Artykuł metodologiczny

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

20K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56891

⸱

23 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Washington State University, 2Parma Research and Extension Center, University of Idaho

W tym artykule

Podsumowanie

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Streszczenie

Diagnozowanie chorób roślin na miejscu może być użytecznym narzędziem dla hodowców do podejmowania decyzji w odpowiednim czasie, umożliwiając wcześniejsze wdrożenie strategii zarządzania chorobami, które zmniejszają wpływ choroby. Obecnie w wielu laboratoriach diagnostycznych reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), a w szczególności PCR w czasie rzeczywistym, jest uważana za najbardziej czułą i dokładną metodę wykrywania patogenów roślinnych. Jednak laboratoryjne PCR zazwyczaj wymagają drogiego sprzętu laboratoryjnego i wykwalifikowanego personelu. W tym badaniu wykorzystano przenoszone przez glebę patogeny ziemniaka, aby wykazać potencjał wykrywania molekularnego na miejscu. Udało się to osiągnąć za pomocą szybkiego i prostego protokołu składającego się z ekstrakcji kwasów nukleinowych na bazie kulek magnetycznych, przenośnego PCR w czasie rzeczywistym (test oparty na sondzie fluorogenicznej). Przenośne podejście do PCR w czasie rzeczywistym wypada korzystnie w porównaniu z systemem laboratoryjnym, wykrywając zaledwie 100 kopii DNA z podziemnej Spongospora. Opracowana w ten sposób przenośna metoda PCR w czasie rzeczywistym może służyć jako alternatywa dla podejść laboratoryjnych i użyteczne narzędzie do diagnozowania patogenów na miejscu.

Wprowadzenie

Dokładna i szybka identyfikacja patogenów wywołujących chorobę znacząco wpływa na decyzje dotyczące zarządzania chorobami roślin. Choroby przenoszone przez glebę są szczególnie trudne do zdiagnozowania, ponieważ środowisko glebowe jest niezwykle duże w stosunku do masy roślin i złożone, co sprawia, że zrozumienie wszystkich aspektów chorób przenoszonych przez glebę jest wyzwaniem. Co więcej, choroby przenoszone przez glebę mogą być bezobjawowe we wczesnych stadiach infekcji, zależne od stresorów środowiskowych, a niektóre mają długie okresy utajenia, które skutkują opóźnioną diagnozą1. Wiele patogenów przenoszonych przez glebę rozwinęło struktury przetrwania, takie jak wyspecjalizowane zarodniki lub melanizowane strzępki, które mogą przetrwać w glebie przez wiele lat nawet pod nieobecność ich żywicieli. Stosowane podejścia do zarządzania chorobami przenoszonymi przez glebę obejmują: unikanie znanych porażonych pól, stosowanie certyfikowanych nasion i sadzonek wolnych od patogenów, utrzymywanie sprzętu w stanie sanitarnym oraz ograniczanie ruchu gleby i wody, gdy tylko jest to możliwe. Wiedza na temat obecności patogenów za pomocą strategii wykrywania molekularnego może również odgrywać użyteczną rolę, dostarczając informacji na temat podejmowania w odpowiednim czasie decyzji dotyczących zabiegów na wczesnym etapie lub oceny pól przed sadzeniem. Testy na miejscu zapewniają dodatkowe korzyści w postaci szybkiego uzyskania wyniku bez wysyłania próbki do laboratorium diagnostycznego, które może znajdować się w pewnej odległości, a także może zaangażować hodowcę, jeśli taka diagnostyka jest przeprowadzana "na miejscu" w jego obecności.

Dla diagnozy na miejscu opartej na detekcji molekularnej, czułość, specyficzność, solidność (powtarzalność i odtwarzalność) oraz wydajność (tj. prostota i wydajność kosztowa) są kluczowymi czynnikami do rozważenia. Urządzenia z przepływem bocznym (LFD), takie jak Immunostrip i PocketDiagnostic, są popularnymi metodami wykrywania patogenów na miejscu ze względu na ich prostotę jako test jednoetapowy. Jednak LFD mogą nie być właściwym narzędziem diagnostycznym we wszystkich sytuacjach, ponieważ brakuje im czułości i swoistości, a czasami dają niejednoznaczne wyniki, jeśli docelowy patogen jest w niskich stężeniach i może reagować krzyżowo z podobnymi gatunkami lub rodzajami2. Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) ma również zastosowanie do wykrywania patogenów na miejscu i jest szczególnie tania ze względu na tanie odczynniki, warunki reakcji, które pozostają stałe, oraz prostą kolorymetryczną analizę wizualną. Jednak zarówno LFD, jak i LAMP są zwykle używane jakościowo, chociaż oba podejścia mogą być używane ilościowo z droższym sprzętem3. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) oferuje wysoką specyficzność, wysoką czułość i możliwości ilościowe w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami wykrywania. Jednak konwencjonalna technologia PCR oparta na laboratorium wymaga drogiego sprzętu laboratoryjnego i wykwalifikowanego personelu, co jest główną wadą przyjęcia tej technologii jako metody wykrywania do celów na miejscu.

