Method Article

Solidna izolacja DNA i wysokoprzepustowa budowa biblioteki sekwencjonowania dla okazów zielnikowych

DOI:

10.3791/56837

⸱

March 8th, 2018

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł demonstruje szczegółowy protokół izolacji DNA i budowy biblioteki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości z materiału zielnikowego, w tym ratowania wyjątkowo niskiej jakości DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zioła są nieocenionym źródłem materiału roślinnego, który może być wykorzystany w różnych badaniach biologicznych. Korzystanie z okazów zielnikowych wiąże się z wieloma wyzwaniami, w tym jakością konserwacji próbek, zdegradowanym DNA i destrukcyjnym pobieraniem próbek rzadkich okazów. Aby efektywniej wykorzystać materiał zielnikowy w dużych projektach sekwencjonowania, potrzebna jest niezawodna i skalowalna metoda izolacji DNA i przygotowania biblioteki. W artykule przedstawiono solidny, kompleksowy protokół izolacji DNA i wysokoprzepustowej budowy biblioteki z okazów zielnikowych, który nie wymaga modyfikacji dla poszczególnych próbek. Protokół ten jest dostosowany do suszonego materiału roślinnego o niskiej jakości i wykorzystuje istniejące metody, optymalizując mielenie tkanek, modyfikując wybór rozmiaru biblioteki i wprowadzając opcjonalny krok reamplifikacji dla bibliotek o niskiej wydajności. Ponowna amplifikacja bibliotek DNA o niskiej wydajności może uratować próbki pochodzące z niezastąpionych i potencjalnie cennych okazów zielnikowych, negując potrzebę dodatkowego destrukcyjnego pobierania próbek i bez wprowadzania dostrzegalnego odchylenia sekwencjonowania dla powszechnych zastosowań filogenetycznych. Protokół został przetestowany na setkach gatunków traw, ale oczekuje się, że po weryfikacji będzie można go dostosować do stosowania w innych liniach roślin. Protokół ten może być ograniczony przez skrajnie zdegradowane DNA, w którym fragmenty nie występują w pożądanym zakresie wielkości, oraz przez metabolity wtórne obecne w niektórych materiałach roślinnych, które hamują izolację czystego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten wprowadza szybką i kompleksową metodę, która pozwala na izolację DNA i przygotowanie biblioteki 24 próbek w mniej niż 13 godzin, przy zaledwie 8 godzinach aktywnego czasu pracy przy minimalnych modyfikacjach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolekcje zielników są potencjalnie cennym źródłem zarówno różnorodności gatunkowej, jak i genomowej dla badań, w tym filogenetyki1,2,3, genetyka populacji4,5, biologia konserwatorska6, biologia gatunków inwazyjnych7, oraz ewolucja cech8. Możliwość uzyskania bogatej różnorodności gatunków, populacji, lokalizacji geograficznych i punktów czasowych podkreśla "skrzynię skarbów"9, która jest zielnikiem. Historycznie rzecz biorąc, zdegradowany charakter DNA pochodzącego z zielnika utrudniał projekty oparte na PCR, często zmuszając badaczy do używania tylko markerów znalezionych w wysokiej kopii, takich jak regiony genomu chloroplastowego lub wewnętrzna transkrybowana ramka dystansowa (ITS) rybosomalnego RNA. Jakość próbek i DNA różni się znacznie w zależności od metod konserwacji9,10, przy czym najczęstszymi formami uszkodzeń są dwuniciowe pęknięcia i fragmentacja od ciepła używanego w procesie suszenia, tworzące tzw. 90% blokadę DNA, która obciążyła badania oparte na PCR11. Oprócz fragmentacji, drugim najczęstszym problemem w genomice zielnika jest zanieczyszczenie, takie jak to pochodzące od grzybów endofitycznych13 lub grzybów nabytych po pobraniu, ale przed zamontowaniem w zielniku12, chociaż ten problem można rozwiązać bioinformatycznie, korzystając z odpowiedniej bazy danych grzybów (patrz poniżej). Trzecim, rzadziej występującym problemem, jest modyfikacja sekwencji poprzez deaminację cytozyny (C/G→T/A)14, chociaż szacuje się, że jest ona niska (~0,03%) w próbkach zielnikowych11. Wraz z pojawieniem się sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (HTS), problem fragmentacji można przezwyciężyć za pomocą krótkich odczytów i głębokości sekwencjonowania12,15, co pozwala na pozyskiwanie danych na poziomie genomu z wielu próbek o niskiej jakości DNA, a czasami nawet pozwala na sekwencjonowanie całego genomu15.

