Artykuł metodologiczny

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56801

⸱

26 lutego 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy obrazowanie optyczne myszy zakażonych Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) za pomocą fluorescencji enzymu reporterowego (REF). Protokół ten ułatwia czułe i swoiste wykrywanie M. tuberculosis w przedklinicznych modelach zwierzęcych do celów patogenezy, terapii i badań nad szczepionkami.

Streszczenie

Reporter enzym fluorescencji (REF) wykorzystuje substraty, które są specyficzne dla enzymów obecnych w organizmach docelowych do obrazowania lub wykrywania przez fluorescencję lub bioluminescencję. Wykorzystujemy BlaC, enzym ulegający konstytutywnej ekspresji przez wszystkie szczepy M. tuberculosis. REF umożliwia szybką ocenę ilościową bakterii w płucach zakażonych myszy. Ta sama grupa myszy może być obrazowana w wielu punktach czasowych, co znacznie obniża koszty, szybciej zlicza bakterie, umożliwia nowatorskie obserwacje interakcji gospodarz-patogen i zwiększa moc statystyczną, ponieważ więcej zwierząt w grupie jest łatwo utrzymywanych. REF jest niezwykle czuły ze względu na katalityczny charakter reportera enzymatycznego BlaC i specyficzny ze względu na niestandardowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) lub zastosowane substraty fluorogeniczne. REF nie wymaga rekombinowanych szczepów, zapewniając normalne interakcje gospodarz-patogen. Opisujemy obrazowanie zakażenia M. tuberculosis przy użyciu substratu FRET o maksymalnej emisji przy 800 nm. Długość fali podłoża umożliwia czułe obrazowanie głębokich tkanek u ssaków. Omówimy zakażenie aerozolem myszy M. tuberculosis, znieczulenie myszy, podawanie substratu REF i obrazowanie optyczne. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do oceny interakcji gospodarz-patogen i skuteczności antybiotyków ukierunkowanych na M. tuberculosis.

Wprowadzenie

Powolne tempo wzrostu M. tuberculosis jest główną przeszkodą w szybkim diagnozowaniu gruźlicy1,2,3. Podczas gdy diagnoza oparta na posiewie potrzebuje tygodni, aby uzyskać wyniki, rozmaz kwasoodporny ma ograniczenia diagnostyczne4 u dzieci5 i pacjentów jednocześnie zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności6,7. Technologie obrazowania optycznego zostały ostatnio uznane za alternatywę dla tradycyjnych metod diagnostycznych gruźlicy8,9. Fluorescencja i bioluminescencja mogą być wykorzystane do optycznego obrazowania M. tuberculosis u żywych zwierząt w czasie rzeczywistym10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Obrazowanie optyczne ma tę zaletę, że umożliwia szybką i specyficzną ocenę zakażenia M. tuberculosis20,21,22.

Przedstawiamy szczegóły optycznego obrazowania M. tuberculosis u żywych myszy za pomocą REF. Ta metoda jest bardzo specyficzna i czuła23,24 i, podobnie jak inne metody optyczne, jest tańsza niż inne metody obrazowania gruźlicy (TB)25, w tym tomografia komputerowa (CT)26, obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI)27 oraz pozytonowa tomografia emisyjna F-fluorodeoksyglukozy/CT (F-FDG PET/CT)28. REF wykorzystuje niestandardowe podłoża fluorescencyjne lub bioluminescencyjne, które po rozszczepieniu przez enzym bakteryjny wytwarzają produkt fluorescencyjny8,29. W związku z tym ma tę zaletę, że nie wymaga rekombinowanego szczepu reporterowego prątków30,31. Opisany substrat FRET składa się z fluorochromu i wygaszacza połączonych pierścieniem β-laktamowym, który jest hydrolizowany przez BlaC (β-laktamazę), naturalnie wyrażaną przez kompleks gruźlicy Mycobacterium8,32. Bakterie bezpośrednio generują sygnał dzięki aktywności katalitycznej REF, która umożliwia amplifikację o wiele rzędów wielkości i czułe wykrywanie M. tuberculosis.

Substrat REF użyty w tym badaniu ma doskonałą penetrację tkanek u żywych zwierząt i zredukowane tło ze względu na jego długą długość fali. Dzięki temu substratowi o dużej długości fali możliwe jest osiągnięcie progu wykrywalności M. tuberculosis wynoszącego prawie 100 jednostek tworzących kolonie (CFU) in vitro i <1000 CFU w płucach myszy in vivo (całe zwierzę)8,33. REF może być stosowany jako narzędzie diagnostyczne plwociny, materiałów klinicznych, a nawet bezpośrednio u pacjentów z mikrosystemami endoskopowymi16,32,33,34 ze względu na wysoką czułość i swoistość. REF może być stosowany do każdego szczepu klinicznego gruźlicy, ponieważ wykorzystuje naturalnie wytwarzany enzym bakteryjny, BlaC, do wykrywania obecnego we wszystkich szczepach. Te cechy sprawiają, że obrazowanie REF jest cennym narzędziem w przedklinicznych badaniach nad gruźlicą w ogóle, aby ułatwić ocenę terapeutyczną i szczepionkową, a także analizę patogenezy, ale ostatecznie może być również stosowane w diagnostyce u pacjentów z gruźlicą.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&M University. Może być wymagany przegląd i zgoda urzędnika ds. bezpieczeństwa zagrożeń biologicznych lub komitetu w Twojej instytucji.

Uwaga: Wszystkie procedury wymagają zabezpieczenia BSL3. Personel jest zobowiązany do noszenia środków ochrony osobistej przez cały czas. Wszystkie manipulacje są wykonywane wewnątrz Komory Bezpieczeństwa Biologicznego (BSC), a wszystkie ostre przedmioty są wyrzucane do pojemników na ostre przedmioty. Powierzchnie robocze i BSC są czyszczone buforowanym fenolem i 70% etanolem przed rozpoczęciem pracy i po jej zakończeniu. Procedury normalnie byłyby wykonywane na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 w przypadku Mycobacterium tuberculosis, ale w celach ilustracyjnych i filmowych autorzy demonstrują te procedury na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 z mniej zjadliwymi bakteriami.

1. Szczepy i warunki hodowli

Uwaga: szczep M. tuberculosis CDC1551 jest używany w tym badaniu, ale każdy szczep M. tuberculosis może być użyty w ten sam sposób.

  1. Hoduj bakterie w podłożu M-OADC-TW (bulion 7H9 uzupełniony 0,5% glicerolu, 10% kompleks dekstrozy kwasu oleinowego bez katalazy i 0,05% Tween-80) w temperaturze 37 °C do OD600 0,5 (~ 0,2 x 107 CFU).
  2. Rozcieńczyć kulturę w M-OADC-TW (seria rozcieńczeń bakterii w stosunku 1:10). Rozcieńczone roztwory bakterii (105, 106, 107, 108) należy roztoczyć trzykrotnie na selektywnych płytkach 7H11, aby umożliwić oznaczenie CFU.
  3. Inkubować płytki przez cztery tygodnie w temperaturze 37 °C lub do momentu, gdy będzie można dokładnie policzyć kolonie.
  4. Odwirować inokulum bakteryjne przy sile 8,534 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Umyj granulkę raz 10 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) i ponownie zawiesić osad w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl).

2. Zakażenie aerozolem myszy za pomocą komory Madison

  1. Pozwól myszom zaaklimatyzować się w nowym otoczeniu przez tydzień.
  2. Zważ myszy przed załadowaniem ich do komory.
  3. Podłącz trzy przewody do listwy zasilającej: zasilanie komory głównej, pompę próżniową i sprężarkę powietrza, w tej kolejności.
  4. Ostrożnie odkręć szklany słoik. Przynieś szklany słoik do szafki bezpieczeństwa biologicznego i dodaj inokulum prowokacyjne zawieszone w 15 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl), aby uzyskać ~ 104 - 106 CFU bakterii w płucach.
  5. Zamknij pokrywkę szklanego słoika w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przymocuj słoik do nebulizatora i wyreguluj pionową rurkę ze stali nierdzewnej tak, aby dolny koniec (wlotowy) znajdował się około ćwierć cala poniżej poziomu płynu w słoiku.
  6. Załaduj wszystkie zwierzęta potrzebne do eksperymentu (komora może pomieścić do 90 myszy) do komory i zamknij wszystkie zatrzaski na drzwiach.
  7. Sprawdź główny (pokojowy) przepływomierz powietrza. Upewnij się, że środek pływaka (kuli) porusza się z prędkością około 50 l/min, jak zmierzono na skali po lewej stronie.
  8. Naciśnij przycisk Start na panelu sterowania komory. Ustaw natężenie przepływu powietrza przez przepływomierz powietrza sprężarki (mniejszy miernik po lewej stronie) na 4 l/min na skali. Sprawdź wzrokowo, aby upewnić się, że inokulum prowokacyjne jest poddawane nebulizacji.
  9. Po 15 minutach, gdy z przodu panelu sterowania pojawi się czerwona lampka, a sygnał dźwiękowy wskaże koniec biegu, naciśnij przycisk Reset w prawym dolnym rogu panelu sterowania, aby zresetować timery.
  10. Przytrzymaj mały czerwony przycisk na drzwiach komory, aby zwolnić podciśnienie.
  11. Otwórz drzwi komory i wyjmij zwierzęta. Umieść myszy z powrotem w klatkach.
  12. Wyjmij szklany słoik nebulizatora i umieść go w szczelnym, szczelnym pojemniku transportowym. Umieść pojemnik w komorze bezpieczeństwa biologicznego i wyrzuć zawiesinę prowokacyjną do wyznaczonego pojemnika na odpady.
  13. Umieść zużyty słoik nebulizatora w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego i zamknij worek na czas transportu do autoklawu.
  14. Pod koniec procedury infekcji spryskaj wnętrze komory buforowanym fenolem i 70% etanolem i pozostaw komorę na 10 minut.
  15. Następnie bardzo dokładnie wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie wewnętrzne. Wyrzuć wszystkie zanieczyszczone ręczniki papierowe itp. w koszu na zagrożenia biologiczne. Autoklaw śmieci, pojemnik na odpady i zużyte słoiki nebulizatora.
  16. Umieść zwierzęta z powrotem w pomieszczeniu przechowawczym do momentu obrazowania.
  17. W dniu obrazowania należy przenieść zwierzęta w pojemniku wtórnym do pomieszczenia do obrazowania.

3. Znieczulenie zwierząt

  1. Znieczulij myszy izofluranem za pomocą dostosowanego systemu znieczulenia gazowego.
  2. Zważ każdy z dwóch kanistrów z filtrem węglowym znajdujących się na górze jednostki anestezjologicznej.
  3. Wymień na nowy kanister, jeśli jego waga jest o 50 g wyższa od masy początkowej.
  4. Sprawdź parownik, aby upewnić się, że izofluran jest wystarczający do zabiegu.
  5. Umieść uchwyt stożka nosowego w komorze obrazowania. Umieść liczbę stożków nosowych wymaganą do zabiegu i uszczelnij pozostałe otwory za pomocą blokerów stożka nosowego.
  6. Włącz dopływ tlenu z butli wysokociśnieniowej i ustaw go na 55 psi.
  7. Włącz pompę ewakuacyjną znajdującą się przed jednostką anestezjologiczną i ustaw ją na 8 l/min.
  8. Włącz przełącznik tlenu znajdujący się przed unitem anestezjologicznym.
  9. Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia, aby ustawić przepływ gazu na 1,5 l/min. Wyłączyć dopływ gazu.
  10. Włącz dopływ gazu do komory obrazowania, aby ustawić przepływ gazu na 0,25 l/min. Wyłącz przepływ gazu.
  11. Włącz waporyzator izofluranu i ustaw go na 2 - 2,5%. Dostosuj poziom izofluranu do liczby i wagi zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie, obracając pokrętło na parowniku izofluranu (2 - 2,5% dla myszy o wadze ~20 g; 4% dla świnki morskiej o wadze 300 g).
  12. Umieść myszy w komorze anestezjologicznej i zamknij pokrywę. Włączyć dopływ gazu do komory indukcyjnej znieczulenia.
  13. Pozostaw myszy w komorze indukcyjnej znieczulenia na 5 - 10 minut, aż do całkowitego znieczulenia.
  14. Po znieczuleniu myszy nałóż maść optyczną na oczy, aby chronić je podczas obrazowania.
  15. Umieść myszy w pozycji brzusznej lub mostkowej tak, aby ich nosy były umieszczone w stożku nosowym, aby ułatwić znieczulenie myszy podczas procedury obrazowania.