W tym protokole demonstrowana jest metoda diagnostyki na miejscu przy użyciu przenośnego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Technologia PCR w czasie rzeczywistym oferuje przewagę nad innymi metodami pod względem dokładności ilościowej, czułości i wszechstronności oraz jest szeroko stosowana do wykrywania szerokiej gamy patogenów roślin4,5, w tym różnych patogenów ziemniaka w glebie6. Ze względu na ostatnie trendy na szybko rozwijającym się, konkurencyjnym rynku, sprzęt wymagany do technologii PCR nadal się rozwija, aby być bardziej kompaktowy i tańszy7. Protokół składa się z następujących etapów: ekstrakcja kwasów nukleinowych za pomocą kulek magnetycznych, przenośny PCR w czasie rzeczywistym (test oparty na sondzie fluorogenicznej) oraz analiza danych ilościowych, które można wykonać zdalnie za pomocą laptopa (rysunek 1).

Korzystając z opracowanego tutaj przenośnego protokołu PCR, próbki gleby zostały przeanalizowane w celu wykrycia patogenu przenoszonego przez glebę, Spongospora subterranea. Spongospora została wybrana, ponieważ jest ważnym patogenem ziemniaka jako czynnik wywołujący parcha sproszkowanego8. Uważa się, że w ostatnich dziesięcioleciach choroba ta rozprzestrzeniła się na wiele regionów, w których uprawia się ziemniaki9,10. Parch pudłowy, ze względu na obecność pryszczowatych zmian na bulwach, może spowodować znaczne straty jakościowe u plantatorów ziemniaków. Ponadto S. subterranea może przenosić wirusa Potato Mop Top (PMTV), który może powodować objawy zmian wewnętrznych w bulwach (znane jako spraing)11,12. Dlatego ważne jest, aby wiedzieć, czy S. subterranea jest obecny na polach przed sadzeniem6. Wykazujemy również przydatność tego protokołu do wykrywania Rhizoctonia solani Anastomosis Group 3 (AG3) i PMTV. Chociaż kilka grup zespoleń Rhizoctonia solani powoduje choroby ziemniaków, AG3 jest prawdopodobnie najważniejszą na świecie13, powodując raka łodygi i czarną skorupę, powodując straty plonów handlowych do 30%14. PMTV powoduje zmiany martwicze w obrębie bulw, które potocznie nazywa się spraingiem. Wirus ten został niedawno po raz pierwszy zgłoszony w kilku stanach na północno-zachodnim wybrzeżu Pacyfiku15,16,17 i budzi coraz większe zaniepokojenie hodowców w tym ważnym regionie uprawy ziemniaków. Oprócz określenia skuteczności przenośnego PCR w przypadku tych ważnych chorób, w tym badaniu zbadano również optymalną metodologię ekstrakcji DNA i wielkość próbki gleby.

Wyniki sugerują, że metoda przenośnego PCR jest wszechstronna i ma zastosowanie do wykrywania różnych patogenów. Opracowana przez nas metoda wykrywania na miejscu może umożliwić pracownikom pierwszej linii w rolnictwie (np. hodowcom) podejmowanie wcześniejszych decyzji dotyczących zarządzania chorobami, takich jak selekcja odmian lub płodozmian, a także może określić ilościowo patogen roślin w próbce podczas badania terenowego, przed sadzeniem, aby uniknąć potencjalnych ognisk choroby.