Próbki z zielnika stają się coraz częściej używane i stanowią większy element projektów filogenetycznych16. Obecnym wyzwaniem związanym z wykorzystaniem próbek zielnikowych do HTS jest konsekwentne uzyskiwanie wystarczającej ilości dwuniciowego DNA, co jest niezbędnym warunkiem wstępnym dla protokołów sekwencjonowania, od wielu gatunków w odpowiednim czasie, bez konieczności optymalizacji metod dla poszczególnych okazów. W artykule przedstawiono protokół ekstrakcji DNA i przygotowania biblioteki próbek zielnikowych, który wykorzystuje istniejące metody i modyfikuje je, aby umożliwić szybkie i powtarzalne wyniki. Metoda ta pozwala na pełne przetworzenie od próbki do biblioteki 24 próbek w ciągu 13 godzin, przy 8 godzinach czasu pracy, lub 16 godzin, przy 9 godzinach czasu pracy, gdy wymagany jest opcjonalny etap reamplifikacji. Jednoczesne przetwarzanie większej liczby próbek jest osiągalne, chociaż czynnikiem ograniczającym jest wydajność wirówki i umiejętności techniczne. Protokół został zaprojektowany tak, aby wymagał tylko typowego sprzętu laboratoryjnego (termocykler, wirówka i stojaki magnetyczne) zamiast specjalistycznego sprzętu, takiego jak nebulizator lub sonikator, do ścinania DNA.

Jakość DNA, rozmiar fragmentu i ilość są czynnikami ograniczającymi wykorzystanie próbek zielnika w eksperymentach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Inne metody izolowania DNA zielnika i tworzenia wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania wykazały użyteczność użycia zaledwie 10 ng DNA16; wymagają jednak eksperymentalnego określenia optymalnej liczby cykli PCR wymaganych do przygotowania biblioteki. Staje się to niepraktyczne, gdy mamy do czynienia z niezwykle małymi ilościami żywotnego dwuniciowego DNA (dsDNA), ponieważ niektóre okazy zielnikowe wytwarzają tylko tyle DNA, ile można przygotować w jednej bibliotece. Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje pojedynczą liczbę cykli niezależnie od jakości próbki, dzięki czemu żadne DNA nie jest tracone na etapach optymalizacji biblioteki. Zamiast tego krok reamplifikacji jest wywoływany, gdy biblioteki nie spełniają minimalnych ilości potrzebnych do sekwencjonowania. Wiele próbek zielnikowych jest rzadkich i zawiera niewiele materiału, co w wielu przypadkach utrudnia uzasadnienie destrukcyjnego pobierania próbek. Aby temu przeciwdziałać, zaprezentowany protokół pozwala na wprowadzenie danych wejściowych dsDNA o rozmiarach mniejszych niż 1,25 ng w procesie przygotowania biblioteki, rozszerzając zakres żywotnych próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i minimalizując potrzebę destrukcyjnego pobierania próbek próbek.

