Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans to użyteczny organizm do testowania chemicznego wpływu na fizjologię. Badania przesiewowe małych cząsteczek całego organizmu oferują znaczące korzyści w identyfikacji biologicznie aktywnych struktur chemicznych, które mogą modyfikować złożone fenotypy, takie jak długość życia. Opisany tutaj jest prosty protokół produkcji setek 96-dołkowych płytek hodowlanych z dość stałą liczbą C. elegans w każdym dołku. Następnie określiliśmy, w jaki sposób wykorzystać te kultury do przesiewania tysięcy substancji chemicznych pod kątem wpływu na długość życia nicieni C. elegans. Protokół ten wykorzystuje wrażliwe na temperaturę sterylne szczepy, warunki na płytkach agarowych i prostą obsługę zwierząt, aby ułatwić szybką i wysokowydajną produkcję zsynchronizowanych kultur zwierząt do badań przesiewowych.

Wprowadzenie

Tutaj opisany jest protokół, który został opracowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków chemicznych pod kątem wpływu na długość życia Caenorhabditis elegans. Sam protokół można łatwo dostosować do innych fenotypowych badań przesiewowych, w tym badań wykorzystujących szczepy reporterowe C. elegans. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do zidentyfikowania nowego biologicznie aktywnego związku, NP1 (nitrofenylopiperazyna 1), który znacznie wydłuża życie C. elegans poprzez mechanizm ograniczeń dietetycznych. NP1 i charakterystyka jego wpływu na długość życia, w tym opis szlaków genetycznych w grze, zostały wcześniej opisane w innym miejscu¹. Sprawozdanie to zawiera również opis wyników wdrożenia ekranu na dużą skalę. W tym miejscu opiszemy znacznie bardziej szczegółowo metodologię i konfigurację samego ekranu, który jest skalowalny zarówno dla małych, jak i dużych aplikacji.

Celem, który doprowadził do stworzenia opisanego tutaj protokołu, było opracowanie platformy hodowli C. elegans, która pozwoliła na szybkie badanie dużych bibliotek chemicznych pod kątem nowych biologicznie aktywnych związków. Chociaż badania chemiczne zostały przeprowadzone przed opracowaniem tego protokołu, były to głównie podejścia na małą skalę i/lub podejścia typu kandydującego^2,3. Rzeczywiście, większość badań przesiewowych przeprowadzonych w laboratorium na dziesiątkach związków wykorzystywała testy odporności na stres, przy czym trafienia były badane pod kątem efektów długowieczności⁴. Badanie to miało na celu bezpośrednie badanie przesiewowe pod kątem wpływu na długość życia. Co ciekawe, w literaturze naukowej w czasie wykonywania badań chemicznych na dużą skalę z użyciem C. elegans, było niewiele opisów. Rzeczywiście, w porównaniu z innymi typami ekranów^5,6,7, badania chemiczne na dużą skalę z użyciem C. elegans wydawały się być niedostatecznie wykorzystywane.

Były dwa opisy dużych badań chemicznych u C. elegans, które zostały wykorzystane jako podstawa do opracowania tego podejścia. Pierwszym z nich było eleganckie badanie z laboratorium Petera Roya, w którym wykorzystano chemiczne badania przesiewowe do identyfikacji związków, które mogą zaburzać rozwój zwierząt. Następnie w badaniu przeprowadzono badanie przesiewowe mutagenezy do przodu, aby zidentyfikować cele genetyczne tych substancji chemicznych⁸. W protokole opisanym w tym badaniu wykorzystano pasztety z 24 dołkami, co było po prostu niewykonalne ze względu na specyficzne potrzeby tego badania (ograniczone ilości substancji chemicznych w bibliotece i ograniczona dostępna przestrzeń w inkubatorze). Drugim badaniem było innowacyjne i ambitne badanie przesiewowe małych cząsteczek Michaela Petraschecka pod kątem wydłużania żywotności chemikaliów^9,10. W badaniu tym wykorzystano płytki 384-dołkowe i kultury płynne. Inną główną cechą tego badania było zastosowanie FUDR (5-fluorodeoksyurydyny) do chemicznego hamowania produkcji potomstwa. Po dokładnym rozważeniu protokołu opisanego w tym badaniu, uniknięto zarówno sterylizacji chemicznej, jak i płynnych kultur C. elegans.

Chociaż FUDR jest powszechnie stosowany w eksperymentach z długością życia C. elegans, pojawiły się obawy, że FUDR może powodować nieprzewidziane interakcje z lekami, lub że sam FUDR może mieć pewien wpływ na długość życia. Ostatnio ta ostatnia obawa została potwierdzona, przynajmniej w niektórych stężeniach, a w szczególności w temperaturze 25 °C¹¹. Aby obejść problem zanieczyszczenia potomstwa, użyto szczepu C. elegans TJ1060, który zawiera dwie niezależne mutacje wrażliwe na temperaturę (spe-9(hc88)I; rrf-3(b26)II), które znoszą produkcję plemników i wykazano, że są przydatne w masowych kulturach populacji synchronicznych¹². Szczep ten był całkowicie sterylny w temperaturze 25 °C, ale daje potomstwo, gdy jest hodowany w temperaturze 15-20 °C. W badaniu wykorzystano konwencjonalne warunki hodowli, w których robaki pełzają po powierzchni agaru, ponieważ wyniki uzyskane z płynnymi kulturami nie zawsze są odtwarzalne na konwencjonalnych płytkach agarowych. Chociaż zjawisko to nie jest w pełni zrozumiałe, wykazano, że robaki hodowane w płynie reagują na DR (ograniczenie dietetyczne) w inny sposób niż robaki hodowane na standardowych pożywkach^13,14. W związku z tym prawdopodobne jest, że płynne media mogą maskować niektóre mimetyki DR, które w przeciwnym razie zostałyby zidentyfikowane z ekranem.

