Method Article

Usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3D z opcjonalną modyfikacją 2D

DOI:

10.3791/56888

⸱

December 9th, 2017

 , 
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy uproszczony protokół różnicowania 3D dla hPSC, wykorzystujący zdefiniowane czynniki wzrostu pożywki i zredukowanej, zdolny do generowania agregatów komórkowych z wczesnymi strukturami neuroepitelicznymi i dodatni dla markerów związanych z móżdżkiem, a także opcjonalną modyfikację 2D do różnicowania komórek jako monowarstwę do generowania funkcjonalnych neuronów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmniejszenie złożoności i kosztów protokołów różnicowania jest ważne dla badaczy. Zainteresowanie to wpisuje się w obawy dotyczące możliwych niezamierzonych skutków, jakie czynniki zewnętrznego wzorca mogą wprowadzić do modeli rozwoju mózgu lub patofizjologii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), takich jak maskowanie fenotypu choroby. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły różnicowania móżdżku dla hPSC, zaprojektowane przy użyciu prostszej metody uruchamiania, mniejszej liczby czynników wzorcowych i mniejszych wymagań materiałowych niż poprzednie protokoły. Niedawno opracowaliśmy procedury hodowlane, które generują swobodnie unoszące się w powietrzu produkty trójwymiarowe (3D) zgodne z innymi protokołami "organoidowymi" mózgu, w tym morfologiami istotnymi dla modelowania rozwoju mózgu, takimi jak struktury podkomorowe i rombowe wargowe. Drugi wykorzystuje przylegającą, jednowarstwową procedurę 2D w celu całkowitego różnicowania, która jest zdolna do generowania funkcjonalnych neuronów móżdżku, ponieważ produkty są dodatnie dla markerów związanych z móżdżkiem i wykazują napływ wapnia podobny do neuronów. Razem protokoły te oferują naukowcom wybór opcji dostosowanych do różnych celów badawczych, a także podstawowy model do testowania innych rodzajów usprawnionych różnicowań neuronalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły in vitro do różnicowania hPSC w kierunku linii móżdżku początkowo działały na zasadzie naśladowania rozwoju móżdżku in vivo1,2,3,4. W związku z tym wymagały one szeregu czynników wprowadzanych w określonym czasie, aby napędzać wzorce pro-móżdżku i dojrzewanie. Najważniejsze z nich to WNT, białka morfogenetyczne kości (BMP) i czynniki wzrostu fibroblastów (FGF) o znanych rolach w rozwoju środkowej części tyłomózgowia i tworzeniu organizatora przesmyku5,6,7. Oczywiście, każdy dodatkowy krok i czynnik oznacza wzrost pracochłonnych manipulacji i większe koszty dla badacza, a więc opracowanie prostszych protokołów zdolnych do osiągnięcia równych wyników jest interesujące. Ta praktyczna kwestia dobrze zazębia się z hipotetycznym pytaniem, czy komórki wymagają tak ścisłej, zewnętrznej kontroli nad swoim rozwojem in vitro.

Dla różnicowania móżdżku, protokół opublikowany w 2015 roku dotyczył konieczności użycia dużej liczby czynników wzrostu przy użyciu tylko FGF2, FGF19 i czynnika 1 pochodzącego z komórek zrębu (SDF1) do celów modelowania8. Badanie to różniło się również od wcześniejszych protokołów móżdżku, wykorzystując swobodnie unoszący się system hodowli 3D. Oprócz wytwarzania komórek dodatnich dla markerów móżdżku, wykazano, że "organoidy" mózgowe wygenerowane przez ich technikę wykazują odpowiednią morfologię, niedostępną w tradycyjnych kulturach jednowarstwowych 2D, takich jak rombowe struktury przypominające wargi. Chociaż jest to mniej skomplikowane i kosztowne w odniesieniu do czynników wzrostu, inne cechy, takie jak tworzenie jednolitych ciał zarodkowych (EB) i hodowla na 96-dołkowych płytkach (96WP), sprawiły, że na początkowych etapach było to skomplikowane proceduralnie. Inny protokół 3D, opublikowany w tym samym roku, donosił o udanym różnicowaniu do linii nerwowych przy użyciu powszechnych i niedrogich technik hodowli komórkowych9. Chociaż grupa ta badała różnicowanie kory mózgowej, a nie móżdżku, nie można było wykluczyć zastosowania ich koncepcji różnicowania móżdżku.

Niedawno opisaliśmy protokół różnicowania móżdżku 3D przy użyciu zmniejszonej liczby czynników wzorcowych (mianowicie FGF2, 4 i 8), a także uproszczoną konfigurację poprzez utrzymywanie komórek na płytkach 6-dołkowych (6WP) przez cały czas, aby zminimalizować wymagania dotyczące podłoża10. Aby wspomóc produkcję komórek ziarnistych, podczas końcowego etapu dojrzewania zastosowano wygładzonego agonistę (SAG). SAG jest tańszą chemiczną alternatywą dla sonic hedgehog (SHH), która była stosowana we wcześniejszych protokołach móżdżku, ze względu na jej rolę w promowaniu wzrostu prekursorów komórek ziarnistych (GCP) in vivo1,2,11,12,13. Produkty różnicowania były zgodne z tymi z innych protokołów 3D, w tym z obecnością markerów związanych z móżdżkiem w morfologicznie istotnych strukturach8,9. Takie wyniki wzmacniają wcześniejszą wiadomość, że szczegółowa mimikra środowiska in vivo może nie być konieczna w przypadku złożonych protokołów różnicowania 3D in vitro.

Oprócz protokołu 3D, ten raport opisuje protokół 2D, zaprojektowany z tą samą szybką konfiguracją, podstawowymi materiałami i zmniejszoną liczbą czynników wzrostu. Jest zdolny do wytwarzania komórek z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), dodatnich dla markerów związanych z wczesną tożsamością komórek nerwowych, móżdżku i ziarnistości. Ponadto obrazowanie wapnia wskazuje na obecność funkcjonalnych neuronów ludzkich. Możliwość wyboru między protokołami zwiększa poziom elastyczności dla badaczy, dla osób zainteresowanych: (1) generowaniem określonych typów komórek, (2) modelowaniem rozwoju ludzkiego mózgu i powiązanych struktur, (3) analizą zoptymalizowaną w ustawieniach jednowarstwowych (np. nagrania patch-clamp) lub (4) interakcjami komórka-komórka w mieszanych kulturach neuronowych. Ich prosty i tani charakter sprawia, że są one dostępne dla badaczy, którzy są nowicjuszami w dziedzinie hPSC lub potrzebują podstawowych procedur hPSC, na podstawie których mogliby zbadać dalsze opcje różnicowania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowania

UWAGA: Aby zapoznać się ze wszystkimi krokami, zobacz Tabelę materiałów dla konkretnych elementów.