Poniższy protokół został zoptymalizowany dla traw i przetestowany na setkach różnych gatunków z próbek zielnika, chociaż spodziewamy się, że protokół może być zastosowany do wielu innych grup roślin. Obejmuje opcjonalny etap odzyskiwania, który można wykorzystać do uratowania rzadkich okazów o niskiej jakości i/lub rzadkich. Opierając się na ponad dwustu przetestowanych próbkach zielnikowych, protokół ten działa na okazach o niskim wkładzie tkankowym i jakości, pozwalając na zachowanie rzadkich okazów poprzez minimalne destrukcyjne pobieranie próbek. Tutaj pokazano, że protokół ten może zapewnić wysokiej jakości biblioteki, które można sekwencjonować dla projektów opartych na filogenomice.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przed rozpoczęciem

  1. Przygotuj świeży bufor bromku trimetyloamoniowego (CTAB) < klasa sup = "xref">17 dodając razem 20 g CTAB, 10 g poliwinylopirolidonu (PVP) 40, 100,0 ml 1 M Tris pH 8,0, 40 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) pH 8,0, 280,0 ml 5 M NaCl i 400,0 ml wody odczynnika i doprowadź całkowitą objętość do 1 litra za pomocą wody z odczynnikiem. Dostosuj pH do 8,0,
    UWAGA: Do CTAB można dodawać dodatkowe odczynniki w zależności od związków drugorzędowych w poszczególnych taksonach. Patrz Allen i wsp.18 dla dokładnej listy odczynników dodatkowych.
  2. Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu na 5 ml buforu CTAB.
    UWAGA: można go przygotować w partiach po 50 ml i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 3-4 tygodnie.
    1. Podgrzać roztwór CTAB w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.
  3. Schładzać moździerze i tłuczki w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut.
  4. Oznaczyć 4 zestawy po 2 x n probówek o pojemności 2 ml (gdzie n = liczba próbek). Połóż 1 zestaw oznaczonych tubek na lodzie.
  5. Schłodzić izopropanol na lodzie lub w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  6. Wyjmij kulki odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) (patrz Tabela materiałów) z lodówki i pozwól im zrównoważyć się do temperatury pokojowej (co najmniej 30 min).
  7. Przygotuj 80% etanolu.
  8. Wybierz próbki zielnikowe do ekstrakcji i pobierz ~1 cm2 lub 10 mg tkanki na próbkę, najlepiej materiał liściowy.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Zmiel ~1cm2 wstępnie wybranej tkanki zielnikowej za pomocą schłodzonych moździerzy i tłuczków. Dodaj ciekły azot i 30–50 mg wysterylizowanego piasku. Zmielić, aż tkanka zamieni się w drobny proszek.
    UWAGA: Pożądane jest 10 mg lub więcej tkanki, ale w niektórych przypadkach zadziałało również mniej. Gdy ciekły azot odparuje, dodaj więcej w razie potrzeby, aż tkanka zostanie całkowicie zmielona. Inną powszechną metodą rozbijania komórek i tkanek jest użycie ubijaka do koralików. Stwierdzono jednak, że ta metoda nie działa dobrze w przypadku próbek użytych w tych eksperymentach.
  2. Przenieść zamrożony proszek do dwóch probówek o pojemności 2 ml (dodać nie więcej niż połowę objętości probówki). Dodać 600 μl ciepłego roztworu CTAB do każdej probówki i dokładnie wymieszać probówki przez inwersję i wirowanie.
    UWAGA: Ponieważ ilość i jakość materiału zielnikowego jest często niska, wykonanie izolacji DNA w dwóch powtórzeniach pomaga uzyskać wyższe plony.
  3. Próbki należy inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 1–1,5 godziny, wirując co 15 minut.
  4. Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do świeżego zestawu oznakowanych probówek (~500 μL). Wyrzucić osad zgodnie ze standardową procedurą usuwania bez chloru.
  5. Dodać 4 μl RNazy-A (10 mg/ml) do każdej probówki i wymieszać przez odwrócenie lub pipetowanie. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej przez 15 minut.
  6. Dodaj równą objętość (~500 μl) mieszaniny fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego w proporcji 25:24:1, gdy probówki osiągną temperaturę pokojową. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół i/lub z odwróceniem. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 15 minut. Przenieś warstwę wodną (górną warstwę) do świeżego zestawu oznakowanych probówek (~400 μL). Wyrzuć warstwę organiczną do pojemnika na odpady chlorowane.
    UWAGA: Krok 2.6 można powtórzyć, jeśli spodziewane są duże ilości związków drugorzędowych w materiale roślinnym.
  7. Dodać równą objętość (~400 μL) mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku 24:1. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół i/lub z odwróceniem. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 15 minut. Przenieść warstwę wodną (górną warstwę) do świeżego zestawu wstępnie schłodzonych, oznakowanych probówek (~300 μL). Wyrzuć warstwę organiczną do pojemnika na odpady chlorowane.
  8. Dodać równą objętość (~300 μl) wstępnie schłodzonego izopropanolu i 12 μl 2,5 M octanu sodu do każdej probówki. Próbki inkubować w temperaturze -20 °C przez 30–60 min.
    UWAGA: Czas inkubacji może być wydłużony (do inkubacji przez noc), ale jakość DNA będzie się pogarszać, im dłużej próbki będą inkubowane.
  9. Wyjąć próbki z zamrażarki i odwirować probówki o masie 12 000 x g przez 15 minut. Delikatnie usunąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Przepłukać granulat przez zawiesinę świeżym 70% etanolem (około 300–500 μl). Dla każdej podwójnej próbki skonsolidować dwie pojedyncze granulki w jeden z towarzyszącym alkoholem etylowym.
    UWAGA: Próbki należy najpierw skonsolidować w jednej probówce przy użyciu etanolu, a następnie kontynuować. Nie jest konieczne osobne mycie każdej próbki etanolem.
  10. Odwirować probówki o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut. Delikatnie usunąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Wysuszyć pelety na powietrzu.
    UWAGA: Próbki można suszyć szybciej za pomocą suchego bloku grzewczego (nie przekraczać 65 °C). Upewnij się, że próbki nie wyschną nadmiernie, ponieważ może to zmniejszyć ostateczną wydajność DNA.
  11. Zawiesić wyizolowane DNA w 50 μl 1x TE. Przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C do wykorzystania w następnym tygodniu.

