Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy szczegółowy proces ilościowej analizy punktowej (QDB) poprzez określenie bezwzględnej zawartości docelowego białka, białka aktynowego capping, gelsolin-like (CAPG), w trzech różnych tkankach myszy. Demonstrujemy wysokoprzepustową, wygodną, ilościową technikę immunoblot do walidacji biomarkerów na poziomie komórkowym i tkankowym.

Streszczenie

Brak wygodnej, ilościowej, wysokoprzepustowej metody immunoblot do bezwzględnego określania zawartości określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym znacznie hamuje postęp w badaniach proteomicznych. Wyniki uzyskane za pomocą obecnie dostępnych technik immunoblot są również względne, co uniemożliwia jakiekolwiek próby łączenia niezależnych badań z analizą próbek białek na dużą skalę. W tym badaniu demonstrujemy proces ilościowej analizy igłowej (QDB) w celu uzyskania bezwzględnej kwantyfikacji w formacie o wysokiej przepustowości. Korzystając z dostępnego na rynku wzorca białkowego, jesteśmy w stanie określić bezwzględną zawartość białka aktynowego capping, żelsolinopodobnego (CAPG) w próbkach białkowych przygotowanych z trzech różnych tkanek myszy (nerki, śledziony i prostaty) wraz ze szczegółowym wyjaśnieniem szczegółów eksperymentalnych. Proponujemy analizę QDB jako wygodną, ilościową, wysokoprzepustową metodę immunoblot bezwzględnej kwantyfikacji poszczególnych białek na poziomie komórkowym i tkankowym. Metoda ta znacząco pomoże w walidacji biomarkerów i weryfikacji ścieżek w różnych obszarach badań biologicznych i biomedycznych.

Wprowadzenie

Wraz z ekscytującymi postępami w badaniach genomicznych w ostatnich latach, w dziedzinie badań biomedycznych obserwuje się również znaczący postęp w badaniach proteomicznych. Wraz z rosnącą akumulacją danych biologicznych zarówno na poziomie genomicznym, jak i proteomicznym, wykorzystanie narzędzi bioinformatycznych do analizy tych danych stało się przedmiotem badań biomedycznych w dającej się przewidzieć przyszłości. W związku z tym sukces badań bioinformatycznych zwiększa zapotrzebowanie na większą i lepszą jakość danych ze strony społeczności badaczy biologicznych i biomedycznych, a zadanie to można osiągnąć tylko dzięki postępowi technologicznemu na poziomie genomicznym i proteomicznym.

Spektrometria mas (MS) i analiza immunoblot to obecnie dwie dominujące techniki analizy białek. Stwardnienie rozsiane zdominowało badania proteomiczne w ostatnich latach, umożliwiając jednoczesną analizę tysięcy pojedynczych białek. Z drugiej strony techniki oparte na immunoblocie, w tym western blot i dot blot, również odegrały znaczącą rolę w badaniach nad białkami nawet od czasu ich wynalezienia^1,2,3,4,5. Test immunoenzymatyczny (ELISA)5^,6,7 i mikromacierz białek z odwróconą fazą (RPPM)^8,9 można uznać za wysokoprzepustowy format analizy immunoblot. Jednak wszystkie te metody testów immunologicznych, z wyjątkiem ELISA, mierzą względny poziom ekspresji określonego białka. Względny charakter tych metod stanie się prawdziwym problemem dla badań populacyjnych, ponieważ analiza musi być wykonywana w tym samym czasie, co uniemożliwia jakiekolwiek wysiłki zmierzające do zwiększenia wielkości puli poprzez wielokrotne analizy. Co więcej, wyniki tych badań są tylko częściowo ilościowe, co komplikuje wszelkie wysiłki bioinformatyczne w zakresie analizy danych. Tymczasem, mimo że test ELISA doskonale nadaje się do wysokoprzepustowej analizy bezwzględnej próbek białek, technika ta wydaje się spełniać wyzwania w złożonych środowiskach, takich jak komórki lub tkanki, ze względu na niską zdolność wiązania i multipleksowanie¹⁰.

Opracowaliśmy metodę immunoblot odpowiednią do badań populacyjnych o kluczowych cechach wygody, wysokiej przepustowości, ilościowej i odpowiedniej do bezwzględnego oznaczania zawartości białka, i nazwaliśmy tę technikę ilościową analizą punktową (QDB)¹¹. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół analizy QDB i demonstrujemy metodę, określając bezwzględną zawartość białka w określonym białku, CAPG, w trzech różnych tkankach myszy, w tym nerkach, śledzionie i prostacie. Uważamy, że ten szczegółowy protokół dobrze ilustruje wykonalność i wygodę tej metody oraz dostarcza wskazówek, jak uniknąć potencjalnych pułapek w praktyce tej metody.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Uniwersytetu Medycznego w Binzhou i zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego w Binzhou.

1. Przygotowanie próbki

1. Weź 50 mg tkanki myszy do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl buforu do lizy (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 mM Na₂P2O₇, 1% Triton X-100, 10% glicerol), uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy (100 mM NaF, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 5 μg/ml pepstatyny, 10 μg/ml leupeptyny, 5 μg/ml aprotyniny).
2. Homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora przez 1 minutę na lodzie.
3. Wirować przez 10 minut w temperaturze 8 000 x g w temperaturze 4 °C.
4. Zebrać supernatant do nowych probówek (1,5 ml) i wyjąć 1 μl do testu stężenia białka za pomocą zestawu BCA.
   nuta: Wszystkie powszechnie stosowane lizy do analizy western blot i analizy Dot blot mogą być używane do analizy QDB.

2. Określanie swoistości przeciwciała

1. Przygotować lizaty próbki (20 μg) w sekcji 1.4, BSA wolne od IgG (20 μg), białko wzorcowe (600 pg), do analizy western blot.
   nuta: BSA wolne od IgG stosuje się jako kontrolę ujemną, a standardowe białko stosuje się jako kontrolę pozytywną. Swoistość przeciwciała wykazuje się poprzez pokazanie jednego pasma o odpowiedniej wielkości za pomocą analizy western blot.

3. Definiowanie zakresu liniowego analizy QDB

1. Rozpuścić białko wzorcowe za pomocą ddH₂O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1 200 pg/μL.
2. Rozcieńczyć skoncentrowane białko z przygotowanych próbek w sekcji 1,4-4 μg/μl.
3. Rozpuścić BSA za pomocą_ddH2O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1,200 pg/μL i 4 μg/μL.
4. Serię rozcieńczeń białka wzorcowego i przygotowanych próbek przygotowano zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabelach 1 i 2.
5. Wymieszać ze sobą 10 μl rozcieńczonego białka wzorcowego lub przygotowanych do rozcieńczenia próbek i 10 μl 2x bufor ładujący (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glicerol, 4% SDS, 0,2% błękit bromfenolowy, 200 mM DTT).

S1
(0pg/μl) S2 (33,3 pg/μl) S3
(100pg/μl) S3
(300 pg/μl) S5
(600 pg/μl) S6
(1200 pg/μl) Standardowe białko (1200 pg / μl) 0 Pytanie 1,39 Rozdział 4.17 Rozdział 12,5 25 50 Rozdział Wolne od IgG BSA
(4pg/μl) 50 Rozdział Lokal mieszkalny 48,61 pkt. Z numerem 45,83 pkt. 37,5 pkt. 25 0 łączny 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział

Tabela 1. Schemat rozcieńczania dla krzywej białka standardowego.

X1
(0μg/μl) X2
(0,25 μg/μl) X3
(0,5 μg/μl) X4
(1μg/μl) X5
(2μg/μl) X6
(4 μg/μl) Próbka (4 μg / μl) 0 Pytanie 3,125 Godzina 6,25 Rozdział 12,5 25 50 Rozdział BSA wolne od IgG (4 μg / μl) 50 Rozdział 46.875 TGL Lokal z numerem 43,75 37,5 pkt. 25 0 łączny 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział 50 Rozdział

Tabela 2. Schemat rozcieńczania dla przygotowanych próbek

6. Podgrzewać mieszaniny w temperaturze 85 °C przez 5 minut.

4. Proces analizy QDB

1. Przykładowa aplikacja
   1. Podeprzyj płytkę QDB, aby spód płyty nie dotykał powierzchni stołu. Na przykład użyj pustego pudełka na końcówki do pipet jako podpory.
   2. Załadować do 2 μl próbki do środka membrany na dnie pojedynczej jednostki płytki QDB.
2. Suszenie talerza
   1. Pozostawić załadowaną płytkę QDB na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie pozostawić załadowaną płytkę w temperaturze 37 °C na 15 minut w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
3. Blokowanie płyty
   1. Zanurz płytkę QDB w buforze transferowym (0,039 M glicyna, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alkohol metylowy) i delikatnie potrząsaj płytką przez 10 s.
   2. Delikatnie opłucz płytkę QDB trzykrotnie TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem, 0,1% Tween 20), a następnie myj płytkę przez 5 minut w TBST pod ciągłym wstrząsaniem.
   3. Zablokować płytkę QDB buforem blokującym (5% mleka beztłuszczowego w TBST (100 μL/basenik) na 1 godzinę przy ciągłym wstrząsaniu.
4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1:500 do 1:5 000) i dodać 100 μl do każdego pojedynczego dołka zwykłej płytki 96-dołkowej. Włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej i inkubować połączone płytki przez 2 godziny w temperaturze suchej lub przez noc w temperaturze 4 °C przy ciągłym wstrząsaniu.
   2. Alternatywnie, należy umieścić płytkę QDB w pudełku i wypełnić pudełko buforem blokującym 2 do 3 mm powyżej części membranowej płytki, jeśli to samo przeciwciało jest używane na całej płytce. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe o wybranym stężeniu i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, stale wstrząsając.
   3. Delikatnie opłucz płytkę TBST trzy razy, a następnie umyj ją TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut pod ciągłym wstrząsaniem.
5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
   1. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1:1 000 do 1:50 000) i podwielokrotnie 100 μl/basenik na płytkę 96-dołkową lub w pudełku opisanym w sekcji 4.4.2, a następnie inkubować płytkę QDB wewnątrz załadowanej płytki 96-dołkowej lub pudełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod ciągłym wytrząsaniem.
   2. Delikatnie opłucz płytkę QDB 3 razy za pomocą TBST, a następnie umyj płytkę 3 razy, po 5 minut za pomocą TBST pod ciągłym wstrząsaniem.
6. Kwantyfikacji
   1. Przygotuj ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Podwielokrotny substrat ECL umieścić na płytce 96-dołkowej (100 μl/studzienkę) i włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej na 2 minuty pod ciągłym wstrząsaniem.
   3. Wyjmij płytkę QDB z płytki 96-dołkowej i krótko wstrząśnij, aby usunąć nadmiar płynu. Umieścić płytkę na białej płytce do mikromiareczkowania.
   4. Włącz czytnik mikropłytek i wybierz "płytkę z pokrywą" w interfejsie użytkownika przed umieszczeniem połączonych płytek (płytka QDB + adapter białej płytki) w czytniku mikropłytek w celu ilościowego określenia.
      nuta: Upewnij się, że używasz białej, nieprzezroczystej płytki do mikromiareczkowania jako adaptera, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń ze strony płytki. Upewnij się, że wybrałeś "płytkę z pokrywą", aby uniknąć zakleszczenia maszyny, gdy połączone płytki (płytka QDB + adapter płytki 96-dołkowej) są umieszczone w czytniku mikropłytek.

Wyniki

Określenie bezwzględnej ilości dowolnego białka, w tym białka CAPG w tkance myszy, wymaga standardowo zarówno specyficznego przeciwciała, jak i oczyszczonego białka. Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy na dużą skalę należy również ustalić liniowy zakres analiz zarówno wzorca białka, jak i lizatów. Liniowy zakres przeciwciała jest w dużym stopniu zależny od przeciwciała jako takiego, a odpowiedni zakres rozcieńczenia określonego przeciwciała musi być zweryfikowany przez każdego indywidualnego użytkownika.

Najpierw określiliśmy specyficzność przeciwciała CAPG w tkankach nerki, śledziony i prostaty myszy, korzystając z analizy western blot z kontrolą negatywną (IgG free BSA) i kontrolą pozytywną (komercyjnie dostępne białko CAPG) (Rysunek 1A). Przeciwciało anty-CAPG było swoiste przeciwko lizatom ze śledziony myszy, serca, mięśni i prostaty (wykryto jedno prążko). Niespecyficzne prążki obserwowano w lizatach z nerek i wątroby. Jednak w lizacie nerkowym niespecyficzne prążki były znacznie słabsze niż swoiste prążki, co sugeruje, że przeciwciało nadaje się do analizy tkanki nerkowej. Następnie określono liniowy zakres wzorca białka i ilość lizatów do analiz za pomocą dwóch równoległych krzywych dawki. Komercyjnie dostępne białko CAPG było seryjnie rozcieńczane, jak wskazano w Tabeli 1 na podstawie naszych wcześniejszych doświadczeń, a lizaty tkankowe nerki, śledziony i prostaty myszy były również rozcieńczane w oparciu o ilość całkowitego białka w lizatach określoną przez zestaw do oznaczania białka całkowitego BCA. Dwa badania dawkowe przeprowadzono obok siebie i wykreślono razem w Rysunek 1B. Odpowiednią ilość lizatów mysich nerek, śledziony i prostaty dobrano na podstawie sygnałów QDB mierzonych przez czytnik mikropłytek w dowolnej jednostce. Oryginalny odczyt dla tego eksperymentu pokazano w tabeli 3.