Protokół

1. Molekularna detekcja patogenów na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Uwaga: Zobacz Rysunek 1.

  1. Ekstrakcja DNA na bazie kulek magnetycznych
    nuta: Zastosowano zestaw do ekstrakcji DNA na bazie kulek magnetycznych (np. firmy Primerdesign) zgodnie z instrukcją producenta. Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Po zawieszeniu liofilizowanej proteinazy K (butelka nr 1) (przy użyciu butelki nr 1a) przechowywać w temperaturze -20 °C.
    1. Wymieszaj 20-50 mg próbki gleby z 500 μl roztworu do przygotowywania próbek w mikroprobówce.
      nuta: Stosunek gleby do roztworu przygotowawczego jest ważny, ponieważ mieszanie ich w innych proporcjach może spowodować niepowodzenie dalszych eksperymentów (np. zanieczyszczenie inhibitorami PCR).
    2. Zmiel ziemię na dnie probówki za pomocą małego sterylnego tłuczka, aż roztwór będzie mętny. Następnie zawiesić cząstki gleby w roztworze, potrząsając mikroprobówką i odstawić ją w spokoju, aby cząstki gleby całkowicie opadły (zwykle od 5 do 10 minut).
    3. Przenieś 200 μl supernatantu do świeżej mikroprobówki i dodaj 200 μl buforu do lizy (butelka nr 2: roztwór chlorowodorku guanidyny) i 20 μl proteinazy K (butelka nr 1).
    4. Dokładnie wymieszać lizat, odwracając probówkę i inkubować w temperaturze otoczenia przez 15 min.
      nuta: Jeśli lizat znajduje się na pokrywie mikroprobówki, postukaj w probówkę lub użyj wirówki, jeśli jest dostępna, aby wyjąć ją z pokrywki.
    5. Dodać 500 μl buforu wiążącego/mieszanki kulek magnetycznych (butelka nr 3) do próbki poddanej lizie. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze otoczenia przez 5 minut z dala od stojaka na probówki magnetyczne.
      nuta: Upewnij się, że dobrze wymieszałeś roztwór kulek przed użyciem, aby upewnić się, że kulki są równomiernie oddzielone od butelki do przechowywania.
    6. Umieść mikroprobówkę na magnetycznym stojaku na probówki. Odczekaj co najmniej 2 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki w mikroprobówce przyczepią się do ścianki po stronie magnetycznej. Następnie usunąć i wyrzucić cały sklarowany osad za pomocą pipetowania.
      nuta: Nie należy naruszać namagnesowanych kulek podczas wyjmowania i zasysania supernatantu. DNA zostało teraz przechwycone przez kulki magnetyczne.
    7. Wyjmij mikroprobówkę z magnetycznego stojaka na probówki, dodaj 500 μl buforu do mycia-1 (butelka nr 4: roztwór nadchloranu sodu/etanolu) i ponownie zawiesić kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Wykonaj ten etap mycia, aby usunąć białko i sól z próbki. Pozostaw mieszaninę na 30 sekund.
    8. Powtórz krok 1.1.6.
    9. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, dodaj 500 μl buforu do mycia-2 (butelka nr 5: roztwór nadchloranu sodu/etanolu) i ponownie zawiesić kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Pozostaw mieszaninę na 30 sekund.
    10. Powtórz krok 1.1.6.
    11. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, a następnie dodaj 500 μl 80% etanolu (butelka nr 6).
      nuta: Ten etap jest niezbędny do usunięcia pozostałości soli z próbki.
      1. Ponownie zawiesić kulki, powtarzając pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone. Odstaw na 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie.
    12. Powtórz krok 1.1.6.
    13. Suszyć na powietrzu granulat kulki magnetycznej przez 10 minut w temperaturze otoczenia przy otwartej pokrywie mikroprobówki.
      nuta: Kulki powinny być wolne od jakichkolwiek widocznych pozostałości etanolu, ale nie powinny być całkowicie wysuszone.
    14. Wyjmij mikroprobówkę ze stojaka na probówki magnetyczne, dodaj 50-200 μl buforu elucyjnego (butelka nr 7) i ponownie zawiesij kulki przez wielokrotne pipetowanie, aż kulki zostaną równomiernie rozproszone i odstaw na 30 s.
      nuta: W powyższych krokach oczyszczone DNA jest uwalniane z kulek magnetycznych do buforu elucyjnego.
    15. Umieść mikroprobówkę na magnetycznym stojaku na probówki. Odczekaj co najmniej 2 minuty lub do momentu, gdy wszystkie koraliki w mikroprobówce przyczepią się do ścianki po stronie magnetycznej.
    16. Przenieś supernatant, który zawiera teraz oczyszczone DNA/RNA, do mikroprobówki o pojemności 0,5 ml w celu użycia w dalszych etapach.
  2. Przenośny PCR
    nuta: Przenośny termocykler i zestaw do oznaczania PCR zostały użyte zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
    1. Otwórz i uruchom oprogramowanie powiązane z termocyklerem, wybierz Test wykrywania celu i wprowadź wszystkie informacje opisu w polach wprowadzania danych Nazwa i szczegóły, Uwagi, Próbki i Testy.
      nuta: Studzienki #1 i #2 są wyznaczone przez oprogramowanie odpowiednio dla kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej.
    2. Przygotuj odczynniki PCR przed użyciem. Przenieść 500 μl buforu do reprodukcji mieszanki głównej do probówki zawierającej liofilizowaną mieszankę wzorcową i dobrze wymieszać przez odwrócenie. Przenieś całą mieszankę wzorcową do brązowych starterów/sondy z etykietą mikroprobówek (Tabela 2).
      1. Zakręć i potrząśnij mikroprobówką, aby wymieszać. Wymagane jest dokładne wymieszanie, aby upewnić się, że wszystkie składniki są całkowicie zawieszone. Pozostaw tę mieszaninę na 5 minut przed użyciem.
        nuta: Po użyciu przechowywać mieszaninę reakcyjną w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować kontrolę ujemną, przenosząc 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z poprzedniego etapu do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl sterylnej wody dejonizowanej wolnej od nukleaz.
    4. Przygotować kontrolę dodatnią, przenosząc 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z etapu 1.2.2 do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl matrycy kontroli dodatniej.
    5. Dla każdej próbki przenieść 10 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z poprzedniego etapu do probówki PCR o pojemności 0,2 ml, a następnie dodać 10 μl próbki DNA przygotowanej z kroku 1.1.16.
    6. Załaduj do studzienek termocyklera zawartość odpowiednich probówek PCR, jak opisano w kroku 2.1.1.
    7. Po wprowadzeniu i potwierdzeniu wszystkich niezbędnych informacji wybierz Start Run i wybierz instrument podłączony do sieci Ethernet lub dysk USB.
      nuta: Jeśli wybrana jest opcja dysku USB, plik uruchamiania musi być zapisany na dysku, aby mógł być używany z termocyklerem (np. F:\genesig). Przebieg rozpocznie się natychmiast po włożeniu napędu do termocyklera.
  3. Analiza danych z przenośnego PCR w czasie rzeczywistym.
    1. Po zakończeniu biegu otwórz plik przebiegu (.usb) z dysku USB za pomocą oprogramowania powiązanego z termocyklerem lub bezpośrednio view wyniki biegu w oprogramowaniu, klikając Wyniki.
    2. Przed analizowaniem wyników zapisz ukończony przebieg, aby uniknąć utraty danych.
    3. Na karcie Wyniki wyświetl stan przebiegu podzielony na kategorie według samples.
      nuta: Dane, które można uzyskać w tej zakładce, to stan wyników i numer kopii wykryty w próbce.
    4. Kliknij zakładkę Szczegóły, aby wyświetlić krzywe wzmocnienia. Gdy cel zostanie pomyślnie wykryty, wyświetlane są wartości Cq (cykl kwantyfikacji) zarówno celu, jak i kontroli wewnętrznej.
      nuta: Wartości te są obliczane w raporcie końcowym i służą do określenia, czy próbka jest dodatnia dla celu i czy występują problemy z reakcją lub próbkami DNA.

