Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Celem tej pracy jest pokazanie nowej metody oceny zdolności niektórych cząsteczek immunomodulujących, takich jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP), do stymulowania migracji komórek. Co ważne, migracja komórek jest zdarzeniem ograniczającym szybkość procesu gojenia się ran w celu przywrócenia integralności i normalnego funkcjonowania warstw tkanek po urazie. Przewagą tej metody nad klasycznym testem, który opiera się na ręcznym zarysowaniu monowarstwy komórki, jest zastosowanie specjalnych silikonowych wkładek hodowlanych zapewniających dwie komory w celu wytworzenia bezkomórkowego pseudo-nawiniętego pola o dobrze zdefiniowanej szerokości (500 μm). Ponadto, dzięki zautomatyzowanej platformie analizy obrazu, możliwe jest szybkie uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości zamykania się ran i migracji komórek. Dokładniej rzecz ujmując, pokazany zostanie wpływ dwóch AMP ze skóry żaby na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Co więcej, wstępne potraktowanie tych komórek specyficznymi inhibitorami dostarczy informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw takich zdarzeń.
Wprowadzenie
Powszechnie wiadomo, że gojenie się ran u zwierząt jest podstawowym procesem przywracania integralności i normalnej funkcji warstw tkanek po urazie1. Pomimo tego, że powierzchnie nabłonkowe narażone na działanie środowiska zewnętrznego (np. skóra, drogi oddechowe i pokarmowe) tworzą barierę ochronną przed urazami fizycznymi i chemicznymi, łatwo może dojść do powstania ran, zwłaszcza po zabiegach chirurgicznych lub infekcjach bakteryjnych2. Na przykład kolonizacja tkanki płucnej przez oportunistyczny patogen bakteryjny Pseudomonas aeruginosa, zwłaszcza u osób cierpiących na mukowiscydozę (CF), prowadzi do uszkodzenia nabłonka dróg oddechowych, a w konsekwencji do niewydolności oddechowej3,4. Gojenie się ran to złożony mechanizm naprawy gospodarza mający na celu przywrócenie normalnej architektury uszkodzonej tkanki5. Charakteryzuje się początkowym stanem zapalnym, po którym następuje okres regeneracji obejmujący nabłonkowanie, angiogenezę i przebudowę tkanek z produkcją kolagenu i różnicowaniem komórek6,7,8. Aby zapewnić integralność nabłonka i kontrolować proliferację drobnoustrojów, wszystkie żywe organizmy wytwarzają cząsteczki obronne, w tym peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP)9,10. Proces gojenia się ran jest bardzo trudny do symulacji in vitro ze względu na brak resztek komórkowych i złożone interakcje między różnymi typami komórek. Jednak zdolność peptydu do przyspieszania zamykania pseudorany poprzez stymulowanie migracji komórek nabłonka in vitro wskazuje na jego zdolność do gojenia uszkodzonego nabłonka. Rzeczywiście, migracja komórek jest zdarzeniem ograniczającym szybkość gojenia się ran, a badanie czynników, które mogą wpływać na migrację komórek, pomoże ukierunkować terapie w celu poprawy gojenia się ran.
Tutaj dostępny jest wysoce powtarzalny test eksperymentalny oparty na specjalnych wkładkach do hodowli silikonowych do oceny migracji komórek in vitro. Polega ona na utworzeniu szczeliny o wielkości 500 μm (pseudo-nawiniętej) na zlewającej się monowarstwie komórek. Komórki na skraju sztucznego "zranionego" pola zaczną migrować do obszaru wolnego od komórek, tworząc nowe kontakty komórka-komórka. Wkładka hodowlana stanowi nowe narzędzie do eksperymentów z szybkim gojeniem się ran. Zapewnione są dwa zbiorniki oddzielone ścianką o grubości 500 μm, które można odpowiednio umieścić w 3-centymetrowej płytce talerzowej lub w studzience płytki 12-dołkowej. Wypełnienie każdej komory wkładki zawiesiną komórek pozwala komórkom rosnąć w każdym wyznaczonym obszarze aż do zbiegu, podczas gdy usunięcie wkładki spowoduje powstanie czystej, wolnej od komórek szczeliny około 500 μm (tej samej szerokości co ściana separacyjna). Odpowiednią pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną badanym związkiem można następnie dodać do płytki/dołka naczynia. Następnie zamknięcie szczeliny można uwidocznić w różnych odstępach czasu pod mikroskopem odwróconym, najlepiej wyposażonym w kamerę wideo do akwizycji obrazu. Wreszcie, pomiar zmian w obszarze pokrytym komórką za pomocą internetowego automatycznego programu do analizy obrazu pozwoli na ilościowe określenie szybkości zamykania się ran i migracji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest krokiem naprzód w stosunku do klasycznego testu, w którym rysa jest wykonywana ręcznie poprzez nacinanie monowarstw zbiegających się komórek za pomocą sterylnej igły lub końcówki pipety11. Rzeczywiście, ostatnia procedura może zniszczyć plastikowe dno talerza/studzienki naczynia i powłokę powierzchniową, tworząc zmarszczki. Ponadto obszar "zraniony" nie ma dobrze zdefiniowanej szerokości na całej długości szczeliny, ponieważ zależy to w dużym stopniu od nacisku wywieranego przez badaczy na igłę/końcówkę. Co więcej, przemieszczone komórki mogą tworzyć skupiska żywych i martwych komórek na krawędziach zadrapania; Co więcej, rozprzestrzenianie się żywych komórek w "zranionym" obszarze może zakłócać prędkość migracji komórek, generując niepowtarzalne wyniki12.