Po ustaleniu warunków hodowli agaru, rozważono różne opcje oceny wydajności studzienek w tym teście. Chociaż dostępne były różne zautomatyzowane lub oparte na obrazowaniu testy, wymagały one nabycia i wdrożenia urządzeń wymagających technicznie, z których większość była zbyt droga. Rozważając te opcje, konieczne było odniesienie się do poprzednich typów ekranów o żywotności. Ostatecznie w badaniu wykorzystano metodę punktacji zaadaptowaną z badania przesiewowego całego genomu RNAi Siu Sylvia Lee Lab dla fenotypów długości życia¹⁵. W szczególności wszystkie tabliczki dotyczące żywotności zostały ustawione w ten sam sposób, ale monitorowano tylko kontrole ujemne. Po potwierdzeniu, że płytki kontroli ujemnej mają prawie całkowitą śmiertelność, płytki testowe zostały ocenione ręcznie. W tym badaniu przesiewowym na dużą skalę wyniki dodatnie zostały potwierdzone przez ponowne testowanie świeżo przygotowanymi substancjami chemicznymi, przy użyciu trzykrotnych powtórzeń pierwotnych wyników dodatnich.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Rosół LB
   1. Używaj wstępnie zmieszanych granulek (patrz tabela materiałów) i postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu przygotowania.
2. Pożywka wzrostowa nicieni (NGM) Agar
   1. Wymieszać 23 g agaru, 3 g NaCl, 2,5 g peptonu baktonowego i wodę dejonizowaną do 0,972 l. Autoklaw i ostudzić do temperatury 60 °C, następnie dodać 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (KPO₄) (pH 6,0), 1 ml 1 M siarczanu magnezu (_MgSO4), 1 ml 1 M chlorku wapnia (CaCl₂), i 1 ml cholesterolu 5 mg/ml (w etanolu).
3. Roztwór podchlorynu
   1. Zmieszać 5 ml 5 M KOH, 4 ml roztworu podchlorynu sodu (6%) i dejonizowany H₂O do całkowitej objętości 50 ml.
4. S podstawowy
   1. Wymieszać 5 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 6 g KH₂PO₄ i wodę dejonizowaną do 1 l, a następnie autoklaw.

2. Przygotowanie skoncentrowanej E. coli (OP50)

UWAGA: Ten krok koncentruje 1 l nasyconego roztworu E. coli w 25 ml buforu bazowego S.

1. Zaszczepić 5 ml autoklawizowanego bulionu LB (krok 1.1) pojedynczą kolonią E. coli (szczep OP50) i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min). Użyć 0,1 ml tego roztworu do zaszczepienia 1 litra LB w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera. Inkubować kolby o pojemności 1 l przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min).
2. Odwirować 1 l kultur przez noc w butelkach wirówkowych o pojemności 500 ml przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C, aby osadzać bakterie i dekantować pozostałe pożywki. Zawiesić osad w 25 ml S Basal (krok 1.4). Przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie płytek hodowlanych NGM

1. W przypadku płytek do hodowli masowej używanych do produkcji dużej liczby robaków, należy dozować 30 ml stopionego (60 °C) agaru NGM (krok 1.2) w komorze z przepływem laminarnym na 10-centymetrowe płytki hodowlane z automatycznym aparatem dozującym płyn lub pipetą serologiczną. Pozostawić do wyschnięcia na noc.
2. Odpipetować 2 ml stężonego OP50 na każdą płytkę o średnicy 10 cm, rozprowadzić tak, aby całkowicie pokryć powierzchnię agaru poprzez przechylanie i obracanie płytki, a następnie pozostawić płytki do wyschnięcia. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
3. W przypadku wysokoprzepustowych płytek hodowlanych używanych do badań przesiewowych należy użyć automatycznego 8-kanałowego dozownika do dozowania 0,15 ml stopionego agaru NGM do każdej studzienki 96-dołkowej płytki w komorze z przepływem laminarnym. Zachowaj ostrożność, aby upewnić się, że studnie są pozbawione pęcherzyków, ponieważ umożliwią one zakopanie robaków, które zagrożą testowi w tej studni. Pozostawić do wyschnięcia na noc. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