2. Inne protokoły

  1. Alternatywne laboratoryjne metody ekstrakcji DNA
    1. Metody oparte na CTAB-fenol-chloroformie
      1. Wykonaj metody oparte na chloroformie CTAB-fenol-chloroform, zgodnie z metodą Doyle'a18 i metodą Dellaporta19, jak opisano wcześniej.
    2. Metoda minipreparatyki DNA
      nuta: Metoda Edwardsa20 została wykonana w następujący sposób.
      1. Dodaj 500 mg gleby, a następnie pięć kulek ceramicznych o średnicy 1,4 mm i 750 μl buforu Edwardsa (200 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) do mikroprobówki i dobrze wymieszaj.
      2. Inkubować mikroprobówkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
      3. Homogenizować próbkę za pomocą homogenizatora z ubijakiem kulkowym przez 60 s (lub przy użyciu moździerza i tłuczka).
      4. Odwirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut.
      5. Przenieść 500 μl supernatantu do świeżej mikroprobówki, a następnie wymieszać z 500 μl schłodzonego izopropanolu. Wymieszaj, odwracając rurkę 10 razy.
      6. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 15 minut w celu granulacji DNA.
      7. Zdekantować supernatant i pozostawić osad DNA do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż pozostały etanol odparuje.
      8. Przemyć osad DNA 750 μl schłodzonego 70% etanolu.
      9. Wysuszyć granulat na powietrzu przed ponownym zawiesieniem w 50-100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 1 mM EDTA).
    3. Inne metody alternatywne
      1. Wykonaj ekstrakcję DNA na bazie krzemionki za pomocą zestawu #1 (MP BIO Fast DNA Spin) i zestawu #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Konwencjonalny laboratoryjny PCR w czasie rzeczywistym.
    nuta: Konwencjonalny termocykler został użyty z mastermixem do PCR na bazie sondy, różnych starterów i sond oligonukleotydowych (Tabela 2).
    1. Używając probówek do PCR z nieprzezroczystym dnem lub płytki PCR, przygotuj 20 μl reakcji dla wszystkich próbek DNA, które mają być analizowane, a także kontrolę ujemną (woda dejonizowana bez nukleaz) i pozytywną kontrolę matrycową przygotowaną we własnym zakresie.
    2. Dla każdej probówki lub studzienki PCR należy przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl mastermixu, 7 μl wody dejonizowanej bez nukleaz, 2 μl starterów/sondy 2 μM i 1 μl próbki DNA (z etapu 1.1.16 lub 2.1) lub matrycy kontrolnej na próbkę.
    3. Zamknij probówki lub płytkę PCR i rozpocznij reakcję, wybierając odpowiedni program PCR.
  3. Analiza danych z konwencjonalnego laboratoryjnego PCR w czasie rzeczywistym
    1. Użyj oprogramowania powiązanego z termocyklerem, aby przeanalizować wyniki z konwencjonalnego termocyklera. Aby rozpocząć analizę danych, przenieś plik przebiegu z termocyklera na dysk USB, włóż dysk USB i wybierz opcję Eksportuj.
    2. Otwórz plik danych (.pcrd) z wyeksportowanego przebiegu w oprogramowaniu powiązanym z termocyklerem.
    3. Podświetl studzienkę próbki, umieszczając odpowiadającą jej studzienkę na instrumencie. Krzywe wzmocnienia i krzywe standardowe (jeśli dotyczy) są generowane automatycznie. Jeśli informacje o próbce nie zostaną wprowadzone, kliknij opcję Ustawienia płyty lub podobną funkcję, aby rozpocząć wprowadzanie danych przed analizą danych.
    4. Wyświetl dane na karcie Kwantyfikacja; można je wyeksportować w celu analizy danych za pomocą oprogramowania innej firmy, takiego jak czytniki plików CSV, XML lub HTML.
    5. Uzyskaj dane Cq na podstawie wyznaczonych progów i porównaj je z kontrolami dodatnimi i ujemnymi.
      nuta: Jeśli w teście użyto wzorców DNA celu, należy porównać dane próbki Cq z danymi wzorców, aby określić wartość odcięcia Cq

Wyniki

Porównanie metod ekstrakcji DNA

Zgodność metody ekstrakcji DNA opartej na kuleczkach magnetycznych z PCR w czasie rzeczywistym oceniono poprzez oznaczenie ilości DNA S. subterranea w próbce gleby z pól zainfekowanych patogenem. Jak pokazano na dodatkowej Rysunku 1, metodę opartą na kuleczkach magnetycznych porównano z innymi metodami, w tym z metodą opartą na CTAB-fenolu i chloroformie18, szybkimi metodami minipreparatyki DNA19,20 oraz innymi standardowymi zestawami do ekstrakcji DNA opartymi na krzemionce. Próbki DNA wyekstrahowane za pomocą sześciu różnych metod poddano konwencjonalnemu laboratoryjnemu PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki zasugerowały, że metoda oparta na kuleczkach magnetycznych jest porównywalna z innymi metodami, choć zestaw do ekstrakcji DNA oparty na krzemionce wykazał najlepszą wydajność spośród przetestowanych metod. Wszystkie zestawy zawierają tiocyjanian guanydyny lub chlorek guanydyny: oba są silnymi czynnikami chaotropowymi, które denaturują większość białek komórkowych, w tym RNazy i DNazy. W związku z tym stosowanie tych metod jest odpowiednie zarówno dla ekstrakcji DNA, jak i RNA.

