Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Joseph B. DeShields; Rachel A. Bomberger; James W. Woodhall; David L. Wheeler; Natalia Moroz; Dennis A. Johnson; Kiwamu Tanaka

doi:10.3791/56891

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/56891

⸱

23 lutego 2018

Joseph B. DeShields¹ , Rachel A. Bomberger¹ , James W. Woodhall² , David L. Wheeler¹ , Natalia Moroz¹ , Dennis A. Johnson¹ , Kiwamu Tanaka¹

¹Department of Plant Pathology, Washington State University, ²Parma Research and Extension Center, University of Idaho

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnozowanie chorób roślin na miejscu może być użytecznym narzędziem dla hodowców do podejmowania decyzji w odpowiednim czasie, umożliwiając wcześniejsze wdrożenie strategii zarządzania chorobami, które zmniejszają wpływ choroby. Obecnie w wielu laboratoriach diagnostycznych reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), a w szczególności PCR w czasie rzeczywistym, jest uważana za najbardziej czułą i dokładną metodę wykrywania patogenów roślinnych. Jednak laboratoryjne PCR zazwyczaj wymagają drogiego sprzętu laboratoryjnego i wykwalifikowanego personelu. W tym badaniu wykorzystano przenoszone przez glebę patogeny ziemniaka, aby wykazać potencjał wykrywania molekularnego na miejscu. Udało się to osiągnąć za pomocą szybkiego i prostego protokołu składającego się z ekstrakcji kwasów nukleinowych na bazie kulek magnetycznych, przenośnego PCR w czasie rzeczywistym (test oparty na sondzie fluorogenicznej). Przenośne podejście do PCR w czasie rzeczywistym wypada korzystnie w porównaniu z systemem laboratoryjnym, wykrywając zaledwie 100 kopii DNA z podziemnej Spongospora. Opracowana w ten sposób przenośna metoda PCR w czasie rzeczywistym może służyć jako alternatywa dla podejść laboratoryjnych i użyteczne narzędzie do diagnozowania patogenów na miejscu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna i szybka identyfikacja patogenów wywołujących chorobę znacząco wpływa na decyzje dotyczące zarządzania chorobami roślin. Choroby przenoszone przez glebę są szczególnie trudne do zdiagnozowania, ponieważ środowisko glebowe jest niezwykle duże w stosunku do masy roślin i złożone, co sprawia, że zrozumienie wszystkich aspektów chorób przenoszonych przez glebę jest wyzwaniem. Co więcej, choroby przenoszone przez glebę mogą być bezobjawowe we wczesnych stadiach infekcji, zależne od stresorów środowiskowych, a niektóre mają długie okresy utajenia, które skutkują opóźnioną diagnozą¹. Wiele patogenów przenoszonych przez glebę rozwinęło struktury przetrwania, takie jak wyspecjalizowane zarodniki lub melanizowane strzępki, które mogą przetrwać w glebie przez wiele lat nawet pod nieobecność ich żywicieli. Stosowane podejścia do zarządzania chorobami przenoszonymi przez glebę obejmują: unikanie znanych porażonych pól, stosowanie certyfikowanych nasion i sadzonek wolnych od patogenów, utrzymywanie sprzętu w stanie sanitarnym oraz ograniczanie ruchu gleby i wody, gdy tylko jest to możliwe. Wiedza na temat obecności patogenów za pomocą strategii wykrywania molekularnego może również odgrywać użyteczną rolę, dostarczając informacji na temat podejmowania w odpowiednim czasie decyzji dotyczących zabiegów na wczesnym etapie lub oceny pól przed sadzeniem. Testy na miejscu zapewniają dodatkowe korzyści w postaci szybkiego uzyskania wyniku bez wysyłania próbki do laboratorium diagnostycznego, które może znajdować się w pewnej odległości, a także może zaangażować hodowcę, jeśli taka diagnostyka jest przeprowadzana "na miejscu" w jego obecności.

Dla diagnozy na miejscu opartej na detekcji molekularnej, czułość, specyficzność, solidność (powtarzalność i odtwarzalność) oraz wydajność (tj. prostota i wydajność kosztowa) są kluczowymi czynnikami do rozważenia. Urządzenia z przepływem bocznym (LFD), takie jak Immunostrip i PocketDiagnostic, są popularnymi metodami wykrywania patogenów na miejscu ze względu na ich prostotę jako test jednoetapowy. Jednak LFD mogą nie być właściwym narzędziem diagnostycznym we wszystkich sytuacjach, ponieważ brakuje im czułości i swoistości, a czasami dają niejednoznaczne wyniki, jeśli docelowy patogen jest w niskich stężeniach i może reagować krzyżowo z podobnymi gatunkami lub rodzajami². Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) ma również zastosowanie do wykrywania patogenów na miejscu i jest szczególnie tania ze względu na tanie odczynniki, warunki reakcji, które pozostają stałe, oraz prostą kolorymetryczną analizę wizualną. Jednak zarówno LFD, jak i LAMP są zwykle używane jakościowo, chociaż oba podejścia mogą być używane ilościowo z droższym sprzętem³. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) oferuje wysoką specyficzność, wysoką czułość i możliwości ilościowe w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami wykrywania. Jednak konwencjonalna technologia PCR oparta na laboratorium wymaga drogiego sprzętu laboratoryjnego i wykwalifikowanego personelu, co jest główną wadą przyjęcia tej technologii jako metody wykrywania do celów na miejscu.