  1. Przygotować 500 ml zdefiniowanej pożywki hodowlanej hPSC do hodowli hPSC
    UWAGA: Użyj podłoża dla kroków 2.1-2.6.
    1. Rozmrozić pożywkę z hPSC przez noc (o/n) w temperaturze 4 °C. Usunąć 12,5 ml pożywki zasadowej hPSC z pożywki butelki, następnie dodać 10 ml suplementu i 2,5 ml (co daje 100 U/L) penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) do butelki.
    2. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni.
      UWAGA: Pożywka hPSC może być używana do zamrażania komórek poprzez dodanie 10 μM inhibitora ROCK (RI) i 10% DMSO.
  2. Przygotować 1 l pożywki do konserwacji neuronów (NMM) do hodowli różnicowania
    UWAGA: Użyj podłoża dla kroków 3.1-4.4.
    1. Wymieszaj DMEM/F12 wzbogacony glutaminą i zasadową pożywkę neuronalną (w stosunku 1:1) w butelce o pojemności 1 l, a następnie uzupełnij (1x) suplementem N2, (1x) suplementem B27, 5 μg/ml insuliny, 1,5 mM L-glutaminy, 100 μM aminokwasami endogennymi (NEAA), 100 U/L Pen/Strep i 10 μM beta-merkaptoetanolem.
    2. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 tygodni.
      UWAGA: Przed dodaniem suplementów do mieszanej pożywki podstawowej należy usunąć odpowiednią objętość, aby dostosować ją do wymaganej objętości dodanych składników w oparciu o stężenia podstawowe.
  3. Przygotować 500 ml 0,5 mM roztworu roboczego EDTA do przechodzenia hPSCs
    UWAGA: Użyj podłoża dla kroków 2.4 i 2.5.
    1. Pod okapem przepływowym przenieś 49 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z 500 ml sterylnej butelki PBS do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 0,5 ml 0,5 M EDTA i 0,9 g NaCl do probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie wymieszaj do rozpuszczenia.
    2. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm i przenieś do sterylnej butelki PBS o pojemności 500 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Przygotowanie płytek do hodowli hPSC do hodowli hPSC
    UWAGA: Użyj płytek dla kroków 2.1-2.6.
    1. Przygotować 50-krotny roztwór roboczy z odpowiednią dla hPSC powłoką adherent (PAAC): Rozmrozić fiolkę z PAAC o/n w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć PAAC w stosunku 1:1 za pomocą DMEM/F12 i przenieść jako 400 μl podwielokrotności do probówek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać 50x roztwór roboczy PAAC w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: (Ważne) PAAC szybko krzepnie w temperaturze pokojowej, dlatego konieczne jest, aby wszystkie składniki (DMEM, probówki itp.) były przechowywane na lodzie (lub w temperaturze 4 °C).
    2. Rozmrozić probówkę z 50-krotnym roztworem roboczym PAAC w temperaturze 4 °C, a następnie rozcieńczyć 50x w zimnym DMEM/F12. Dodać 750 μl/studzienkę rozcieńczonego PAAC do 6WP. Inkubować płytkę przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Płytki PAAC można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C, owijając płytkę po 1 godzinnym okresie inkubacji. Przed użyciem podgrzej płytkę do temperatury 37 °C.
  5. Przygotuj tabliczki antyadhezyjne (AA) do różnicowania kultur
    UWAGA: Użyj płytek dla kroków 3.1-4.1.
    1. Przygotować 5 mg/ml roztworu poli(2-hydroksyetylometakrylanu) (poli-HEMA) w 95% etanolu. Wstrząsać o/n w temperaturze 37 °C aż do uzyskania klarownego roztworu. Przechowywać w RT.
      UWAGA: Filtrowanie przez filtr 0,22 μm może usunąć nierozpuszczony poly-HEMA.
    2. Dodaj poly-HEMA do płytki hodowlanej, tak aby pokryła dno każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 dni i sprawdzić płytkę, aby zapewnić całkowite odparowanie cieczy/równomierne pokrycie studzienek. Tabliczki AA mogą być pakowane i przechowywane w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotowanie płytek z poli-L-ornityny/Lamininy (PLO/LAM) do hodowli różnicowania
    UWAGA: Użyj tabliczek dla kroków 4.2-4.4.
    1. Pokryj powierzchnię studzienek za pomocą 20 μg/ml PLO rozpuszczonego w sterylnym PBS. Inkubować płytkę o/n w temperaturze 37 °C. Odessać PLO i przepłukać 3 razy PBS.
      UWAGA: (Opcjonalnie) Inkubowana płytka z PLO może być owinięta i przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
    2. Powierzchnię studzienek pokrytych PLO należy pokryć roztworem o stężeniu 10 μg/ml MD rozpuszczonym w sterylnym PBS. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C lub o/n w temperaturze 4 °C. Usunąć MD i przemyć studzienki 2-3 razy PBS, a następnie natychmiast dodać odpowiednią pożywkę i/lub komórki.
      UWAGA: (Opcjonalnie) Usunięty roztwór MD można przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie użyć do 2 razy. (Ważne) Nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni pokrytych LAM; Aby temu zapobiec, należy natychmiast dodać PBS lub odpowiednią pożywkę.
       

2. Protokół 1: Hodowla hPSC bez feederu

UWAGA: hESC zostały uzyskane od organizacji niekomercyjnej (linia H01, patrz Tabela materiałów). Trzy linie kontrolne hiPSC (hvs51, 60 i 88) zostały wygenerowane przez przeprogramowanie fibroblastów od trzech zdrowych pacjentów (fibroblasty pochodziły od anonimowych, niezidentyfikowanych dawców, a zatem były zwolnione z zatwierdzenia przez IRB)10,17.

  1. Utrzymuj hPSC w hodowli wolnej od karmnika
    1. Po rozmrożeniu i posianiu hPSC na płytkach PAAC w pożywce hPSC (patrz krok 2.2), należy utrzymać hPSC w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Odświeżaj pożywkę hPSC codziennie (patrz krok 2.3), z wyjątkiem dnia po rozmrożeniu lub pasażowaniu, i badaj komórki pod mikroskopem (cele: 2,5x/0,06, 5x/0,12 Ph0, 10x/0,25 Ph1), aby obserwować tempo wzrostu i zidentyfikować potencjalne obszary różnicowania (Rysunek 3, lewy górny panel pokazuje przykład różnicowania).
    2. Przejście hPSC co 3-4 dni lub gdy kultura osiągnie >80% konfluencji. Jeśli mniej niż 5% komórek wykazuje różnicowanie, należy zastosować normalną metodę pasażowania hPSC (patrz krok 2.4), w przeciwnym razie należy zastosować metodę delikatną (patrz krok 2.5). Gdy hPSC nie są już potrzebne w hodowli, można je zamrozić w celu długotrwałego przechowywania (patrz krok 2.6).
  2. Rozmrozić hPSC w pożywce hPSC
    1. Przenieść wymaganą objętość pożywki hPSC do sterylnych probówek w celu przeprowadzenia procesu rozmrażania (9 ml/probówkę kriogeniczną) i na przygotowaną płytkę PAAC w celu otrzymania rozmrożonych komórek. Uzupełnij pożywkę w obu probówkach o 10 μM RI.
    2. Wyjmij krioprobówkę z magazynu LN2 i umieść bezpośrednio w łaźni wodnej (37 °C). Gdy pozostaną tylko małe kryształki lodu, wyjmij je z łaźni wodnej i przenieś zawartość probówki kriogenicznej do probówki w celu rozmrożenia (całkowita objętość 10 ml). Odwirować probówkę o sile 290 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Za pomocą pipety serologicznej usunąć roztwór PAAC z dołków płytki PAAC (patrz krok 1.4) przeznaczonej do odbioru komórek, a następnie dodać pożywkę hPSC o stężeniu 10 μM RI.
      UWAGA: (Ważne) Nie zasysaj roztworu PAAC za pomocą igły ssącej, ponieważ może on zestalać się i zatkać przewody do pompy próżniowej.
    4. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki w pożywce hPSC z 10 μM RI. Rozprowadź komórki na płytce docelowej w stosunku 1 rurki kriogenicznej / studzienki 6WP. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i nie odświeżać podłoża przez 1 dzień.
      UWAGA: Uruchomienie komórek w temperaturze 5%O2 może zwiększyć przeżywalność komórek.
  3. Odśwież pożywkę hPSC
    1. Podgrzać niezbędną objętość pożywki hPSC w sterylnej probówce w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej; sugeruje się 2 ml / studzienkę 6WP.
      UWAGA: (Opcjonalnie): Dodając dodatkową ilość pożywki hPSC, hPSC mogą pozostać przez dodatkowy dzień bez odświeżania; Nie pozwalaj jednak na to częściej niż raz w tygodniu.
    2. Odessać pożywkę ze studzienek zawierających hPSC i dodać świeżą pożywkę hPSC.
    3. Hodowla hPSC w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Pasażowe hPSC w pożywce hPSC
    1. Przenieść wymaganą objętość pożywki hPSC do sterylnych probówek w celu przeprowadzenia procesu pasażowania i przygotowania płytki PAAC do przyjęcia pasażowanych komórek. Uzupełnić podłoże na płytkę docelową o 10 μM RI. Podgrzej probówki w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej.
      UWAGA: Przygotowanie i obchodzenie się z materiałem będzie się różnić w przypadku użycia alternatywnego materiału powłokowego niż wymieniony w Tabeli materiałów.
    2. Za pomocą pipety serologicznej usunąć roztwór PAAC z dołków płytki PAAC (patrz krok 1.4) przeznaczonej do odbioru komórek, a następnie dodać pożywkę hPSC o stężeniu 10 μM RI.
      UWAGA: (Ważne) Nie zasysaj roztworu PAAC za pomocą igły ssącej, ponieważ może on zestalać się i zatkać przewody do pompy próżniowej.
    3. Odessać pożywkę z dołków z hPSC, które mają być pasażowane, przemyć komórki dwukrotnie 0,5 mM EDTA, następnie dodać 0,5 mM EDTA i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: 1 ml / studzienka 6WP to wystarczająca objętość EDTA do mycia i inkubacji.
    4. Sprawdź studzienki pod mikroskopem (obiektywy: 2,5x/0,06, 5x/0,12 Ph0, 10x/0,25 Ph1). Jeśli komórki zaczynają się odłączać, odessać roztwór EDTA i przepłukać komórki za pomocą pożywki hPSC.
      UWAGA: (Ważne) Uważaj, aby nie usuwać całych kolonii hPSC podczas zasysania EDTA (nie czekaj, aż całe kolonie się odłączą). Nie należy spłukiwać komórek więcej niż 5 razy, ponieważ może to zaszkodzić hPSC i wpłynąć na pluripotencję. Nie należy również pozostawiać komórek w pożywce hPSC z RI przed wypłukaniem komórek ze studzienek, ponieważ mogą one ponownie przylgnąć do płytki.
    5. Na podstawie oznaczeń empirycznych (zwykle związanych z konfluencją, wielkością kolonii i szybkością wzrostu) przenieś hPSC do studzienek płytki docelowej, stosując stosunek podziału 1:4-1:16 (tj. 1 dołek z pierwotnej płytki na 4 dołki płytki docelowej). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i nie odświeżać podłoża przez 1 dzień.
      UWAGA: Możliwe są proporcje podziału wynoszące 1:16-1:20, aby zapobiec stłoczeniu i poprawić wygląd kolonii.
  5. Pasaż hPSC metodą łagodną (metoda G)
    1. Przenieść wymaganą objętość pożywki hPSC do sterylnych probówek w celu przeprowadzenia procesu pasażowania i przygotowania płytki PAAC do przyjęcia pasażowanych komórek. Uzupełnić podłoże do płytki docelowej o 10 μM RI. Ciepłe rurki z podłożem w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Za pomocą pipety serologicznej usunąć roztwór PAAC z dołków płytki PAAC (patrz krok 1.4) przeznaczonych do odbioru komórek, a następnie dodać pożywkę hPSC o stężeniu 10 μM RI.
      UWAGA: (Ważne) Nie zasysaj PAAC igłą ssącą, ponieważ może to spowodować zestalenie się i zatkanie przewodów do pompy próżniowej.
    3. Odessać pożywkę z dołków z hPSC, które mają być pasażowane, i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą 0,5 mM EDTA. Przy drugim płukaniu odczekać 30 s przed aspiracją EDTA, następnie dodać 1 ml PBS i inkubować przez 4-9 minut w temperaturze 37 °C. Podczas oczekiwania przygotuj sterylną probówkę z 4 ml PBS.
      UWAGA: 1 ml / studzienkę 6WP to wystarczająca objętość EDTA do mycia.
    4. Sprawdź studzienki pod mikroskopem (obiektywy: 2,5x/0,06, 5x/0,12 Ph0, 10x/0,25 Ph1). Jeśli komórki zaczynają się odłączać, ostrożnie postukaj w boki płytki, aby pomóc uwolnić kolonie. Gdy >50% kolonii jest swobodnie pływających, użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby przenieść kolonie w 1 ml PBS do probówki zawierającej 4 ml PBS (nie rozcierać).
      UWAGA: (>Ważne) Ponieważ celem jest oczyszczenie kultury hPSC, sprawdź, czy zróżnicowane komórki pozostają przyczepione do płytki. Ponadto nie jest konieczne przechodzenie wszystkich kolonii w studni przy użyciu tego procesu, więc kolonie, które pozostają przyczepione, mogą zostać pozostawione.
    5. Odczekaj 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aż komórki osiądą w probówce (nie odwirowuj). Odessać PBS z probówki, uważając, aby nie usunąć osiadłych hPSC. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w pożywce hPSC (nie rozcierać) i przenieść komórki na płytkę docelową z zachowaniem proporcji podziału 1:4-1:16. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i nie odświeżać podłoża przez 1 dzień.
  6. Zamrażanie komórek hPSC
    1. W zależności od konfluencji należy użyć 1 dołka hPSC, w ciągu 2-3 dni (maksymalnie) w hodowli, aby napełnić 1-2 fiolki do krioprezerwacji do przechowywania w LN2.
    2. Pod koniec pasażowania (krok 2.5) użyj 500 μl lub 1 ml pożywki hPSC do przeniesienia komórek z 1 dołka 6WP odpowiednio do 1 lub 2 fiolek do krioprezerwacji (500 μl / fiolkę). Do każdej probówki dodać 500 μl 2x pożywki zamrażającej zawierającej pożywkę hPSC, 20 μM RI i 20% DMSO.
      UWAGA: (Opcjonalnie) Komórki można przenieść bezpośrednio do 1x pożywki do zamrażania w 1 ml / fiolkę.
    3. Umieścić probówki kriogeniczne w pojemniku kriogenicznym (zawierającym izopropanol) wstępnie schłodzonym do temperatury 4 °C i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Następnego dnia przenieś probówki kriogeniczne do zbiornika LN2 w celu długotrwałego przechowywania.