3. Kontrola jakości (QC)

  1. Uruchom żel agarozowy w celu sprawdzenia jakości.
    1. Przygotuj 1x bufor Tris/Boran/EDTA (TBE), dodając 54 g zasady Tris, 27,5 g kwasu borowego i 3,75 g soli disodowej EDTA, zwiększając całkowitą objętość do 5 l przy użyciu wody z odczynnikiem.
    2. Przygotuj żel agarozowy 1%, dodając 1 g agarozy do 100 ml 1x TBE. Roztwór podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż nie będzie widać agarozy. Dodać 0,01% barwnika z żelu kwasu nukleinowego (patrz tabela materiałów). Pozostawić kolbę do ostygnięcia, aż stanie się ciepła w dotyku. Dobrze wymieszaj, mieszając. Wlej agarozę do tacki na żel i pozostaw do zestalenia.
    3. Wymieszaj 3 μl próbki, 2 μl wody z odczynnikiem i 1 μl 6-krotnie obciążającego barwnika. Załaduj próbki do matrycy żelowej, zwracając uwagę na ich kolejność.
    4. Próbki należy badać przez 60–70 minut pod napięciem 60–70 V. Zobrazować żel w świetle UV z prawidłową ekspozycją i ostrością.
      UWAGA: Obecność przezroczystego pasma o dużej masie cząsteczkowej jest oznaką wysokiej jakości DNA, podczas gdy rozmazy zwykle wskazują na degradację DNA. Większość okazów zielnikowych jest zdegradowana.
  2. Przeprowadź analizę ilościową dsDNA (patrz tabela materiałów), aby określić ilość dwuniciowego DNA.
    1. Do analizy należy użyć 2 μl próbki.
      UWAGA: Rozcieńczenia nie są potrzebne do analizy ilościowej materiału zielnikowego, ponieważ zwykle występują w minimalnych ilościach. Na tym etapie udało się stworzyć biblioteki z zaledwie 1,26 ng całkowitego dsDNA.