W tym protokole demonstrowana jest metoda diagnostyki na miejscu przy użyciu przenośnego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Technologia PCR w czasie rzeczywistym oferuje przewagę nad innymi metodami pod względem dokładności ilościowej, czułości i wszechstronności oraz jest szeroko stosowana do wykrywania szerokiej gamy patogenów roślin⁴^,⁵, w tym różnych patogenów ziemniaka w glebie⁶. Ze względu na ostatnie trendy na szybko rozwijającym się, konkurencyjnym rynku, sprzęt wymagany do technologii PCR nadal się rozwija, aby być bardziej kompaktowy i tańszy⁷. Protokół składa się z następujących etapów: ekstrakcja kwasów nukleinowych za pomocą kulek magnetycznych, przenośny PCR w czasie rzeczywistym (test oparty na sondzie fluorogenicznej) oraz analiza danych ilościowych, które można wykonać zdalnie za pomocą laptopa (rysunek 1).

Korzystając z opracowanego tutaj przenośnego protokołu PCR, próbki gleby zostały przeanalizowane w celu wykrycia patogenu przenoszonego przez glebę, Spongospora subterranea. Spongospora została wybrana, ponieważ jest ważnym patogenem ziemniaka jako czynnik wywołujący parcha sproszkowanego⁸. Uważa się, że w ostatnich dziesięcioleciach choroba ta rozprzestrzeniła się na wiele regionów, w których uprawia się ziemniaki⁹^,¹⁰. Parch pudłowy, ze względu na obecność pryszczowatych zmian na bulwach, może spowodować znaczne straty jakościowe u plantatorów ziemniaków. Ponadto S. subterranea może przenosić wirusa Potato Mop Top (PMTV), który może powodować objawy zmian wewnętrznych w bulwach (znane jako spraing)¹¹^,¹². Dlatego ważne jest, aby wiedzieć, czy S. subterranea jest obecny na polach przed sadzeniem⁶. Wykazujemy również przydatność tego protokołu do wykrywania Rhizoctonia solani Anastomosis Group 3 (AG3) i PMTV. Chociaż kilka grup zespoleń Rhizoctonia solani powoduje choroby ziemniaków, AG3 jest prawdopodobnie najważniejszą na świecie¹³, powodując raka łodygi i czarną skorupę, powodując straty plonów handlowych do 30%¹⁴. PMTV powoduje zmiany martwicze w obrębie bulw, które potocznie nazywa się spraingiem. Wirus ten został niedawno po raz pierwszy zgłoszony w kilku stanach na północno-zachodnim wybrzeżu Pacyfiku¹⁵^,¹⁶^,¹⁷ i budzi coraz większe zaniepokojenie hodowców w tym ważnym regionie uprawy ziemniaków. Oprócz określenia skuteczności przenośnego PCR w przypadku tych ważnych chorób, w tym badaniu zbadano również optymalną metodologię ekstrakcji DNA i wielkość próbki gleby.

Wyniki sugerują, że metoda przenośnego PCR jest wszechstronna i ma zastosowanie do wykrywania różnych patogenów. Opracowana przez nas metoda wykrywania na miejscu może umożliwić pracownikom pierwszej linii w rolnictwie (np. hodowcom) podejmowanie wcześniejszych decyzji dotyczących zarządzania chorobami, takich jak selekcja odmian lub płodozmian, a także może określić ilościowo patogen roślin w próbce podczas badania terenowego, przed sadzeniem, aby uniknąć potencjalnych ognisk choroby.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Molekularna detekcja patogenów na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Uwaga: Zobacz Rysunek 1.