Ponadto, dzięki platformie do analizy obrazów scratch, użytkownicy mogą szybko otrzymać (w ciągu kilku minut) dane ilościowe na temat migracji wybranych komórek bez konieczności nabywania dodatkowego oprogramowania. Platforma ta jest w stanie analizować obrazy z mikroskopii kontrastu fazowego o małym (~5X), średnim (~10X) i dużym (~20X) powiększeniu. Po przesłaniu pliku zip z obrazami (w formacie *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff) analiza jest automatycznie przeprowadzana w celu wygenerowania pliku podsumowującego, który pokazuje procent zarówno obszarów pokrytych komórkami, jak i obszarów zarysowań, a także szybkość migracji komórek, w różnych odstępach czasu.
W tej pracy, przy użyciu pochodnej AMP ze skóry żaby, tj. Esc(1-21) i jego diastereomeru Esc(1-21)-1c13, oraz linii komórkowej oskrzeli wyrażającej funkcjonalny transbłonowy regulator przewodnictwa CF (CFTR)14,15, podano przykład migracji komórek wywołanej peptydem w porównaniu z próbkami nietraktowanymi (kontrolnymi). Należy pamiętać, że nabłonek dróg oddechowych i CFTR odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji płuc i gojeniu ran16. Ponadto, za pomocą selektywnych inhibitorów (np. AG1478)17 receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), przedstawiono dowody na to, że migracja komórek oskrzeli indukowana przez wyżej wymienione peptydy wiąże się z aktywacją EGFR12,18.
Podsumowując, celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób użycie takich silikonowych wkładek do hodowli stanowi szybki i łatwo dostępny test do dokładnego określenia migracji przylegających komórek (np. komórek nabłonka oskrzeli) i mechanizmów molekularnych kontrolujących takie zdarzenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Wysiać 2,5x106 komórek w 10 mL Minimum Essential Medium (MEM) uzupełnionego o 2 mM glutaminy (MEMg), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), antybiotyki (0,1 mg/mL penicyliny i streptomycyny) oraz puromycynę (0,5 µg/mL do selekcji i utrzymania linii komórkowej) do kolby T75. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdzić konfluencję komórek pod mikroskopem odwróconym.
UWAGA: Komórki użyte w eksperymencie to unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka oskrzeli transdukowane wektorem lentiwirusowym nadającym oporność na puromycynę. Stabilnie ekspresjonują one funkcjonalny CFTR14,15. - Gdy konfluencja komórek osiągnie 90-100%, odessać medium z kolby i wylać je do butelki na odpady w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Przemyć komórki 6 mL roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym bez jonów wapnia i magnezu (CMF-PBS). Delikatnie potrząsnąć kolbą ręcznie i odlać CMF-PBS.
UWAGA: Należy uważać, aby nie dotknąć monowarstwy komórek pipetą. - Dodać 10 mL CMF-PBS i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min.
- Odessać CMF-PBS i go wylać. Następnie dodać do kolby 2 mL trypsyny/EDTA.
- Delikatnie potrząsnąć kolbą, aby roztwór całkowicie pokrył komórki, i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 10 min, aż komórki zostaną widocznie oderwane pod mikroskopem.