Porównanie przenośnego urządzenia do real-time PCR z konwencjonalnym laboratoryjnym systemem real-time PCR

Aby porównać czułość i swoistość przenośnego urządzenia PCR z konwencjonalnym PCR laboratoryjnym, przeprowadzono ilościowe oznaczenie DNA patogenu przy użyciu różnych ilości genu ITS S. subterranea przeniesionego do wektora pGEM-T21. Serię 10-krotnych rozcieńczeń genu ITS (od 106 do 100 kopii) analizowano przy użyciu zestawu starterów i sondy SsTQ2. Wyniki wykazały, że metoda przenośnego PCR wykryła docelowe DNA patogenu (~10 kopii), choć czułość była 10 razy niższa niż w przypadku konwencjonalnej metody PCR laboratoryjnej, która wykryła co najmniej 10 kopii (Rysunek 2).

W celu dalszej walidacji przebadano gleby sztucznie zainfekowane. Sporosory S. subterranea pozyskano z narośli korzeniowych wywołanych przez mączną pierścienicę z korzeni ziemniaka. Gleby zainfekowano zawiesinami sporosor w końcowym stężeniu 105 sporosori/g suchej masy gleby. Wykorzystując metodę opartą na koralikach magnetycznych, wyekstrahowano DNA z próbek zainfekowanej gleby, a następnie przygotowano 10-krotne rozcieńczenia szeregowe w celu uzyskania stężeń odpowiadających 105, 104, 103, 102, 101 i 100 sporosori/g suchej masy gleby. Próbki DNA wykorzystano do reakcji PCR z użyciem zestawu starterów i sond SPO23. Wyniki wykazały, że przenośna metoda PCR wykazuje zdolność analityczną porównywalną do konwencjonalnej metody PCR przeprowadzanej w laboratorium, jednak ponownie czułość była obniżona około 10-krotnie (Rycina 3).

Na koniec przetestowano próbkę gleby z pola naturalnie zanieczyszczonego S. subterranea. Ekstrakcję DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych przeprowadzono dla różnych ilości gleby (10, 20, 50 i 10 mg gleby na 50 µL roztworu buforu do ekstrakcji). Wyniki sugerują, że optymalna masa gleby jako materiału wyjściowego do ekstrakcji DNA wynosiła 50-100 mg (Rycina 4). Ilości gleby poza tym zakresem powodowały niepowodzenie w późniejszych etapach PCR. Efekt ten może wynikać z faktu, że przy zastosowaniu nadmiaru gleby jako materiału wyjściowego, zanieczyszczenia (np. związki fenolowe) mogą zakłócać przebieg reakcji PCR24. W przypadku mniejszych ilości gleby ilość ekstrahowanego DNA może być niższa niż granica wykrywalności metody PCR (np. wydajność całkowitego DNA ekstrahowanego z 10-20 mg gleby była zmienna). Czułość była zbliżona pomiędzy przenośną metodą PCR a konwencjonalną metodą PCR. Podobne wyniki uzyskano w próbkach DNA otrzymanych różnymi metodami ekstrakcji (Rycina dodatkowa 2)

Wykrywanie innych patogenów za pomocą systemu detekcji w miejscu pobrania próbek z wykorzystaniem przenośnego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym

Przetestowaliśmy przenośną metodę PCR w celu wykrycia innych istotnych patogenów ziemniaka przenoszonych przez glebę: R. solani AG3 oraz PMTV. W niniejszym badaniu przeprowadzono reakcję real-time PCR z wykorzystaniem zestawu starterów RsTq i sondy RQP125 do wykrywania R. solani AG3 w DNA z czystej hodowli. Przeprowadzono również reakcję real-time PCR z użyciem zestawu starterów i sondy PMTV-D26 do wykrywania PMTV w RNA z próbki objawowej bulwy. Jak pokazano na Rysunku 5, przenośna metoda PCR pomyślnie wykryła oba patogeny. Wyniki były porównywalne pomiędzy urządzeniem przenośnym a konwencjonalnym, co sugeruje, że przenośna metoda PCR jest wszechstronna i może być stosowana do wykrywania innych patogenów, pod warunkiem dostępności sekwencji starterów zaprojektowanych dla real-time PCR.

Homogenizacja tkanki w probówce do mikrocentryfugi; magnetyczna ekstrakcja DNA za pomocą pipety; przenośny zestaw do PCR; analiza danych na laptopie.
Rysunek 1Procedura wykorzystania przenośnego systemu real-time PCR do detekcji patogenów w miejscu pobrania próbek. Protokół składa się z następujących etapów: przygotowanie lizatu poprzez krótką homogenizację (A), ekstrakcję kwasów nukleinowych z wykorzystaniem kulek magnetycznych (B), przenośny real-time PCR (C) oraz ilościową analizę danych przy użyciu laptopa (D). Należy zwrócić uwagę, że wszystkie etapy mogą zostać wykonane w miejscu pobrania próbek.