Ekstrakcja DNA na bazie kulek magnetycznych
nuta: Zastosowano zestaw do ekstrakcji DNA na bazie kulek magnetycznych (np. firmy Primerdesign) zgodnie z instrukcją producenta. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Po zawieszeniu liofilizowanej proteinazy K (butelka nr 1) (przy użyciu butelki nr 1a) przechowywać w temperaturze -20 °C.
1. Wymieszaj 20-50 mg próbki gleby z 500 μl roztworu do przygotowywania próbek w mikroprobówce.
  nuta: Stosunek gleby do roztworu przygotowawczego jest ważny, ponieważ mieszanie ich w innych proporcjach może spowodować niepowodzenie dalszych eksperymentów (np. zanieczyszczenie inhibitorami PCR).
2. Zmiel ziemię na dnie probówki za pomocą małego sterylnego tłuczka, aż roztwór będzie mętny. Następnie zawiesić cząstki gleby w roztworze, potrząsając mikroprobówką i odstawić ją w spokoju, aby cząstki gleby całkowicie opadły (zwykle od 5 do 10 minut).
3. Przenieś 200 μl supernatantu do świeżej mikroprobówki i dodaj 200 μl buforu do lizy (butelka nr 2: roztwór chlorowodorku guanidyny) i 20 μl proteinazy K (butelka nr 1).
4. Dokładnie wymieszać lizat, odwracając probówkę i inkubować w temperaturze otoczenia przez 15 min.
  nuta: Jeśli lizat znajduje się na pokrywie mikroprobówki, postukaj w probówkę lub użyj wirówki, jeśli jest dostępna, aby wyjąć ją z pokrywki.
5. Dodać 500 μl buforu wiążącego/mieszanki kulek magnetycznych (butelka nr 3) do próbki poddanej lizie. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze otoczenia przez 5 minut z dala od stojaka na probówki magnetyczne.
  nuta: Upewnij się, że dobrze wymieszałeś roztwór kulek przed użyciem, aby upewnić się, że kulki są równomiernie oddzielone od butelki do przechowywania.
6. Umieść mikroprobówkę na magnetycznym stojaku na probówki. Odczekaj co najmniej 2 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki w mikroprobówce przyczepią się do ścianki po stronie magnetycznej. Następnie usunąć i wyrzucić cały sklarowany osad za pomocą pipetowania.
  nuta: Nie należy naruszać namagnesowanych kulek podczas wyjmowania i zasysania supernatantu. DNA zostało teraz przechwycone przez kulki magnetyczne.
7. Wyjmij mikroprobówkę z magnetycznego stojaka na probówki, dodaj 500 μl buforu do mycia-1 (butelka nr 4: roztwór nadchloranu sodu/etanolu) i ponownie zawiesić kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Wykonaj ten etap mycia, aby usunąć białko i sól z próbki. Pozostaw mieszaninę na 30 sekund.
8. Powtórz krok 1.1.6.
9. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, dodaj 500 μl buforu do mycia-2 (butelka nr 5: roztwór nadchloranu sodu/etanolu) i ponownie zawiesić kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Pozostaw mieszaninę na 30 sekund.
10. Powtórz krok 1.1.6.
11. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, a następnie dodaj 500 μl 80% etanolu (butelka nr 6).
  nuta: Ten etap jest niezbędny do usunięcia pozostałości soli z próbki.
  1. Ponownie zawiesić kulki, powtarzając pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Odstaw na 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie.
12. Powtórz krok 1.1.6.
13. Suszyć na powietrzu granulat kulki magnetycznej przez 10 minut w temperaturze otoczenia przy otwartej pokrywie mikroprobówki.
  nuta: Kulki powinny być wolne od jakichkolwiek widocznych pozostałości etanolu, ale nie powinny być całkowicie wysuszone.
14. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, dodaj 50-200 μl buforu elucyjnego (butelka nr 7) i ponownie zawiesij kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone i odstaw na 30 s.
  nuta: W powyższych krokach oczyszczone DNA jest uwalniane z kulek magnetycznych do buforu elucyjnego.
15. Umieść mikroprobówkę na magnetycznym stojaku na probówki. Odczekaj co najmniej 2 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki w mikroprobówce przyczepią się do ścianki po stronie magnetycznej.
16. Przenieś supernatant, który zawiera teraz oczyszczone DNA/RNA, do mikroprobówki o pojemności 0,5 ml w celu użycia w dalszych etapach.
Przenośny PCR
nuta: Przenośny termocykler i zestaw do oznaczania PCR zostały użyte zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
1. Otwórz i uruchom oprogramowanie powiązane z termocyklerem, wybierz Test wykrywania celu i wprowadź wszystkie informacje opisu w polach wprowadzania danych Nazwa i szczegóły, Uwagi, Próbki i Testy.
  nuta: Studzienki #1 i #2 są wyznaczone przez oprogramowanie odpowiednio dla kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej.
2. Przygotuj odczynniki PCR przed użyciem. Przenieść 500 μl buforu do reprodukcji mieszanki głównej do probówki zawierającej liofilizowaną mieszankę wzorcową i dobrze wymieszać przez odwrócenie. Przenieś całą mieszankę wzorcową do brązowych starterów/sondy z etykietą mikroprobówek (Tabela 2).
  1. Zakręć i potrząśnij mikroprobówką, aby wymieszać. Wymagane jest dokładne wymieszanie, aby upewnić się, że wszystkie składniki są całkowicie zawieszone. Pozostaw tę mieszaninę na 5 minut przed użyciem.
    nuta: Po użyciu przechowywać mieszaninę reakcyjną w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować kontrolę ujemną, przenosząc 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z poprzedniego etapu do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl sterylnej wody dejonizowanej wolnej od nukleaz.
4. Przygotować kontrolę dodatnią, przenosząc 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z etapu 1.2.2 do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl matrycy kontroli dodatniej.
5. Dla każdej próbki przenieść 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z poprzedniego etapu do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl próbki DNA przygotowanej z kroku 1.1.16.
6. Załaduj do studzienek termocyklera zawartość odpowiednich probówek PCR, jak opisano w kroku 2.1.1.
7. Po wprowadzeniu i potwierdzeniu wszystkich niezbędnych informacji wybierz Start Run i wybierz instrument podłączony do sieci Ethernet lub dysk USB.
  nuta: Jeśli wybrana jest opcja dysku USB, plik uruchamiania musi być zapisany na dysku, aby mógł być używany z termocyklerem (np. F:\genesig). Przebieg rozpocznie się natychmiast po włożeniu napędu do termocyklera.
Analiza danych z przenośnego PCR w czasie rzeczywistym.
1. Po zakończeniu biegu otwórz plik przebiegu (.usb) z dysku USB za pomocą oprogramowania powiązanego z termocyklerem lub bezpośrednio view wyniki biegu w oprogramowaniu, klikając Wyniki.
2. Przed analizowaniem wyników zapisz ukończony przebieg, aby uniknąć utraty danych.
3. Na karcie Wyniki wyświetl stan przebiegu podzielony na kategorie według samples.
  nuta: Dane, które można uzyskać w tej zakładce, to stan wyników i numer kopii wykryty w próbce.
4. Kliknij zakładkę Szczegóły, aby wyświetlić krzywe wzmocnienia. Gdy cel zostanie pomyślnie wykryty, wyświetlane są wartości Cq (cykl kwantyfikacji) zarówno celu, jak i kontroli wewnętrznej.
  nuta: Wartości te są obliczane w raporcie końcowym i służą do określenia, czy próbka jest dodatnia dla celu i czy występują problemy z reakcją lub próbkami DNA.

