie jednowarstwowe
    1. Pracując w sterylnym środowisku, należy zarysować monowarstwę hodowli, mocno przeciągając wąską końcówkę sterylnej końcówki mikropipety o pojemności 20 μl lub 200 μl, w zależności od pożądanej szerokości zarysowania. Trzymaj końcówkę prostopadle do powierzchni hodowli, aby zmaksymalizować jednorodność szczeliny.
      1. Umieść płytki hodowlane na ciemnej powierzchni, aby wyraźnie monitorować monowarstwę komórek. W razie potrzeby wykonaj dwie prostopadłe rysy (w kształcie krzyża) na każdym dołku, aby zbadać do 4 obszarów migracji.
    2. Umyj oderwane komórki, delikatnie usuwając pożywkę hodowlaną i delikatnie dodając świeżą pożywkę bez surowicy. Powtórz tę czynność dwa razy lub do momentu, gdy większość nieprzyłączonych komórek zostanie usunięta.
  3. Procedura doświadczalna i gromadzenie danych
    1. Wykonaj do 4 obrazów referencyjnych przed obróbką wyśrodkowanych na szczelinie rysy z każdego dołka za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonego w kamerę CCD. Wybierz interesujące obszary, wyrównując krawędź pola mikroskopu do sąsiedniego przecięcia rys.
      UWAGA: Zazwyczaj obrazy są uzyskiwane przy użyciu 10-krotnego powiększenia i rozmiaru obrazu 1,280 x 1,024 pikseli. Wybór obszarów zainteresowania zgodnie z powyższym opisem pomaga w łatwej lokalizacji i walidacji do 4 pomiarów na odwiert.
    2. Po uzyskaniu wszystkich obrazów wyznacz studzienki zabiegowe; zamień pożywkę w studzienkach na świeżą pożywkę, która zawiera wybrane zabiegi.
      UWAGA: Alternatywnie, w przypadku substancji chemicznych lub związków, które nie zaburzają jednorodności pożywki hodowlanej, zabiegi można zaszczepić bezpośrednio w pożywce.
    3. Inkubować zarysowaną płytkę (37 °C w kontrolowanej atmosferze zawierającej 5% CO2 ) do momentu, gdy obserwowane warunki osiągną 90% zamknięcie szczeliny rysowej. Unikaj całkowitego zamknięcia.
      UWAGA: Całkowite zamknięcie luki unieważnia zbieranie obrazów po zabiegu, ponieważ obszary referencyjne nie są wykrywalne i nie można ustalić odniesienia czasowego dla zamknięcia luki. W przypadku komórek Mv1Lu lub HaCaT potrzeba 16-19 godzin, aby osiągnąć 90% konfluencję.
    4. Zatrzymaj migrację komórek poprzez utrwalenie komórek; delikatnie zastąp eksperymentalną pożywkę hodowlaną 1 ml 4% formaliny w PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Umyj komórki, aby usunąć nadmiar formaliny; delikatnie zastąp roztwór w studzienkach świeżym PBS. Powtórz co najmniej dwa razy.
      UWAGA: Na tym etapie, po uszczelnieniu, płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
    6. Wykonaj zdjęcia referencyjne po obróbce każdego studzienka z oryginalnych obszarów referencyjnych uchwyconych po zarysowaniu. Użyj tego samego sprzętu (odwrócony optyczny mikroskop z kontrastem fazowym z kamerą CCD) i pasujących ustawień obrazu (powiększenie i rozdzielczość/gęstość cyfrowa).
      UWAGA: W przypadku komórek, które migrują indywidualnie i wypełniają lukę niezależnie od tworzenia spójnego frontu (np. komórki ludzkie raka piersi MDA-MB-231), obrazy przebiegu czasowego mogą pozwolić na obliczenie prędkości migracji poszczególnych komórek.
  4. Analiza obrazu i kwantyfikacja migracji
    1. Korzystając z oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ), zdefiniuj granice szczeliny zarysowania i określ powierzchnię szczeliny dla maksymalnie czterech pomiarów na zdjęciach przed obróbką. Zapisz dane jako "powierzchnię szczeliny przed obróbką" (PREGAP). Powtórz tę samą procedurę dla zdjęć po zabiegu. Zapisz dane jako "powierzchnię szczeliny po obróbce" (POSTGAP).