Wykres porównujący konwencjonalną i przenośną PCR, przedstawiający log Cq^-1 w funkcji liczby kopii plazmidu, porównanie R².
Rycina 2Porównanie czułości przenośnego PCR i konwencjonalnego PCR laboratoryjnego. Ilościowe oznaczenie DNA patogenu przeprowadzono z wykorzystaniem różnych ilości S. subterranea gen ITS (106 do 100 kopii) za pomocą zestawu starterów/sond SsTQ. Regresja liniowa między wartością logarytmiczną S. subterranea pDNA i odwrotna wartość logarytmiczna Cq w konwencjonalnym termocyklerze (A) oraz w przenośnym termocyklerze (B). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Porównanie konwencjonalnego i przenośnego PCR; wykres, Log(Cq) w stosunku do liczby przyrzeczników, przedstawiono wartości R².
Rycina 3Porównanie wydajności detekcji w sztucznie zainfekowanych glebach z S. subterranea. Próbki gleby zostały sztucznie zainfekowane (105 do 100 sporosori/g suchej masy gleby) z *S. subterranea* zawiesiny sporosoriów. Zastosowano metodę opartą na kuleczkach magnetycznych do ekstrakcji DNA z próbek zakażonej gleby. Reakcje PCR przeprowadzono na próbkach gleby przy użyciu zestawu starterów/sond SPO. Regresja liniowa między wartością logarytmiczną ilości początkowej sporosoriów na gram gleby a odwrotnością wartości logarytmicznej Cq w konwencjonalnym termocyklerze (A) oraz w przenośnym termocyklerze (B). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Analiza DNA gleby metodą ilościowego PCR, wykresy przedstawiające korelację: log ilości DNA vs. [Log(Cq)]⁻¹.
Rysunek 4Porównanie początkowej ilości próbek gleby do ekstrakcji DNA. Do ekstrakcji DNA z próbek gleby o masach 10, 20, 50 i 10 mg wykorzystano metodę opartą na kuleczkach magnetycznych. Reakcje Real-time PCR przeprowadzono przy użyciu przenośnego termocyklera. Krzywe standardowe przedstawiają zależność między ilością całkowitego DNA wyekstrahowanego z próbek gleby (oś x) a ilością produktu PCR (oś y) amplifikowanego za pomocą zestawu starterów/sond Sss. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki analizy PCR: wykresy porównujące przenośny i konwencjonalny PCR w ilościowym oznaczaniu RNA/DNA.
Rycina 5Wykrywanie innych patogenów ziemniaka, R. solani oraz PMTV. Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu przenośnego termocyklera oraz konwencjonalnego termocyklera. R. solani W całkowitym DNA wyekstrahowanym z czystej kultury wykryto AG3 przy użyciu starterów RsTq i sondy RQP1 (A). W całkowitym RNA wyekstrahowanym z próbki bulwy zainfekowanej PMTV wykryto PMTV przy użyciu zestawu starter/sonda PMTV-D (B). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat oceny patogenów; identyfikacja wizualna/molekularna; mikroskop, PCR; proces decyzyjny.
Rysunek 6Procedura diagnostyczna dla fitopatogenów. Schemat blokowy przedstawia ogólny przebieg procesu diagnostyki fitopatogenów. Należy zauważyć, że tradycyjny etap, np., identyfikacja wizualna, może zostać pominięta w przypadku zastosowania detekcji molekularnej w miejscu badania, co sprawia, że cały proces diagnostyczny jest prosty i szybki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Przenośny PCR w czasie rzeczywistymPCR w czasie rzeczywistymLAMP (izotermiczna amplifikacja z pętlą)ELISAprzepływ boczny
Koszt jednej reakcji docelowej$0.60-$8.47$0.60$0.75$0.60$4.74
Czułość10 kopii10 kopii10 kopii1-10 sporosori33
1-10 ng/ml (białko)33		1-10 sporosori34
5x105JCF/ml35
Nakład czasu90 minut80–240 minut50–90 minut323–24 godziny10–15 minut
Wymagane przygotowania●Ekstrakcja kwasów nukleinowych
● Projektowanie starterów		●Ekstrakcja kwasów nukleinowych
● Projektowanie starterów/sond		● Ekstrakcja kwasów nukleinowych
● Projektowanie starterów		● Ekstrakcja białek
● Przeciwciała		Brak danych
Pozostałe wymagane materiały● Przenośny termocykler● Konwencjonalny termocykler● Barwienie kolorymetryczne
● Inkubator		● Czytnik płytek
● Sprzęt myjący		Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.

Tabela 1. Wykres porównawczy molekularnych i serologicznych metod wykrywania fitopatogenów

StarterSekwencja (5′–3′)aCelb
SsTQ-F13CCGGCAGACCCAAAACCITS1-ITS2 w S. subterranea
SsTQ-R13CGGGCGTCACCCTTCAITS1-ITS2 w S. subterranea
SsTQ-P13[FAM]CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG[TAM]ITS1-ITS2 w S. subterranea
Starter/sonda Genesig S.subterraneaN/AAktyna w S. subterranea
SPO1014GGTCGGTCCATGGCTTGAITS w S. subterranea
SPO114GGCACGCCAATGGTTAGAGAITS w S. subterranea
SPOPRO114[FAM]CCGGTGCGTCTGGCTT[TAM]ITS w S. subterranea
RsTqF119AAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTTITS1-ITS2 w R. solani
RsTqR119AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTTITS1-ITS2 w R. solani
RQP119[FAM]TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC[TAM]ITS1-ITS2 w R. solani
Starter/sonda Genesig PMTVN/ACP-RT w PMTV
PMTV-D-F20AGAATTGRCATCGAAACAGCACP w PMTV
PMTV-D-R20GTCGCGCTCCAATTTCGTTCP w PMTV
PMTV-D-P20[FAM]CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA[TAM]CP w PMTV
a Oligonukleotydowe startery zostały zmodyfikowane za pomocą FAM (6-karboksyfluoresceiny) lub TAM (5-karboksytetrametylorodaminy)
b ITS: wewnętrzne sekwencje odstępowe (internal transcribed spacers), CP: białko płaszcza (coat protein); CP-RT: białko płaszcza z odczytem przez stop (coat protein readthrough)