4. Ścinanie DNA

UWAGA: To jest zoptymalizowana wersja komercyjnego protokołu dwuniciowej fragmentazy (zobacz Spis materiałów).

  1. Umieść enzym fragmentacji dsDNA na lodzie po wirowaniu przez 3 s.
  2. W sterylnej probówce o pojemności 0,2 ml do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) wymieszaj 1–16 μl wyizolowanego DNA z 2 μl towarzyszącego buforu reakcji fragmentacji. Doprowadzić całkowitą objętość do 18 μl, dodając wodę wolną od nukleaz. Dodać 2 μl enzymu fragmentacji dsDNA i mieszać mieszaninę przez 3 s.
    UWAGA: Potrzebna ilość DNA różni się w zależności od stężenia DNA (celuj w 200 ng łącznie w probówce).
  3. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 8,5 minuty. Następnie dodaj 5 μl 0,5 M EDTA do probówek.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać zaraz po zakończeniu okresu inkubacji, aby zakończyć reakcję i zapobiec nadmiernemu ścinaniu próbek DNA.

5. Czyszczenie koralików

  1. Homogenizuj kulki SPRI przez wirowanie.
  2. Doprowadzić całkowitą objętość ściętego DNA do 50 μl, dodając 25 μl wody wolnej od nukleaz. Dodać 45 μl kulek SPRI o temperaturze pokojowej (90% objętości) do 50 μl ściętego DNA i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    UWAGA: Dodawanie kulek w 90% całkowitej objętości próbki odbywa się w celu usunięcia najmniejszych fragmentów DNA, często poniżej 200 par zasad.
  3. Pozostaw próbki do inkubacji przez 5 minut. Umieść probówki na płytce magnetycznej i pozostaw je na 5 minut. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć koralików, ponieważ zawierają one pożądane cele DNA.
  4. Dodaj 200 μl świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz. Suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut, gdy tuba znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.
    UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia koralików. Może to skutkować mniejszą regeneracją DNA.
  5. Wyjmij rurki z magnesu. Wypłucz DNA z kulek do 55 μl 0,1x TE i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny (~2 min).
  6. Pobrać 52 μl supernatantu. Przeprowadź analizę ilościową DNA na próbkach, aby sprawdzić odzysk i początkowe stężenie, które trafia do biblioteki prep.
    UWAGA: Stworzono biblioteki, w których całkowita ilość dsDNA szacowana jest na mniej niż 1,25 ng, choć w każdym przypadku wymagana była ponowna amplifikacja.

6. Przygotowanie biblioteki

UWAGA: To jest zmodyfikowana wersja dostępnego na rynku zestawu bibliotecznego (zobacz protokół Table of Materials).

