Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kinematyka oka mierzona za pomocą stymulacji nerwów czaszkowych in vitro u żółwia

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56864

⸱

2 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać preparatu in vitro z izolowanych głów żółwi do pomiaru kinematyki ruchów ich gałek ocznych. Po usunięciu mózgu z czaszki, nerwy czaszkowe mogą być stymulowane prądami w celu ilościowego określenia rotacji oka i zmian wielkości źrenic.

Streszczenie

Po eutanazji zwierząt, ich tkanki zaczynają umierać. Żółwie mają przewagę ze względu na dłuższy czas przeżycia ich tkanek, zwłaszcza w porównaniu z kręgowcami stałocieplnymi. Z tego powodu eksperymenty in vitro na żółwiach mogą być przeprowadzane przez dłuższy czas w celu zbadania sygnałów neuronowych i kontroli ich docelowych działań. Za pomocą izolowanego preparatu głowy zmierzyliśmy kinematykę ruchów gałek ocznych u żółwi oraz ich modulację sygnałami elektrycznymi przenoszonymi przez nerwy czaszkowe. Po usunięciu mózgu z czaszki, pozostawiając nerwy czaszkowe nienaruszone, wypreparowaną głowę umieszczono w gimbalu w celu kalibracji ruchów gałek ocznych. Szklane elektrody przymocowano do nerwów czaszkowych (okoruchowych, bloczkowych i odwodzących) i stymulowano prądami w celu wywołania ruchów gałek ocznych. Monitorowaliśmy ruchy gałek ocznych za pomocą systemu śledzenia wideo w podczerwieni i określaliśmy ilościowo obroty gałek ocznych. Impulsy prądowe o różnych amplitudach, częstotliwościach i czasach trwania ciągu wykorzystano do obserwacji wpływu na odpowiedzi. Ponieważ preparat jest oddzielony od mózgu, szlak odprowadzający prowadzący do celów mięśniowych może być badany w izolacji w celu zbadania sygnalizacji neuronalnej przy braku centralnie przetwarzanych informacji sensorycznych.

Wprowadzenie

Uzasadnienie dla używania żółwi czerwonolicy w eksperymentach elektrofizjologicznych:

Żółwie czerwonolicy (Trachemys scripta elegans), są uważane za jedne z najgorszych gatunków inwazyjnych na świecie1 i mogą wskazywać, że ekosystem jest w tarapatach. Powód, dla którego żółwie czerwonolice suwakowe odnoszą takie sukcesy, jest słabo poznany, ale może to częściowo wynikać z ich tolerancyjnej fizjologii i posiadania tkanek nerwowych, które mogą przetrwać w warunkach niedotlenienia2,3,4. Używanie ich do eksperymentów nie zagraża ich liczebności i przy minimalnym wysiłku przygotowania elektrofizjologiczne mogą pozostać żywotne przez dłuższy czas, nawet 18 godzin5,6. Korzyść jest podobna do korzyści płynącej z używania zwierząt bezkręgowych, takich jak raki7, które również mają zdolność wytrzymywania niskiego poziomu tlenu8.

Techniki pomiaru ruchów gałek ocznych:

Podejścia do pomiaru ruchów gałek ocznych u zwierząt o przednich oczach przy użyciu naczelnych innych niż ludzie zostały dobrze rozwinięte9. Oko obraca się na orbicie wokół trzech osi: poziomej, pionowej i skrętnej. Metoda magnetycznej cewki wyszukiwania jest ogólnie uważana za najbardziej wiarygodną do pomiaru obrotów, ale jest inwazyjna, wymaga włożenia małych cewek do twardówek zwierząt10,11. Systemy oparte na wideo mogą również mierzyć rotacje i mają tę zaletę, że są nieinwazyjne. Rozwój lepszych kamer wraz z innowacyjnym przetwarzaniem obrazu zwiększył ich funkcjonalność, dzięki czemu systemy oparte na wideo są atrakcyjną alternatywą do rozważenia12,13,14.

Techniki opracowane do pomiaru ruchów gałek ocznych u nie-ssaków były znacznie mniej znaczące. Miary mają albo niską rozdzielczość, albo opisują tylko niektóre rotacje15,16,17,18. Brak rozwoju można częściowo zrzucić na karb trudności w szkoleniu zwierząt niebędących ssakami w celu podążania za celami wizualnymi. Chociaż ruchy gałek ocznych zostały dobrze zbadane u żółwi czerwonolicy suwakowych19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, ze względu na trudności w szkoleniu zwierząt do śledzenia celów, dokładna kinematyka ruchów ich gałek ocznych jest słabo poznana.

Żółwie czerwonolicy są zazwyczaj uważane za kręgowce o bocznych oczach, ale ponieważ mogą całkowicie schować głowę w skorupie31, następuje znaczne zasłanianie bocznych pól widzenia przez pancerz32. W rezultacie ich wizualna linia wzroku jest wymuszona do przodu, co sprawia, że zachowują się bardziej jak ssaki o przednich oczach. W związku z tym ich wykorzystanie jako modelu do opracowywania podejść do pomiaru ruchów gałek ocznych oferuje również unikalną perspektywę ewolucyjną.

Protokół opisany w tej pracy wykorzystuje in vitro izolowane przygotowanie głowy do identyfikacji kinematyki ruchów gałek ocznych u czerwonolicy żółwia suwakowego. Mózgi są wycinane z czaszek, pozostawiając nerwy czaszkowe nienaruszone. Głowice są umieszczane w gimbalu w celu kalibracji ruchów gałek ocznych i wywoływania reakcji poprzez elektryczną stymulację nerwów czaszkowych unerwiających mięśnie oka. Pomiary obrotów oczu są wykonywane przez system oparty na wideo, wykorzystujący algorytmy oprogramowania, które śledzą ciemną źrenicę i oznaczenia tęczówki. Preparat daje możliwość pomiaru kinematyki zarówno ruchów pozagałkowych (tj. poziomych, pionowych i skrętnych)32, jak i wewnątrzgałkowych (tj. zmian źrenic)33.

Model systemu do analizy odprowadzających ścieżek neuronowych:

Bardziej ogólnie, podejście to daje badaczom szansę na zbadanie, w jaki sposób odprowadzające sygnały neuronowe generują ruchy gałek ocznych, gdy mięśnie zaczynają od stanu relaksu i przy braku zintegrowanych informacji sensorycznych przetwarzanych przez mózg32,33. W związku z tym kinematyka oka może być badana w systemie modelowym, w którym jest ona przetwarzana wyłącznie przez odprowadzający szlak nerwowy opuszczający mózg i synapsujący do mięśni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Żółwie czerwonolice, zarówno samce, jak i samice, zostały zakupione od sprzedawcy. Żółwie były trzymane w ciepłym apartamencie dla zwierząt zawierającym dwie 60-galonowe wanny wyposażone w ceglane wyspy do opalania się pod światłem podczerwonym o mocy 250 W. Środowisko było utrzymywane w cyklu 14/10 godzin światło/ciemność z temperaturą wody 22 °C. Światła włączano o 6:00 rano i wyłączano o 20:00. Zbiorniki wyposażone w systemy filtrujące były czyszczone co tydzień, a żółwie były karmione ad libitum co drugi dzień. Opieka nad żółwiami czerwonolicy i wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne32,33 zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Lafayette College.

1. Ustawienia sprzętu

  1. Przygotuj roztwór żółwia Ringera. Do wody destylowanej dodać w tej kolejności: chlorek sodu 96,5 mM (58,44 g/mol), chlorek potasu 2,6 mM (74,56 g/mol), chlorek magnezu 2,0 mM (203,31 g/mol), wodorowęglan sodu 31,5 mM (84,01 g/mol), dekstroza 20,0 mM (180,16 g/mol), stężony kwas solny w celu dostosowania pH do 7,51 i chlorek wapnia 4,0 mM (110,98 g/mol) (patrz tabela materiałów). Wymieszaj roztwór, dodając każdą sól.
    UWAGA: Skoncentrowany HCl jest niebezpieczny (zagrożenia dla skóry, oczu, dróg oddechowych i spożycia).
  2. Wykonać końcówki elektrod ssących ze szkła kapilarnego o długości 5 cm (patrz tabela materiałów), polerując ogniowo do różnych rozmiarów średnic wewnętrznych, aby pomieścić nerwy czaszkowe o różnej grubości.
    1. Użyj małego pilnika, aby wytrawić linię w poprzek kawałka szkła kapilarnego. Włożyć do bibuły i przełamać na pół.
    2. Powoli wtocz jeden z końców szkła kapilarnego w płomień palnika Bunsena. Okresowo sprawdzaj końcówkę pod kątem rozmiaru, gładkości i symetrii za pomocą lunety preparacyjnej i światłowodowego źródła światła (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W przypadku żółwi o szerokości głowy od 20 do 30 mm, optymalne rozmiary średnicy wewnętrznej dopasowania zwykle wahają się od 0,4 do 0,8 mm dla nerwu okoruchowego (nIII), 0,3 do 0,6 mm dla nerwu bloczkowego (nIV) i 0,2 do 0,4 mm dla nerwu odwodzącego (nVI).
  3. Oczyść i uporządkuj Rongeurs, sondę preparacyjną, mikronożyczki, drobne kleszcze, zakrzywione kleszcze i rękojeść skalpela z ostrzami (patrz Tabela materiałów) do sekcji.
    UWAGA: Sterylizacja narzędzi jest opcjonalna.

2. Znieczulenie i eutanazja

  1. Umieść żółwia w wiaderku z lodem na 60 minut, aby go znieczulić.
  2. Poddaj żółwia eutanazji przez ścięcie głowy za pomocą gilotyny dla małych zwierząt (patrz Tabela Materiałów).
    1. Delikatnie podważ szczęki zwierzęcia małą szpatułką do ważenia, aby można było włożyć i obrócić haczyk tak, aby zmieścił się pod czubkiem górnej szczęki.
    2. Pociągnij ze stałym naciskiem, aby wysunąć głowę zwierzęcia przez gilotynę. Szybko odetnij głowę zwierzęciu.
  3. Umieść głowę żółwia w naczyniu preparacyjnym. Miej pod ręką wystarczającą ilość roztworu żółwia Ringera, aby nawodnić tkankę. Natlenić roztwór 95/5%O2/CO2 (patrz tabela materiałów).
  4. Utrzymuj tkankę w temperaturze 4 °C, umieszczając lód wokół zewnętrznej strony naczynia.

3. Sekcja

  1. Do przeprowadzenia sekcji należy użyć lunety sekcyjnej ze światłowodowym źródłem światła.
  2. Zdejmij dolną szczękę. Umieść sondę preparacyjną w ustach, aby zapewnić łatwiejszą obsługę głowy. Przeciąć skalpelem staw łączący kość zębową z czaszką. Użyj rongeurs, aby odciągnąć dolną szczękę od czaszki. Użyj rongeurs, aby ściągnąć skórę i mięśnie z ich przyczepów w grzbietowych i bocznych obszarach czaszki.
  3. Usuń kręgosłup.
    1. Zidentyfikuj kręgosłup na ogonowym końcu czaszki. Zegnij kręgosłup brzusznie, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Użyj mikronożyczek, aby przeciąć rdzeń kręgowy. Użyj rongeurs, aby usunąć kręgosłup i inne tkanki z czaszki, ciągnąc doogonowo.
  4. Usuń mózg z czaszki po przecięciu nerwów czaszkowych.
    1. Zaczynając od otworu wielkiego, użyj rongeurs, aby wyciąć dwa nacięcia na grzbietowej czaszce. Rób nacięcia powierzchowne, aby uniknąć uszkodzenia mózgu pod spodem.
    2. Użyj rongeurs, aby ostrożnie ściągnąć czaszkę grzbietową. Użyj mikronożyczek, aby usunąć opony mózgowe, aby odsłonić resztę mózgu. Usuń wystarczającą ilość opon mózgowych, aż będzie można zidentyfikować opuszki węchowe w przedniej jamie czaszki (patrz Rysunek 1A). W razie potrzeby kontynuuj nawadnianie mózgu roztworem żółwia Ringera.
    3. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie pociągnąć mózg doogonowo i wytworzyć lekkie napięcie na nerwach czaszkowych. Ostrożnie odetnij i usuń opuszki węchowe i mózg za pomocą zakrzywionych kleszczy.
    4. Użyj mikronożyczek, aby delikatnie popchnąć śródmózgowie w kierunku linii środkowej, aby odsłonić nerwy czaszkowe; nIII, około 0,6 mm, można zobaczyć przed nIV, a średnica nIV będzie nieco mniejsza niż nIII. Przetnij nIII i nIV w miejscu, w którym przyczepiają się do śródmózgowia (patrz Rysunek 1B). Powtórz to po drugiej stronie.
    5. Przetnij lewy i prawy nerw wzrokowy (nII) za pomocą mikronożyczek. Następnie przechyl pień mózgu na bok. Obserwuj nVI wyłaniające się z powierzchni brzusznej w pobliżu połączenia mostu i rdzenia (patrz Rysunek 1C); średnica nVI jest mała i wynosi około 0,3 mm. Wytnij zarówno lewą, jak i prawą nVI.
    6. Usuń pozostałe części pnia mózgu żółwia za pomocą drobnych kleszczy i mikronożyczek. Gdy czaszka jest pusta, zbadaj dno jamy czaszki. Zidentyfikuj nIII, nIV i nVI.
  5. Usuń górną i dolną powiekę za pomocą drobnych kleszczyków i mikronożyczek.

4. Kalibracja ruchów gałek ocznych

  1. Użyj sztywnego stołu (patrz Tabela materiałów), aby podeprzeć umieszczenie gimbala i innych instrumentów. Umieść głowę żółwia w uchwycie gimbala tak, aby grzbietowa powierzchnia głowy była równoległa do horyzontu, używając małej poziomicy spoczywającej w poprzek czaszki. Z grubsza umieść jedno z oczu w środku obrotów poziomych i pionowych gimbala.
  2. Kamerę na podczerwień, wyposażoną w diodę elektroluminescencyjną (LED) w podczerwieni, która jest częścią systemu śledzenia ruchu gałek ocznych opartego na wideo (patrz tabela materiałów), należy umieścić w odległości oglądania około 12 cm od oka żółwia.
    1. Ustaw kamerę pod kątem 45 stopni powyżej linii wzroku oka. Dioda LED powinna znajdować się w pozycji godziny 11, patrząc na obiektyw aparatu. Wyśrodkuj diodę LED wzdłuż osi optycznej oka. Kamera będzie nieco odchylona od osi (patrząc z góry oka).
    2. Dostosuj odległość kamery od oka tak, aby widok kamery był maksymalnie wypełniony przez gałkę oczną. Upewnij się, że kąciki oczu (canthi) znajdują się na krawędziach widoku poziomego.
  3. Podłącz kamerę do systemu śledzenia ruchu gałek ocznych opartego na wideo, aby przetworzyć dane. Podziel sygnał na nagrywarkę DVD, aby przechwycić surowe wideo. Ustaw ostrość aparatu, aby uzyskać wyraźny obraz oka. Zwróć uwagę, aby precyzyjnie ustawić oko w środku kamery view za pomocą trzech stopni regulacji liniowej (x, y, z) dostarczonych z gimbalem.
  4. Wykryj ciemną źrenicę, odpowiednio ustawiając próg i kontrast za pomocą programu dostarczonego z systemem śledzenia ruchu gałek ocznych opartym na wideo.
    1. Za pomocą myszy kliknij menu "Wideo" i w sekcji "Tryb" wybierz "Wysoka precyzja", aby przechwytywać obrazy z częstotliwością próbkowania 30 Hz (rozdzielczość 640 pikseli x 480 linii). Również w sekcji "Wideo" wybierz "Ciemna źrenica" dla "Typ źrenicy" i "Elipsa (obrócona elipsa)" dla "Metoda segmentacji źrenicy".
    2. W oknie "EyeCamera" kliknij ikonę "Regulacja obszaru wyszukiwania źrenicy" (mały pionowy prostokąt z kropką pośrodku). Użyj myszy, aby przeciągnąć prostokąt, który ogranicza obszar wokół źrenicy. Unikaj ciemnych obszarów, które można pomylić ze źrenicą.
    3. W oknie "Sterowanie" upewnij się, że pola "Auto Image" i "Positive-Lock Threshold-Tracking" są zaznaczone. Kliknij "Automatyczny próg", aby zoptymalizować gęstość skanowania, która będzie wyświetlana jako zielone kropki nad ciemną źrenicą.
  5. Skalibruj wyświetlanie wideo programu do śledzenia ruchu gałek ocznych opartego na wideo do obrotów gimbala o 12.5 ° (+/-) wokół jego osi poziomej i 10 ° (+/-) wokół jego osi pionowej.
    1. W oknie "Sterowanie" kliknij "Wyświetlacz". Zaznacz pola zarówno pod "Spojrzeniem", jak i "Stymulantem" dla "Punktu spojrzenia", "Regionu kalibu" i "Siatki geometrii". Po zaznaczeniu pól w sekcji "Siatka geometrii" pojawi się okno z informacją: "Geometria wyświetlania bodźca musi zostać zmierzona, zanim będzie można wyświetlić siatkę geometrii. Czy chcesz to zrobić teraz?" Wybierz "Y", aby tak.
    2. Za pomocą myszy kliknij menu "Windows" i wybierz "Bodziec". Otworzy się okno "Bodziec" pokazujące pionowe i poziome skrzyżowanie linii na środku wyświetlacza. Zmierz długość linii z dokładnością do milimetra. Naciśnij "Esc" na klawiaturze, aby wyjść z okna "Bodziec".
    3. Za pomocą myszy kliknij menu "Bodziec" i wybierz "Ustawienia geometrii". Wprowadź długości linii, które właśnie zostały zmierzone. Dostosuj odległość oglądania tak, aby stopnie/linia była równa 25 ° dla linii poziomej i 20 ° dla linii pionowej. Kliknij przycisk "Sklep" i zamknij okno.
    4. W oknie "EyeSpace" wybierz numer kalibracji "Data Point" na "9". Trzymając oko żółwia w środku, kliknij środkowy punkt danych i kliknij przycisk "Prezentuj ponownie".
      UWAGA: Otworzy się okno "Bodziec", a na środku ekranu pojawi się "Przygotuj się". W środkowej lokalizacji pojawi się pole, a następnie zniknie. Po jego zniknięciu okno "Bodziec" zostanie zamknięte. Pozycja środkowa powinna być teraz skalibrowana.
    5. Powtórz procedurę, obracając gimbala w prawo/w lewo, +12.5 ° / -12.5 ° i góra/dół +10 ° / -10 °, aby skalibrować pozostałe punkty danych.
  6. Aby skalibrować rotację skrętną, należy użyć algorytmu dopasowania szablonu dostarczonego z programem do śledzenia ruchu gałek ocznych opartym na wideo. Algorytm ustawia pozycję zerową na podstawie oznaczeń tęczówki i oblicza kąt obrotu, gdy oznaczenia zostaną przesunięte od środka ciężkości źrenicy.
    1. Za pomocą wskaźnika myszy kliknij menu "Windows" i wybierz "Skręcanie". Kliknij przycisk "START" w oknie "Skręcanie". W oknie "EyeCamera" nad obrazem oka pojawi się łuk
      2. .
    2. Dostosuj promień, kąt i długość łuku za pomocą suwaków w miejscu, w którym w przysłony występują nieregularne oznaczenia. Zaznacz pola "Grafika w czasie rzeczywistym" i "Automatyczne ustawienie po dostosowaniu". W razie potrzeby dostosuj jasność i kontrast w oknie Sterowanie i ponownie ustaw próg ciemnej źrenicy (patrz krok 4). Kliknij przycisk "Ustaw szablon".
  7. Umieść linijkę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co źrenica i zapisz szerokość pełnego widoku kamery. Wartość ta zostanie później wykorzystana do określenia rzeczywistej szerokości źrenicy.

5. Ustawienie elektrody ssącej na nerwie czaszkowym w celu wywołania ruchów gałek ocznych

  1. Ostrożnie umieść elektrodę referencyjną w tkance łącznej lub mięśniowej pozostałej na głowie.
  2. Umieść elektrodę ssącą (patrz Tabela materiałów) na nerwie czaszkowym za pomocą mikromanipulatora i lunety preparacyjnej zamontowanej na wysięgniku. Użyj światłowodowego źródła światła, aby view i poprowadź umieszczenie.
    1. Dopasuj rozmiar nerwu do szklanej końcówki kapilarnej. Metoda prób i błędów jest konieczna, aby uzyskać najlepsze dopasowanie wokół średnicy nerwu (patrz krok 1.2, aby zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi rozmiaru). Umieść szklaną końcówkę na elektrodzie ssącej. Napełnij elektrodę ssącą roztworem Ringera i dostosuj objętość strzykawki do około połowy jej pojemności.
    2. Ostrożnie przesuń szklaną końcówkę elektrody za pomocą mikromanipulatora do pozycji powyżej odciętego końca wybranego nerwu. Upewnij się, że roztwór Ringera wypełnia czaszkę, a końcówka znajduje się pod jej powierzchnią. W razie potrzeby użyj modeliny, aby zatamować miejsca, w których roztwór Ringera wycieka z czaszki.
    3. Odciągnąć tłok strzykawki.
      UWAGA: Próżnia wciągnie nerw do końca końcówki kapilary. O dobrym dopasowaniu świadczy to, że nerw pozostaje w końcówce z niewielkim lub żadnym dodatkowym podciśnieniem.

6. Stymulacja nerwu czaszkowego i analiza ruchów gałek ocznych

  1. Użyj stymulatora nerwów/mięśni ogólnego przeznaczenia z urządzeniem izolującym prąd (patrz Tabela materiałów), aby stymulować nerw czaszkowy za pomocą elektrody ssącej.
    1. Podłącz elektrodę ssącą do urządzenia izolującego prąd za pomocą. Podłącz przewód od elektrody odniesienia kołkowego do uziemienia urządzenia izolującego.
    2. Dobierz parametry prądów za pomocą pokręteł i przełączników na stymulatorze i urządzeniu izolującym. Używaj prądów z zakresu od 1 do 100 μA, z częstotliwością od 10 do 400 Hz. Używaj impulsów 1- lub 2-ms w pociągach trwających 100, 500 lub 1,000 ms.
  2. Zapisz czas stymulacji.
    UWAGA: Impulsy TTL (tranzystor-tranzystor-logika) są zsynchronizowane z dostarczaniem prądów ze stymulatora i komunikują się w czasie rzeczywistym za pomocą z kanałami wejściowymi systemu śledzenia ruchu gałek ocznych opartego na wideo. Moduł oprogramowania dostarczony z programem do śledzenia ruchu gałek ocznych opartego na wideo steruje komunikacją.
    1. Aby zobrazować czas działania bieżących aplikacji i ich wpływ na ruchy gałek ocznych, kliknij menu "PenPlots". Wybierz "Pozycja spojrzenia X", "Pozycja spojrzenia Y", "Skręt" i "Szerokość źrenicy", aby wyświetlić wykresy surowych danych w czasie rzeczywistym dla pozycji oczu X i Y, skrętu i szerokości źrenicy. Wybierz również "Sekundy i znaczniki" z menu "PenPlots", aby wyświetlić wykres czasowy ze znacznikami, które pojawiają się w odstępach 1 s.
      UWAGA: Pojawi się wielka litera "T" oznaczająca początek impulsu TTL, występującego jednocześnie z bieżącą aplikacją.
    2. Aby zapisać dane o ruchach gałek ocznych wywołanych przez prądy, kliknij menu "Plik" i wybierz "Nowy plik danych" w sekcji "Dane". Wprowadź nazwę pliku i naciśnij "Enter". Zapisywanie danych można wstrzymać, a następnie wznowić za pomocą kombinacji poleceń klawiszowych "Ctrl" + "p". Po zakończeniu sesji eksperymentalnej wybierz opcję "Zamknij plik danych" z menu "Plik" w sekcji "Dane".
    3. Aby pomóc w śledzeniu typu zastosowanych prądów, kliknij menu "Windows" i wybierz "Data Pad". Pojawi się okno "KeyPad/DataMarker". Kliknij na literę lub cyfrę, aby zidentyfikować parametry aktualnych stymulacji dostarczanych do nerwu.
      UWAGA: Na przykład "X" może oznaczać 10 μA. Kliknięcie "X" powoduje zapisanie jego wpisu do pliku danych w czasie rzeczywistym w celu analizy post hoc. Pojawia się również na "PenPlot" dla "Sekund i znaczników" dla ciągłej obserwacji.
  3. Analizuj dane z systemu śledzenia ruchu gałek ocznych.
    1. Otwórz zapisany plik danych, który jest w formacie rozdzielanym tekstem, w wybranym programie arkusza kalkulacyjnego, aby uporządkować dane i przeprowadzić analizę statystyczną.
      1. Przelicz wartości szerokości źrenicy zapisane w pliku na rzeczywiste rozmiary w mm.
      2. Przelicz wartości pozycji i skrętów oczu X i Y na jednostki stopnia i użyj konwencji do opisu ruchów gałek ocznych, a zatem dodatnich kierunków obrotów: wkręcenia, uniesienia i przywodzenia; oraz ujemnych kierunków obrotów: wymuszenia, depresji i odwiedzenia.
    2. Skopiuj informacje nagłówka do nowego arkusza. Obejmuje to wartości rozmiaru ekranu (szerokość i wysokość) oraz odległości oglądania. Osiem kolumn danych zbieranych z częstotliwością 30 Hz będzie znajdować się poniżej informacji w nagłówku.
    3. Wróć do arkusza zawierającego nieprzetworzone dane. Wykonaj "Znajdź" dla "X" w ostatniej kolumnie zatytułowanej "Znacznik", aby zlokalizować miejsce, w którym zastosowano stymulację za pomocą 10 μA. Znajdź częstość występowania "T", oznaczającą początek bieżącej stymulacji. Kopiowanie 15 wierszy (0,5 s) danych występujących przed "T" i 90 klatek po "T" (3,0 s); tj. łącznie 3,5 s. Wklej dane w nowym arkuszu poniżej informacji nagłówka.
    4. Wstaw pustą kolumnę po "PupilWidth". W pustej kolumnie przekonwertuj na skalibrowany wymiar w mm:
      Pozioma średnica źrenicy = "PupilWidth" × wymiar szerokości widoku kamery
    5. Wstaw 2 puste kolumny po "X_Gaze" i "Y_Gaze". Normalizuj pozycje do wymiarów ekranu wyświetlania: współrzędne (0, 0) w lewym górnym rogu ekranu rozciągające się do (1, 1) w prawym dolnym rogu. W pierwszej pustej kolumnie przekształć pozycje w układ współrzędnych mający wartość (0, 0) na środku ekranu. Uwzględnij konwersję na wymiary ekranu w mm:
      X = (0,5 × szerokości) – ("X_Gaze" × szerokości); Y = (0,5 × wysokości) – ("Y_Gaze" × wysokości)
      UWAGA: Sekwencja operacji dotyczy lewego oka. Sekwencja będzie musiała zostać odwrócona dla prawego oka, aby postępować zgodnie z konwencją negatywności dla porwania i pozytywności dla przywodzenia.
    6. W drugich kolumnach użyj funkcji trygonometrycznych, aby przeliczyć na kąty (°) obrotu:
      obrót w poziomie = arctan (X/odległość widzenia); obrót w pionie = arctan (Y/odległość widzenia)
    7. Skręcanie jest już pokazane w stopniach, ale aby zachować zgodność z konwencją pozytywności dla wkrętu, jeśli pomiar jest wykonywany na lewym oku, pomnóż przez -1. W przypadku prawego oka nie jest konieczne mnożenie. Program koduje obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara jako dodatni.
    8. Wykreśl średnicę źrenicy i obroty w funkcji czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia klatki z filmu opisującego sekcję. Obrazy wskazują typowe rozmieszczenie nerwów przed ich oddzieleniem od mózgu.

Schemat sekcji mózgu ryby z zaznaczoną cebulką węchową, mózgowiem, tekum optycznym i rdzeniem przedłużonym.
Rysunek 1: Klatki z n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne:

Kluczowe kroki w tym protokole są następujące: 1) sekcja i dbałość o utrzymanie żywotności przeciętych nerwów; 2) dopasowanie rozmiarów przez elektrody ssące do nerwów czaszkowych w celu zapewnienia spójnych odpowiedzi; oraz 3) umieszczenie głowicy w gimbalu w celu zapewnienia odpowiedniej kalibracji obrotów oka.

Rozwiązywanie problemów:

Sekcja może być trudna, ale po jej kilkukrotnym wykonaniu kroki powinny stać się stosunkowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Pani Paulette McKenna i Lisie Pezzino za wsparcie sekretarskie, a Panu Philowi Auerbachowi za wsparcie techniczne. Autorzy dziękują również doktorom Michaelowi Arielowi i Michaelowi S. Jonesowi (Saint Louis University School of Medicine) za zapoznanie nas z preparatem głowy izolowanej in vitro. Fundusze na wsparcie tej współpracy zostały zapewnione przez Wydział Biologii (Robert S. Chase Fund), Komitet Badań Akademickich oraz Program Neuronauki w Lafayette College. Na koniec praca ta dedykowana jest panu Philowi Auerbachowi, który zmarł 28 września 2016 r.; Wycofał ze służby skaningowy mikroskop elektronowy i uznał przydatność jego 5-osiowego stolika do wykorzystania w tym protokole. Będzie nam bardzo brakowało jego przyjaźni i zaradności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żółwie czerwonolice suwakoweKons ScientificTrachemys scripta elegansDuży rozmiar (długość karapaksu 15-20 cm)
Chlorek soduSigma-Aldrich Co., LLC.S5886
Chlorek potasuSigma-Aldrich Co., LLC.P5405
Choryd magnezuSigma-Aldrich Co., LLC.M7304
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich Co., LLC.S5761
DekstrozaSigma-Aldrich Co., LLC.C5767
Stężony kwas solnySigma-Aldrich Co., LLC.H7020
Chlorek wapniaSigma-Aldrich Co., LLC.C7902
pH-metrOaktonpH 6+
Elektroda do stymulacji ssaniaAM Systems573000Bipolarna elektroda ssąca. Należy zauważyć, że liczba 573000 została zastąpiona liczbą 573050.
Szkło kapilarneSystemy A-M626000Jednobębenkowe borokrzemianowe szkło kapilarne bez mikrofilamentu, długość 10 cm, średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,50 mm
Alternatywna elektroda ssącaA-M Systems573050Bipolarna elektroda ssąca. Wymaga szkła kapilarnego o większej średnicy: 627000, średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,68 mm
StereoskopLiecaGZ7Zakres powiększenia, 10x i 70x
Światłowodowe źródło światłaAmscopeHL250-A150W Światłowód oświetlacz mikroskopu
RongeursCarolina Biological Supply Company625654stal nierdzewna, sprężyna prosta, 5,25"
sonda preparcyjnaCarolina Biological Supply Company627405Huber Mall, dwustronna sonda i poszukiwacz, 6-calowe
mikronożyczkiCarolina Biological Supply Company623555Nożyczki do mikropreparacji Iris, stal nierdzewna, ostrza 0,5", długość 4,75"
Drobne kleszczeSigma-Aldrich Co. LLC.F6521Kleszcze jubilerskie, dumont nr 5, stop inox, 4,25 "
Kleszcze zakrzywioneSigma-Aldrich Co. LLC.Z168696Średnia końcówka, zakrzywione kleszcze, stal nierdzewna, 4"
Rękojeść skalpelaSigma-Aldrich Co. LLC.S2896Rękojeści do skalpeli, nr 3, stal nierdzewna
Ostrze skalpelaSigma-Aldrich Co. LLC.S2771Ostrza skalpela, nr 11, stalowe
GilotynaHarvard Apparatus73-1918Gilotyna Kleine typ 7575
SzpatułkaSigmaZ648299Zestaw do ważenia Micro łyżki i szpatułki. Użyj małej szpatułki: 5.9" długi x 0,07" Średnica rękojeści z kwadratowym końcem: 0,17" x 1,3" długi, drugi koniec rundy: 0,17 " x 1,27 cala długi
HookAutozone98069Zestaw haczyków i picków SureBilt. Użyj młynka do stępienia ostrych końcówek haka, aby zapobiec zranieniu pyska zwierzęcia.
95/5% O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C20031025% Bilans dwutlenku węgla certyfikowana standardowa mieszanina gazów z certyfikatem tlenu, rozmiar 200 Butla, regulator CGA-296
Airgas, Inc.Y11244D296-AGJednostopniowy mosiężny regulator cylindryczny 0-100 psi CGA-296 z wylotem igły. Użyj mosiężnego regulowanego zaworu rury powietrznej, aby przejść z 3/8 ", średnicy wewnętrznej, winylowej rurki powietrznej podłączonej do regulatora do 3/16", średnicy wewnętrznej, połączenia powietrznego prowadzącego do pipety napowietrzającej lub szklanej pipety Pasteura.
Regulowany zawór rurowy przewodu powietrznegoLekarze Foster i SmithCD-12061Zawór mosiężny
Sztywny stółNieznanyNieznany Drzwiautoklawe ułożone na solidnym stole. Dziewięć piłek tenisowych o średnicy 5" izoluje wibracje od górnej powierzchni stołu.
5-calowa piłka tenisowaPetco Animal Supplies, Inc.712868Piłka tenisowa Petco Jumbo Pet: piłki są niekrojone i trzymane w zintegrowanej ramie w dolnej części drzwi autoklawu.
Alternatywny stół do izolacji drgańNewport CorporationINT1-36-6-NSztywny system kontroli drgań, integralność 1: Wymiary powierzchni, gimbal 3' x 6'
ISI, International Scientific Instruments, Inc.Stolik z SUPER III-A Skanowanie EM5-osiowy stolik eucentryczny: ruchy liniowe X, Y i Z, ± 20 mm, dokładność 0,1 mm; Obroty, pionowe, ± 10°, i poziomo, ± 12,5°, z 1,25° precyzja. Uwaga: z instrumentu likwidacyjnego.
Uchwyt do gimbalaNieznanyNieznany Uchwyt ze starego mikrotomu nieznanej produkcji został obróbiony tak, aby pasował do wału uchwytu próbki
alternatywnego gimbalaThorLabs, Inc.GN2/M z MBT602/MGoniometr dwuosiowy (GN2/M) zamontowany na 3-osiowym stoliku mikroblokowym z regulatorami śrubowymi skrzydełkowymi (MBT602/M): zaprojektuj uchwyt do trzymania głowy żółwia z okiem na wysokości 12,7 mm nad górną powierzchnią goniometru (odległość do punktu obrotu)
System śledzenia ruchu gałek ocznych oparty na wideoArrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60Metoda śledzenia: Wideo w podczerwieni przez ciemną źrenicę; Aparat czarno-biały (pozycja BC02): 30 Hz, 640 x 480; Wymagania systemowe: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Zakres widzenia: Poziomy +/- 44&; pionowo +/- 20&; Dokładność ~0,5°; Rozdzielczość przestrzenna ~0,15°; Rozdzielczość wielkości źrenicy ~0,03 mm; Dane dotyczące oczu: pozycja wzroku X, Y, wysokość i szerokość źrenicy, skręcanie, czas delta, czas całkowity i obszary zainteresowania (ROI); Komunikacja w czasie rzeczywistym (pozycja 0022): 4-kanałowe wyjście analogowe z ośmioma kanałami wejściowymi TTL do oznaczania kodów w pliku danych
Wielopozycyjna podstawa magnetycznaHarbor Freight ToolsPittsburg, pozycja #5645Uchwyt magnetyczny osiąga do 12 cali i wytwarza 45 funtów siły przyciągania magnetycznego. Służy do ustawiania kamery. Maszynowo nagwintuj otwory na końcu pręta, aby zamontować kamery.
MikromanipulatorKopf9005-osiowa manipulacja do montażu elektrody ssącej: przesuw liniowy X, Y, Z, 2 osie obrotu
Luneta sekcyjna na wysięgnikuLiecaGZ6Zakres powiększenia, 6,7x i 40x
Stymulator nerwów/mięśniAstro-Med Grass TelefactorGrass S88Dwuimpulsowy stymulator napięcia: dwa kanały wyjściowe, które mogą być obsługiwane niezależnie lub zsynchronizowane w celu generowania nieizolowanych impulsów o stałym napięciu (od 10 mv do 150 V). Impulsy mogą być pojedyncze (10 μ s do 10 s), powtarzalne (0,01 Hz do 1 KHz) i pociągi (1 ms do 10 s) oraz zsynchronizowane z wejściami i wyjściami TTL. Wysyłaj wyjścia TTL przez kanały wyjściowe złącza DB25 do kanałów wejściowych TTL ViewPoint EyeTracker. Uwaga: Astro-Med Grass Telefactor nie jest już dostępny.
Urządzenie do izolacji prąduAstro-Med Grass TelefactorPSIU6Jednostka izolująca bodźce prądowe: umożliwia bezpieczne dostarczanie prądów stałych przez S88 do preparatu. PSIU6 łączy się za pomocą BNC z jednym z kanałów wyjściowych S88. Przełączniki mnożnika na PSIU6 pozwalają S88 generować szeroki zakres amplitud prądu od 0,1 do mikro; Od A do 15 mA.
Alternatywny stymulator nerwów/mięśni z izolacjąimpulsów A-M Systems2100: Urządzenie ma wbudowany izolator do wytwarzania prądów stałych.
do skanowania stopnia EM Izolowany stymulator

Bibliografia

  1. Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
  2. Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-425 (1985).
  3. Lutz, P. L., Milton, S. L. Negotiating brain anoxia survival in the turtle. J Exp Biol. 207, 3141-3147 (2004).
  4. Storey, K. B. Anoxia tolerance in turtles: Metabolic regulation and gene expression. Comp Biochem Physiol A-Mol Integr Physiol. 147 (2), 263-276 (2007).
  5. Granda, A. M., Dearworth, J. R., Subramaniam, B. Balanced interactions in ganglion-cell receptive fields. Vis Neurosci. 16, 319-332 (1999).
  6. Dearworth, J. R., Granda, A. M. Multiplied functions unify shapes of ganglion-cell receptive fields in retina of turtle. J Vis. 2 (3), 204-217 (2002).
  7. Nesbit, S. C., Van Hoof, A. G., Le, C. C., Dearworth Jr, J. R. Jr Extracellular recording of light responses from optic nerve fibers and the caudal photoreceptor in the crayfish. J Undergrad Neurosci Educ. 14 (1), A29-A38 (2015).
  8. McMahon, B. R. Respiratory and circulatory compensation to hypoxia in crustaceans. Resp Phsiol. 128 (3), 349-364 (2001).
  9. Leigh, R. J., Zee, D. S. The neurology of eye movements. , 3rd edition, Oxford University Press. New York. (1999).
  10. Robinson, D. A. A method of measuring eye movement using a scleral search coil in a magnetic field. IEEE Trans Biomed Eng. 10, 137-145 (1963).
  11. Judge, S. J., Richmond, B. J., Chu, F. C. Implantation of magnetic search coils for measurement of eye position: an improved method. Vis Res. 20, 535-538 (1980).
  12. Ong, J. K. Y., Halswanter, T. Measuring torsional eye movements by tracking stable iris features. J Neurosci Meth. 192, 261-267 (2010).
  13. Kimmel, D. L., Mammo, D., Newsome, W. T. Tracking the eye non-invasively: simultaneous comparison of the scleral search coil and optical tracking techniques in the macaque monkey. Front Behav Neurosci. 6 (49), 1-17 (2012).
  14. Otero-Millan, J., Roberts, D. C., Lasker, A., Zee, D. S., Kheradmand, A. Knowing what the brain is seeing in three dimensions: A novel, noninvasive, sensitive, accurate, and low-noise technique for measuring ocular torsion. J Vis. 15 (14), 1-15 (2015).
  15. Demski, L. S., Bauer, D. H. Eye movements evoked by electrical stimulation of the brain in anesthetized fishes. Brain Behav Evol. 11, 109-129 (1975).
  16. Gioanni, H., Bennis, M., Sansonetti, A. Visual and vestibular reflexes that stabilize gaze in the chameleon. Vis Neurosci. 10, 947-956 (1993).
  17. Straka, H., Dieringer, N. Basic organization principles of the VOR: lessons from frogs. Prog Neurobio. 73 (4), 259-309 (2004).
  18. Voss, J., Bischof, H. -J. Eye movements of laterally eyed birds are not independent. J Exp Biol. 212 (10), 1568-1575 (2009).
  19. Ariel, M. Independent eye movements in the turtle. Vis Neurosci. 5, 29-41 (1990).
  20. Ariel, M., Rosenberg, A. F. Effects of synaptic drugs on turtle optokinetic nystagmus and the spike responses of the basal optic nucleus. Vis Neurosci. 7, 431-440 (1991).
  21. Balaban, C. D., Ariel, M. A "beat-to-beat" interval generator for optokinetic nystagmus. Biol Cybern. 66, 203-216 (1992).
  22. Keifer, J. In vitro eye-blink reflex model: Role of excitatory amino acid receptors and labeling of network activity with sulforhodamine. Exp Brain Res. 97, 239-253 (1993).
  23. Keifer, J., Armstrong, K. E., Houk, J. C. In vitro classical conditioning of abducens nerve discharge in turtles. J Neurosci. 15, 5036-5048 (1995).
  24. Rosenberg, A. F., Ariel, M. A model for optokinetic eye movements in turtles that incorporates properties of retinal slip neurons. Vis Neurosci. 13, 375-383 (1996).
  25. Ariel, M. Open-loop optokinetic responses of the turtle. Vis Res. 37, 925-933 (1997).
  26. Anderson, C. W., Keifer, J. Properties of conditioned abducens nerve responses in a highly reduced in vitro brainstem preparation from the turtle. J Neurophysiol. 81, 1242-1250 (1999).
  27. Keifer, J. In vitro classical conditioning of the turtle eyeblink reflex: Approaching cellular mechanisms of acquisition. Cerebell. 2, 55-61 (2003).
  28. Zhu, D., Keifer, J. Pathways controlling trigeminal and auditory nerve-evoked abducens eyeblink reflexes in pond turtles. Brain Behav Evol. 64, 207-222 (2004).
  29. Jones, M. S., Ariel, M. The effects of unilateral eighth nerve block on fictive VOR in the turtle. Br Res. 1094, 149-162 (2006).
  30. Jones, M. S., Ariel, M. Morphology, intrinsic membrane properties, and rotation-evoked responses of trochlear motoneurons in the turtle. J Neurophysiol. 99 (3), 1187-1200 (2008).
  31. Krenz, J. G., Naylor, G. J. P., Shaffer, H. B., Janzen, F. J. Molecular phylogenetics and evolution of turtles. Mol Phylogenet Evol. 37 (1), 178-191 (2005).
  32. Dearworth, J. R. Jr, et al. Role of the trochlear nerve in eye abduction and frontal vision of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Comp Neur. 52, 3464-3477 (2013).
  33. Dearworth, J. R. Jr, et al. Pupil constriction evoked in vitro by stimulation of the oculomotor nerve in the turtle (Trachemys scripta elegans). Vis Neurosci. 26, 309-318 (2009).
  34. Mead, K., et al. IFEL TOUR: a description of the introduction to FUN electrophysiology labs workshop at Bowdoin College, July 27-30, and the resultant faculty learning community. J Undergrad Neurosci Educ. 5, A42-A48 (2007).
  35. Jackson, D. C., Ultsch, G. R. Physiology of hibernation under the ice by turtles and frogs. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 313 (6), 311-327 (2010).
  36. Romano, J. M., Dearworth, J. R. Jr Pupil constriction evoked by stimulation of the ciliary nerve in the red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans). J Penns Acad Sci. 85, 4-8 (2011).
  37. Miller, J. M., Robins, D. Extraocular-muscle forces in alert monkey. Vis Res. 32, 1099-1113 (1992).
  38. Gamlin, P. D., Miller, J. M. Extraocular muscle motor units characterized by spike-triggered averaging in alert monkey. J Neurosci Meth. 204, 159-167 (2011).
  39. Quaia, C., Ying, H. S., Optican, L. M. The Viscoelastic properties of passive eye muscle in primates. III: Force elicited by natural elongations. PLOS ONE. 5, A236-A254 (2010).
  40. Anderson, S. R., et al. Dynamics of primate oculomotor plant revealed by effects of abducens microstimulation. J Neurophys. 101, 2907-2923 (2009).
  41. Maxwell, J. H. Anesthesia and surgery. Turtles: Perspective and Research. Harless, M., Morlock, H. , Wiley. New York. 127-152 (1979).
  42. AVMA Panel on Euthanasia. American Veterinary Medical Association. J Am Vet Med Assoc. 218 (5), 669-696 (2001).
  43. Clarke, R. J. Shaping the pupil's response to light in the hooded rat. Exp Br Res. 176, 641-651 (2007).
  44. Bennett, R. A. A review of anesthesia and chemical restraint in reptiles. J Zoo Wild Med. 22 (3), 282-303 (1991).
  45. Bickler, P. E., Buck, L. T. Hypoxia Tolerance in Reptiles, Amphibians, and Fishes: Life with Variable Oxygen Availability. Ann Rev Physiol. 69, 145-170 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar ruch w ga ek ocznychstymulacja nerw w czaszkowychpreparat in vitroizolacja g owy wiapodczerwone ledzenie wideokalibracja gimbalaparametry stymulacji elektrycznejanaliza sygna w neuronalnychkwantyfikacja rotacji oka
Kinematyka oka mierzona za pomocą stymulacji nerwów czaszkowych in vitro u żółwia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.