Tabela 2. Primery użyte w niniejszym badaniu

Rycina uzupełniająca 1. Porównanie metod ekstrakcji DNA w celu wykrycia patogenu powodującego mączniaka ziemniaka. Porównano sześć różnych metod ekstrakcji DNA (A-F) w celu wykrycia patogenu mączniaka ziemniaka, S. subterranea, w próbkach gleby. (B, D, F). DNA ekstrahowano odpowiednio przy użyciu zestawu opartego na krzemionce nr 1 (nazwy wszystkich zestawów znajdują się w Tabeli materiałów), zestawu opartego na krzemionce nr 2 oraz zestawu opartego na kuleczkach magnetycznych. Reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu standardowego laboratoryjnego termocyklera do PCR. Krzywe wzorcowe przedstawiają zależność między ilością całkowitego DNA wyekstrahowanego z próbek gleby a ilością produktu PCR amplifikowanego za pomocą zestawu starterów/sond SsTQ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina dodatkowa 2. Porównanie granicy wykrywalności między przenośnym urządzeniem PCR a konwencjonalnym urządzeniem PCR stacjonarnym. Całkowite DNA wyizolowano z próbki gleby, stosując trzy różne metody ekstrakcji: (A, B) metodę Doyle'a, (C, D) zestaw oparty na krzemionce nr 2 oraz (E, F) zestaw oparty na kuleczkach magnetycznych. Wykresy po lewej stronie przedstawiają dane uzyskane przy użyciu przenośnego termocyklera z zestawem starterów/sond Sss, natomiast wykresy po prawej stronie reprezentują dane wygenerowane przy użyciu konwencjonalnego stacjonarnego termocyklera z zestawem starterów/sond SsTQ. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Dyskusja

Jak pokazano w tabeli 1, niedawny postęp technologiczny w molekularnej identyfikacji czynników chorobotwórczych zwiększył skuteczność, dokładność i szybkość diagnozy, co przyczyniło się do wykrywania zakażeń przedobjawowych27. Jeśli chodzi o diagnostykę na miejscu, często stosuje się metody LAMP i przepływu bocznego, ponieważ są one przenośne i zapewniają natychmiastowe wyniki przy niższych kosztach. Jednak w przypadku metod serologicznych wykrycie specyficzne dla danego gatunku może być trudne do osiągnięcia. Czasami powoduje to błędne wykrywanie drobnoustrojów niedocelowych, takich jak zwykli mieszkańcy gleby. Na przykład w przypadku patogenów ziemniaka może wystąpić reaktywność krzyżowa między testami serologicznymi Phytophthora spp. i Pythium spp.28, co wskazuje, że czasami występują trudności w wykrywaniu docelowych patogenów roślin.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy zoptymalizowany protokół wykrywania molekularnego patogenów ziemniaka przenoszonych przez glebę na miejscu przy użyciu przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym, porównując jego możliwości z konwencjonalnym laboratoryjnym systemem PCR w czasie rzeczywistym. Odkryliśmy, że metoda na miejscu specyficznie wykrywa patogeny ziemniaka w próbce gleby, chociaż czułość jest ~10 razy niższa niż w przypadku równoważnego testu laboratoryjnego. Warto również wziąć pod uwagę, że w tym przypadku zarówno w badaniu laboratoryjnym, jak i w terenie nie wykorzystano biologicznie istotnej wielkości próby. Duże rozmiary próbek są wymagane do stosowania w rutynowych badaniach przesiewowych gleb polowych, jak opisano wcześniej29,30, gdzie przetwarzane są próbki o wielkości od 250 g do 1 kg, chociaż metody te wymagają wykwalifikowanych operatorów i wyrafinowanego sprzętu do ekstrakcji DNA. Zazwyczaj ekstrakt DNA glebowy na dużą skalę pobiera się z pojedynczej zbiorczej próbki gleby reprezentatywnej dla wielu podpróbek o powierzchni od 1 do 4 hektarów 6,29,30. Jednak opracowany tutaj protokół jest szybki i łatwy w użyciu dla użytkowników bez wcześniejszego doświadczenia w diagnostyce molekularnej i może być stosowany poza laboratorium. Ponieważ metoda ta jest szybka i stosunkowo tania w porównaniu z ekstrakcją gleby na dużą skalę, może być stosowana do badań przesiewowych wielu próbek na małą skalę pobranych z podobnego obszaru pobierania próbek zbiorczych na dużą skalę. Mogłoby to przezwyciężyć niektóre braki wynikające z małej wielkości próbki i określić dodatkowe informacje na temat przestrzennego rozmieszczenia patogenu w terenie. Ponadto przenośność i szybkość metody oznaczają, że może ona być również wykorzystywana w działaniach demonstracyjnych dla hodowców w celach edukacyjnych i angażujących.