2. Inne protokoły

Alternatywne laboratoryjne metody ekstrakcji DNA
1. Metody oparte na CTAB-fenol-chloroformie
  1. Wykonaj metody oparte na chloroformie CTAB-fenol-chloroform, zgodnie z metodą Doyle'a¹⁸ i metodą Dellaporta¹⁹, jak opisano wcześniej.
2. Metoda minipreparatyki DNA
  nuta: Metoda Edwardsa²⁰ została wykonana w następujący sposób.
  1. Dodaj 500 mg gleby, a następnie pięć kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm i 750 μl buforu Edwardsa (200 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) do mikroprobówki i dobrze wymieszaj.
  2. Inkubować mikroprobówkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  3. Homogenizować próbkę za pomocą homogenizatora z ubijakiem kulkowym przez 60 s (lub przy użyciu moździerza i tłuczka).
  4. Odwirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut.
  5. Przenieść 500 μl supernatantu do świeżej mikroprobówki, a następnie wymieszać z 500 μl schłodzonego izopropanolu. Wymieszaj, odwracając rurkę 10 razy.
  6. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 15 minut w celu granulacji DNA.
  7. Zdekantować supernatant i pozostawić osad DNA do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż pozostały etanol odparuje.
  8. Przemyć osad DNA 750 μl schłodzonego 70% etanolu.
  9. Wysuszyć granulat na powietrzu przed ponownym zawiesieniem w 50-100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 1 mM EDTA).
3. Inne metody alternatywne
  1. Wykonaj ekstrakcję DNA na bazie krzemionki za pomocą zestawu #1 (MP BIO Fast DNA Spin) i zestawu #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) zgodnie z instrukcjami producenta.
Konwencjonalny laboratoryjny PCR w czasie rzeczywistym.
nuta: Konwencjonalny termocykler został użyty z mastermixem do PCR na bazie sondy, różnych starterów i sond oligonukleotydowych (Tabela 2).
1. Używając probówek do PCR z nieprzezroczystym dnem lub płytki PCR, przygotuj 20 μl reakcji dla wszystkich próbek DNA, które mają być analizowane, a także kontrolę ujemną (woda dejonizowana bez nukleaz) i pozytywną kontrolę matrycową przygotowaną we własnym zakresie.
2. Dla każdej probówki lub studzienki PCR należy przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl mastermixu, 7 μl wody dejonizowanej bez nukleaz, 2 μl starterów/sondy 2 μM i 1 μl próbki DNA (z etapu 1.1.16 lub 2.1) lub matrycy kontrolnej na próbkę.
3. Zamknij probówki lub płytkę PCR i rozpocznij reakcję, wybierając odpowiedni program PCR.
Analiza danych z konwencjonalnego laboratoryjnego PCR w czasie rzeczywistym
1. Użyj oprogramowania powiązanego z termocyklerem, aby przeanalizować wyniki z konwencjonalnego termocyklera. Aby rozpocząć analizę danych, przenieś plik przebiegu z termocyklera na dysk USB, włóż dysk USB i wybierz opcję Eksportuj.
2. Otwórz plik danych (.pcrd) z wyeksportowanego przebiegu w oprogramowaniu powiązanym z termocyklerem.
3. Podświetl studzienkę próbki, umieszczając odpowiadającą jej studzienkę na instrumencie. Krzywe wzmocnienia i krzywe standardowe (jeśli dotyczy) są generowane automatycznie. Jeśli informacje o próbce nie zostaną wprowadzone, kliknij opcję Ustawienia płyty lub podobną funkcję, aby rozpocząć wprowadzanie danych przed analizą danych.
4. Wyświetl dane na karcie Kwantyfikacja; można je wyeksportować w celu analizy danych za pomocą oprogramowania innej firmy, takiego jak czytniki plików CSV, XML lub HTML.
5. Uzyskaj dane Cq na podstawie wyznaczonych progów i porównaj je z kontrolami dodatnimi i ujemnymi.
  nuta: Jeśli w teście użyto wzorców DNA celu, należy porównać dane próbki Cq z danymi wzorców, aby określić wartość odcięcia Cq

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównanie metod ekstrakcji DNA