3. Protokół 2: Różnicowanie "Organoidów" 3D

  1. Układ różnicowania ze zmodyfikowaną metodą G pasażowania hPSC
    1. Przenieś wymaganą objętość NMM dla liczby dołków docelowych do sterylnej probówki. Uzupełnić 4 ng/ml FGF2 i 10 μM RI. Ogrzać probówkę z medium w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W zależności od zbiegu studzienek początkowych, hPSC są skoncentrowane podczas dystrybucji do płytki docelowej w stosunku 2:1 lub 3:1 (tj. 2 dołki z pierwotnej płytki do 1 dołka płytki docelowej), z objętością końcową 2,5 ml / studzienkę 6WP.
    2. Odessać pożywkę z dołków zawierających hPSC, które mają być różnicowane, i dwukrotnie przemyć komórki za pomocą 0,5 mM EDTA. Przy drugim płukaniu odczekać 30 s przed aspiracją EDTA, następnie dodać 1 ml PBS i inkubować przez 4-9 minut w temperaturze 37 °C. Podczas oczekiwania przygotuj sterylną probówkę z 4 ml PBS.
      UWAGA: 1 ml / studzienkę 6WP to wystarczająca objętość EDTA do mycia. (Ważne) Zaleca się stosowanie hPSC, które nie były dłużej niż 3 dni w hodowli po ostatnim pasażu i co najmniej 1-2 pasaże po rozmrożeniu.
    3. Sprawdź studzienki pod mikroskopem (obiektywy: 2,5x/0,06, 5x/0,12 Ph0, 10x/0,25 Ph1). Jeśli komórki zaczynają się odłączać, uwolnij je, delikatnie stukając w boki płytki. Przenieść komórki do probówki zawierającej 4 ml PBS za pomocą pipety 5 mL.
      UWAGA: (Ważne) Lekkie zaczerwienienie i rozcieranie jest dozwolone w celu rozbicia kolonii i zebrania luźnych komórek, ale zignoruj komórki, które pozostają przyklejone do płytki.
    4. Pozostaw rurkę na 10 minut w temperaturze pokojowej, w celu separacji grawitacyjnej. Opcjonalnie, w razie potrzeby, lekko odwirować komórki (nie więcej niż 200 x g w temperaturze pokojowej, przez 5 minut).
    5. Odessać PBS z probówki, uważając, aby nie usunąć osiadłych hPSC, ponownie zawiesić komórki w NMM za pomocą 4 ng/ml FGF2 i 10 μM RI, a następnie rozprowadzić na płytce pokrytej AA w stosunku 2:1 lub 3:1. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i nie odświeżać pożywki przez 3 dni, chyba że jest to wymagane (patrz krok 3.2.1).
      UWAGA: (Opcjonalnie) Dla wygody przenoszenia komórek, przed dystrybucją dodaj porcję pożywki hodowlanej do dołków płytki docelowej i ponownie zawieś komórki w mniejszej objętości. Ponadto hPSC mogą być barwione i liczone w celu określenia dokładnej początkowej gęstości komórek. Jednak końcowa objętość na płytce docelowej powinna wynosić 2,5 ml / dołek 6WP.
  2. Utrzymanie swobodnie unoszącej się kultury różnicowania w temperaturze 37 °C (5 % CO2 )
    1. Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem zmian w kolorze podłoża, nagromadzenia martwych komórek, zbrylania się i przylegania do dna studzienki.
      1. Opcjonalnie: Niezależnie od harmonogramu wymiany nośnika odśwież (w tym pierwsze 3 dni bez odświeżania) nośnik, jeśli zmienił kolor na żółty, i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi zmiany/odświeżenia nośnika (krok 3.3). Jeśli większość komórek wydaje się martwa, postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wymiany/odświeżania podłoża z separacją grawitacyjną (krok 3.4).
        UWAGA: Oczekuje się tworzenia EB i wzrostu w duże agregaty komórkowe, ale komórki i agregaty komórkowe mogą zlepiać się ze sobą w duże masy nie z powodu indywidualnego wzrostu/proliferacji. Jeśli zostanie to zaobserwowane, dopuszczalne jest lekkie rozdrobnienie mas. Jeśli komórki zaczną przylegać do powierzchni płytki AA, pozostała pływająca zawartość studzienek może zostać przeniesiona bezpośrednio do nowych studzienek lub przeniesiona podczas procesu zmiany/odświeżania podłoża. Nie próbuj przenosić komórek, które przylgnęły do płytki.
    2. W dniu 3 zmień pożywkę na NMM z 4 ng/ml FGF2. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
    3. W 7 dniu zmień pożywkę na NMM z 1 μM kwasem retinowym (RA), 100 ng/ml FGF8B i 4 ng/ml FGF2. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
      UWAGA: (Ważne) RZS jest wrażliwy na światło. Chroń próbki kultur RZS przed światłem.
    4. W dniu 14 zmień pożywkę na NMM o stężeniu 100 ng/ml FGF8B, 100 ng/ml FGF4 i 20 ng/ml FGF2. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
    5. W 17 dniu zmień pożywkę na NMM z 100 ng/ml FGF8B. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
    6. W 21 dniu zmień pożywkę na NMM z 100 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 10 ng/ml neurotroficznego czynnika glejowego (GDNF). Odświeżaj podłoże co drugi dzień.
    7. W 28 dniu zmień pożywkę na NMM ze 100 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF, 3 ng/ml SAG, 100 ng/ml czynnika neurotroficznego 3 (NT3) i 25 mM KCl. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień.
    8. W 35 dniu zbierz organoidy 3D do analizy.
  3. Zmień/odśwież podłoże różnicujące dla kultury 3D
    1. Przenieś wymaganą objętość NMM z odpowiednimi składnikami (patrz kroki 3.2.2-3.2.7 dla schematu składników) do sterylnej probówki. Ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Przechyl talerz i delikatnie potrząśnij, aż komórki osiądą na dolnych krawędziach studzienek. Ostrożnie usunąć 2 ml starej pożywki za pomocą pipety serologicznej, unikając usuwania komórek, a następnie dodać 2 ml świeżej pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: (Ważne) Objętość końcowa powinna wynosić 2,5 ml / studzienkę 6WP. Jeśli nastąpi parowanie, nie usuwaj 2 ml starej pożywki, ponieważ spowodowałoby to dalsze wysuszenie kultur komórkowych; Zamiast tego dodaj dodatkowe podłoże.
  4. Zmień/odśwież podłoże różnicujące z separacją grawitacyjną
    1. Przenieś wymaganą objętość NMM z odpowiednimi składnikami do sterylnej probówki. Ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Przenieść zawartość studzienek do sterylnej probówki i pozostawić probówkę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia grawitacyjnego.
    3. Za pomocą pipety usuń stare podłoże z probówki, uważając, aby nie usunąć osiadłych komórek, ponownie zawieś w NMM z odpowiednimi składnikami, a następnie rozprowadź do nowych studzienek pokrytych AA. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: (Opcjonalnie) Dla wygody część pożywki hodowlanej można dodać do dołków docelowych przed dystrybucją, a komórki różnicujące zawiesić w mniejszej objętości. Objętość końcowa powinna wynosić 2,5 ml / studzienkę 6WP.