W ostatnim kroku, seryjnie rozcieńczony wzorzec białka CAPG oraz lizaty z mysich nerek, śledziony i prostaty zostały załadowane na płytkę QDB. W tym przypadku zdecydowaliśmy się załadować 0,3 μg / próbkę dla lizatów z nerki i śledziony myszy oraz 1 μg / próbkę dla lizatów z analizy prostaty myszy , ponieważ na tych poziomach odczyt QDB był co najmniej 20-krotnie wyższy niż tło, podczas gdy mieścił się w liniowym zakresie analizy opartym na krzywej dawki zarówno lizatów, jak i wzorca białka. Płytka została poddana opisanemu protokołowi QDB, zanim płytka została oznaczona ilościowo bezpośrednio przez czytnik mikropłytek. Korzystając z seryjnie rozcieńczalnionego oczyszczonego białka CAPG, mogliśmy ustalić krzywą dawka-odpowiedź, równanie i R2 za pomocą prostej analizy regresji przy użyciu dostępnego oprogramowania (np. Microsoft Office Excel). Sygnały QDB z lizatów mysich nerek, śledziony i prostaty przeliczono na bezwzględną ilość białka CAPG w tych lizatach za pomocą ustalonego równania, a wyniki skorygowano o całkowitą ilość białka, w tym przypadku 0,3 μg dla lizatów z mysich śledzion, i 1 μg dla lizatów z mysiej prostaty, dla końcowego stężenia białka CAPG w tych tkankach jako pg/μg. Wyniki są pokazane w Rysunek 1C z oryginalnym odczytem pokazanym w Tabeli 4.

Rysunek 1. Reprezentatywny wynik analizy QDB w celu określenia bezwzględnych poziomów CAPG w trzech tkankach myszy (nerki, śledziona i prostata). ZA. Badanie swoistości króliczego przeciwciała anty-CAPG przy użyciu lizatów tkanek myszy przygotowanych ze śledziony, serca, mięśni, nerek, wątroby i prostaty przy użyciu analizy western blot z kontrolą ujemną (IgG wolne BSA) i kontrolą pozytywną (komercyjnie dostępne białko CAPG). B. określenie liniowego zakresu analiz QDB króliczego przeciwciała anty-CAPG z wykorzystaniem lizatów przygotowanych z prostaty, nerek, śledziony oraz z wykorzystaniem oczyszczonego rekombinowanego wzorca białka CAPG. Wyniki były średnią z trzech powtórzeń. C. Bezwzględne oznaczanie poziomów CAPG w lizatach przygotowanych z mysich nerek, śledziony i prostaty. Każdy pasek reprezentuje jedną tkankę z pojedynczej myszy. Wyniki były średnią trzykrotną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 3: Wyniki badań dawkowania z czytnikiem mikropłytek z użyciem zarówno seryjnie rozcieńczonych, zbiorczych lizatów ze śledziony, nerek i prostaty myszy, jak i oczyszczonego rekombinowanego białka CAPG.

Tabela 4: Wynik analizy QDB z mikropłytki bezwzględnego poziomu CAPG w nerkach myszy (8), śledzionie (4) i prostacie (5) przy użyciu rekombinowanego białka CAPG jako standardu.

Dyskusja

Spośród wszystkich obecnie dostępnych technik analizy immunologicznej białek, z wyjątkiem ELISA, analiza QDB jest jedyną metodą pozwalającą osiągnąć bezwzględną zawartość określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym w formacie o wysokiej przepustowości. Chociaż spektrometria mas ze stabilnym izotopem jest w stanie osiągnąć bezwzględną kwantyfikację kilku białek, metoda ta nie jest jeszcze zaprojektowana z myślą o wysokiej przepustowości. W tym badaniu pokazaliśmy proces analizy QDB w celu uzyskania bezwzględnego określenia poziomu białka CAPG w tkankach myszy, w tym nerkach, śledzionie i prostacie. Stwierdzono, że poziomy CAPG wynoszą od 200 do 360 pg/g w tkankach nerkowych myszy, od 460 do 650 pg/g w śledzionie myszy i od 330 do 390 pg/g w tkankach prostaty myszy.

W porównaniu z ELISA, analiza QDB wymaga minimalnego wysiłku, aby została opracowana w zwykłym laboratorium. Po pierwsze, płytka QDB jest oparta na membranie nitrocelulozowej w celu wyeliminowania etapu powlekania w ELISA. Po drugie, analiza QDB wymaga tylko jednego zamiast dwóch specyficznych przeciwciał w teście ELISA typu sandwich. Po trzecie, wysoka zdolność wiązania membrany nitrocelulozowej w porównaniu z powierzchnią płytki ELISA pozwala również membranie wytrzymać rygorystyczne etapy mycia, zwykle stosowane w analizie immunoblot w celu zmniejszenia zakłóceń tła. Ta funkcja jest bardzo przydatna w analizie skomplikowanych lizatów przygotowanych z komórek i tkanek. Natomiast ze względu na stosunkowo niską zdolność wiązania płytek ELISA, redukcja tła podczas analizy skomplikowanych lizatów komórkowych i tkankowych staje się prawdziwym wyzwaniem w procesie rozwojowym.

Analizę QDB można łatwo zastosować w dowolnym laboratorium z dostępem do określonego przeciwciała. Należy jednak wspomnieć, że specyficzność przeciwciała jest terminem względnym, ograniczonym przez czynniki, w tym gatunek, typy tkanek i typy komórek. Jak pokazano na rysunku 1A, przeciwciało CAPG jest specyficzne podczas analizy lizatu z nerki, śledziony i prostaty myszy, a mimo to staje się niespecyficzne podczas analizy wątroby myszy. W rzeczywistości rutynowo stwierdzaliśmy, że jedno przeciwciało jest specyficzne dla jednego typu tkanki, ale nie zawsze jest specyficzne dla innego typu tkanki tego samego gatunku. W związku z tym konieczna jest wcześniejsza analiza western blot, aby zapewnić specyficzność analizy QDB. W rzeczywistości względna swoistość przeciwciała może być przyczyną fałszywych wyników często związanych z analizą ELISA, ponieważ bez względu na to, ile wysiłku firma produkcyjna mogła włożyć, aby zapewnić specyficzność testu, nie może wyczerpać wszystkich możliwych typów próbek, które użytkownicy mogą zdecydować się na analizę przy użyciu swoich produktów ELISA.

Podobnie jak w przypadku wszystkich testów immunologicznych, potencjalnym problemem związanym z metodą analizy QDB jest brak spójności jakości komercyjnego przeciwciała. Nawet jeśli używana jest pozorna jakość przeciwciała tej samej firmy (ten sam numer katalogowy itp.), mogą wystąpić duże różnice między zakupami ze względu na zmienność między partiami. W związku z tym, o ile nie zostanie osiągnięte pełne zaufanie do jakości dostępnego przeciwciała, ważne jest, aby przy każdym zakupie ponownie scharakteryzować przeciwciało.

Podsumowując, podajemy tutaj szczegółowy protokół i przykład użycia metody analizy QDB w celu uzyskania bezwzględnego ilościowego określenia określonego białka na poziomie tkankowym. Pokazujemy, że metoda analizy QDB jest wygodnym narzędziem dla każdego, kto jest zainteresowany wysokoprzepustową, ilościową analizą immunoblotów. Jej zdolność do osiągnięcia bezwzględnego określenia zawartości określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym również odróżnia tę technikę od tradycyjnych technik immunoblot. Cecha ta pozwala na łączenie i porównywanie wyników z wielu analiz, co jest niezbędne zwłaszcza w badaniach populacyjnych większych populacji, oraz realizację odpowiednich badań asocjacyjnych na poziomie białek w najbliższej przyszłości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Czytnik mikropłytek	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB płytka	Yantai Zestern Co.Ltd		Płytki są dostępne na żądanie w celu weryfikacji za pośrednictwem poczty elektronicznej lub odwiedzając www.zestern.net.
Peroksydaza AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, sy hms, hrs, hu, ms, rat, shp sr prot)	jackson	711-035-152
Podłoże o podwyższonej chemiluminescencji	Thermo	32134
Królik anty-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
Białko CAPG	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin Special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
Test medycyny chińskiej EGTA	Sigma BNN1913
Na2P2O7	Haituo	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glicerol	Sigma	G7757
fluorek fenylometylosulfonylu	pepstatyna Sigma	P7626-5G
	Sigma	Z290033
leupeptyna	Sigma	L2884
aprotynina	Sigma	A3428
Tris-HCL	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920