Zgodność metody ekstrakcji DNA opartej na kulkach magnetycznych z PCR w czasie rzeczywistym została oceniona poprzez wykrycie ilości DNA S. subterranea w próbce gleby z pól zaatakowanych przez patogen. Jak pokazano w Uzupełniającym Rysunek 1, metoda oparta na kulkach magnetycznych została porównana z innymi metodami, w tym metodą opartą na CTAB-fenol-chloroform¹⁸, szybkimi metodami mini-przygotowania DNA¹⁹^,²⁰ i innymi standardowymi zestawami do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki. Próbki DNA wyekstrahowane przy użyciu sześciu różnych metod poddano konwencjonalnemu laboratoryjnemu PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki sugerują, że metoda oparta na kulkach magnetycznych jest porównywalna z innymi metodami, chociaż zestaw do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki wykazał najlepszą wydajność spośród testowanych przez nas metod. Wszystkie zestawy zawierają tiocyjanian guanidyny lub chlorowodorek guanidyny: oba są silnymi środkami chaotropowymi, które denaturują większość białek komórkowych, w tym RNazy i DNazy. Dlatego stosowanie tych metod nadaje się zarówno do ekstrakcji DNA, jak i RNA.

Porównanie między przenośnym PCR w czasie rzeczywistym a konwencjonalnym laboratoryjnym PCR w czasie rzeczywistym

Aby porównać czułość i swoistość przenośnego PCR z konwencjonalnym laboratoryjnym PCR, przeprowadzono bezwzględną kwantyfikację DNA patogenu przy użyciu różnych ilości genu S. subterranea ITS, który był przenoszony przez wektor pGEM-T²¹. Serię 10-krotnych rozcieńczeń genu ITS (10⁶ do 10⁰ kopii) analizowano przy użyciu starterów SsTQ/zestawu sondy²². Wyniki wykazały, że przenośna metoda PCR wykryła DNA docelowego patogenu (~100 kopii), chociaż czułość była 10 razy niższa niż w przypadku konwencjonalnej laboratoryjnej metody PCR, która wykryła co najmniej 10 kopii (Figura 2).

Dla dalszego sprawdzenia, przetestowano sztucznie zainfekowane gleby. Sporosori S. subterranea otrzymywano z galasów kopa parcha sproszkowanego z korzeni ziemniaka. Gleby zostały porażone zawiesinami sporosori w końcowym stężeniu 10⁵ sporosori/g suchej masy gleby. Za pomocą metody opartej na kulkach magnetycznych wyekstrahowano DNA z porażonych próbek gleby i przygotowano 10-krotne seryjne rozcieńczenia w celu uzyskania stężeń równoważnych 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ i 10⁰ sporosori/g suchej masy gleby. Próbki DNA wykorzystano do PCR przy użyciu startera/sondy SPO set²³. Wyniki pokazały, że przenośna metoda PCR ma porównywalne możliwości analityczne do konwencjonalnej laboratoryjnej metody PCR, ale ponownie czułość została zmniejszona o współczynnik ~10 (Rysunek 3).

Na koniec, przetestowaliśmy próbkę gleby z pola, które było naturalnie skażone S. subterranea. Ekstrakcję DNA za pomocą kulek magnetycznych przeprowadzono na różnych ilościach gleb (10, 20, 50 i 100 mg gleby na 500 μl roztworu buforowego do ekstrakcji). Wyniki sugerowały, że optymalna waga gleby jako materiału wyjściowego do ekstrakcji DNA wynosiła 50-100 mg (Ryc. 4). Ilości gleby znajdujące się poza zakresem spowodowały awarię dalszych etapów PCR. Efekt ten może wynikać z faktu, że gdy nadmiar gleby jest używany jako materiał wyjściowy, zanieczyszczenia (np. związki fenolowe) mogą zakłócać PCR²⁴. W przypadku mniejszych objętości gleby ilość wyekstrahowanego DNA może być niższa niż granica wykrywalności PCR (np. wydajność całkowitego DNA wyekstrahowanego z gleby 10-20 mg była zróżnicowana). Czułość była dość porównywalna między przenośnymi metodami PCR i konwencjonalnymi metodami PCR. Podobne wyniki uzyskano w próbkach DNA różnymi metodami ekstrakcji (rysunek uzupełniający 2)

Wykrywanie innych patogenów przez system wykrywania na miejscu za pomocą przenośnego PCR w czasie rzeczywistym

Przetestowaliśmy metodę przenośnego PCR do wykrywania innych ważnych patogenów ziemniaka przenoszonych przez glebę, R. solani AG3 i PMTV. W tym badaniu przeprowadziliśmy PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu starterów RsTq / zestawu sondy RQP1 ²⁵ do wykrywania R. solani AG3 z DNA z czystej hodowli. Przeprowadziliśmy również PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zestawu starter/sondy PMTV-D²⁶ do wykrywania PMTV z RNA z próbki bulw z objawami. Jak pokazano na Rysunek 5, przenośna metoda PCR skutecznie wykryła oba patogeny. Wyniki były porównywalne między urządzeniami przenośnymi i konwencjonalnymi, co sugeruje, że metoda przenośnego PCR jest wszechstronna i ma zastosowanie do wykrywania innych patogenów, jeśli dostępne są sekwencje starterów zaprojektowane do PCR w czasie rzeczywistym.