4. Protokół 3: Alternatywna kultura różnicowania 2D

  1. Rozpocznij i utrzymuj hodowlę, wykonując czynności opisane w sekcji 3 dla protokołu 3D do 12 dnia
    1. Wykonaj kroki 3.1-3.2.3 i zmień/odśwież nośnik zgodnie z krokami 3.3 i 3.4.
  2. Przełącz się na monowarstwową kulturę 2D i utrzymuj ją jako
    1. W 13 dniu różnicowania postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi zmiany/odświeżania pożywki z separacją grawitacyjną (krok 3.4), tylko rozprowadź komórki/agregaty na płytce pokrytej PLO/LAM (patrz krok 1.6) o końcowej objętości 2,5 ml / studzienki 6WP.
      UWAGA: Pożywka może być uzupełniona o 10 μM RI podczas początkowego posiewu, aby pomóc w przyleganiu i przetrwaniu komórek. (Ważne) Pożądane jest równomierne rozłożenie komórek w studzienkach, aby uniknąć niskiej gęstości lub stłoczenia na płytkach oraz przejście (patrz krok 4.4), jeśli to konieczne. Preferowany rozmiar płytek powlekanych PLO/LAM (tj. 6WP, 12WP itp.) musi być określony empirycznie, w oparciu o szybkość proliferacji linii komórkowej i przeznaczenie produktu. Instrukcje podają objętości dla 6WP i można je przeliczyć na pół dla każdego podwojenia liczby studzienek (tj. 2 ml / dołek dla 6WP, 1 ml / dołek dla 12WP itp.)
    2. W dniu 14 zmień pożywkę na NMM o stężeniu 100 ng/ml FGF8B, 100 ng/ml FGF4 i 20 ng/ml FGF2. Odświeżaj podłoże co drugi dzień zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    3. W 17 dniu zmień pożywkę na NMM z 100 ng/ml FGF8B. Odświeżaj podłoże co drugi dzień zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    4. W 21 dniu zmień pożywkę na NMM ze 100 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF. Odświeżaj podłoże co drugi dzień zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    5. W 28 dniu zmień pożywkę na NMM ze 100 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF, 3 ng/ml SAG, 100 ng/ml NT3 i 25 mM KCl. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień, jak opisano w kroku 4.3.
    6. W 35. dniu należy pobrać komórki do analizy lub utrzymać w tym samym podłożu, co w kroku 4.2.5 w przypadku hodowli rozszerzonej (limit potencjału nie został przetestowany).
  3. Zmień/odśwież podłoże różnicujące dla kultury 2D
    1. Przenieś wymaganą objętość NMM z odpowiednimi składnikami (patrz kroki 4.2.2-4.2.5 dla harmonogramu składników) do sterylnej probówki. Ogrzać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    2. Odessać pożywkę z dołków, a następnie dodać 2 ml nowej pożywki. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: (Opcjonalnie) Objętość końcową można utrzymać na poziomie 2,5 ml / studzienkę 6WP, używając pipety do usunięcia 2 ml starej pożywki i dodając 2 ml świeżej pożywki. Zarezerwowanie części starego podłoża w studzienkach i zapobieganie kontaktowi komórek z powietrzem może zmniejszyć wstrząs dla komórek podczas etapów wymiany.
  4. Kultura różnicowania 2D przejścia
    1. Przenieść wymaganą objętość NMM z odpowiednimi składnikami (patrz kroki 4.2.2-4.2.5 dla schematu składników) do sterylnych probówek, w celu przeprowadzenia procesu pasażowania i, oddzielnie, w celu przygotowania płytki pokrytej PLO/LAM do odbioru pasażowanych komórek. Uzupełnić podłoże płytki docelowej o 10 μM RI. Ogrzać probówki z podłożem w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Aby zaoszczędzić na komponentach, możliwe jest użycie samego NMM do mycia komórek podczas procesu pasażu.
      UWAGA: (Ważne) Jeśli produkty będą używane w eksperymentach obrazowania wapnia, upewnij się, że komórki przechodzą między 2-6 dni przed końcem różnicowania.
    2. Odessać pożywkę ze studzienek, które mają być przepuszczone. Dodać 300 μl/studzienkę środka dysocjacyjnego na bazie trypsyny (patrz tabela materiałów), zawirować płytkę do przykrycia studzienek, a następnie natychmiast usunąć środek dysocjacyjny.
    3. Pozostaw płytkę na 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie poluzuj komórki, stukając w boki płytki. Dodać 600 μl/dobrze zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI) i przenieść komórki w DTI do sterylnej probówki z 5 ml NMM.
    4. Odwirować probówkę o sile 290 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zassać pożywkę i dodać kolejne 5 ml NMM do probówki.
    5. Odwirować probówkę o sile 290 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim podłożu zawierającym RRI.
    6. Rozmieścić komórki na płytce PLO/LAM, stosując stosunek podziału 1:1-1:12, w zależności od początkowej konfluencji, szybkości proliferacji i różnicy wielkości w punkcie początkowym do płytki docelowej, i utrzymywać w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualny przegląd protokołów różnicowania móżdżku 2D i 3D o obniżonym współczynniku wzrostu
Rysunek 1 pokazuje ogólny harmonogram protokołów różnicowania móżdżku 2D i 3D, identyfikując czynniki zewnętrzne i czas posiewu. Typowy postęp dla hPSC przechodzących trójwymiarowe różnicowanie móżdżku przedstawiono na rysunku Rysunek 2: z linią hESC H01 rozpoczynającą się jako kolonie w hodowli bezkarmowej w dniu 0 (lewy górny róg rysunku); ulegający tworzeniu się EB do dnia 2 (górny środek); wzrost w większe agregaty komórkowe z pozornym światłem po indukcji neuronalnej RA i FGF8 w dniu 14 (u góry po prawej); formowanie agregatów o różnej wielkości i kształcie w 28 dniu (na dole po lewej); rozwijający się w złożoności z różnymi strukturami pojedynczego agregatu wskazanego w dniu 28 (dolny środek); i z ciągłymi zmianami morfologicznymi w tych samych strukturach w dniu 35 (u dołu po prawej). Typowy postęp dla hPSC ulegających różnicowaniu móżdżkowi 2D przedstawiono w Rysunek 3: z linią hESC H01 jako koloniami w hodowli bez karmienia w dniu 0 (lewy górny róg rysunku, z okręgiem wskazującym obszar zróżnicowanych komórek wśród kolonii hESC); ulegający tworzeniu się EB do dnia 2 (górny środek); wzrost w większe agregaty komórkowe z pozornym światłem po indukcji neuronalnej RA i FGF8 w dniu 13 (u góry po prawej); proliferujące jako komórki przylegające po posiewie w dniu 14 (lewy dolny róg); a następnie jako monowarstwa komórek o bardziej złożonej/dojrzałej morfologii w 35 dniu w małym (dolny środek) i dużym powiększeniu (na dole po prawej).

Produkty 3D wykazują markery i struktury wczesnego nabłonka nerwowego
Rysunek 2 (zdjęcie na dole po lewej) i Rysunek 4 pokazuje niejednorodność morfologii agregatów 3D obserwowaną podczas hodowli, ze względu na różne tempo wzrostu i/lub dojrzewania, a także stochastyczne łączenie lub rozpadanie agregatów. Pomimo niejednorodności, każde różnicowanie wytwarza agregaty wykazujące wczesne markery neuronalne i neuronalne, w tym marker ziarnistości móżdżku ZIC1, na co wskazuje barwienie immunocytochemiczne (ICC) w Ryc. 5. Co ważniejsze, Rysunek 5 i Rysunek 6 sugerują, że prosta hodowla 3D, ze zmniejszonymi czynnikami wzrostu, jest w stanie generować agregaty o złożonych strukturach związanych z rozwojem mózgu, takich jak wczesny neuroepithelium i rombowa warga.