UWAGA: Po czasie inkubacji komórki powinny stać się okrągłe i nie być przytwierdzone do plastikowej powierzchni. Jeśli komórki nie są dobrze oderwane, może być konieczne ręczne wytrząśnięcie. - Dodać 10 mL MEMg z 10% FBS w celu inaktywacji trypsyny i zebrać komórki, przemywając dno kolby. Przenieść zawiesinę do stożkowatej probówki 50 mL.
- Wirować probówkę przez 5 min przy 80 x g.
- Odessać nadsącz i resuspendować komórki w 6 mL MEMg z 10% FBS. Pipetować wielokrotnie, aby rozbić wszelkie aglomeraty.
- Pobrać 10 µL zawiesiny komórkowej mikropipetą i wstrzyknąć tę objętość pod szkiełko nakrywkowe uprzednio umieszczone nad komorą Burkera lub Neubauera.
- Policzyć liczbę komórek.
2. Wysiew komórek do insertów hodowlanych
- Do każdego dołka płytki 12-dołkowej przenieś wkład kulturkowy za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 1). Użyj pęsety, aby docisnąć krawędzie wkładów w celu ich utrwalenia na powierzchni płytki.
UWAGA: Wkłady posiadają klejącą stronę dolną, która umożliwia adhezję.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie silikonowych insertów hodowlanych, prawidłowo umieszczonych w dołkach płytki 12-dołkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę komórek w MEMg z dodatkiem 10% FBS. Napełnić każdą komorę wkładki 70 µL zawiesiny komórek (około 3,5x104 komórek/komorę).
UWAGA: Gęstość komórek nanoszonych do każdej komory zależy od rodzaju komórek. Zaleca się zastosowanie takiej gęstości komórek, która doprowadzi do pełnej konfluencji w ciągu 24 h. - Pod mikroskopem sprawdzić, czy komórki nie wyciekają z komór wkładki, a następnie inkubować płytkę 12-dołkową przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
3. Test pseudo-gojenia ran
- Po inkubacji należy zwizualizować komórki pod mikroskopem odwróconym, aby zweryfikować, czy utworzyły się konfluentne monowarstwy komórek.
- Resuspendować związki testowe (np. AMP) w 1 mL MEMg.
UWAGA: Przygotować świeże rozcieńczenia AMP z roztworu zapasowego przechowywanego w -20 °C. - Ostrożnie usunąć wkłady za pomocą sterylnej pęsety. Należy uważać, aby nie przerwać monowarstw komórek. Przenieść wkłady na papier chłonny.
UWAGA: Aby ponownie wykorzystać te same wkłady, należy je wysterylizować w 70% etanolu przez co najmniej 3 h. Zaleca się ich późniejszą utylizację. - Aby usunąć nieprzylegające komórki, dodać 1 mL MEMg na dołek za pomocą mikropipety. Zamknąć płytkę i delikatnie nią potrząsać.
UWAGA: Nie dodawać pożywki bezpośrednio na monowarstwy komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia. - Odssać pożywkę i zastąpić ją 1 mL MEMg na dołek. Zamknąć płytkę i zwizualizować wolne od komórek przerwy (powstałe w wyniku usunięcia wkładów) pod mikroskopem odwróconym przy powiększeniu 4X, wyposażonym w kamerę wideo. Pozyskać obrazy w czasie zero (T0) i zapisać je w formacie .jpg.
- Usunąć pożywkę z dołków, przemyć je 1 mL PBS, a następnie odrzucić roztwór.
- Dodać do dołków związki testowe (przygotowane w punkcie 3.2). W przypadku nieleczonych próbek kontrolnych dodać 1 mL MEMg. Inkubować płytkę w 37 °C i 5% CO2.
- Po 15, 20 i 24 h traktowania obserwować migrację komórek pod mikroskopem przy powiększeniu 4X i pozyskać obrazy.
UWAGA: Na tym etapie należy starać się rejestrować obrazy w tych samych obszarach, co dla T0. Wybór odstępów czasowych, w których rejestrowane są obrazy, zależy od prędkości migracji komórek. - Aby zbadać wpływ niektórych selektywnych inhibitorów, tzn. AG1478, na migrację komórek, należy odessać pożywkę z każdego przedziału wkładu przed ich usunięciem.
- Przemyć każdy przedział świeżym MEMg i napełnić go 70 µL MEMg uzupełnionego o AG1478.
- Po 30 min inkubacji w 37 °C i 5% CO2 postępować zgodnie z opisem od punktu 3.3.
UWAGA: Podczas etapu płukania i wstępnego traktowania monowarstw komórek specyficznymi inhibitorami należy uważać, aby nie usunąć wkładów.
4. Analiza obrazu
- Po zakończeniu eksperymentu wybierz obrazy najbardziej reprezentatywnych próbek z poszczególnych grup eksperymentalnych i utwórz plik zip zawierający pojedyncze obrazy dla punktów czasowych T0, T15, T20 i T24 h.
UWAGA: Pojedyncze obrazy są pobierane w wybranych odstępach czasu dla wszystkich próbek. Każdy eksperyment należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach, a cały proces powtórzyć co najmniej trzy razy. Na koniec, dla wszystkich grup eksperymentalnych, analizuje się minimum 3 obrazy („a”, „b”, „c”, itp., pochodzące z każdego niezależnego eksperymentu) dla każdego punktu czasowego. - Prześlij plik zip do oprogramowania do analizy obrazu, które automatycznie prześle pocztą elektroniczną plik z podsumowaniem w arkuszu kalkulacyjnym, zawierający dane eksperymentalne dotyczące obszarów pokrytych komórkami oraz obszarów zadrapania (wyrażone w procentach) w wybranych punktach czasowych.
UWAGA: Rozpoznawanie krawędzi czoła migracji oraz obszaru luki opiera się w dużej mierze na metodzie detekcji krawędzi (mającej na celu identyfikację punktów, w których jasność obrazu gwałtownie się zmienia). - Zapisz i zgromadź dane. Znormalizuj wszystkie dane względem wartości średniej w czasie zero. Oblicz średnią wartość znormalizowanych danych dla wszystkich powtórzeń w każdym punkcie czasowym oraz względny błąd standardowy (SEM). Wykorzystując dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA), przeprowadź analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Różnice między grupami traktowanymi peptydami a grupami kontrolnymi w różnych odstępach czasu uznaje się za istotne statystycznie dla p<0.05.
- Przedstaw uzyskane dane na wykresie w formie histogramu, który obrazuje procent obszaru pokrytego komórkami dla wszystkich grup próbek w funkcji wybranych odstępów czasu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół został wykorzystany do określenia wpływu Esc(1-21) oraz Esc(1-21)-1c na gojenie ran w kontekście aktywności migracyjnej komórek nabłonka oskrzeli wykazujących ekspresję funkcjonalnego CFTR. W tym badaniu w dołkach płytki 12-dołkowej umieszczono wkłady hodowlane, a do każdej komory zasiano 35 000 komórek w pożywce MEMg uzupełnionej o 10% FBS. Komórki osiągnęły pełną konfluencję w ciągu 24 h. Następnie utworzono przerwę o szerokości 500 μm, a każdy dołek wypełniono pożywk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Migracja komórek jest niezbędnym procesem w wielu zdarzeniach fizjologicznych i patologicznych, w tym w gojeniu się ran, rozwoju embrionalnym i przerzutach raka. Podstawowa procedura badania migracji komórek in vitro obejmuje: (i) stworzenie monowarstwy komórki, (ii) wytworzenie pseudo-rany w zlewającej się warstwie komórek, (iii) przechwytywanie obrazów w różnych odstępach czasu, aż do osiągnięcia zamknięcia rany, oraz (iv) analizę sekwencji obrazu w celu ilościowego określenia prędkości migracji wybranych komó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Ta praca została wsparta przez fundusze Uniwersytetu Sapienza w Rzymie i Włoskiej Fundacji Badań nad Mukowiscydozą (Projekt FFC#11/2014 przyjęty przez delegacje FFC ze Sieny, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny i Pawii). Część tych prac była również wspierana przez FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Jesteśmy wdzięczni dr Loretcie Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genua, Włochy) za dostarczenie komórek nabłonka oskrzeli.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Minimalna ilość niezbędnego podłoża (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem |
| Glutamina | Euroclone | ECB3000D | |
| Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicylina i streptomycyna | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsyna/EDTA 1X w PBS | Euroclone | ECB3052D | Przed użyciem ogrzać w temperaturze pokojowej |
| DPBS bez wapnia i magnezu (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS z wapniem i magnezem (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 dołki | Ibidi | 80209 | |
| Analiza obrazu Wimasis | Ibidi | 30002 | |
| Oprogramowanie PRISM | GraphPad | w wersji 6.0 |
Bibliografia
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663(2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