figure-results-1
Rysunek 1. Procedura przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów na miejscu. Protokół składa się z kroków w następującej kolejności: przygotowanie lizatu przez krótką homogenizację (A), ekstrakcja kwasów nukleinowych na bazie kulek magnetycznych (B), przenośny PCR w czasie rzeczywistym (C) oraz analiza danych ilościowych za pomocą laptopa (D). Pamiętaj, że wszystkie kroki można wykonać na miejscu.

figure-results-2
Rysunek 2. Porównanie czułości między przenośnym PCR a konwencjonalnym PCR w laboratorium. Kwantyfikację DNA patogenu przeprowadzono przy użyciu różnych ilości genu ITS S. subterranea (10,⁶ do 10,⁰ kopii) za pomocą zestawu starterów/sondy SsTQ. Regresja liniowa między wartością logarytmiczną plazmidowego DNA S. subterranea a odwrotną wartością Log Cq na konwencjonalnym termocyklerze (A) i termocyklerze przenośnym (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Porównanie skuteczności wykrywania w glebach sztucznie porażonych z S. subterranea. Gleby były sztucznie porażone (10⁵ do 10⁰ sporosori/g suchej masy gleby) zawiesinami S. subterranea sporosori. Za pomocą metody opartej na kulkach magnetycznych wyekstrahowano DNA z porażonych próbek gleby. PCR przeprowadzono przy użyciu próbek gleby z zestawem starter/sonda SPO. Regresja liniowa między wartością logarytmiczną ilości wyjściowej w sporosori na gram gleby a odwrotną wartością logarytmiczną Cq na konwencjonalnym termocyklerze (A) i termocyklerze przenośnym (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Porównanie wyjściowej ilości próbek gleby do ekstrakcji DNA. Metodę opartą na kulkach magnetycznych zastosowano do ekstrakcji DNA z 10, 20, 50 i 100 mg próbek gleby. PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu przenośnego termocyklera. Krzywe standardowe reprezentują zależność między ilością całkowitego DNA wyekstrahowanego z próbek gleby (oś x) a ilościami produktu PCR (oś y) amplifikowaną przez zestaw starter/sonda Sss. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Wykrywanie innych patogenów ziemniaka, R. solani i PMTV. Testy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu przenośnego termocyklera i konwencjonalnego termocyklera. R. solani (R. solani) AG3 wykryto w całkowitym DNA wyekstrahowanym z czystej kultury przy użyciu starterów RsTq, a sondę RQP1 (A) PMTV wykryto w całkowitym RNA wyekstrahowanym z próbki bulw zakażonej PMTV przy użyciu zestawu starter/sonda PMTV-D (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Linia diagnostyczna dla fitopatogenów. Schemat blokowy przedstawia ogólny przebieg diagnostyki fitopatogenów. Należy pamiętać, że tradycyjny krok, np. identyfikacja wizualna, można pominąć, jeśli stosuje się detekcję molekularną na miejscu, co sprawia, że cały proces diagnozy jest prosty i szybki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	Przenośny PCR w czasie rzeczywistym	PCR w czasie rzeczywistym	lampa	Elisa	Przepływ boczny
Koszt reakcji docelowej	0,60 dolarów - 8,47 dolarów	0,60 dolarów	0,75 dolarów	0,60 dolarów	4,74 dolarów
czułość	100 egz.	10 kopii	10 kopii	1-10 Sporosori³³ 1-10 ng/ml (białko)³³	1-10 Sporosori³⁴ 5x10⁵jtk/ml³⁵
Wydatek czasowy	90 minut	80-240 minut	50-90 minut³²	3-24 godziny	10-15 minut
Wymagane przygotowanie	●Ekstrakcja kwasów nukleinowych ● Projekt podkładu	●Ekstrakcja kwasów nukleinowych ● Konstrukcja podkładu/sondy	● Ekstrakcja kwasu nucelowego ● Projekt podkładu	● Ekstrakcja białka ● Przeciwciała	N/a
Inne wymagane materiały	● Przenośny termocykler	● Konwencjonalny termocykler	● Bejca kolorometryczna ● Inkubator	● Czytnik płyt ● Sprzęt myjący	N/a

Tabela 1. Wykres porównawczy molekularnych i serologicznych metod wykrywania fitopatogenów

podkład	Sekwencja (5′–3′)^a	Element docelowy^b
SsTQ-F¹³	CCGGCAGACCCAAAACC	ITS1-ITS2 w S. subterranea
SsTQ-R¹³	CGGGCGTCACCCTTCA	ITS1-ITS2 w S. subterranea
SsTQ-P¹³	[FAM]CAGACAATCGACCCAGGTTCTCATG[TAM]	ITS1-ITS2 w S. subterranea
Podkład/sonda Genesig S.subterranea	Nie dotyczy	Aktyna w S. subterranea
SPO10¹⁴	GGTCGGTCCATGGCTTGA	ITS w S. subterranea
SPO11¹⁴	GGCACGCCAATGGTTAGAGA	ITS w S. subterranea
^{SPOPRO1 14}	[FAM]CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT[TAM]	ITS w S. subterranea
RsTqF1¹⁹	AAGAGTTTGGGGTAGCTGGTCTATTT	ITS1-ITS2 w R. solani
RsTqR1¹⁹	AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT	ITS1-ITS2 w R. solani
Zobacz materiał RQP1¹⁹	[FAM]TTTAGGCATGTGCACACCTCTCTCTTTC[TAM]	ITS1-ITS2 w R. solani
Starter/sonda Genesig PMTV	Nie dotyczy	CP-RT w PMTV
PMTV-D-F²⁰	AGAATTGRCATCGAAACAGCA	CP w PMTV
PMTV-D-R²⁰	GTCGCGCTCCAATTTCGTT	CP w PMTV
PMTV-D-P²⁰	[FAM]CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA[TAM]	CP w PMTV
^{a Startery}Oligo DNA zostały zmodyfikowane FAM (6-karboksyfluoresceiną) lub TAM (5-karboksytetrametylorodaminą)
^bITS: Przekładki transkrybowane wewnętrznie, CP: białko płaszcza; CP-RT: odczyt białek płaszcza