      1. Otwórz nagrany obraz za pomocą ImageJ. W menu "obraz" ustaw typ obrazu na 8 bitów. W menu "proces" przejdź do podmenu "filtry" i zastosuj filtrowanie "wariancja".
      2. W menu "obraz" wejdź w podmenu "dostosuj" i ustaw próg na czarno-biały (czarno-biały), upewnij się, że nie jest wybrana opcja "Ciemne tło". W menu "proces" przejdź do podmenu "binarne" i wybierz "wypełnij otwory".
      3. W menu "analizuj" wybierz "ustaw pomiary" i aktywuj "obszar". Następnie narysuj mierzalny obszar zgodnie z konturem krawędzi migrującej, wyznaczając w ten sposób odstęp.
      4. W menu "analizuj" wybierz "analizuj cząstki" i zapisz wartości "całkowitej powierzchni" dla narysowanej powierzchni obszaru.
    2. Wprowadź wartości całkowitej powierzchni PREGAP i POSTGAP w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo migrację bezwzględną dla każdego zestawu pojedynczych próbek jako różnicę pomiarów powierzchni szczeliny: PREGAP − POSTGAP [Jednostki arbitralne]. Dodatkowo znormalizuj dane migracji bezwzględnej każdego warunku do próbek kontrolnych: (PRÓBKA / KONTROLA) * 100 [%].
      UWAGA: W przypadku komórek, które migrują indywidualnie i wypełniają lukę niezależnie od tworzenia spójnego frontu (np. komórki ludzkie raka piersi MDA-MB-231), bezwzględną migrację można obliczyć, zliczając komórki atakujące centralny pasek w próbce kontrolnej lub poddanej działaniu środka.
    3. Wyniki kwantyfikacji wykresu (patrz Rysunek 1). W razie potrzeby wykonaj analizę statystyczną. Weź pod uwagę test t-Studenta podczas porównywania dwóch warunków lub test analizy wariancji dla większej liczby warunków.

2. Test sztucznego frontu migracyjnego do badań topograficznych

  1. Przygotowanie monowarstwy komórek
    1. Pracując w sterylnych warunkach, umieść jedną warstwę wysterylizowanych okrągłych szkiełek nakrywkowych na pustych płytkach hodowlanych, aż powierzchnia płytki zostanie całkowicie pokryta.
      UWAGA: Na płytkach o średnicy 5 cm i 10 cm mieszczą się odpowiednio do 12 i 33 szkiełek nakrywkowych.
    2. Na płytce hodowlanej delikatnie wysiew odpowiednią objętość komórek w stężeniu, które pozwala na 100% zbieżność po 2 lub 3 dniach. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie zachodzi na sąsiednie szkiełka nakrywkowe i zapobiegaj unoszeniu się szkiełek nakrywkowych, delikatnie uciskając sterylną końcówką do mikropipet. Odświeżaj podłoże co 24-48 h.
      UWAGA: Każda linia komórkowa musi zostać dokładnie przetestowana w celu określenia stężenia komórek i czasu wymaganego do osiągnięcia pełnej konfluencji. Zazwyczaj w przypadku komórek Mv1Lu lub HaCaT wysiewa się odpowiednio 2-3 x 106 lub 2,5-4 x 106 komórek/10 cm średnicy. W przypadku mniejszych płytek numery komórek muszą być zmniejszone.
    3. Po tym, jak komórki osiągną zbieg, usuń pożywkę uzupełnioną surowicą i zastąp ją świeżą pożywką bez surowicy. Przechowuj komórki w podłożu wolnym od surowicy przez 24 godziny przed wykonaniem sztucznej rany.
      UWAGA: Komórki Mv1Lu lub HaCaT nie mają specjalnych wymagań dotyczących substratów; jednak w przypadku linii komórkowych podatnych na spontaniczne odklejanie się w warunkach bez surowicy, należy rozważyć wstępne pokrycie powierzchni hodowli roztworem poli-L-lizyny10.
  2. Nawijanie jednowarstwowe
    1. Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie przenieś szkiełko nakrywkowe na czystą 10-centymetrową płytkę zawierającą świeże podłoże bez surowicy. Unikaj uszkodzenia monowarstwy, przytrzymując szkiełko nakrywkowe pęsetą na obrzeżach. Unikaj nadmiernego nacisku, który mógłby spowodować pęknięcie szkiełka nakrywkowego.