  1. Przygotowanie do końca
    1. Dodać 3 μl endonukleazy i enzymów ogonowych fosforanowych oraz 7 μl towarzyszącego buforu reakcyjnego do 50 μl oczyszczonego, ściętego DNA. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Zakręć rurkami, aby usunąć bąbelki.
      UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 60 μL.
    2. Umieścić próbki w termocyklerze z następującym programem: 30 min w 20 °C, 30 min w 65 °C, następnie trzymać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Podgrzewana pokrywa została ustawiona na ≥75 °C
  2. Podwiązanie adaptera
    1. Rozcieńczyć adapter 25–50 razy (stężenie adaptera roboczego 0,6–0,3 μM). Dodać do probówek 30 μl głównej mieszanki ligacyjnej, 1 μl wzmacniacza ligacji i 2,5 μl adaptera do wysokowydajnego sekwencjonowania krótkiego odczytu.
      UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 93,5 μl.
    2. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Zakręć rurkami, aby usunąć bąbelki. Inkubować probówki w temperaturze 20 °C przez 15 minut.
    3. Dodać 3 μl handlowej mieszaniny uracylozy DNA glikozylazy (UDG) i endonukleazy DNA z liazą glikozylazy VIII (patrz tabela materiałów) do probówek. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 96,5 μl. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 15 minut za pomocą termocyklera.
      UWAGA: Pokrywę należy ustawić na ≥47 °C. Oryginalna wersja protokołu komercyjnego obejmuje wybór rozmiaru po etapie podwiązania adaptera, a następnie czyszczenie koralików jako ostatni krok. Ten protokół, który osiąga wyższe plony, zmienia kolejność tych kroków i wdraża wybór rozmiaru jako ostatni krok.
  3. Czyszczenie w celu usunięcia enzymów i małych fragmentów
    1. Homogenizuj kulki magnetyczne przez wirowanie.
    2. Dodać 78 μl kulek magnetycznych SPRI (80% objętości) i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: Dodawanie kulek w 80% całkowitej objętości próbki odbywa się w celu usunięcia najmniejszych fragmentów DNA, które często są krótsze niż 250 par zasad. Bardziej rygorystyczne usuwanie małych fragmentów DNA polega na (i) usunięciu nadmiaru adaptatorów i (ii) podkreśleniu amplifikacji większych fragmentów w kolejnych krokach.
    3. Pozostaw próbki do inkubacji przez 5 minut. Umieść probówki na płytce magnetycznej na 5 minut. Ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant zawierający DNA poza pożądany zakres wielkości.
      UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają pożądane cele DNA.
    4. Dodaj 200 μl świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz. Suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut, gdy tuba znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia koralików. Może to skutkować mniejszą regeneracją DNA.
    5. Wyjmij rurki z magnesu. Eluować cel DNA z kulek, dodając 17 μl 0,1x TE i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym i poczekać, aż roztwór stanie się klarowny (~2 min).
    7. Pobrać 15 μl supernatantu.
  4. Amplifikacja PCR
    1. Dodać 25 μl wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR, 5 μl wysokoprzepustowego startera 5' do biblioteki sekwencjonowania krótkiego odczytu i 5 μl wysokoprzepustowego startera do przygotowania biblioteki sekwencjonowania krótkiego odczytu 3' do 15 μl oczyszczonego DNA ligowanego adaptorem.
      UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 50 μL.
    2. Dobrze wymieszaj, wirując. Umieść próbki w termocyklerze, korzystając z ustawień znajdujących się w Tabeli 1: Termocykler ampustawienie amplifikacji.
      UWAGA: Potrzebna jest duża liczba cykli ze względu na małą ilość wejściowego DNA.
Krok cykluNajwyższa temp. GodzinaCykli
Początkowa denaturacja98 °C30 sekund1
denaturacja98 °C10 sekund12
Wyżarzanie/Wydłużanie65 °C75 sekund12
Końcowe przedłużenie65 °CCzas trwania: 5 min1
trzymać4 °C

Tabela 1: Czas denaturacji, wyżarzania i wydłużania protokołu PCR oraz temperatury. Temperatura i czasy zostały zoptymalizowane dla odczynników przedstawionych w tym protokole. Jeśli odczynniki zostaną zmienione, temperatury i czasy powinny zostać ponownie zoptymalizowane.