Tabela 2. Podkłady użyte w tym badaniu

Rysunek uzupełniający 1. Porównanie metod ekstrakcji DNA w celu wykrycia patogenu parcha sproszkowanego. Porównano sześć różnych metod ekstrakcji DNA (A-F) w celu wykrycia patogenu parcha sproszkowanego, S. subterranea w próbkach gleby. (B, D, F). DNA zostało wyekstrahowane przy użyciu zestawu na bazie krzemionki #1 (wszystkie nazwy zestawów można znaleźć w Tabeli Materiałów), zestawu na bazie krzemionki #2 i zestawu na bazie kulek magnetycznych. PCR przeprowadzono przy użyciu konwencjonalnego laboratoryjnego termocyklera PCR. Krzywe standardowe reprezentują zależność między ilością całkowitego DNA wyekstrahowanego z próbek gleby a ilościami produktu PCR amplifikowanego przez zestaw starterów/sond SsTQ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2. Porównanie granicy wykrywalności między przenośnym PCR a konwencjonalnym laboratoryjnym PCR. Całkowite DNA wyizolowano z próbki gleby przy użyciu trzech różnych metod ekstrakcji: (A, B) metoda Doyle'a, (C, D) zestaw na bazie krzemionki #2 i (E, F) zestaw na bazie kulek magnetycznych. Wykresy pokazane po lewej stronie to dane przy użyciu przenośnego termocyklera z zestawem starterów/sond Sss, natomiast wykresy po prawej reprezentują dane wygenerowane przy użyciu konwencjonalnego termocyklera laboratoryjnego z zestawem starterów/sond SsTQ. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak pokazano w tabeli 1, niedawny postęp technologiczny w molekularnej identyfikacji czynników chorobotwórczych zwiększył skuteczność, dokładność i szybkość diagnozy, co przyczyniło się do wykrywania zakażeń przedobjawowych²⁷. Jeśli chodzi o diagnostykę na miejscu, często stosuje się metody LAMP i przepływu bocznego, ponieważ są one przenośne i zapewniają natychmiastowe wyniki przy niższych kosztach. Jednak w przypadku metod serologicznych wykrycie specyficzne dla danego gatunku może być trudne do osiągnięcia. Czasami powoduje to błędne wykrywanie drobnoustrojów niedocelowych, takich jak zwykli mieszkańcy gleby. Na przykład w przypadku patogenów ziemniaka może wystąpić reaktywność krzyżowa między testami serologicznymi Phytophthora spp. i Pythium spp.²⁸, co wskazuje, że czasami występują trudności w wykrywaniu docelowych patogenów roślin.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół wykrywania molekularnego patogenów ziemniaka przenoszonych przez glebę na miejscu przy użyciu przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym, porównując jego możliwości z konwencjonalnym laboratoryjnym systemem PCR w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy, że metoda na miejscu specyficznie wykrywa patogeny ziemniaka w próbce gleby, chociaż czułość jest ~10 razy niższa niż w przypadku równoważnego testu laboratoryjnego. Warto również wziąć pod uwagę, że w tym przypadku zarówno w badaniu laboratoryjnym, jak i w terenie nie wykorzystano biologicznie istotnej wielkości próby. Duże rozmiary próbek są wymagane do stosowania w rutynowych badaniach przesiewowych gleb polowych, jak opisano wcześniej^29,30, gdzie przetwarzane są próbki o wielkości od 250 g do 1 kg, chociaż metody te wymagają wykwalifikowanych operatorów i wyrafinowanego sprzętu do ekstrakcji DNA. Zazwyczaj ekstrakt DNA glebowy na dużą skalę pobiera się z pojedynczej zbiorczej próbki gleby reprezentatywnej dla wielu podpróbek o powierzchni od 1 do 4 hektarów ^6,29,30. Jednak opracowany tutaj protokół jest szybki i łatwy w użyciu dla użytkowników bez wcześniejszego doświadczenia w diagnostyce molekularnej i może być stosowany poza laboratorium. Ponieważ metoda ta jest szybka i stosunkowo tania w porównaniu z ekstrakcją gleby na dużą skalę, może być stosowana do badań przesiewowych wielu próbek na małą skalę pobranych z podobnego obszaru pobierania próbek zbiorczych na dużą skalę. Mogłoby to przezwyciężyć niektóre braki wynikające z małej wielkości próbki i określić dodatkowe informacje na temat przestrzennego rozmieszczenia patogenu w terenie. Ponadto przenośność i szybkość metody oznaczają, że może ona być również wykorzystywana w działaniach demonstracyjnych dla hodowców w celach edukacyjnych i angażujących.