    2. Twórz sztuczne rany, przeciągając wysterylizowaną żyletkę w linii poprzecznej po środku szkiełek nakrywkowych. Przeciągnij 3-4 mm w przód iw tył, aby całkowicie usunąć środkowy pasek jednowarstwowy. Upewnij się, że żadne resztki komórek nie są przyczepione do zranionych krawędzi.
      UWAGA: W przypadku okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm nacięcie wykonuje się w połowie szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że smuga komórek naprzeciwko głównego frontu jest wystarczająco duża (co najmniej 2 mm szerokości), aby uniknąć przechylenia szkiełka nakrywkowego w kolejnych krokach.
    3. Zranione szkiełka nakrywkowe przenieść z komórkami skierowanymi do góry na czystą 6-dołkową płytkę zawierającą co najmniej 2 ml świeżej pożywki wolnej od surowicy. Pasuje do 4 zranionych szkiełek nakrywkowych/studzienki.
    4. Delikatnie umyj dwa razy świeżym podłożem bez serum, aby usunąć oderwane komórki.
  3. Procedura doświadczalna i pobieranie próbek
    1. Delikatnie wymień pożywkę w studzienkach na świeżą pożywkę, która zawiera wybrane zabiegi.
      UWAGA: Alternatywnie, w przypadku substancji chemicznych lub związków, które nie zaburzają jednorodności pożywki hodowlanej, zabiegi można zaszczepić bezpośrednio w pożywce. Postępuj ostrożnie, aby uniknąć potencjalnego oderwania komórek.
    2. Przechowywać płytkę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) przez żądany czas doświadczalny.
    3. Zatrzymaj migrację komórek poprzez utrwalenie komórek; delikatnie zastąp eksperymentalną pożywkę hodowlaną 1 ml 4% formaliny w PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: W przypadku eksperymentów z biegiem czasu należy usunąć próbki z płytki hodowlanej i umieścić je na osobnej płytce, aby uniknąć wpływu oparów formaliny na inne, trwające warunki eksperymentalne.
    4. Umyj komórki, aby usunąć nadmiar formaliny; delikatnie zastąp roztwór w studzienkach świeżym PBS. Powtórz co najmniej dwa razy.
      UWAGA: Na tym etapie, po uszczelnieniu, płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
  4. Immunofluorescencja (IF) i analiza topologiczna
    1. Wykonaj barwienie IF i obrazowanie na poszczególnych szkiełkach nakrywkowych, jak opisano w innym miejscu3,4,11.
      1. Przepuszczalność przez 10 minut, zanurzając szkiełka nakrywkowe w 0,3% roztworze Triton X-100 w PBS.
      2. Blokuj przez 30 minut, używając następującego roztworu blokującego: 0,3% albuminy surowicy bydlęcej; 10% płodowej surowicy bydlęcej; 5% mleka odtłuszczonego; 0,3% roztworu Triton X-100 w PBS.
        UWAGA: Roztwór blokujący bez mleka można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze, z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w bezmlecznym roztworze blokującym. Umieść szkiełka nakrywkowe do góry nogami w 15 μl roztworze przeciwciał, aby zapewnić prawidłowe rozprowadzenie.
        UWAGA: Rozcieńczenie robocze przeciwciała jest zmienne i zależy od używanego przeciwciała. Na przykład przeciwciało anty-c-Jun Rabbit wymaga rozcieńczenia 1/100.
      4. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, zanurzając je w 0,1% roztworze Triton X-100 w PBS.
      5. Szkiełka nakrywkowe inkubować w przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w bezmlecznym buforze blokującym przez 30 min.
        UWAGA: Rozcieńczenie robocze przeciwciała jest zmienne i zależy od używanego przeciwciała. Na przykład Koza-anty-Królik (488) wymaga rozcieńczenia 1/400 w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości. Na tym etapie do buforu inkubacyjnego można dodać inne odczynniki do znakowania, takie jak falloidyna i Hoechst-33258.
      6. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie, zanurzając je w 0,1% roztworze Triton X-100 w PBS.
      7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe do góry nogami w kropli 10 μl materiału montażowego (np. Vectashield) umieszczonej na szkiełku mikroskopowym. Pozostaw szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej na noc w celu utwardzenia podłoża montażowego. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez czas nieokreślony.
    2. Uzyskać obrazy z mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej zmian strukturalnych zachodzących na migrującej krawędzi czołowej.