  1. Wybór rozmiaru dla żądanego rozmiaru biblioteki
    UWAGA: Ten krok koralików usunie fragmenty zarówno powyżej, jak i poniżej zakresu docelowego.
    1. Homogenizuj kulki SPRI przez wirowanie.
    2. Dodać 25 μl (50% objętości) kulek magnetycznych o temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostawić próbki do inkubacji przez 5 minut. Umieść probówki na płycie magnetycznej i pozostaw je na 5 minut. Ostrożnie wyjąć i przenieść supernatant do nowego zestawu oznaczonych probówek.
      UWAGA: Tę głośność można dostosować w zależności od żądanego rozmiaru biblioteki. Supernatant zawiera fragmenty DNA o pożądanej wielkości. W pierwszej inkubacji koralików koraliki wiążą większe fragmenty biblioteki. Są one usuwane, aby skupić się na tych w zakresie 400–600 par zasad. Supernatant zawiera mniejsze fragmenty.
    3. Dodać 6 μl kulek SPRI o temperaturze pokojowej do supernatantu i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostawić próbki do inkubacji przez 5 minut. Umieść probówki na płycie magnetycznej i pozostaw je na 5 minut.
      UWAGA: Tę głośność można dostosować w zależności od żądanego rozmiaru biblioteki zgodnie z krokiem 6.5.2.
    4. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają pożądane DNA. W drugiej inkubacji kulek koraliki wiążą się z fragmentami pozostałymi po wstępnym usunięciu największych fragmentów DNA. Ten zestaw fragmentów jest zwykle w pożądanym zakresie rozmiarów.
    5. Dodaj 200 μl świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórzyć. Suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut, gdy tuba znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia koralików. Może to skutkować mniejszą regeneracją DNA.
    6. Wyjmij rurki z magnesu. Eluować cel DNA z kulek do 33 μl 0,1x TE i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym i poczekać, aż roztwór stanie się klarowny (~2 min). Pobrać 30 μl supernatantu i przenieść do probówek o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów) w celu przechowywania.
      UWAGA: Biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Kontrola jakości
    1. Przeprowadź test kontroli jakości w bibliotekach DNA. Patrz kroki 3.1 i 3.2.
      UWAGA: W przypadku bibliotek DNA uruchom żel na ~45 minut przy napięciu 96 V.
  3. Wzmocnienie biblioteki: Opcjonalne, jeśli liczba bibliotek jest niewystarczająca.
    UWAGA: Próbki o stężeniach bibliotecznych poniżej 10 nM można ponownie amplifikować, wykonując następujące czynności. Reamplifikacja bibliotek o niskim stężeniu może przynieść użyteczne wyniki dla sekwencjonowania, ale reamplifikacja może spowodować niewielką zmianę w różnorodności składu podstawowego, chociaż zebrane dane (Tabela 3) sugerują, że jest to nieistotne dla niektórych wskaźników.
    1. Rozcieńczyć uniwersalne podkłady wzmacniające 10-krotnie, używając 0,1x TE.
    2. Dodać 25 μl wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR, 5 μl rozcieńczonego uniwersalnego startera do reamplifikacji 1 (AATGATACGGCGACCGA) i 5 μl rozcieńczonego uniwersalnego startera do reamplifikacji 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) do 15 μl bibliotek o niskim stężeniu. UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 50 μl.
    3. Dobrze wymieszaj, wirując. Umieść próbki w termocyklerze, korzystając z ustawień znajdujących się w Tabeli 1: Termocykler ampustawienie amplifikacji
      UWAGA: Duża liczba cykli jest potrzebna ze względu na małą ilość wejściowego DNA.
    4. Czyszczenie ściegów
    5. Homogenizuj kulki SPRI przez wirowanie. Dodać 45 μl kulek SPRI o temperaturze pokojowej (90% objętości) i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
    6. Pozwól próbkom inkubować przez 5 minut. Umieść probówki na płytce magnetycznej na 5 minut.
    7. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant zawierający niechciane DNA.
      UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć koralików, które zawierają pożądane cele DNA.
    8. Dodaj 200 μl świeżego 80% etanolu do probówek na stojaku magnetycznym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.
    9. Suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut, gdy rurka znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia koralików. Może to skutkować mniejszą regeneracją celu DNA.
    10. Wyjmij rurki z magnesu. Eluować cel DNA z kulek do 33 μl 0,1x TE i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.
    11. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym i poczekać, aż roztwór stanie się klarowny (~2 min).