4. Przygotowanie sterylnych kultur masowych C. elegans wrażliwych na temperaturę (ts)

1. Aby rozpocząć hodowle, używając "wykałaczki do robaków" (szklanej pipety z dołączonym drutem platynowym lub wyprodukowanej szpikulca) pod mikroskopem preparacyjnym, przenieś 20 jaj (szczep TJ1060: spe-9(hc88)I; rrf-3(b26)II) na płytkę (płytki) do hodowli masowej przygotowane w kroku 3.1. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 20 °C przez 6 dni (pozwala na wzrost więcej niż jednego pokolenia, ponieważ celem jest zebranie potomstwa z 20 przeniesionych jaj).
2. Wizualnie potwierdź obecność ciężarnych dorosłych osobników (jaj obecnych w macicy) za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zebrać ciężarne dorosłe osobniki, dozując 2-3 ml S baseal na płytkę za pomocą szklanej pipety. Ręcznie zamieszaj płyn wokół płytki, a następnie zbierz płyn do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.
3. Odwirować probówkę (1 000 x g przez 1,5 minuty w temperaturze 20 °C) w celu osadzenia robaków, a następnie odessać supernatant. Dodać 10 ml roztworu podchlorynu (krok 1.3) do osadu robaka i szybko potrząsać probówką ręcznie w kierunku od góry do dołu przez 5 sekund. Inkubować przez 5 minut, wstrząsając co 2,5 minuty.
4. Ponownie odwiruj rurkę (1000 x g przez 1,5 minuty); osad powinien być żółtawo-brązowy. Odessać supernatant. Dodaj 10 ml roztworu podchlorynu do granulki jaja i energicznie potrząśnij probówką. Inkubować 1-3 minuty, od czasu do czasu potrząsając i monitorując pojawienie się za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Potwierdź wzrokowo, że pozostały tylko jaja i przejdź do następnego kroku.
5. Odwirować probówkę (1 000 x g przez 1,5 minuty) i odessać supernatant. Granulka powinna być biała bez brązowego zabarwienia.
   UWAGA: Po usunięciu roztworu podchlorynu bardzo ważne jest użycie sterylnych technik i, ponieważ zanieczyszczenie (w szczególności bakteryjne i grzybicze) może zrujnować eksperyment, marnując cenny czas i odczynniki. W badaniu wykorzystano komorę z filtrowanym przepływem laminarnym i przenoszono ciecze wyłącznie za pomocą sterylnych pipet i końcówek.
6. Otwórz probówki w sterylnym miejscu. Przemyć osad 3 razy roztworem S basetal, odkręcając w dół (1 000 x g przez 1,5 min) i za każdym razem odsysając supernatant. Ponownie zawiesić osad jajeczny w 2-3 ml S basetal. Jaja te można teraz wykorzystać do nocnego wylęgu w buforze w celu zebrania larwy L1 (krok 5).

5. Wylęganie jaj C. elegans w buforze w celu uzyskania synchronicznych kultur (przygotowanie larwy L1 C. elegans )

1. Zdekantować granulki jaj i przelać je na sterylną szklaną szalkę Petriego z pokrywą. Opłucz pozostałe jaja z probówki do naczynia za pomocą pipety serologicznej z 2-3 ml S basetal. Dodaj 5 ml S basal, aby złagodzić stłoczenie, ponieważ może to zachęcić do wylęgu, podobnie jak lekkie potrząsanie (20 obr./min z wytrząsarką orbitalną tancerki brzucha). Inkubować przez noc w temperaturze 20 °C, aby jaja miały czas na wyklucie się (16-24 godziny). Wszystkie pisklęta zatrzymują się w 1.^{stadium larwalnym} (L1) z powodu braku pokarmu.
   UWAGA: Anegdotyczne dowody wskazują, że świeże preparaty L1 (16-36 godzin po zebraniu jaj) generują najbardziej synchroniczne populacje dorosłych robaków.
2. Zebrać L1 w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej. Odwirować L1 w wirówce (1,000 x g przez 1,5 minuty), odessać supernatant i powtarzać, aż wszystkie L1 zostaną zebrane z płytek wylęgowych, pozostawiając 10 ml S baseal do następnego kroku.
3. Z probówki zawierającej L1s wypiąć mikropipetą 0,01 ml (natychmiast po wymieszaniu) i dozować na płytkę NGM bez nasion (bez E. coli). Policz liczbę L1 na tabliczce. Powtórzyć czynność 10 razy i uzyskać średnią dla liczby L1 w każdej podwielokrotności. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewaj się od 1 do 3 L1 na μl (zaczynając od 1 płytki do masowej hodowli zawierającej 20 jaj).
4. Oznaczyć pipetą serologiczną objętość S baseal zawierającego L1s. Następnie dokonaj ekstrapolacji z ustaloną średnią liczbą robaków na 0,01 ml, uzyskaną w poprzednim kroku, aby oszacować całkowitą liczbę L1. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewaj się od 10 000 do 30 000 L1 (na płytkę do hodowli masowej zawierającą 20 jaj).
5. Aby użyć tej kultury w teście 96-dołkowym, należy rozcieńczyć zawiesinę L1 do 1 L1 na μl w sterylnej okrągłej butelce z pożywką, a następnie przejść do kroku 7. Jeśli ta kultura ma być użyta do wygenerowania dodatkowych masowych kultur C. elegans, przejdź do kroku 6.

6. Przygotowanie kultur synchronicznych na dużą skalę

UWAGA: Rozwiązania L1 mogą być używane do szybkiego zwiększania populacji robaków.

1. Aby wygenerować dużą liczbę robaków za pomocą roztworu L1, należy dozować do 5 000 L1 na każdą z żądanych liczb płytek do hodowli masowej. Zebrać ciężarne dorosłe osobniki 2,5 dnia później (20 °C) zgodnie z opisem w krokach 4.1-2 i przejść do kroku 4.3 w celu zebrania jaj.
2. Jak anegdotycznie zaobserwowano, powtarzające się zbieranie podchlorynu może stresować ujarzmioną populację, podzielij populacje poprzez zbieranie jaj do rozmnażania przed poddaniem pozostałej populacji działaniu podchlorynu, tak aby wiele pokoleń populacji nie było wielokrotnie poddawanych działaniu roztworu podchlorynu.