      UWAGA: Badania topologiczne można przeprowadzić, układając obrazy od frontu migrującego do wewnętrznej warstwy monologicznej. Badania półilościowe są możliwe dzięki analizie opartej na oprogramowaniu lokalnych intensywności fluorescencji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test sztucznego zadrapania ran do badań ilościowych: Ocena wpływu naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) na migrację:

EGF jest dobrze znanym induktorem proliferacji i migracji komórek nabłonkowych, a tym samym pozytywnym środkiem kontrolnym do ilościowego określania promocji migracji. W testach zadrapań ran zastosowano monowarstwy komórek Mv1Lu i HaCaT i uzyskano obrazy przed leczeniem. Po inokulacji 10 ng / ml EGF komórki inkubowano ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przerwaniu ciągłości skóry lub błony śluzowej funkcja bariery zostaje przywrócona przez działanie wielu typów komórek, w tym fibroblastów lub komórek nabłonkowych i odpornościowych. Łącznie komórki te przechodzą złożony proces obejmujący apoptozę, proliferację, różnicowanie i, co ważne, migrację fibroblastów i komórek nabłonkowych, która jest ostatecznym mechanizmem odpowiedzialnym za odbudowę uszkodzonej tkanki i zamknięcie powierzchownej luki nabłonkowej 1,12

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcemy podziękować starszym członkom laboratorium, którzy pomagają ulepszać i udoskonalać te techniki do ich aktualnego stanu: dr Celii Martinez-Mora; dr Annie Mrowiec, dr Catalinie Ruiz-Cañada i dr Antonii Alcaraz-Garcíi. Jesteśmy wdzięczni Szpitalowi Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca za silne wsparcie w rozwoju tych technik. Także Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I+D+I oraz Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (nr dotacji: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Dziękujemy również Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca i FFIS za wsparcie i pomoc administracyjną. Na koniec pragniemy złożyć specjalne podziękowania dr Isabel Martínez-Argudo oraz Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo za ich życzliwe wsparcie w chętnym oddaniu Laboratorium Biomedycyny i Biotechnologii, aby umożliwić nakręcenie filmu w części tego artykułu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FrancjaL0102-500Opcjonalnie 10 % suplement FBS
Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOpcjonalnie 10% suplement FBS
L-glutaminaLonzaBE17-605EStosować przy 2 mM
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Rozcieńczyć w razie potrzeby
Poli-L-LizynaSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) (10x)Gibco firmy Life Technologies14200-067Rozcieńczyć do 1x
24-dołkowych płytek hodowlanychBD FALCON//SARSTED734-0020
6-dołkowe płytki hodowlaneSARSTEDT83-3920
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Używany 10 ng/mL
Okrągły szkło nakrywkoweMENZEL-GLÄ SER MENZCB00120RA020 KRÓTKA GŁĘBIA OSTROŚCI
Wzmocniona żyletka nr 743Martor (przez VWR)MARO743.50
200 µ l sterylne końcówki do pipet aerozolowychVWR732-0541
20 µ l sterylne końcówki do pipet aerozolowychVWR732-0528
Mikroskop kontrastu fazowego sprzężonego z kamerącyfrową Motic HiszpaniaKamera Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Mikroskop konfokalnyZEISS Microimaging, NiemcyLSM 510 META
10 cm Naczynie hodowlaneBD FALCON353003
Królicze poliklonalne przeciwciało anty c-JunSanta Cruz Biotechnologysc-1694Używany 1:100
Anty-królicza IgG (koza poliklonalna) AF 488InvitrogenA11008Używany 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Używany 1:1000
Alexa Fluor 594 falloidyna (w metanolu) (czerwony)InvitrogenA12381
albumina surowicy bydlęcejSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Mleko odtłuszczoneBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USAWydanie 1.50i
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu Zen LSM 510ZEISS Microimaging, NiemcyWydanie 5.0 SP 1.1
używany 1:100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
  3. Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).
  4. Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  5. Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
  6. Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024(2014).
  7. Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271(2012).
  8. Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).
  9. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36(2010).
  10. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  11. Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
  12. Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
  13. Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
  14. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  15. Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
  16. Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
  17. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  18. Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
  19. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  20. Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
  21. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
  22. Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
  23. Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
  24. Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MigrationWound Healing AssayArtificial Wound ScratchMigration Front AssayPhase Contrast MicroscopyFluorescence MicroscopyImage Processing SoftwareVariance FilteringThreshold AdjustmentFill Holes

Related Articles