Inną kwestią jest to, że opublikowano już wiele testów PCR w czasie rzeczywistym dla szerokiego zakresu patogenów roślin5. System ten może wykorzystywać te istniejące testy bez konieczności projektowania nowych starterów LAMP, aby umożliwić je w testach terenowych. Częstą krytyką testów LAMP jest to, że mogą być trudne do zaprojektowania31. Przenośna reakcja PCR pozwala zatem na stosunkowo łatwe wdrożenie szerokiej gamy łatwo dostępnych testów na obecność patogenów do testów na miejscu.

Tradycyjne metody mogą być często kosztowne, pracochłonne, niedokładne i czasochłonne. Prostota opracowanej przez nas metody na miejscu pozwala hodowcom i pracownikom przemysłu na samodzielne wykrywanie patogenów i być może generowanie wyników znacznie szybciej niż wysyłanie ich do laboratorium diagnostycznego, które może znajdować się w pewnej odległości. Szybkość i czułość przenośnej metody PCR może pomóc hodowcom uniknąć potencjalnych wtórnych infekcji, które mogą jeszcze bardziej zwiększyć populację patogenów i niezamierzone rozprzestrzenianie się (za pośrednictwem sprzętu lub ludzi). Podsumowując, metoda on-site opracowana w niniejszym badaniu umożliwia dokładne i stosunkowo czułe wykrywanie ważnych patogenów przenoszonych przez glebę w terenie. Mamy nadzieję, że metoda opracowana na miejscu w tym badaniu przyczyni się do obecnego procesu diagnostycznego (ryc. 6), nie tylko dostarczając szybkich i dokładnych odpowiedzi na pytania epidemiologiczne dotyczące chorób roślin w terenie, ale także zapewniając lepsze zrozumienie biologii i epidemiologii patogenów roślin.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni dr Neilowi C. Gudmestadowi z Uniwersytetu Stanowego Północnej Dakoty za dostarczenie plazmidowego DNA S. subterranea, dr Hanu Pappu z Washington State University (WSU) za dostarczenie PMTV RNA, oraz dr Debrze Inglis z WSU za dostarczenie R. solani AG3. Specjalne podziękowania dla dr Jeremy'ego Jewella z WSU za komentarze do manuskryptu oraz WSU CAHNRS Communications za wideografię. Badania te były wspierane przez Northwest Potato Research Consortium oraz Departament Rolnictwa Stanu Waszyngton - Specialty Crop Block Grant Program (grant nr K1764). PPNS nr 0741, Zakład Patologii Roślin, Wyższa Szkoła Rolnicza, Nauki o Człowieku i Zasobach Naturalnych, Centrum Badań Rolniczych, projekt włazu nr WNP00833, Uniwersytet Stanowy Waszyngtonu, Pullman, Waszyngton, Stany Zjednoczone.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biała płytka do PCRBio-RadHSP9601
CFX ManagerBio-Rad1845000
SsoAdvanced Sondy uniwersalne Supermix Dotykowy aparat qPCR Bio-Rad1725280
CFX96Bio-Rad
Alkohol etylowy, czysty 200 proofDecon Laboratories04-355-222
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)OdczynnikiFisher BP118-500
Fenol, nasycony Fisher BioReagentsBP1750I-400
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Fisher BioReagentsBP152-5
q16 maszyna do PCR w czasie rzeczywistymgenesigMBS486001
Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)Invitrogen15525-017
2-propanol (izopropanol)JT Baker67-63-0
ChloroformJT Baker9180-03
Kwas solny, 36,5-38,0% (HCl)JT Baker9535-03
Alkohol izo-amylowyJT Baker9038-01
FastDNA Spin MP Biomedicals6560-200Zestaw do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki #1
Luna Uniwersalny jednoetapowy zestaw RT-qPCRNew England BiolabsE3005S
0,1 ml Niskoprofilowe indywidualne probówki do PCRPhenix ResearchMPC-100LP
Łatwy zestaw do ekstrakcji DNA/RNA PrimerdesigngenesigEASY-EK
genesig Probówki Easy 1,5 mlPrimerdesigngenesigEASY-1.5
Magnetyczny stojak na probówkiPrimerdesigngenesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy KitPrimerdesignPath-S.subterranea-EASY
Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB)Sigma-AldrichH6269-100G
Tłuczki do granulekThermo Fisher Scientific12-141-364
Chlorek sodu (NaCl)Thermo Fisher Scientific7647-14-5
Zestaw do miniprzygotowania DNA ZymoBIOMICSD4300Zestaw do ekstrakcji DNA na bazie krzemionki #2
1855195

Bibliografia

  1. Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
  2. Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
  3. Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
  4. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
  5. Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
  6. Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
  7. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
  8. Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
  9. Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
  10. Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241(2008).
  11. Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
  12. Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
  13. Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
  14. Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
  15. Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
  16. Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
  17. Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337(2016).
  18. Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
  19. Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
  20. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349(1991).
  21. Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
  22. van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
  23. Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
  24. Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
  25. Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
  26. Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
  27. Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
  28. Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
  29. Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
  30. Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
  31. Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
  32. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
  33. Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
  34. Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja za pomoc kulek magnetycznychpatogeny glebowewykrywanie chor b ro lintest z u yciem sond fluorogennychprotok ekstrakcji DNAdiagnostyka w terenieSpongospora subterraneaPCR laboratoryjnylaptop do analizy danych
Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.