7. Konfiguracja 96-dołkowych płytek testowych

1. Pozwól, aby płytki testowe (przygotowane w kroku 3.3) osiągnęły temperaturę pokojową. Następnie w komorze z przepływem laminarnym dodaj 5 μl stężonego OP50 (przygotowanego w kroku 2.2) do każdej studzienki. Tak jak poprzednio, użyj automatycznego 8-kanałowego dozownika.
2. Dodać 10 μl zawiesiny L1 do każdej studzienki za pomocą automatycznego 8-kanałowego dozownika. Daje to średnio 10 robaków na studzienkę, ponieważ są one obecne w zawiesinie w ilości 1 L1 na μl. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie L1 z gnojowicy, dozuj L1 z okrągłej butelki z podłożem, aktywnie mieszając się z umiarkowanie wolno obracającym się mieszadłem.
3. Przykryć płytkę pokrywką, pudełka z partiami płytek i inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 dni.

8. Leczenie 1 dnia dorosłego C. elegans za pomocą chemikaliów

1. Wyjmij płytki z biblioteki chemicznej z zamrażarki i pozwól płytkom osiągnąć temperaturę pokojową przed kontynuowaniem.
   UWAGA: Tabliczki biblioteki chemicznej, jak opisano tutaj, to 96-dołkowe płytki zawierające dyskretne związki w każdym dołku, z których wszystkie są w tym samym stężeniu i rozpuszczone w DMSO. Biblioteki te nie wykorzystują zewnętrznych kolumn, więc każda płyta zawiera maksymalnie 80 różnych substancji chemicznych. W opisanym tutaj protokole stężenie biblioteki wynosi 10 mM. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę wpływ rozpuszczalnika na fenotypy. Chociaż w tym badaniu przeprowadza się badanie przesiewowe przy stężeniu DMSO wynoszącym 0,5%, poziom ten nigdy nie został przekroczony w tych testach żywotności oraz w testach o niskiej przepustowości, w których bardziej prawdopodobne jest wybranie stężenia roztworu podstawowego związku. Protokół ten nie przekracza 0,25%, co jest poziomem, przy którym modyfikacje żywotności nie występują¹⁶, przynajmniej w odmianie N2.
2. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie wstrząsnąć płytką z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek przez 1 minutę.
3. Za pomocą zautomatyzowanego 96-dołkowego urządzenia do obsługi cieczy przenieś 0,75 μl związku (lub DMSO) z płytki bibliotecznej na płytkę testową. Głębokość pipety podczas dostarczania cieczy na płytkę testową jest dokładnie kontrolowana, tak aby końcówki pipet osoby zajmującej się cieczą dostarczały objętość 0,75 μl do ~15 μl cieczy na powierzchni agaru (z robakami i skoncentrowanym OP50 z kroków 7.1-2) i nie przebijały powierzchni agaru w studzience. Nie należy używać ręcznych 8 lub 12 pipet wielokanałowych, z wyjątkiem bardzo małych sit (<10 płytek), ponieważ mogą one zwiększyć błąd i często powodować przebicie powierzchni agaru, co pogarsza jakość testu.
4. Przygotować płytki kontroli ujemnej biblioteki chemicznej z DMSO (dimetylosulfotlenkiem), zakładając, że testowana biblioteka wykorzystuje DMSO jako rozpuszczalnik. Wykonać 1 płytkę kontroli ujemnej na każde 5 płytek testowych, do 10 płytek kontroli ujemnej. Jeśli to możliwe, należy również wykonać płytkę kontroli dodatniej (NP1¹ przy 20 mM, dla końcowego stężenia testowego 0,1 mM, jest skuteczna w tym celu; patrz sekcja Reprezentatywne wyniki). Nie dodawaj chemikaliów (testowych lub kontrolnych) do 2 zewnętrznych kolumn płyt, ponieważ są one szczególnie podatne na wysuszenie.

9. Suszenie kultur

1. Aby usunąć płyn z powierzchni agaru, susz płytki w komorze laminarnej przez 4-8 godzin. Bardzo ważne jest, aby płytki te zostały całkowicie wysuszone, ale nie uległy wysuszeniu. Ponieważ niektóre płytki schną dłużej niż inne, uważnie monitoruj wszystkie płytki i wyjmij, gdy tylko wyschną. Potwierdzić suszenie poprzez dokładne oględziny poszczególnych dołków płyty.
   UWAGA: W zależności od czynników, które obejmują natężenie wywiewu szafy, czas ten musi być określony empirycznie. Ten etap suszenia może zająć około 4-8 godzin dla pełnej szafki.
2. Uszczelnij płytki przezroczystą folią, a następnie załóż pokrywki talerzy.
3. Obracaj 96-dołkowe płytki testowe przez 45 s przy 1,000 x g.
4. Przechowywać płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 25 °C.

10. Punktacja kultur C. Elegans dla długowieczności

1. Monitoruj płytki kontroli ujemnej do momentu zaobserwowania śmiertelności >95%. Sprawdzaj tabliczki co tydzień przez pierwsze dwa tygodnie, a następnie codziennie. Kohorty Caenorhabditis tego samego szczepu i gatunku mogą wykazywać znacznie różną długość życia w zależności od próby¹⁷.
   UWAGA: W opisanym tutaj teście długości życia, ze zwierzętami TJ1060 hodowanymi w temperaturze 25 °C, 95% śmiertelność w tych populacjach wystąpiła od 16 do 20 dnia dorosłości.
2. Jeżeli uznaje się, że studzienki kontroli ujemnej osiągnęły poziom >95 %, należy odwirowywać wszystkie 96-dołkowe płytki testowe przez 45 s na wirówce stołowej z wirnikiem przystosowanym do mikropłytek (250 x g przez 45 s w temperaturze 20 °C).
3. Punktow wszystkie dołki na płytkach kontrolnych. Odbywa się to poprzez liczenie i rejestrowanie liczby żywych i martwych zwierząt w każdej studzience. Martwe robaki można odróżnić od żywych robaków po ich całkowitym braku ruchu. Sprowokuj ruch u żywych robaków, upuszczając 96-dołkową płytkę z około 7 cm na powierzchnię mikroskopu preparacyjnego, patrząc przez okular w poszukiwaniu wywołanej reakcji. Martwe robaki nie będą reagować, a pobliscy koledzy z laboratorium mogą nie doceniać powtarzającego się hałasu.
4. W przypadku płytek testowych należy liczyć i zapisywać tylko studzienki zawierające żywe robaki. Kiedy zaobserwuje się żywego robaka, policz wszystkie żywe i martwe zwierzęta w tej studni, wraz z pozycją studni i płytą.
   UWAGA: Często przydatne jest ponowne nacięcie płytek po tym, jak >99% robaków kontroli ujemnej jest martwych. W przypadku ekranów o dużej skali może to być najlepszy punkt do wykonania wstępnej oceny. W obu przypadkach oceń/ponownie oceń zgodnie z powyższym opisem

11. Ponowne testowanie związków

1. W przypadku testowania tylko niewielkiej liczby związków kandydujących (<320 związków), jak w przypadku ponownego testu lub badania przesiewowego (patrz Reprezentatywne wyniki), należy ograniczyć test do 32 studzienek centralnych, aby zminimalizować możliwe efekty płytki. To pozostawia 2 studzienki najbliżej krawędzi płytki niepoddane obróbce, ale nadal zawierające agar, pokarm i robaki.

Wyniki

Zaczynamy od omówienia reprezentatywnych wyników uzyskanych przy zastosowaniu tego protokołu w testach długości życia przeprowadzanych na płytkach 96-dołkowych. W pierwszym przykładzie metodę tę wykorzystano do przesiewania 30 000 substancji chemicznych, co pozwoliło na pomyślną identyfikację związków przedłużających życie C. elegans; przedstawiono również wyniki ponownego przesiewu weryfikacyjnego najlepiej działających substancji z użyciem tego samego protokołu. Wyniki te zostały opisane wcześniej¹. Drugi przykład przedstawia zastosowanie tego samego protokołu w mniejszym przesiewie związków kandydujących.

Przesiewanie na dużą skalę i ponowne testowanie: Przesiewanie na dużą skalę z udziałem 30 000 związków przeprowadzono w pojedynczej dawce, w dubletach. Każdy związek chemiczny testowano zatem w dwóch dołkach, przy oczekiwanej całkowitej populacji zwierząt wynoszącej 20. Aby to osiągnąć, w ciągu ok. 3 miesięcy przesiewano trzy oddzielne zestawy po 10 000 związków (w dubletach), aby objąć wszystkie 30 000 związków. Zrobiono to częściowo w celu zapewnienia możliwej do opanowania ilości ręcznego punktowania na koniec testu, co wymagało łącznie 260 płytek testowych z 96 dołkami w każdym z zestawów. Na płytkach z zapasami biblioteki tylko 80 dołków zawierało związek; jedna replikacja 10 000 związków daje 125 płytek testowych. W badaniu tym zastosowano 2 replikacje z 10 płytkami kontroli negatywnej w każdym zestawie. Aby zwiększyć przepustowość, płytki punktowano, gdy oceniono, że w populacjach kontroli negatywnej śmiertelność wyniosła ok. 99%. Następnie wszystkie dołki testowe sprawdzono pod kątem obecności żywych nicieni.

Substancje chemiczne w studzienkach, w których przeżył jeden nicień, określono mianem hitów. Za hity uznano również substancje w studzienkach zawierających więcej niż 1 żywy organizm, a dodatkowo zliczono wszystkie nicienie w tych studzienkach (żywe i martwe), aby wygenerować prosty wynik (wskaźnik procentowy przeżywalności; liczba żywych nicieni podzielona przez liczbę martwych nicieni). W związku z tym każda substancja chemiczna w bibliotece mogła zostać dwukrotnie uznana za hit, a hitom tym mogły, lecz nie musiały, być przypisane wyniki. Z przesiewu 30 000 związków za hity (co najmniej raz) uznano 512 różnych substancji chemicznych. Przesiew został przeprowadzony z zamiarem zidentyfikowania silnych i/lub stabilnych (powtarzalnych) efektów pro-longevity. Te dwie różne właściwości mogą wywierać odmienne skutki. Silne substancje chemiczne mogłyby drastycznie wydłużyć czas życia, w takim przypadku oczekiwalibyśmy wysokiego procentu żywych nicieni w studzience danej substancji. W przypadku substancji stabilnych oczekiwałoby się obecności żywych nicieni w obu powtórzeniach. Lista hitów została uszeregowana na podstawie tych kryteriów. 179 substancji chemicznych wykazało wysokie wskaźniki procentowe przeżywalności lub zostało uznanych za hity w obu powtórzeniach, w związku z czym wybrano je do ponownego testowania. Większość pozostałych substancji chemicznych uznanych za hity, ale niewybranych do ponownego testowania, zawierała tylko jednego żywego nicienia w jednej ze studzienek powtórzeniowych.

Przeprowadzono ponowne testowanie hitów w sposób podobny do przesiewania pierwotnego, z wyjątkiem zastosowania 3 powtórzeń (oczekiwana całkowita populacja zwierząt wyniosła 30) oraz dokładnej kwantyfikacji długości życia zwierząt na płytkach kontrolnych nieleczonych. Zmiany te wprowadzono, aby ułatwić porównanie studzienek testowych i kontrolnych. 179 hitów chemicznych zamówiono ponownie, rozcieńczono do stężenia 10 mM i przeniesiono do płytek 96-dołkowych. Do testu powtórnego wykorzystano jedynie 24 wewnętrzne studzienki (obecne wersje tego protokołu wykorzystywałyby 32 wewnętrzne studzienki, zgodnie z opisem w sekcji protokołu dotyczącej przesiewania powtórnego), a związki przetestowano w trzech powtórzeniach, stosując sześć płytek kontrolnych negatywnych traktowanych rozpuszczalnikiem DMSO. Jedną płytkę kontrolną negatywną oceniano okresowo pod kątem całkowitej przeżywalności (Rycina 1A). Gdy padło około 95% zwierząt kontrolnych, dokonano pełnej oceny wszystkich płytek (policzono wszystkie żywe i martwe nicienie traktowane).

Aby wyłonić trafienia (hits) z wyników ponownych testów, przyjęto wartość odcięcia równą średniemu procentowi przeżywalności dla kontroli negatywnej +2 odchylenia standardowe (SD). Dla dołków testowych obliczono średnie wartości procentu przeżywalności (w momencie oceny), wyciągając średnią z trzech powtórzeń dla każdego dołka. W przypadku tego konkretnego testu średnie wartości procentu przeżywalności dla dołków kontroli negatywnej obliczono jako średnią z trzech powtórzeń dla 48 dołków (2 zestawy płytek z kontrolą negatywną w trzech powtórzeniach). SD wykorzystane do wyłonienia trafień z zestawu chemicznego poddanego ponownym testom było odchyleniem standardowym dla 48 średnich wyników procentu przeżywalności kontroli negatywnej. Stosując tę strategię, w badaniu zidentyfikowano 57 trafień z biblioteki 179 związków poddanych ponownym testom, co pokazuje, że łącznie 32% przetestowanych substancji chemicznych dało wynik dodatni (Rysunek 1B). Grupowanie (binning) średnich wyników procentu przeżywalności dla dołków kontrolnych i testowych wykazało, że dołki testowe osiągały lepsze wyniki niż dołki kontrolne (Rysunek 1C).

Przesiewanie kandydatów: Przesiewania w małej skali można przeprowadzić w sposób podobny do opisanego powyżej powtórzenia testu. W niniejszym rozdziale opisujemy wyniki przesiewania kandydatów z udziałem 139 związków. Kandydaci ci zostali dobrani na podstawie struktur prawdopodobnie promujących długowieczność. W tym przesiewaniu wykonaliśmy 5 powtórzeń płytek testowych w dwóch różnych dawkach (50 µM i 100 µM). Dodatkowo zastosowano 8 płytek kontroli negatywnej oraz jedną płytkę kontroli pozytywnej (NP1) zawierającą dwie różne dawki: 50 µM i 100 µM.

Płytki z kontrolą negatywną monitorowano do momentu, aż ok. 90% zwierząt padło. W tym czasie dokonano oceny dołków poprzez policzenie żywych i martwych nicieni we wszystkich dołkach kontrolnych oraz w dołkach testowych, w których znajdowały się żywe nicienie. Procent żywych osobników w momencie oceny wykorzystano do obliczenia średniego procentu przeżywalności dla każdego dołka. W przypadku kontroli negatywnych 32 dołki posiadały wyniki procentu przeżywalności z 8 powtórzeń. W przypadku kontroli pozytywnych uzyskano 4 wyniki dla dołków, uśrednione z 4 powtórzeń dla każdej dawki. Jako trafienia (hits) uznano dołki, w których średni procent przeżywalności był wyższy niż średni procent przeżywalności kontroli negatywnej + 2 SD. Taka wartość odcięcia pozwoliła wyłonić 14 trafień z przesiewu kandydatów i wykluczyła wszystkie dołki kontroli negatywnej. Wartość odcięcia ta objęła również wszystkie dołki kontroli pozytywnej traktowane stężeniem 100 µM oraz 50% kontroli pozytywnych traktowanych stężeniem 50 µM. Wyniki te przedstawiono tutaj jako pogrupowane średnie wartości procentu przeżywalności dla przesiewów testowych przy stężeniu 50 µM (Figure 2A) oraz 100 µM (Figure 2B).

Na koniec wszystkie płytki ponownie oceniono w późniejszym punkcie czasowym, który odpowiadał momentowi, w którym ponad 99% zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej padło. Wyniki te wykazały, że studzienki kontroli dodatniej wypadły znacznie lepiej niż studzienki kontroli ujemnej oraz studzienki testowe (Rysunek 2C). Studzienki testowe były nieco lepsze od kontroli ujemnych. Ten ostatni wynik jest obciążony faktem, że wiele studzienek testowych wykazywało toksyczność w stosunku do traktowania kontrolnego (Tabela 1), co komplikuje tę prostą interpretację. Było to do przewidzenia, ponieważ biblioteka kandydacka była rzeczywistym przesiewem substancji chemicznych o nieznanej aktywności biologicznej u C. elegans, podczas gdy przesiew powtórny był w istocie wstępnie przefiltrowany pod kątem związków nietoksycznych. Ponieważ ten pierwotny przesiew służył do wyszukiwania związków wydłużających długość życia, silnie toksyczne substancje chemiczne nie powinny znaleźć się w zestawie do powtórnych testów.

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki wysokoprzepustowego przesiewu i ponownego badania
(A) Krzywa przeżywalności z reprezentatywnej płytki kontroli negatywnej użytej w teście ponownym. Krzywa ta została opracowana na podstawie oceny wszystkich żywych i martwych nicieni w 24 studzienkach użytych w tym badaniu, przeprowadzanej 4 razy w ciągu 18 dni trwania testu. W 18. dniu dorosłości oceniono, że przeżywalność kontroli wynosi ~5%, po czym oceniono wszystkie płytki kontrolne i testowe. (B) Tabela podsumowująca wyniki przesiewu i ponownego badania. (C) Grupowanie studzienek ze średnimi wynikami procentu przeżywalności dla warunków kontrolnych i testowych z ponownego przesiewu. Dla kontroli wyniki pochodzą z 48 studzienek, z których każda stanowi średnią z 3 powtórzeń. Wyniki testowe pochodzą ze 179 studzienek, z których każda stanowi średnią z trzech powtórzeń. Rysunek 1 został powielony z wcześniejszej publikacji¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne wyniki przesiewania kandydatów
(A) Pogrupowanie wyników z przesiewania kandydatów przy stężeniu 50 µM. Wyniki dla 139 studzienek testowych stanowią uśredniony wskaźnik procentu przeżywalności z 5 powtórzeń. Wyniki dla 32 kontroli negatywnych obejmują uśrednione wskaźniki procentu przeżywalności z 8 powtórzeń. Wyniki dla 4 kontroli pozytywnych obejmują uśrednione wskaźniki procentu przeżywalności z 4 powtórzeń (łącznie 16 studzienek zawierających NP1 w stężeniu 50 µM). (B) Pogrupowanie wyników z przesiewania kandydatów przy stężeniu 100 µM. Wszystko jest analogiczne jak w (A), z wyjątkiem tego, że studzienki testowe i kontrole pozytywne były poddawane działaniu stężeń 100 µM. Te same płytki kontroli negatywnej są pokazane zarówno w (A, jak i B). (C) Reprezentatywne wyniki ponownej oceny płytek w stosunkowo późnym punkcie czasowym. Kontrole pozytywne znacząco przewyższyły wszystkie pozostałe, biorąc pod uwagę jedynie procent studzienek z żywymi nicieniami w tym punkcie czasowym, co jest obciążone na niekorzyść studzienek testowych, jak opisano w tekście głównym i w Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

	Grupowanie uśrednionych wyników procentowej przeżywalności
Wyniki zgrupowane	Wszystkie martwe (0)	1-10	11-20	21-30	31-40	>41
Ponowne badanie
liczba kontroli ujemnych (-)	16	31	1	0	0	0
Liczba dołków testowych (50µM)	46	69	50	8	3	3
Przesiew kandydatów
Liczba kontroli ujemnych (-)	0	11	21	0	0	0
Liczba kontroli (+) (50µM)	0	0	2	2	0	0
Liczba kontroli dodatnich (+) (100µM)	0	0	0	0	2	2
Liczba studzienek testowych (50µM)	94	22	21	2	0	0
Liczba studzienek testowych (100µM)	86	25	21	6	1	0

Tabela 1: Reprezentatywne wyniki grupowania różnych przesiewów
Przedstawiono tutaj grupowanie uśrednionych wyników procentowej przeżywalności z dwóch przesiewów (ponownego testowania oraz kandydackiego). W przesiewie ponownego testowania szczyt jest podobny do kontroli negatywnej, przy czym wyniki ponownych testów znacznie przewyższają kontrolę negatywną po prawej stronie (długowiecznej) tabeli. Wskazuje to na obecność wielu związków pro-longewitywnych w zestawie do ponownego testowania. W przesiewie kandydackim widać, że szczyt znajduje się w kategorii całkowitego obumarcia, podczas gdy po prawej stronie tabeli widoczny jest również wyraźny sygnał. Wskazuje to na obecność związków pro-longewitywnych w zestawie kandydackim, ale sugeruje również występowanie znacznej toksyczności wśród kandydackiego zestawu związków.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy prostą metodę hodowli C. elegans na 96-dołkowych płytkach. Opisujemy te kultury do stosowania w chemicznych badaniach przesiewowych i testach długości życia, ale mogą być one używane do wielu rodzajów testów. Chociaż warunki hodowli wielostudziennej do badań przesiewowych substancji chemicznych były już wcześniej opisywane⁸, w tym w przypadku analizy długości życia¹⁰, opisany tutaj test różni się pod kilkoma względami. Opisany tutaj test żywotności wykorzystuje 96-dołkowe płytki, opiera się na sterylnych mutantach (zamiast sterylizacji chemicznej), wykorzystuje warunki hodowli agaru, wykorzystuje prostą obsługę płynów do przemieszczania robaków i jest ręcznie oceniany w punkcie końcowym. Różne podejścia zastosowane w tym teście mogą być pomocne dla badaczy poszukujących metod badań przesiewowych, które obejmują te schorzenia.

Kluczowe elementy tego protokołu koncentrują się głównie na jakości płytek wyprodukowanych do testu. Po pierwsze, podczas wykonywania talerzy konieczne jest, aby powierzchnia agaru była wolna od pęcherzyków i innych niedoskonałości. Te różnice w powierzchni agaru prawie zawsze prowadzą do zakopywania się i utraty studni. Po drugie, protokół ten opiera się na wysuszaniu płynów osadzonych na etapie konfiguracji i lekowania. Bardzo ważne jest, aby te płyny zostały całkowicie usunięte, ale agar nie wysycha. Anegdotycznie wydaje się, że robaki w studniach, które nie są całkowicie wysuszone (pływające w cieczy) żyją dłużej niż prawidłowo wysuszone studnie, podczas gdy nadmierne wysuszenie płytek prowadzi do wysuszenia i pękania agaru, co prowadzi do zakopywania się i utraty robaków. Kolejnym istotnym elementem tego protokołu jest utrzymanie sterylnych warunków. Podobnie jak w przypadku każdego testu żywotności, konfiguracja płytki wiąże się z dużą ilością pracy, a także istnieje wiele możliwości i czasu, aby test rujnujący zanieczyszczenie osiadło i rosło na płytkach.

Chociaż opisany tutaj test długości życia jest przydatny do badań przesiewowych związków u C. elegans, jest ograniczony do określonych środowisk genetycznych, ponieważ opiera się na sterylnym szczepie wrażliwym na temperaturę (ts); użyliśmy TJ1060, który ma wysoką penetrację sterylności. Ogranicza to liczbę szczepów dostępnych do badań przesiewowych tą metodą. Alternatywne podejścia, w tym krzyżowanie sterylnych mutacji ts na pożądanym tle lub stosowanie sterylizacji chemicznej. Nie próbowaliśmy sterylizacji chemicznej za pomocą tego testu, ale powinno to być możliwe. Potencjalne przeszkody obejmują umieszczenie sterylizatora na robakach na odpowiednim etapie i w odpowiedniej dawce. Opisany tutaj protokół wykorzystuje dozownik płynu, który jest szybki, ale nie wydaje się, aby skutecznie dozować dorosłych. Tak więc robaki te rozwijają się na płytkach i dlatego muszą być traktowane środkiem chemicznym do sterylizacji na płytkach. Określenie optymalnej dawki i czasu będzie ważne dla osiągnięcia sukcesu. Alternatywne strategie obejmują użycie metody dozowania, która może poruszać dorosłych. W przeszłości odkryliśmy, że maszyny zdolne do identyfikacji i sortowania dorosłych osobników są na ogół znacznie wolniejsze niż proste urządzenia do obsługi płynów, które mogą dozować jednorodne zawiesiny zawieszonych larw.

Ogólnie rzecz biorąc, używamy tej metody do szybkiego badania chemikaliów i zabiegów pod kątem dużego pozytywnego wpływu na długość życia. Metoda ta jest szczególnie skuteczna, gdy jest stosowana w przypadku wielu dawek, dużej liczby powtórzeń i ścisłego monitorowania kontroli ujemnych, które są zawsze utrzymywane i przeplatane między płytkami testowymi. Kontrole dodatnie są również przydatne przy projektowaniu i wdrażaniu badań przesiewowych opisanych w niniejszym manuskrypcie. Jednak, aby być skutecznym pozytywnym, kontrola musiałaby być dość silna i/lub wysoce wytrzymała. Kiedy ekran został pierwotnie zainstalowany, nie można było zidentyfikować odpowiednio silnego i wytrzymałego związku. Obecnie w literaturze dotyczącej "starzenia się" znajduje się wiele doniesień o prawdopodobnych kandydatach do kontroli pozytywnych, przydatnych w opisanych tutaj badaniach przesiewowych. Jak opisano w sekcji dotyczącej kandydatów na ekran w sekcji dotyczącej oczekiwanych wyników niniejszego manuskryptu oraz na rysunku 2 i w tabeli 1, związek NP1 jest skuteczną kontrolą pozytywną dla tego badania. Zazwyczaj potwierdzamy pozytywne trafienia z tych ekranów za pomocą standardowych testów żywotności na płytkach hodowlanych 3 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB Bulion Miller Granulat	VWR
Unispense	Zautomatyzowany aparat dozujący płyny	Wheaton Science Products
96-dołkowa płytka testowa; COSTAR 3370	Corning
Multidrop 384; automatyczny 8-kanałowy dozownik	Thermo Fisher Scientific
wyprodukowany pick do robaków	Genesee Scientific
Belly Dancer Wytrząsarka orbitalna	Stovall Life Science Inc.
wytrząsarka do mikropłytek; MTS 2/4 Digital	IKA Works, inc.
zautomatyzowana 96-dołkowa obsługa cieczy; Płyn do obsługi Biomek FX	Zautomatyzowana
; Pipet stołowy	Sorenson Bioscience, inc.
Ręczne pipety wielokanałowe 8 lub 12	Używamy Rainin&Hellip;
przezroczysta 96-dołkowa pokrywa filmowa; Folia optyczna TempPlate RT	USA Naukowa
wirówka stołowa; Wirówka 5810 R	Eppendorf

96-dołkowa ładowarka do cieczy Beckman Coulter