Produkty 2D wykazują markery móżdżku i funkcjonalną aktywność neuronalną
Chociaż hodowle 2D nie mogą odtwarzać złożonych struktur 3D, są w stanie generować komórki wykazujące wczesne markery nerwowe i neuronalne, w tym marker komórek ziarnistości móżdżku ZIC1, jak wskazuje barwienie ICC w Ryc. 7. Analiza ekspresji genów za pomocą RT-PCR, jak widać na Rycina 8, potwierdza wyniki barwienia ICC, chociaż obecność wczesnego markera komórek ziarnistych ATOH1 jest zmienna między eksperymentami i liniami. Obrazowanie wapnia jest łatwiejsze w hodowli 2D. Jak widać w Rysunek 9, Dodatkowe wideo 1 i Dodatkowe wideo 2, elektrycznie stymulowane komórki wykazują napływ wapnia, który jest typowy dla wzorców wypalania neuronów, co sugeruje generowanie funkcjonalnych neuronów.

figure-results-1
Rysunek 1: Oś czasu protokołu różnicowania (rozpoczynająca się w dniu 0 różnicowania). Pola z liniami ciągłymi wskazują, kiedy do pożywki hodowlanej dodawane są określone czynniki, a pola z liniami przerywanymi wskazują powlekanie płytki w celu opcjonalnej modyfikacji 2D. W przypadku FGF2 strzałka w dół odnosi się do niższych stężeń (4 ng/ml), a strzałka w górę odnosi się do wyższych stężeń (20 ng/ml). Ten rysunek został zmodyfikowany z Holmes and Heine10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy w jasnym polu protokołu 3D. Kolonie hESC w d0, EB w d2, agregaty po indukcji w d14, skupiska o różnej wielkości i morfologii (ponumerowane 1-5) w d28, pojedyncze skupisko z unikalnymi, możliwymi do zidentyfikowania cechami (oznaczonymi literami a-c) w d28 i widoczne zmiany w tych samych cechach w d35. Podziałka = 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Holmes and Heine10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy w jasnym polu protokołu 2D. hESC kolonie a d0, EB w d2, agregaty po indukcji w d13, po posiewie agregaty w d14, po dojrzewaniu w d35, jak widać przy 5-krotnym powiększeniu i 20-krotnym powiększeniu. Białe kółko w lewym górnym panelu pokazuje obszar zróżnicowanych komórek w koloniach hESC. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazy w jasnym polu przedstawiające różne rozmiary i złożoność w kulturze 3D. Agregaty w (A) dniu 8 (hESC) i (B) d35 (hiPSC). Ten ostatni obraz składa się z trzech oddzielnych obrazów, które pokazują cały agregat. Oba agregaty mogły zostać naruszone przez łączenie się mniejszych agregatów lub utratę (oderwanie) konstrukcji. Podziałka = 200 μm. Ten rysunek został przedrukowany z Holmes and Heine10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obrazy ICC produktów 3D pokazują odpowiednie znaczniki i struktury. W hodowli d35 produkty 3D prezentują: PAX6 (zielony) i TBR2 (czerwony) według światła formacji przypominającej rozetę nerwową (pierwszy rząd); DCX (zielony) i NeuN (czerwony) rozprzestrzeniające się ze struktury przypominającej zewnętrzną krawędź strefy komorowej (VZ) (drugi rząd); KIRREL2, marker związany z neuroepithelium móżdżku (trzeci rząd, po lewej); i ZIC1, marker związany z komórkami ziarnistymi móżdżku (trzeci rząd, po prawej). Eksperyment przeprowadzono wielokrotnie przy użyciu czterech różnych linii hPSC: linii hESC H01 (n = 5) oraz linii iPSC hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3) i hvs51 (n = 1). Strzałki wskazują strukturę podobną do rombowej wargi (RL). Podziałka = 100 μm. Ten rysunek został przedrukowany z Holmes and Heine10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wielkoskalowa struktura przypominająca strefę komorową w produkcie 3D. W hodowli d35 agregat pochodzący z hESC jest dodatni dla PAX6 (zielony) i TBR2 (czerwony) powszechnie związany z wczesnymi neuronami znajdującymi się w strefach komorowych (VZ) i strefach podkomorowych (SVZ), in vivo. (Góra) Gwiazdka (*) oznacza wierzchołkową stronę obszaru podobnego do VZ biegnącego wzdłuż krawędzi agregatu, z nawiasami wskazującymi głębokość/podział VZ/SVZ. (Środek) Połączone sygnały pokazują rozproszone sekcje komórek PAX6+/TBR2- zwiększające swój rozmiar w kierunku prawego górnego końca VZ. (Na dole) Obraz w większym powiększeniu przekroju wskazywanego przez prostokąt w środkowym panelu. Podziałka = 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Holmes and Heine10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Obrazy ICC produktów 2D pokazują odpowiednie znaczniki. W hodowli d35 produkty 2D wykazują, od hESC (górny rząd) i hiPSC (dolny rząd), komórki dodatnie pod kątem: markera komórek ziarnistych ZIC1 i markera migrującego neuronu móżdżku TAG1 (lewa kolumna); oraz neurofilament markerowy neuronalny (NF) i TAG1 (prawa kolumna). Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: RT-PCR produktów 2D. Analiza ekspresji mRNA linii hESC H01 (górny rząd) i linii hiPSC hvs60 (dolny rząd) na końcu protokołu 2D pokazuje produkty z elektroforezą żelową dla: marker komórek ziarnistych ZIC1, marker komórek ziarnistych ATOH1, marker migrującego neuronu móżdżku TAG1, marker komórek Purkiniego Calbindin (CALB), zależny od napięcia kanał wapniowy CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), kwas gamma-aminomasłowy (GABA) receptor B 1 (G-Br1), i gen utrzymania czystości EIF4G2).