Inną kwestią jest to, że opublikowano już wiele testów PCR w czasie rzeczywistym dla szerokiego zakresu patogenów roślin⁵. System ten może wykorzystywać te istniejące testy bez konieczności projektowania nowych starterów LAMP, aby umożliwić je w testach terenowych. Częstą krytyką testów LAMP jest to, że mogą być trudne do zaprojektowania³¹. Przenośna reakcja PCR pozwala zatem na stosunkowo łatwe wdrożenie szerokiej gamy łatwo dostępnych testów na obecność patogenów do testów na miejscu.

Tradycyjne metody mogą być często kosztowne, pracochłonne, niedokładne i czasochłonne. Prostota opracowanej przez nas metody na miejscu pozwala hodowcom i pracownikom przemysłu na samodzielne wykrywanie patogenów i być może generowanie wyników znacznie szybciej niż wysyłanie ich do laboratorium diagnostycznego, które może znajdować się w pewnej odległości. Szybkość i czułość przenośnej metody PCR może pomóc hodowcom uniknąć potencjalnych wtórnych infekcji, które mogą jeszcze bardziej zwiększyć populację patogenów i niezamierzone rozprzestrzenianie się (za pośrednictwem sprzętu lub ludzi). Podsumowując, metoda on-site opracowana w niniejszym badaniu umożliwia dokładne i stosunkowo czułe wykrywanie ważnych patogenów przenoszonych przez glebę w terenie. Mamy nadzieję, że metoda opracowana na miejscu w tym badaniu przyczyni się do obecnego procesu diagnostycznego (ryc. 6), nie tylko dostarczając szybkich i dokładnych odpowiedzi na pytania epidemiologiczne dotyczące chorób roślin w terenie, ale także zapewniając lepsze zrozumienie biologii i epidemiologii patogenów roślin.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dr Neilowi C. Gudmestadowi z Uniwersytetu Stanowego Północnej Dakoty za dostarczenie plazmidowego DNA S. subterranea, dr Hanu Pappu z Washington State University (WSU) za dostarczenie PMTV RNA, oraz dr Debrze Inglis z WSU za dostarczenie R. solani AG3. Specjalne podziękowania dla dr Jeremy'ego Jewella z WSU za komentarze do manuskryptu oraz WSU CAHNRS Communications za wideografię. Badania te były wspierane przez Northwest Potato Research Consortium oraz Departament Rolnictwa Stanu Waszyngton - Specialty Crop Block Grant Program (grant nr K1764). PPNS nr 0741, Zakład Patologii Roślin, Wyższa Szkoła Rolnicza, Nauki o Człowieku i Zasobach Naturalnych, Centrum Badań Rolniczych, projekt włazu nr WNP00833, Uniwersytet Stanowy Waszyngtonu, Pullman, Waszyngton, Stany Zjednoczone.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biała płytka do PCR	Bio-Rad	HSP9601
CFX Manager	Bio-Rad	1845000
SsoAdvanced Sondy uniwersalne Supermix	Dotykowy aparat qPCR Bio-Rad	1725280
CFX96	Bio-Rad
Alkohol etylowy, czysty 200 proof	Decon Laboratories	04-355-222
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Odczynniki	Fisher BP118-500
Fenol, nasycony	Fisher BioReagents	BP1750I-400
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)	Fisher BioReagents	BP152-5
q16 maszyna do PCR w czasie rzeczywistym	genesig	MBS486001
Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)	Invitrogen	15525-017
2-propanol (izopropanol)	JT Baker	67-63-0
Chloroform	JT Baker	9180-03
Kwas solny, 36,5-38,0% (HCl)	JT Baker	9535-03
Alkohol izo-amylowy	JT Baker	9038-01
FastDNA Spin	MP Biomedicals	6560-200	Zestaw do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki #1
Luna Uniwersalny jednoetapowy zestaw RT-qPCR	New England Biolabs	E3005S
0,1 ml Niskoprofilowe indywidualne probówki do PCR	Phenix Research	MPC-100LP
Łatwy zestaw do ekstrakcji DNA/RNA	Primerdesign	genesigEASY-EK
genesig Probówki Easy 1,5 ml	Primerdesign	genesigEASY-1.5
Magnetyczny stojak na probówki	Primerdesign	genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit	Primerdesign	Path-S.subterranea-EASY
Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB)	Sigma-Aldrich	H6269-100G
Tłuczki do granulek	Thermo Fisher Scientific	12-141-364
Chlorek sodu (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Zestaw do miniprzygotowania DNA	ZymoBIOMICS	D4300	Zestaw do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki #2

1855195

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241(2008).
Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337(2016).
Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349(1991).
Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja za pomoc kulek magnetycznych patogeny glebowe wykrywanie chor b ro lin test z u yciem sond fluorogennych protok ekstrakcji DNA diagnostyka w terenie Spongospora subterranea PCR laboratoryjny laptop do analizy danych

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły