Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

DOI:

10.3791/56820

⸱

21 grudnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translacja mRNA na białka to złożony proces obejmujący kilka warstw regulacji. Często przyjmuje się, że zmiany w transkrypcji mRNA odzwierciedlają zmiany w syntezie białek, ale zaobserwowano wiele wyjątków. Ostatnio technika zwana profilowaniem rybosomów (lub Ribo-Seq) pojawiła się jako potężna metoda, która umożliwia identyfikację z dużą dokładnością, które regiony mRNA są tłumaczone na białka i kwantyfikację translacji na poziomie całego genomu. W tym miejscu przedstawiamy uogólniony protokół kwantyfikacji translacji całego genomu przy użyciu Ribo-Seq w pączkujących drożdżach. Ponadto połączenie danych Ribo-Seq z pomiarami obfitości mRNA pozwala nam jednocześnie określić ilościowo wydajność translacji tysięcy transkryptów mRNA w tej samej próbce i porównać zmiany tych parametrów w odpowiedzi na manipulacje eksperymentalne lub w różnych stanach fizjologicznych. Opisujemy szczegółowy protokół generowania śladów rybosomów za pomocą trawienia nukleazy, izolacji nienaruszonych kompleksów rybosom-ślad poprzez frakcjonowanie gradientu sacharozy oraz przygotowanie bibliotek DNA do głębokiego sekwencjonowania wraz z odpowiednimi kontrolami jakości niezbędnymi do zapewnienia dokładnej analizy translacji in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

translacja mRNA jest jednym z podstawowych procesów w komórce, który odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji białek. Dlatego translacja mRNA jest ściśle kontrolowana w odpowiedzi na różne wewnętrzne i zewnętrzne bodźce fizjologiczne 1,2. Mechanizmy regulacji translacyjnej pozostają jednak niedostatecznie zbadane. W tym miejscu opisujemy protokół kwantyfikacji translacji całego genomu w pączkujących drożdżach za pomocą profilowania rybosomów. Ogólnym celem techniki profilowania rybosomów jest badanie i ilościowe określenie translacji określonych mRNA w różnych warunkach komórkowych. Technika ta wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji do ilościowej analizy zajętości rybosomów w całym genomie i umożliwia monitorowanie szybkości syntezy białek in vivo w rozdzielczości pojedynczego kodonu 3,4. Obecnie metoda ta zapewnia najbardziej zaawansowany sposób pomiaru poziomów translacji białek i okazała się użytecznym narzędziem odkrywczym dostarczającym informacji, których nie można ujawnić za pomocą innych obecnie dostępnych technik, np. mikromacierzy lub analizy tablic stanu translacji (TSAA) 5. Ponieważ profilowanie rybosomów informuje o połączonych zmianach poziomów transkryptów i wydajności translacji, zapewnia również znacznie większą czułość w porównaniu z innymi metodami.

To podejście opiera się na głębokim sekwencjonowaniu fragmentów mRNA chronionych rybosomami 3. Podczas translacji białek rybosomy chronią ~ 28 nt części mRNA (zwane śladami stóp) 6. Określając sekwencję fragmentów chronionych rybosomem, Ribo-Seq może mapować położenie rybosomów na translowanym mRNA i identyfikować, które regiony mRNA mogą być aktywnie translowane do białka 3,7. Ponadto możemy ilościowo zmierzyć translację mRNA, licząc liczbę śladów, które są zgodne z danym transkryptem mRNA.

W celu wyizolowania fragmentów chronionych przez rybosomy, lizaty komórkowe są początkowo traktowane inhibitorem translacji, aby zatrzymać rybosomy, a następnie trawienie rybonukleazą. Podczas gdy wolne mRNA i części translowanych mRNA niechronionych przez rybosomy są degradowane przez rybonukleazę, fragmenty mRNA chronione rybosomem można odzyskać poprzez oczyszczanie nienaruszonych kompleksów rybosom-ślad. Te ślady mRNA są następnie przekształcane do biblioteki cDNA i analizowane przez głębokie sekwencjonowanie (Rysunek 1). Równolegle z profilowaniem rybosomów nienaruszone mRNA jest ekstrahowane z tej samej próbki i sekwencjonowane. Porównując poziom translacji zidentyfikowany przez Ribo-Seq z pomiarami obfitości mRNA, możemy zidentyfikować geny, które są specyficznie regulowane w górę lub w dół na poziomie translacji i obliczyć wydajność translacji mRNA na poziomie całego genomu. Chociaż protokół opisany w tym artykule jest specyficzny dla drożdży, powinien być również przydatny dla badaczy, którzy będą próbowali ustalić protokół Ribo-Seq w innych systemach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie ekstraktu

  1. Szczepy drożdży z zamrożonych zapasów dla pojedynczych kolonii na płytkach YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy i 2% agaru). Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2 dni.
  2. Zaszczepić drożdże z płytki YPD (użyć pojedynczej kolonii) do 15 ml pożywki YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% glukozy) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i rosnąć przez noc z wytrząsaniem (200-250 obr./min) w temperaturze 30 °C.
  3. Rozcieńczyć kulturę w 500 ml pożywki YPD w sterylnej kolbie o pojemności 2 l, tak aby OD600 < 0,1. Hodować komórki drożdży, wytrząsając w temperaturze 30 °C przez 3-5 godzin, aż OD600 = 0,5 (faza środkowej logarytmu).
  4. Zbieraj komórki, filtrując je przez filtry membranowe 0,45 μm za pomocą zespołu filtrów ze szklanym uchwytem. Zeskrobać granulkę szpatułką, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Przewidywana wielkość zamrożonego pelletu to ~ 0,2 - 0,5 g.
    Uwaga: Ciekły azot ma bardzo niską temperaturę; Nosić odpowiednią ochronę.
  5. Przygotować świeży bufor do lizy (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/ml cykloheksymidu, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) bezpośrednio przed użyciem, przechowywać na lodzie.
  6. Umieść 3 koraliki ze stali chromowanej (3,2 mm) w probówce ze stali nierdzewnej o pojemności 1,8 ml. Wstępnie schłodzić w ciekłym azocie i dodać zamrożone granulki, przykryć nakrętką z gumy silikonowej. Homogenizować próbkę przez kriomielenie przez 10 s przy 4200 obr./min; Powtórz 10 razy. Schładzaj probówkę w ciekłym azocie przez co najmniej 10 sekund między każdą rundą.
    UWAGA: Ważne jest, aby zawsze przechowywać próbkę w stanie zamrożonym.
  7. Dodać 1 ml buforu do lizy, dobrze wymieszać pipetując. Przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Wirować przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Podczas pracy z lodem przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Przenieś 100 μl lizatu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu izolacji poli(A) mRNA. Natychmiast przystąp do izolacji RNA lub błyskawicznego zamrożenia probówki w ciekłym azocie. Zmierz OD260 reszty lizatu, który zostanie użyty do ekstrakcji śladu węglowego, i błyskawicznie zamroź probówki w ciekłym azocie. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.

2. Usuwanie śladów stóp

  1. Przygotowanie gradientów sacharozy
    1. Przygotuj roztwory dla 50%, 40%, 30%, 20% i 10% sacharozy w buforze gradientowym (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 μg/ml cykloheksymidu, 0,5 mM DTT).
    2. Pobrać pipetą 2,2 ml przygotowanego 50% buforu sacharozy na dno cienkościennej probówki polialomerowej o pojemności 13,2 ml i zamrozić roztwór na 10 minut w temperaturze -80 °C (Rysunek 2). Następnie ułóż 2,2 ml 40% buforu sacharozy na wierzchu zamrożonego 50% buforu sacharozy i zamrażaj przez 10 minut w temperaturze -80 °C. Postępując zgodnie z tymi samymi instrukcjami, ułóż 30%, następnie 20%, a na końcu 10% sacharozy jeden na drugim. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza podczas nakładania warstw. Utrzymuj gradienty w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Gradienty sacharozy powinny być przygotowane co najmniej jeden dzień przed doświadczeniem i przechowywane w temperaturze -80 °C.
  2. Trawienie nukleaz
    1. Rozmrozić gradienty sacharozy w noc poprzedzającą eksperymenty w temperaturze 4 °C.
    2. Rozmrozić lizat komórkowy (próbka śladu węglowego) na lodzie. Przenieś porcję lizatu komórkowego zawierającego 50 OD260 jednostek do nowej probówki 1.5 mL i dodaj świeży bufor do lizy do 1 ml. Pozostały lizat przechowywać w temperaturze -80 °C. Dodać 10 μl RNazy I (100 U/μL) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem na rotatorze typu head-over-heels.
    3. (Opcjonalnie) Sklarować próbki w temperaturze 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odzyskać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Ultrawirowanie
    1. Delikatnie ułóż próbki lizatu na wierzchu 10-50% gradientu sacharozy.
    2. Ultraodwirować probówki polialomerowe przy 210 000 x g (35 000 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny przy użyciu wirnika SW-41 Ti.
  4. Konfiguracja systemu frakcjonowania gradientowego
    1. Włącz komponenty i pozwól monitorowi UV rozgrzać się przez co najmniej 30 minut.
    2. Jeśli używasz oprogramowania do nagrywania cyfrowego, uruchom oprogramowanie na komputerze, ustaw limity skalowania wykresu na -0,01 i 1.
    3. Napełnij strzykawkę roztworem Chase (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% sacharozy), usuń wszelkie pęcherzyki powietrza wewnątrz strzykawki i kaniuli.
    4. Zainstaluj rurkę ultrawirówki wypełnioną wodą wolną od RNaz. Przebij rurkę kaniulą, aż będą widoczne dwa czarne ślady. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością 1 ml/min.
    5. Gdy woda przepływa przez komórkę przepływową, naciśnij przycisk "Auto Zero" na monitorze UV, aby ustawić linię bazową na 0. Ustaw czułość monitora UV na "2.0 AU". Po ustawieniu stabilnej linii podstawowej należy zatrzymać pompę strzykawkową. Odzyskaj roztwór Chase i wyjmij probówkę ultrawirówki.
  5. Izolacja monosomów
    1. Zainstalować i przekłuć probówkę ultrawirówki zawierającą gradient sacharozy. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością 1 ml/min, zebrać frakcje o pojemności 1 ml, monitorując wartości A254. Frakcje puli reprezentujące szczyt monosomu 80S w jednej probówce, trzymaj na lodzie (Rysunek 3).
    2. Gdy Chase Solution dotrze do komory przepływowej, zatrzymaj pompę strzykawkową. Odzyskaj roztwór Chase i wyjmij probówkę ultrawirówki. Powtórzyć frakcjonowanie dla pozostałych próbek, zaczynając od etapu 2.5.1.
      UWAGA: Po zakończeniu wyczyść system frakcjonowania co najmniej 30 ml wody wolnej od RNaz. Dokładnie umyj rurki, strzykawkę i wszystkie wyjmowane elementy ciepłą wodą.
    3. Przefiltrować frakcje przez 0,5 ml filtrów odśrodkowych (100 kDa MWCO) przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić przepływ, powtarzać do momentu, aż objętość osiągnie < 100 μL. Dodać 400 μl buforu uwalniającego (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 U/ml inhibitora RNazy). Wymieszać pipetując, inkubować na lodzie przez 10 minut i przenieść urządzenie do nowej probówki zbiorczej. Odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać przepływ.
  6. Oczyszczanie fragmentów śladów stóp
    1. Przenieść przepływowy fragment RNA zawierający ślad węglowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, dodać 20 μl 20% SDS (do końcowego stężenia 1%), wymieszać pipetując.
    2. Dodać 1 objętość kwasowo-fenolowo-chloroformowego (pH 4,5), wirować przez 10 s.
      Uwaga: Kwas-fenol: Chloroform jest toksyczny, należy unikać kontaktu ze skórą i wdychania.
    3. Ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 minut, umieszczać na lodzie przez 1 minutę. Odwirowywać próbkę o temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Wytrącić fragmenty śladu RNA, dodając 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg / ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.

3. Ekstrakcja mRNA poli(A)

  1. Ekstrakcja całkowitego RNA
    1. Rozmrozić 100 μl podwielokrotności lizatu komórkowego (próbki całkowitego RNA) na lodzie, dodać 300 μl 20 mM Tris-HCl pH 7,0 i 20 μl 20% SDS (do końcowego stężenia 1%), wymieszać pipetując.
    2. Dodaj 1 objętość (400 μl) kwasu-fenolu:chloroformu (pH 4,5) i wiruj przez 10 s.
    3. Ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 minut, umieszczać na lodzie przez 1 minutę. Odwirowywać próbkę o temperaturze 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Wykonaj drugą ekstrakcję fenolową. Dodaj 1 objętość kwasu-fenolu:chloroformu (pH 4,5), wiruj przez 10 s. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 min, położyć na lodzie na 1 min. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, przenieść fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Wytrącić RNA. W tym celu dodaj 1/10 objętości 3M NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg / ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Izolacja mRNA poli(A)
    1. Odwirować próbki RNA o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odkręć 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel i susz pelety na powietrzu przez 5 minut.
    2. Rozpuść osad w 300 μl buforu do lizy/wiązania z zestawu do izolacji mRNA poli(A). Przejdź do ekstrakcji mRNA poli(A) zgodnie z protokołem producenta zestawu do izolacji mRNA poli(A).
    3. Wytrącić próbki mRNA, dodając 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg / ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Fragmentacja mRNA
    1. Odwirować próbki mRNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odwiruj przez 30 sekund, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel i susz granulki na powietrzu przez 5 minut.
    2. Ponownie zawiesić mRNA w 18 μl wody wolnej od RNaz, dodać 2 μl 10x buforu fragmentacji RNA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 94°C. Przenieść rurkę do lodu.
    3. Wytrącić się, dodając 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg / ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.

4. Defosforylacja

  1. Potraktuj Footprint i pofragmentowane próbki mRNA kinazą polinukleotydową T4. W tym celu należy odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odkręć 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą żelowej końcówki ładującej. Suszyć pelety na powietrzu przez 5 minut.
  2. Zawiesić osad w 7,75 μl wody, dodać 1 μl 10x buforu kinazy polinukleotydowej T4, 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 (10 000 U/ml) i 0,25 μl inhibitora RNazy (20 U/μL). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. (Opcjonalnie) Uruchom 15% żel mocznikowy TBE przy napięciu 180 V przez 15 minut przy użyciu 1x bufora TBE.
  4. Dodaj 10 μl buforu 2X TBE-mocznik do 10 μl każdej próbki śladu i mRNA. Przygotować próbkę kontrolną zawierającą 1 μL 10 μM oligonukleotydu znacznika górnej wielkości (32 nt), 1 μL oligonukleotydu markerowego o mniejszej wielkości 10 μM (28 nt), 8 μL wody i 10 μL 2x buforu próbki TBE-mocznik dla próbek Footprint. Przygotować próbkę kontrolną zawierającą 1 μl oligonukleotydu markera 10 μM RNA (63 nt), 9 μl wody i 10 μl 2x buforu próbki TBE-mocznik dla próbek mRNA.
  5. Inkubować próbki i próby kontrolne przez 3 minuty w temperaturze 75 °C, odwirować, umieścić na lodzie na 1 minutę. Załadować każdą próbkę do 2 dołków 15% żelu TBE-mocznikowego, oddzielić fragmenty RNA za pomocą elektroforezy żelowej przy natężeniu 180 V przez 1 godzinę.
  6. Barwić żel przez 5 min barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym (rozcieńczyć 10 000x w wodzie), chronić przed światłem.
  7. Za pomocą transiluminatora światła niebieskiego przetnij odpowiednie pasmo między 28 a 32 nt markerów dla próbek odcisków stóp (Rysunek 4A) i około 50-70 nt dla próbek mRNA ( Rysunek 4B) czystą żyletką. Kawałki żelu poliakrylamidowego zamrozić w temperaturze -80 °C przez co najmniej 10 minut.
  8. Ekstrahuj RNA z żelu poliakrylamidowego w następujący sposób. Podgrzewać kawałki żelu w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, mielić żel za pomocą jednorazowych tłuczków do granulek. Eluować RNA za pomocą 300 μl buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA), dodać 1 μl inhibitora RNazy (20 U/μL) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  9. Odwirować próbkę o sile 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i wytrącić przez dodanie 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg/ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.

5. Podwiązanie adaptera 3'

  1. Odwirować próbki śladu węglowego i mRNA przy 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Spękpić 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel. Suszyć pellet na powietrzu przez 10 minut.
  2. Zawiesić osad w 4,75 μl wody wolnej od nukleaz, 2 μl 50% PEG8000, 1 μl buforu ligazy 10X T4 RNA, 1 μl adaptera 3' (100 ng / μL), 0,25 μl inhibitora RNazy (20 U / μL), 1 μl ligazy T4 RNA 2 skrócone KQ (200 000 U / ml). Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
  3. Następnego ranka usuń nadmiar adaptera, dodając 0,5 μl 5'-deadenylazy (10 U/μL) i 0,5 μl egzonukleazy Rec J (10 U/μL) bezpośrednio do reakcji ligacji. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
  4. Wytrącić próbki. W tym celu dodaj 30 μl wody wolnej od nukleaz, 1 μl glikogenu (10 mg/ml), 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.

6. Odwrotna transkrypcja

  1. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Spękpić 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel. Suszyć pellet na powietrzu przez 10 minut.
  2. Zawiesić osad w 11,5 μl wody wolnej od nukleaz, dodać 0,5 μl 8 μM startera odwrotnej transkrypcji (starter RT) i 1 μl mieszanki dNTP (10 mM). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C, umieścić na lodzie.
  3. Dodać 4 μl buforu 5X pierwszej nici, 2 μl 0,1 M DTT, 0,5 μl inhibitora RNazy (20 U/μL), 0,5 μl odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 48 °C, 1 minutę w temperaturze 65 °C, 5 minut w temperaturze 80 °C.
  4. Nie wytrącać i natychmiast przystąpić do hydrolizy RNA, dodając 0,8 μL 2M NaOH, inkubować 30 minut w temperaturze 98 °C. Dodać 0,8 μL 2M HCl w celu zobojętnienia reakcji.
  5. Wytrącić próbki. W tym celu dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz, 1 μl glikogenu (10 mg/ml), 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  6. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Spękpić 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel. Suszyć pellet na powietrzu przez 10 minut.
  7. Zawiesić osad w 5 μl wody wolnej od nukleaz, dodać 5 μl buforu do próbek 2X TBE-mocznik. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 75 °C, odwirować, umieścić na lodzie na 1 minutę.
  8. (Opcjonalnie) Uruchom wstępnie 10% żel mocznikowy TBE przy napięciu 180 V przez 15 minut, używając bufora 1X TBE.
  9. Załaduj próbkę do 1 dołka 10% żelu TBE-mocznik. Oddzielić produkty reakcji odwrotnej transkrypcji za pomocą elektroforezy żelowej pod napięciem 180 V przez 50 minut. Jako kontrolę należy przygotować próbkę zawierającą 1 μl startera 2,5 μM RT, 1 μl 2,5 μM oligonukleotydu markerowego 128 nt, 3 μl wody i 5 μl buforu do próbek 2X TBE-mocznik i uruchomić na oddzielnym torze żelu.
  10. Barwić żel przez 5 min barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym (rozcieńczyć 10 000x w wodzie), chronić przed światłem. Używając transiluminatora światła niebieskiego, przeciąć opaskę o około 128 nt i więcej (Rysunek 5) czystą żyletką. Kawałki żelu poliakrylamidowego zamrozić w temperaturze -80 °C przez co najmniej 10 minut.
  11. Podgrzej kawałki żelu w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, zmiel żel za pomocą jednorazowych tłuczków do granulek. Wypłukać DNA za pomocą 300 μl 20 mM Tris-HCl o pH 7,0 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  12. Odwirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i wytrącić, dodając 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg/ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.

7. Cyrkularyzacja

  1. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odkręć 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel i susz granulat na powietrzu przez 10 minut.
  2. Zawiesić osad w 16,75 μl wody wolnej od nukleaz. Dodać 2 μl 10x buforu ligazy jednoniciowego DNA (ssDNA), 1 μL 50 mM MnCl2, 0,25 μL ligazy ssDNA (100 U/μL). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C, 10 minut w temperaturze 80 °C. Nie wytrącać i przechowywać produkt reakcji ligacji ssDNA w temperaturze -20 °C.

8. Wzmocnienie biblioteki PCR

  1. Podczas pracy z lodem wymieszaj w probówce PCR: 146 μL wody wolnej od nukleaz, 2 μL 20 μM startera Forward, 2 μL 20 μM indeksowanego startera odwrotnego, 40 μL 5x buforu plymerazy DNA o wysokiej wierności, 4 μL dNTPs (10 mM), 4 μL produktu reakcji ligacji ssDNA, i 2 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności. Wybierz inny indeksowany starter odwrotny dla każdej próbki, która zostanie zmultipleksowana w celu sekwencjonowania. Przenieść 50 μl podwielokrotności mieszaniny PCR do 4 nowych probówek do PCR.
  2. Wykonaj amplifikację PCR z różną liczbą cykli (8, 10, 12, 14) przy użyciu następujących ustawień:
    1 min w 98 °C początkowej denaturacji
    8 do 14 cykli:
    15 s w 94 °C
    5 s przy 55 °C
    10 s przy 65 °C
    2 min przy 65 °C przedłużeniu końcowym
  3. Wytrącić produkt PCR, dodając 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg / ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  4. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odkręć 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel i wysusz granulkę na powietrzu.
  5. Zawiesić osad w 8 μl wody wolnej od nukleaz, dodać 2 μl niedenaturującego 5x buforu próbki kwasu nukleinowego. Załadować próbkę do 1 dołka niedenaturującego 8% żelu TBE. Oddzielić produkty DNA za pomocą elektroforezy żelowej pod napięciem 150 V przez 35 minut. Jako kontrolę przygotuj próbkę zawierającą 0,5 μl drabinki DNA o stężeniu 10 pz (1 μg/μl), 7,5 μl wody i 2 μl niedenaturującego 5x buforu próbki kwasu nukleinowego i uruchom na oddzielnym torze żelu.
  6. Barwić żel przez 5 min barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym (rozcieńczyć 10 000x w wodzie), chronić przed światłem. Używając transiluminatora światła niebieskiego, przeciąć pasmo o około 150 pz dla próbek śladów stóp i około 180 pz dla próbek mRNA (Rysunek 6) czystą żyletką. Przechowywać kawałki żelu w temperaturze -80 °C przez co najmniej 10 minut.
  7. Podgrzewać kawałki żelu w temperaturze 70 °C przez 2 minuty, mielić żel za pomocą jednorazowych tłuczków do granulek. Wypłukać DNA za pomocą 300 μl 20 mM Tris-HCl o pH 7,0 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  8. Odwirować próbkę przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i wytrącić, dodając 1/10 objętości NaOAc (pH 5,5), 1/100 objętości glikogenu (10 mg/ml) i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  9. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, usunąć etanol. Odkręć 30 s z maksymalną prędkością, usuń resztę etanolu za pomocą końcówki ładującej żel i wysusz granulkę na powietrzu. Na koniec ponownie zanurz biblioteki w 20 μl wody wolnej od nukleaz i przejdź do kwantyfikacji, kontroli jakości i sekwencjonowania.

9. Kwantyfikacja biblioteki i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

  1. Przed wysłaniem próbek do sekwencjonowania należy określić wydajność i jakość bibliotek amplifikowanych PCR. Reprezentatywne profile dla bibliotek sekwencjonowania śladów i mRNA są pokazane na Rysunek 7. Oczekiwany rozmiar biblioteki amplifikowanej PCR wynosi 148-152 pz dla próbek Footprint i 170-190 pz dla próbek mRNA.
  2. Jeśli kilka próbek z różnymi kodami kreskowymi zostanie połączonych w celu sekwencjonowania, należy przeprowadzić dokładną kwantyfikację bibliotek za pomocą testu ilościowego biblioteki sekwencjonowania opartego na qPCR.
  3. Połącz biblioteki w proporcjach równomolowych. Obliczyć całkowitą objętość próbki zbiorczej jako 3 μl x całkowita liczba próbek, które mają zostać połączone. Określ objętość każdej biblioteki, która musi zostać dodana, tak aby biblioteki były mieszane w proporcjach równomolowych w celu uzyskania końcowego stężenia puli 10 nM. Dodaj obliczone objętości z każdej biblioteki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, mieszaj pipetując. Dodaj wodę, aby uzyskać obliczoną całkowitą objętość. Przechowuj biblioteki w puli w temperaturze -20 °C.
  4. Wyślij podwielokrotność biblioteki w puli do sekwencjonowania przy użyciu sekwencjonowania pojedynczego końca 50 bp na platformie sekwencjonowania Illumina. Rutynowo multipleksujemy 12 próbek w jednym cyklu sekwencjonowania, co daje ~ 200 milionów odczytów na linię sekwencjonowania.
    UWAGA: Ostateczna liczba odczytów śladów stóp zebranych dla każdej próbki zależy od ilości materiału wejściowego i poziomu zanieczyszczenia rRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowe procedury analizy bioinformatycznej danych profilowania rybosomów zostały opisane wcześniej 8,9. Ponadto kilka grup badawczych opracowało narzędzia bioinformatyczne do różnicowej analizy ekspresji genów i przetwarzania danych sekwencjonowania, które są specyficzne dla metody profilowania rybosomów 10,11,12,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podejście Ribo-Seq okazało się potężną technologią do analizy translacji mRNA in vivo na poziomie całego genomu 3. Badania wykorzystujące to podejście, które umożliwia monitorowanie translacji z rozdzielczością pojedynczego kodonu, przyczyniły się do naszego zrozumienia regulacji translacji. Pomimo swoich zalet, Ribo-Seq ma kilka ograniczeń. Fragmenty rybosomalnego RNA (rRNA) są zawsze oczyszczane podczas izolacji śladów chronionych przez rybosom, co zmniejsza wydajność użytecznych odczyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health granty AG040191 i AG054566 dla VML. Badania te zostały przeprowadzone, gdy VML był laureatem grantu badawczego AFAR od Amerykańskiej Federacji Badań nad Starzeniem się.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ Filtry membranoweM MilliporeHVLP04700
0,5 M EDTAInvitrogenAM9261
0,5 mL filtry odśrodkowe (100 kDa MWCO)MiliporyUFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7,0InvitrogenAM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 przy 4° C)Invitrogen15567-027
10X Bufor TBEInvitrogenAM9863
10% żel mocznikowy TBEInvitrogenEC6875BOX
15% żel mocznikowy TBEInvitrogenEC6885BOX
2 M MgCl2RPIM24500-10.0
2X Bufor do próbek TBE-mocznikaInvitrogenLC6876
3M NaOAc, pH 5,5InvitrogenAM9740
5' Deadenylaza (10 U/μ L)EpicentrumDA11101K
5X Bufor do ładowania próbki kwasu nukleinowegoBio-Rad161-0767
8% żel TBEInvitrogenEC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
Nadajnik światła niebieskiegoClare Chemical ResearchDR-46B
Koraliki ze stali chromowej, 3,2 mmBioSpec Products11079132c
CryogrinderBiospec produkt3110BX
CykloheksymidRPIC81040-5.0
System akwizycji danychDATAQ InstrumentsDI-245
Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM)NEBN0447L
GlikogenInvitrogenAM9510
System frakcjonowania gradientowegoBrandelBR-184X
Polimeraza DNA o wysokiej wierności (2,000 U/ml)NEBM0530SDostarczany z 5X Phusion HF Buffer
Zestaw do kwantyfikacji biblioteki sekwencjonowania nowej generacjiKapa BiosystemsKK4824
Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymUltrawirówka InvitrogenS11494
Optima XE-90Beckman CoulterA94471
Zestaw do izolacji mRNA Poly(A)Invitrogen61011
Rec J egzonukleaza (10 U/μ L)EpicentrumRJ411250
Odwrotna transkryptaza (200 U/μ L)Invitrogen18080093Dostarczany z 5-krotnym buforem pierwszej nici i 0,1 M
buforem fragmentacyjnym DTT RNANEBE6186A
RNaza I (100 U/μ L)InvitrogenAM2295
(20 U/μ L)InvitrogenAM2696
Nakładki z gumy silikonowejBioSpec Products2008
ligaza ssDNA (100 U/μ L)EpicentrumCL9021KDostarczane z 10X buforem CircLigase II i 50 mM MnCl2
Fiolki ze stali nierdzewnej, 1,8 mlProdukty BioSpec2007
SacharozaRPIS24060-5000.0
SW-41 Ti RotorBeckman Coulter331362
Pompa strzykawkowaNew Era Systemy pompoweNE-300
Kinaza polinukleotydowa T4 (10 000 U / ml)NEBM0201S Dostarczanaz 10X buforem kinazy polinukleotydowej T4
Ligaza T4 RNA 2 skrócona KQ (200 000 U / mL)NEBM0373S Dostarczanaz 10X buforem ligazy RNA T4 i 50% PEG8000
TermocyklerBio-Rad1851148
Cienkościenne probówki poliallomerowe, 13,2 mlBeckman Coulter331372
Triton X-100Monitor UV Sigma AldrichX100-100ML
Bio-Rad7318160
Saccharomyces cerevisiae szczep BY4741Open BiosystemsYSC1048
Inhibitor RNazy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
  3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
  5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
  8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
  10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
  11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
  12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194(2016).
  13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
  14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309(2016).
  15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).
  16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
  17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
  18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
  24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
  28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
  29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
  30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).
  31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).
  32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kwantyfikacja translacjifrakcjonowanie w gradiencie sacharozytrawienie nukleazprzygotowanie biblioteki RNAsekwencjonowanie g bokiewydajno translacjiobfito mRNAanaliza w skali ca ego genomu

Powiązane artykuły