figure-results-9
Rysunek 9: Obrazowanie/analiza wapnia produktów 2D. W hodowli d35 produkty różnicowania hPSC rejestrowano przez 2 minuty pod mikroskopem, po inkubacji z barwnikiem fluor5. Po 30 s komórki były stymulowane elektrycznie przez 10 s przy 10 Hz. (A) Zdjęcia pokazują hESC po 0 s (po lewej) i po rozpoczęciu stymulacji elektrycznej po 30 s (po prawej). Strzałki wskazują obszar zainteresowania (ROI) do analizy napływu wapnia. (B) Analiza graficzna pokazująca zmianę względnej fluorescencji w funkcji czasu dla ROI (zmiana fluorescencji = (F-F0)/F0, gdzie F0 = (∑F1-n)/n), z neuronalnymi skokami występującymi przed, w trakcie i po stymulacji. pasek wskazuje długość stymulacji elektrycznej. Podziałka (biała) = 50 μm. Pełne nagranie dla hESC (jak pokazano tutaj) i linia hiPSC (nie pokazano) są dostępne odpowiednio w Dodatkowym filmie 1 i Dodatkowym filmie 2. Nagrania są w formacie AVI, z prędkością 4x. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Film przedstawiający obrazowanie wapnia produktu 2D z linii hESC H01. W hodowli d35 produkty różnicowania z linii hESC H01 rejestrowano przez 2 minuty pod mikroskopem, po inkubacji z barwnikiem fluor5. Po 30 s komórki były stymulowane elektrycznie przez 10 s przy 10 Hz. Nagrania były wykonywane z prędkością 2 klatki/s, a następnie przetwarzane na wideo AVI z prędkością ~7 klatek/s, tworząc wideo trwające ~30 s, z prędkością ~4x. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 2: Film z obrazowaniem wapnia produktu 2D z linii hiPSC hvs51. W hodowli d35 produkty różnicowania z linii hiPSC hvs51 rejestrowano przez 2 minuty pod mikroskopem, po inkubacji z barwnikiem fluor5. Po 30 s komórki były stymulowane elektrycznie przez 10 s przy 10 Hz. Nagrania były wykonywane z prędkością 2 klatki/s, a następnie przetwarzane na wideo AVI z prędkością ~7 klatek/s, tworząc wideo trwające ~30 s, z prędkością ~4x. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożoność i koszty są istotnymi czynnikami dla badaczy komórek macierzystych przy wyborze lub opracowywaniu protokołów różnicowania. Jest to szczególnie prawdziwe, ponieważ otwartym pytaniem jest, jak duża zewnętrzna kontrola jest wymagana do wytworzenia pożądanych typów komórek lub – ujmując to inaczej – jak kompetentne są hPSC w wytwarzaniu własnego środowiska rozwojowego, jeśli pozostawi się je samym sobie z wystarczającą ilością składników odżywczych. Wprowadzenie czynników zewnętrznych in vitro może z powodzeniem doprowadzić do powstania pożądanych produktów komórkowych, ale może również zakłócać wewnętrzne zdolności rozwojowe, które komórki wykazywałyby in vivo. Takie rozważania są ważne, zwłaszcza jeśli celem jest wykorzystanie iPSC pochodzących od pacjentów do modelowania choroby. Szerokie stosowanie wzorców i/lub czynników wzrostu może maskować fenotypy choroby. Protokoły wyszczególnione w tym raporcie są zgodne z trendem poprzednich badań w celu zmniejszenia złożoności, kosztów i/lub wykorzystania zewnętrznych czynników wzorcowych 8,9.

Opierając się na wynikach przedstawionych przez Mugurumę i wsp., oraz na naszym niedawnym badaniu, wydaje się, że możliwe jest osiągnięcie różnicowania w kierunku losów móżdżku bez wspólnych wysiłków w celu rozmnażania się w warunkach in vivo, jak to miało miejsce we wcześniejszych badaniach 1,2,3,4,8,10 . Intrygujące jest to, że w obu badaniach stosowano różne zestawy czynników wzrostu, co sugeruje, że żaden z nich nie był konieczny, chociaż oba wykorzystywały FGF2. Przeprowadziliśmy dodatkowe testy, w których FGF zostały selektywnie wykluczone z protokołu i wykazaliśmy, że komórki były zdolne do wytwarzania tych samych produktów bez zewnętrznych FGF10. Różnice między naszymi badaniami zostały sprecyzowane przez fakt, że zastosowaliśmy różne linie hPSC i metody hodowli, indukowaliśmy różnicowanie neuronalne za pomocą RZS oraz włączyliśmy składniki wspomagające przeżycie i dojrzewanie komórek ziarnistych (BDNF, GDNF, SAG i KCL)11-14. Ponadto zastosowano mniej złożoną metodę uruchamiania w porównaniu z Mugurumą i wsp. Ich protokół rozpoczął się od wygenerowania jednolitych EB w 96WP, które odizolowały je fizycznie i chemicznie od siebie. W tym przypadku protokół zakładał, że wszystkie PSC są stosunkowo stłoczone razem w 6WP podczas tworzenia EB, co pozwalało im na swobodną interakcję. W jaki sposób mogło to w różny sposób wpłynąć na fizyczne i chemiczne środowisko EB i późniejszych organoidów (w tym na wewnętrzną produkcję związków sygnałowych), nie jest znane i można je zbadać. Ponadto, chociaż wykazujemy ekspresję genów związanych z pochodzeniem móżdżkowym, a więc sugerujących ich pochodzenie, zlokalizowanych w strukturach morfologicznie podobnych do tych opisanych przez Mugurumę i wsp., nie możemy wykluczyć generowania struktur podobnych do neuronów, które są identyczne niż móżdżek. Przyszłe badania, wykorzystujące duży panel przeciwciał, takich jak te zgłoszone przez Mugurumę i wsp. (tj. ATOH1, CALB, itp.) sprawi, że takie przypisania i porównanie między iloczynami obu protokołów będą bardziej przekonujące.

W ramach protokołu 3D ważne jest, aby rozpocząć i utrzymać wystarczającą liczbę komórek w hodowli, aby zapewnić wystarczającą liczbę produktów końcowych do analizy. Biorąc pod uwagę znaczne wymieranie na wczesnym etapie protokołu, zalecamy rozpoczęcie od ponad 500 EB / studzienkę w ciągu pierwszych 3 dni w hodowli (ryc. 1). Nie powinno to być trudne do osiągnięcia, biorąc pod uwagę rozmiary kolonii hPSC w hodowli wolnej od karmienia, ale może nie być tak łatwe dla tych, którzy nadal stosują metody zależne od karmienia. Biorąc pod uwagę dużą liczbę komórek, ważne jest, aby zwracać uwagę na zmianę koloru podłoża (wskazującą na zmiany pH) i nagromadzenie martwych komórek. Oba muszą zostać skorygowane, aby zapobiec upadkowi kultury. Może również dojść do zlepiania się komórek i agregatów w masywne struktury. Chociaż nadal może to skutkować agregatami, które można analizować, ilość produktu zostanie znacznie zmniejszona, więc podzielenie ich na mniejsze agregaty z delikatnym rozcieraniem może być przydatne. Należy jednak unikać zakłócania normalnych agregatów, które same mogą urosnąć do dużych rozmiarów (rysunek 4). Jeśli kruszywa stają się zbyt rzadkie, zaleca się łączenie studni, aby kruszywa nie były całkowicie odizolowane. Zmienność produktu (pod względem liczby, wielkości i morfologii) jest dobrze znanym problemem w hodowli komórkowej 3D, w tym w przypadku protokołów rozpoczynających się od izolowanych, jednolitych etapów tworzenia EB, co sugeruje, że mniej złożona procedura uruchamiania (taka jak protokół opisany tutaj) może być bardziej praktyczna 8,15. Chociaż ta heterogeniczność jest czymś, o czym naukowcy muszą pamiętać, szczególnie podczas analizy, zgłoszony protokół wygenerował produkty zgodne z tymi, które można znaleźć w innych protokołach 3D 8,9,15. Opierając się na wielkości i morfologii, mieszczą się w zakresie rozety nerwowej do organoidu mózgowego, jak opisano w niedawnym przeglądzie Kelava i Lancaster15, z najbardziej odpowiednią klasyfikacją sferoidy. Szczególnie godna uwagi jest obecność struktur 3D sugerujących rozety nerwowe ze światłem, strefami (pod)komorowymi i cechami rombowo-wargowymi (ryc. 5 i ryc. 6), zidentyfikowanymi przez inne grupy 8,15,16,17. Ponieważ w każdym eksperymencie uzyskano co najmniej jeden agregat z przypuszczalnymi VZ/SVZ i markerami związanymi z móżdżkiem (ZIC1, KIRREL2), są to przydatne kryteria do określenia sukcesu różnicowania 3D przy użyciu naszego protokołu, z funkcjami podobnymi do RL zapewniającymi dodatkowe wsparcie. Wydłużenie długości hodowli powyżej 35 dni nie zostało przetestowane, ale można je było kontynuować w celu określenia maksymalnego zakresu wzrostu, złożoności i dojrzałości dozwolonego przez tę technikę.