    12. Pobrać 30 μl supernatantu. Biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  4. Kontrola jakości
    1. Przeprowadź test kontroli jakości w bibliotekach DNA. Patrz kroki 3.1 i 3.2. W przypadku bibliotek DNA uruchom żel na ~45 minut przy 96 V.
      UWAGA: Jeśli w żelu widoczne jest podwójne prążki, jest to prawdopodobnie konsekwencja wyczerpania startera po etapie reamplifikacji. Prążki można usunąć, powtarzając czynności opisane w pkt 6.9, ale używając tylko jednego cyklu w programie PCR przedstawionym w Tabeli 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja DNA i ostateczny wynik biblioteki
W tym badaniu wykazano skuteczność protokołu izolacji DNA zielnika i odzyskiwania wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania przy użyciu pięćdziesięciu różnych próbek, z których najstarsza pochodzi z 1920 roku, a najmłodsza z 2012 roku (tabela 2). Do izolacji DNA użyto około 10 mg tkanki liścia dla każdej próbki. Preferowano bardziej zieloną tkankę liści, jeśli była dostępna, i nie wybrano żadnej tkanki z oc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół jest kompleksową i solidną metodą izolacji DNA i przygotowania biblioteki sekwencjonowania z wysuszonych okazów roślin. Spójność metody i minimalna potrzeba jej zmiany w oparciu o jakość próbki sprawiają, że jest ona skalowalna w przypadku dużych projektów sekwencjonowania opartych na zielnikach. Włączenie opcjonalnego etapu reamplifikacji dla bibliotek o niskiej wydajności pozwala na włączenie próbek o niskiej jakości, małej ilości, rzadkich lub historycznie ważnych, które w przeciwnym razie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Taylor AuBuchon-Elder, Jordanowi Teisherowi i Kristinie Zudock za pomoc w pobieraniu próbek zielników, a Ogrodowi Botanicznemu Missouri za dostęp do okazów zielnikowych w celu destrukcyjnego pobierania próbek. Prace te zostały wsparte grantem z National Science Foundation (DEB-1457748).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 dobrze 
System obrazowania żelowegoAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SeriesBeckman CoulterB30137
Cyfrowy test porównawczy do suchej kąpieliNaukowy
EasyCastB2
PURELAB flex 2 (Ultra czysta woda)ELGA 89204-092
Rurka DNA LoBind Eppendorf301080782 ml
Mini wirówkaFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MoździerzFisher ScientificS02591tłuczek porcelanowy
fisher ScientificS02595porcelana
Probówki wirówkowefisher Scientific21-403-161
Kuchenka mikrofalowaKenmore405.7309231
Probówki do testów kubitowychInvitrogenQ32856
0,2 ml Probówka paskowa i nasadka do PCRVWR20170-004
Fluorometr Qubit 2.0InvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Krótkotrwałe przechowywanieciekłego azotuNalgeneF9401
Stojak z pierścieniem magnetycznym ThermoFisher Naukowy AM1005096 dobrze 
Łaźnia wodnaVWR89032-210
Mieszadła z płytą grzejnąVWR97042-754
Ciekły azotAirgasUN1977
1 x TE BuforAmbionAM9849pH 8,0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERKAPTOETANOLAMRESCO0482-200ML
Rybonukleaza AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml roztwór
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Chlorek sodubio WORLD705744
Alkohol izopropylowybio WORLD40970004-1
Woda bez nukleazbio WORLD42300012-2
Alkohol izoamylowyFisher ScientificA393-500
Trójwodny octan soduFisher Scientifics608-500
LE AgarozaGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder GoldBiotechnologyD003-500
EDTA, sól disodowaIBI ScientificIB70182
Zestaw testowy dsDNA HSTechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultra czysty
barwnik ładujący żel fioletowy (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentazaNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos dla IlluminaNew England BioLabsE7600SZestaw podkładów dwuindeksowych 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 XPheonix Research41003-1
Roztwór fenoluSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EtanolKoptecV1016200 Proof
Piasek kwarcowyVWR14808-60-7
Podkłady wzmacniająceZintegrowane technologie DNAzobacz tekst
Sequencher v.5.0.1GeneCodes
system do elektroforezy BSH1001 Moździerz Life

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18(2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Herbarium DNA IsolationHigh throughput Sequencing LibraryCTAB DNA ExtractionSPRI Bead PurificationDNA Fragmentation EnzymeLibrary Size SelectionOptional Reamplification StepAgarose Gel AnalysisThermocycler AmplificationMagnetic Stand Separation

Related Articles