4. Obrazowanie fluorescencji enzymu reporterowego (REF)

  1. Wstrzyknąć substrat (20 μM, 2,5 μl/g wagi) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe do myszy zakażonych, jak również kontrolnych. Myszy są pod narkozą w komorze obrazowania przez mniej niż 1 minutę.
  2. Uruchom system obrazowania.
  3. Zainicjuj system, klikając przycisk Inicjuj. Poczekaj, aż pasek temperatury zmieni kolor na zielony.
    UWAGA: Komora obrazowania składa się z podgrzewanej platformy do utrzymywania temperatury ciała zwierzęcia podczas obrazowania.
  4. Aby ustawić akwizycję obrazu, wybierz Fluorescencyjny | Trans-iluminacja dla całego zwierzęcia lub Epi-iluminacja dla tkanek płucnych, struktura i nakładka w Panelu sterowania akwizycją.
  5. Ustaw Pole widzenia na B dla pojedynczej myszy i poziom lampy na wysoki.
  6. Ustaw czas ekspozycji na automatyczny, średni bining, 2 - 3 dla przysłony, filtr wzbudzenia na 745 nm i filtry emisji od 780 nm do 840 nm.
  7. Aby ustawić sekwencję, kliknij Sequence Setup (Ustawienia sekwencji), wybierz 9 - 12 punktów trans-illumination w obszarze płuc.
  8. Kliknij Pobierz, aby uzyskać obraz.
  9. Umieść mysz z powrotem w klatce po obrazowaniu.
  10. Monitoruj myszy do momentu całkowitego wyzdrowienia lub poświęcenia w celu ilościowego określenia CFU, jeśli obrazowanie odbywa się w punkcie czasowym eksperymentu. Wykonaj zmodyfikowaną punktację Karnofsky'ego, aby monitorować dobrostan myszy po obrazowaniu.

5. Analiza obrazowania REF

  1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania.
  2. Załaduj pliki obrazów, klikając ikonę Przeglądaj.
  3. Aby rozmieszać spektralnie, kliknij Spektralne mieszanie w palecie narzędzi i kliknij widma wymagane do rozmieszania. Kliknij rozpocznij rozmieszanie.
  4. Aby zrekonstruować powierzchnię optyczną, kliknij na Topografia powierzchni.
  5. Wybierz orientację grzbietową, z zastrzeżeniem futra myszy i kliknij przycisk Generuj powierzchnię.
  6. Narysuj obraz kadrowania i ustaw obraz progowy dla obszaru zainteresowania. Kliknij Gotowe.
  7. Aby zarejestrować narządy, przejdź do zakładki rejestracji w menu rozwijanym Narzędzia optyczne 3D.
  8. Rejestrowanie interesujących nas narządów w atlasie narządów.
  9. Dostosuj rozmiar lub lokalizację organów do wygenerowanej topografii powierzchni za pomocą narzędzia do przekształcania on/off znajdującego się w panelu-Narzędzia do rejestracji.
  10. Przejdź do sekcji Rekonstrukcja 3D tomografii fluorescencyjnej (FLIT) i wybierz zakładkę Analizuj. Wybierz obrazy, które mają zostać uwzględnione do analizy, typ obrazu na Wydajność znormalizowanej fluorescencji transmisyjnej (NTF), kliknij przycisk Start.
  11. Zaznacz zaznacz wszystko i zrekonstruuj na karcie Podgląd danych.
  12. Aby określić ilościowo fluorescencję, przejdź do Narzędzia obszaru zainteresowania (ROI), dodaj kostkę ROI do narządu zainteresowania i dostosuj rozmiar sześcianu, aby pokryć interesujący nas narząd. Kliknij na Zmierz ROI 3D.
  13. W oknie Pomiary ROI przejdź do Pomiary ROI 3D, wybierz typ danych do źródła wokseli oraz jednostkę miary do pmolM-1 cm-1.
  14. Zapisz i/lub wyeksportuj wynik analizy rekonstrukcji FLIT 3D do rysunku lub pliku danych.

6. Kwantyfikacja bakterii za pomocą CFU

  1. Poddaj myszy eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 ml pentobarbitalu sodu (390 mg / ml).
  2. Sprawdź odruch pedałowania, ściskając opuszki stóp myszy, aby upewnić się, że nie ma reakcji odruchowej.
  3. Usuń tkankę płucną myszy za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek. Homogenizować tkankę płucną w 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenatu płuc w sterylnym 1x PBS.
  5. W celu posiewu, na płytce agarowej umieścić trzy porcje po 20 μl każdy z odpowiedniego rozcieńczenia.
  6. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i monitorować rozwój bakterii.
  7. Policz kolonie w każdym miejscu po czasie inkubacji i wyraż je jako CFU/ml, korygując objętość i rozcieńczenie, stosując następujące równanie:
    jtk/ ml = (C/V) x M
    Gdzie C = liczba kolonii na plamkę, V = objętość próbki zaszczepionej na każdej płytce (ml), a M = współczynnik mnożenia (odwrotność użytego rozcieńczenia).
    UWAGA: Jeśli 11 kolonii zostanie policzonych w jednym miejscu na objętość próbki 0,002 ml przy rozcieńczeniu próbki 10-4, przy użyciu równania liczbę kolonii zostanie obliczona jako
    (11/0,02) x 104 = 5,5 x 106 jtk/ml

Wyniki

Obrazowanie REF myszy zainfekowanych M. tuberculosis wraz z niezinfekowaną myszą kontrolną przedstawiono na Rysunku 1A. Po podaniu substratu myszy zainfekowane wykazały istotnie wyższy (P = 0,0057) sygnał fluorescencyjny z płuc w 6. tygodniu po infekcji w porównaniu do grupy kontrolnej. Typowy przebieg czasowy badania skuteczności terapeutycznej przeciwko M. tuberculosis z użyciem REF mógłby obejmować obrazowanie w 1., 2., 4., 6., 15. i 24. tygodniu po infekcji. Intensywność fluorescencji jest ilościowo określana przy użyciu epiluminacji dla tkanek płuc (Rysunek 1B). Spójny wzrost sygnału od 2. do 6. tygodnia w płucach zainfekowanych myszy sugeruje, że REF jest w stanie skutecznie wykrywać M. tuberculosis in vivo. Spadek sygnału tła u myszy kontrolnych w późniejszym punkcie czasowym (Rysunek 1B) można przypisać zwiększeniu masy ciała i objętości myszy w okresie 6 tygodni, co zmniejszyło penetrację długości fali wzbudzenia. Rekonstrukcja 3D FLIT źródeł fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis przedstawiona jest na Rysunku 2A. Sekwencje obrazów są pobierane w wielu punktach transiluminacji u myszy przy użyciu tego samego wzbudzenia i serii filtrów emisyjnych. Te sekwencje obrazów są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji 3D FLIT w celu określenia rozkładu źródeł fluorescencyjnych w organizmie zwierzęcia. Rysunek 2A-D prezentuje różne płaszczyzny (czołową, strzałkową i poprzeczną) tomografii myszy z rejestracją organu płuc. Mapy wydajności NTF służące do weryfikacji jakości rekonstrukcji przedstawiono na Rysunku 2E. NTF pozwala na odjęcie tła wynikającego z przecieku światła z obrazów transiluminacyjnych poprzez dodatkowy obraz uchwycony z filtrem neutralnym. Obraz wykonany ze specyficznym filtrem wzbudzenia (Rysunek 2E-measured) jest normalizowany do obrazu transmisji zmierzonego z tym samym filtrem emisyjnym i otwartym filtrem wzbudzenia (Rysunek 2E-simulated), aby uzyskać sygnał generowany wyłącznie przez substrat. Podobne zmierzone i symulowane profile wydajności NTF zarówno w profilu poziomym (Rysunek 2F), jak i pionowym (Rysunek 2G), z błędem procentowym bliskim 0% (Rysunek 2E-% error), stanowią dowód wysokiej jakości rekonstrukcji 3D przy zredukowanych artefaktach oraz poprawionej lokalizacji sygnału i czułości.

Obrazowanie fluorescencyjne i analiza postępu infekcji u myszy; dołączono wykres porównawczy.
Rycina 1. Obrazowanie M. tuberculosis za pomocą REF. (A) Obrazowanie in vivo myszy niezinfekowanych oraz zainfekowanych M. tuberculosis w 2., 4. i 6. tygodniu po infekcji. Pasek kolorów przedstawia intensywność sygnału fluorescencyjnego w fotonach na sekundę na cm2 , od niskiej (żółty) do wysokiej (czerwony). (B) Ilościowe oznaczenie intensywności fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis. Wartości fluorescencji dla grupy kontrolnej (czarny) i zainfekowanej (czerwony) przedstawiono wraz z błędem standardowym dla każdego punktu czasowego. Istotność wyników określono za pomocą testu t Studenta; wartości p <0,05 uznano za istotne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Model obrazowania optycznego płuc z danymi symulowanymi i zmierzonymi; efektywność NTF, schemat analizy błędów.
Rycina 2. Rekonstrukcja 3D FLIT źródeł fluorescencji u myszy zainfekowanych M. tuberculosis. Tomografia myszy przedstawiona w różnych przekrojach: A) czołowym, B) strzałkowym oraz C) poprzecznym, wraz z D) rejestracją organu płuc. Trójwymiarowy obszar zainteresowania (ROI) dla pomiarów źródła przedstawiono jako czerwony sześcian w płucach. (E) Mapy efektywności NTF dla danych zmierzonych i symulowanych w celu weryfikacji jakości rekonstrukcji. Porównanie profili efektywności NTF zmierzonej i symulowanej wykazało wysoką jakość rekonstrukcji 3D (podobna efektywność NTF zmierzona i symulowana). F) Poziomy i G) pionowy profile sygnału reprezentujące krzywe efektywności NTF zmierzonej (niebieska) i symulowanej (czerwona). Poziome i pionowe czerwone paski wskazują położenie źródła. Pasek kolorów reprezentuje intensywność sygnału fluorescencyjnego w fotonach na sekundę na cm2 od niskiej (niebieski) do wysokiej (czerwony). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

W przypadku korzystania z technik obrazowania, takich jak REF, istnieją kluczowe strategie, które umożliwiają generowanie solidnych i spójnych danych. Obrazowanie optyczne wytwarza rozproszone światło w tkankach, co może wpływać na głębokość penetracji, ponieważ trudno jest uchwycić światło emitowane we wszystkich kierunkach. Zastosowanie substratu fluoroforowego w bliskiej podczerwieni (NIR) do obrazowania REF o długości fali wzbudzenia i emisji w Querange 700 - 900 nm ułatwia minimalną absorpcję sygnału fluorescencyjnego przez tkanki ssaków. Specjalnie zaprojektowane podłoże zostało skonstruowane przez połączenie fluoroforu NIR, IRDye 800Cw z wygaszaczem, IRDye QC-1, za pomocą pierścienia laktamowego umożliwiającego wygaszanie oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji. IRDye ma doskonałe właściwości penetracji tkanek i rozpraszania światła oraz nie ma żadnego widocznego szkodliwego wpływu na ssaki36, jest usuwany z krwi i narządów w ciągu 24 godzin. Sygnał fluorescencyjny znacznie wzrasta począwszy od 4 godzin po podaniu substratu, osiągając maksymalny poziom 6 godzin po podaniu.

Bakteryjna dawka zakaźna, sposób podawania dawki zakaźnej i substratu, a także punkty czasowe obrazowania po zakażeniu poprzez wykonanie badań pilotażowych powinny być ustandaryzowane przed rozpoczęciem dużych, złożonych eksperymentów. Badania pilotażowe mogą znacznie skrócić czas i obniżyć koszty obrazowania dużej liczby zwierząt, ponieważ standardową procedurę można zoptymalizować przed przeprowadzeniem kluczowego eksperymentu. Obciążenia bakteryjne w narządach/tkankach będących przedmiotem zainteresowania należy określić po obrazowaniu całego ciała za pomocą transiluminacji i obrazowaniu płuc ex vivo przy użyciu epi-iluminacji w celu walidacji źródła sygnału i określenia jakości korelacji z obecną liczbą bakterii8. Badania pilotażowe dostarczą informacji na temat progu detekcji, zakresu dynamicznego techniki, a także określą optymalne warunki eksperymentalne dla obrazowania.

Głównymi zaletami stosowania obrazowania REF w porównaniu z innymi strategiami fluorescencyjnymi i bioluminescencyjnymi są jego wysoka czułość i zdolność do obrazowania naturalnych szczepów M. tuberculosis. Obrazowanie REF wykorzystuje katalitycznie wytrzymały enzym BlaC, który jest konserwatywny we wszystkich izolatach klinicznych M. tuberculosis i szczepach kompleksu gruźlicy. Duża czułość obrazowania REF wynika z szybkiego tempa katalitycznego BlaC w połączeniu z zatrzymywaniem rozszczepionego produktu fluorescencyjnego przez komórkę gospodarza. Sygnał stale wzrasta tak długo, jak długo substrat jest dostępny, co powoduje niemal nieograniczone gromadzenie się sygnału w zainfekowanych komórkach i tkankach. Ta zwiększona czułość obrazowania REF w porównaniu z alternatywnymi podejściami do obrazowania umożliwia specyficzne wykrywanie M. tuberculosis zarówno in vitro, jak i in vivo 8,23,24,29.

Obrazowanie REF może być stosowane do wykrywania bakterii bez modyfikacji genetycznych, co umożliwia jego bezpośrednie zastosowanie do dowolnego modelu infekcji, zarówno zwierząt laboratoryjnych 8,37, jak i materiałów klinicznych u ludzi29,38. REF może być stosowany do wykrywania i obrazowania szerokiej gamy patogenów39,40, ponieważ substraty fluorogenne mogą być opracowywane dla wielu celów enzymatycznych innych niż BlaC, takich jak proteazy, kinazy, ureazy i β-galaktozydazy. Należy jednak dokładnie przemyśleć cel, aby upewnić się, że wykazuje on optymalne cechy do obrazowania. BlaC stanowi dobry enzym modelowy dla cech, które zapewnią skuteczne zastosowanie tej strategii. Obrazowanie REF zapewnia natychmiastowy odczyt obciążenia bakteryjnego obecnego w płucach podczas infekcji, co znacznie przyspiesza postęp w badaniach nad patogenezą gruźlicy, ponieważ określenie liczby bakterii zwykle zajmuje od trzech do sześciu tygodni, ale nawet w przypadku szybciej rosnących organizmów takie podejście pozwoli zaoszczędzić dużo czasu. REF może być również stosowany do odróżniania raków od gruźlicy, kluczowego problemu w diagnostyce zmian guzkowych u pacjentów41,42. REF służy jako nowatorskie narzędzie przyspieszające translacyjne obrazowanie gruźlicy i może być nawet stosowany u ludzi, potencjalnie umożliwiając szybkie przewidywanie wyników leczenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IzofluranVETONE501027
CNIR800Niestandardowo syntetyzowany
roztwór Fatal PlusVortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Bulion MiddlebrookBD271310
OADC Wzbogacanie MiddlebrookBD212351
SporcidinRE-1284F
7H11 Middlebrook AgarBD212203
Madison Chamber
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262
XGI-8-gazowy system anestezjologicznyPerkin Elmer
Living Oprogramowanie do obrazowaniaPerkin Elmer
Przezroczyste stożki nosowePerkin Elmer
M. gruźlica szczep CDC1551ATCC
Samice myszy BALB/C, 5-7 tygodniLaboratorium
Jacksona

Bibliografia

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150(2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717(2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie Mycobacterium tuberculosisinfekcja myszy drog aerozolowsystem obrazowania optycznegosubstrat FRET 800 nmmetoda oznaczania CFUanaliza tkanki p ucnejrekonstrukcja 3D FLITinterakcje gospodarz patogenbadanie skuteczno ci antybiotyk w
Obrazowanie Mycobacterium tuberculosis u myszy z fluorescencją enzymu reporterowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.