Protokół 2D wykorzystuje ten sam proces tworzenia i indukcji neuronalnej, co protokół 3D, a więc powyższe uwagi również mają zastosowanie. Po platerowaniu należy wziąć pod uwagę inny zestaw rozważań. EB powinny szybko przylegać, aby komórki mogły rozprzestrzeniać się na zewnątrz na płytkę. W przypadku problemów z przestrzeganiem zaleceń lekarskich można zastosować dodanie RI (jeśli nie zostało już użyte), zmniejszenie objętości pożywki lub eksperymentalne zmiany w stężeniu PLO/LAM. Ważne jest, aby komórki nie rosły zbyt gęsto lub rzadko (najlepiej hodowane między 20-80% zbieżności) w studzienkach; Ważne jest codzienne monitorowanie i terminowe przechodzenie, aby uniknąć nadmiernej konfluencji lub pływających komórek. W przeciwieństwie do protokołu 3D, podczas hodowli nie powinno dojść do znacznego wymierania, chociaż mogą istnieć obszary o słabym wzroście lub spowolnieniu tempa proliferacji. Pasażowanie wpływa na stan dojrzewania komórek (na przykład usuwanie procesów komórkowych i rozwiniętych sieci między komórkami) i należy o nim pamiętać podczas zbliżania się do punktów, w których komórki będą w jakiś sposób zbierane lub analizowane. Na przykład w przypadku obrazowania wapnia bardzo ważne jest, aby komórki przeszły między 2-6 dniami przed analizą. Przejście zbyt blisko analizy może oznaczać, że komórki nie miały czasu na połączenie i/lub dojrzewanie, a zbyt daleko może spowodować przepełnienie komórek, co utrudni obrazowanie. Chociaż mogą istnieć różnice między eksperymentami, wyniki są zgodne z tymi zgłoszonymi w początkowych protokołach móżdżku 2D 1,2. Barwienie ICC i analiza ekspresji genów potwierdzają obecność komórek dodatnich dla markera komórek ziarnistych ZIC1, jednocześnie identyfikując markery związane z innymi tożsamościami neuronalnymi i móżdżkowymi (Figura 7 i Figura 8). Obrazowanie wapnia, które polega na elektrycznej stymulacji komórek inkubowanych z barwnikiem fluor5, wykazało funkcjonalną aktywność neuronalną (ryc. 9, ryc. uzupełniająca 1 i ryc. uzupełniająca 2), chociaż nie potwierdzono, czy były to komórki ziarniste. Można się spierać, czy dając komórkom więcej czasu na dojrzewanie poprzez wydłużenie czasu trwania hodowli powyżej 35 dni, ilość funkcjonalnej aktywności neuronalnej powinna wzrosnąć. Potencjał ten może zostać wykorzystany w przyszłości.

Oprócz kierunków badań zasugerowanych powyżej, interesujące byłoby określenie różnic w tożsamości produktów (ilości i jakości) między protokołami 2D i 3D. Znaczenie zewnętrznych FGF nie zostało przetestowane w protokole 2D i warto byłoby wiedzieć, czy brak struktury 3D po posiewaniu, a więc związane z tym szlaki sygnałowe, sprawi, że kultury 2D będą mniej lub bardziej zależne od tych wczesnych związków wzorcowych. Bardziej uproszczone protokoły (np. brak RA, BDNF, SAG) są równie prawdopodobnymi liniami do dalszych badań. Wreszcie, przyszłe badania mogą skorzystać z nowych narzędzi badawczych, aby lepiej scharakteryzować (i ocenić wydajność generowania) specyficznych dla człowieka podtypów neuronów móżdżku.

Mając na uwadze podane zastrzeżenia, oba zgłoszone protokoły mogą być stosowane do różnicowania móżdżku, z produktami dostosowanymi do różnych celów. Mogą one służyć jako praktyczne punkty wyjścia dla badaczy prowadzących badania pilotażowe, testujące żywotność linii komórkowych pod kątem takich różnicowań, lub jako podstawowy model dla innych typów ukierunkowanego różnicowania neuronalnego.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Gerbren Jacobs i Jurjen Broeke za ich fachową pomoc techniczną, Prisce Leferink za przyczynienie się do stworzenia i scharakteryzowania dwóch linii kontrolnych iPSC, oraz Lisie Gasparotto za demonstrację naszych procedur.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12+GlutamaxGibco31331-028wzmocniony glutaminą DMEM/F12
Pożywka neurobazalnaGibco21103-049pożywka neuronowa
Podłoże N2 suplementGibco17502-048
B27 suplementGibco17504001
InsulinaImgenPT468-B
L-glutaminaGibco25030-024
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140-035
beta-merkaptoetanolGibco21985-023
Poli-L-OrnitynaSigmaP3655
Poly (2-hydroksyetylometakrylan)SigmaP3932aka Poly-Hema
LamininSigmaL2020
E8 pożywka i suplementGibcoA1517001hPSC pożywka i suplement
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
Chlorek soduSigmaS-5886
y-27632 (inhibitor ROCK)SelleckChemS1049-10mg
DMSOSigmaD-2650
GeltrexGibcoA1413302Powłoka adherentna odpowiednia dla hPSC (PAAC)
0,5M EDTAGibco15575-020
Filtr 0,2 umVWR28145-77
1,5 mL rurka EppendorfVWR525-0130
DMEM/F12Gibco21331-020
EtanolVWR83804360
ParafilmSigmaPM996owijka do
hodowlane krioprobówkiThermoFisher368632
TrypLEGibco12563-029środek dysocjacyjny na bazie trypsyny
Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)GibcoR-007-100
FGF-2Peprotech100-18B
FGF-4R& D Systems100-31
FGF-8BPeprotech100-25
Kwas retinowySigmaR2625
Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowegoPeprotech450-02
Neurotroficzny czynnik glejowyPeprotech450-10
Chlorek potasuSigmaP5405
Neurotroficzny Czynnik 3Peprotech450-03
Wygładzony agonista (SAG)Cayman11914CAS 912545-86-9
Mikroskop Axiovert 40CZeissBrightfield
AxiocamObrazowanie ZeissBrightfield - akwizycja obrazu
Wirówka Eppendorf 5810Eppendorf521-0996wirówka do hodowli komórkowych
PBS (gebufferde natrium oplossing)Braun Medical3623140
5 ml Pipety serologiczneVWR612-4950
10 ml Pipety serologiczneVWR612-4951
6-dołkowe płytki hodowlaneVWR734-2323
12-dołkowe płytkiVWR734-2324
hESCWiCELLlinia H01
płytki Mikroskop obrazowania hodowlane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).">Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).">Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).">Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).">Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).">Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).">Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).">Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).">Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).">Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).">Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).">Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).">Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).">Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).">Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).">Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).">Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).">Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).">Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cerebellar DifferentiationHuman Pluripotent Stem Cells3D Organoid Culture2D Monolayer CultureNeural Maintenance MediumFGF2 SupplementationROCK Inhibitor TreatmentFree floating 3D ProductsAdherent DifferentiationCerebellar Neuron Markers

Related Articles