Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans to użyteczny organizm do testowania chemicznego wpływu na fizjologię. Badania przesiewowe małych cząsteczek całego organizmu oferują znaczące korzyści w identyfikacji biologicznie aktywnych struktur chemicznych, które mogą modyfikować złożone fenotypy, takie jak długość życia. Opisany tutaj jest prosty protokół produkcji setek 96-dołkowych płytek hodowlanych z dość stałą liczbą C. elegans w każdym dołku. Następnie określiliśmy, w jaki sposób wykorzystać te kultury do przesiewania tysięcy substancji chemicznych pod kątem wpływu na długość życia nicieni C. elegans. Protokół ten wykorzystuje wrażliwe na temperaturę sterylne szczepy, warunki na płytkach agarowych i prostą obsługę zwierząt, aby ułatwić szybką i wysokowydajną produkcję zsynchronizowanych kultur zwierząt do badań przesiewowych.

Wprowadzenie

Tutaj opisany jest protokół, który został opracowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków chemicznych pod kątem wpływu na długość życia Caenorhabditis elegans. Sam protokół można łatwo dostosować do innych fenotypowych badań przesiewowych, w tym badań wykorzystujących szczepy reporterowe C. elegans. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do zidentyfikowania nowego biologicznie aktywnego związku, NP1 (nitrofenylopiperazyna 1), który znacznie wydłuża życie C. elegans poprzez mechanizm ograniczeń dietetycznych. NP1 i charakterystyka jego wpływu na długość życia, w tym opis szlaków genetycznych w grze, zostały wcześniej opisane w innym miejscu¹. Sprawozdanie to zawiera również opis wyników wdrożenia ekranu na dużą skalę. W tym miejscu opiszemy znacznie bardziej szczegółowo metodologię i konfigurację samego ekranu, który jest skalowalny zarówno dla małych, jak i dużych aplikacji.

Celem, który doprowadził do stworzenia opisanego tutaj protokołu, było opracowanie platformy hodowli C. elegans, która pozwoliła na szybkie badanie dużych bibliotek chemicznych pod kątem nowych biologicznie aktywnych związków. Chociaż badania chemiczne zostały przeprowadzone przed opracowaniem tego protokołu, były to głównie podejścia na małą skalę i/lub podejścia typu kandydującego^2,3. Rzeczywiście, większość badań przesiewowych przeprowadzonych w laboratorium na dziesiątkach związków wykorzystywała testy odporności na stres, przy czym trafienia były badane pod kątem efektów długowieczności⁴. Badanie to miało na celu bezpośrednie badanie przesiewowe pod kątem wpływu na długość życia. Co ciekawe, w literaturze naukowej w czasie wykonywania badań chemicznych na dużą skalę z użyciem C. elegans, było niewiele opisów. Rzeczywiście, w porównaniu z innymi typami ekranów^5,6,7, badania chemiczne na dużą skalę z użyciem C. elegans wydawały się być niedostatecznie wykorzystywane.

Były dwa opisy dużych badań chemicznych u C. elegans, które zostały wykorzystane jako podstawa do opracowania tego podejścia. Pierwszym z nich było eleganckie badanie z laboratorium Petera Roya, w którym wykorzystano chemiczne badania przesiewowe do identyfikacji związków, które mogą zaburzać rozwój zwierząt. Następnie w badaniu przeprowadzono badanie przesiewowe mutagenezy do przodu, aby zidentyfikować cele genetyczne tych substancji chemicznych⁸. W protokole opisanym w tym badaniu wykorzystano pasztety z 24 dołkami, co było po prostu niewykonalne ze względu na specyficzne potrzeby tego badania (ograniczone ilości substancji chemicznych w bibliotece i ograniczona dostępna przestrzeń w inkubatorze). Drugim badaniem było innowacyjne i ambitne badanie przesiewowe małych cząsteczek Michaela Petraschecka pod kątem wydłużania żywotności chemikaliów^9,10. W badaniu tym wykorzystano płytki 384-dołkowe i kultury płynne. Inną główną cechą tego badania było zastosowanie FUDR (5-fluorodeoksyurydyny) do chemicznego hamowania produkcji potomstwa. Po dokładnym rozważeniu protokołu opisanego w tym badaniu, uniknięto zarówno sterylizacji chemicznej, jak i płynnych kultur C. elegans.

Chociaż FUDR jest powszechnie stosowany w eksperymentach z długością życia C. elegans, pojawiły się obawy, że FUDR może powodować nieprzewidziane interakcje z lekami, lub że sam FUDR może mieć pewien wpływ na długość życia. Ostatnio ta ostatnia obawa została potwierdzona, przynajmniej w niektórych stężeniach, a w szczególności w temperaturze 25 °C¹¹. Aby obejść problem zanieczyszczenia potomstwa, użyto szczepu C. elegans TJ1060, który zawiera dwie niezależne mutacje wrażliwe na temperaturę (spe-9(hc88)I; rrf-3(b26)II), które znoszą produkcję plemników i wykazano, że są przydatne w masowych kulturach populacji synchronicznych¹². Szczep ten był całkowicie sterylny w temperaturze 25 °C, ale daje potomstwo, gdy jest hodowany w temperaturze 15-20 °C. W badaniu wykorzystano konwencjonalne warunki hodowli, w których robaki pełzają po powierzchni agaru, ponieważ wyniki uzyskane z płynnymi kulturami nie zawsze są odtwarzalne na konwencjonalnych płytkach agarowych. Chociaż zjawisko to nie jest w pełni zrozumiałe, wykazano, że robaki hodowane w płynie reagują na DR (ograniczenie dietetyczne) w inny sposób niż robaki hodowane na standardowych pożywkach^13,14. W związku z tym prawdopodobne jest, że płynne media mogą maskować niektóre mimetyki DR, które w przeciwnym razie zostałyby zidentyfikowane z ekranem.

Po ustaleniu warunków hodowli agaru, rozważono różne opcje oceny wydajności studzienek w tym teście. Chociaż dostępne były różne zautomatyzowane lub oparte na obrazowaniu testy, wymagały one nabycia i wdrożenia urządzeń wymagających technicznie, z których większość była zbyt droga. Rozważając te opcje, konieczne było odniesienie się do poprzednich typów ekranów o żywotności. Ostatecznie w badaniu wykorzystano metodę punktacji zaadaptowaną z badania przesiewowego całego genomu RNAi Siu Sylvia Lee Lab dla fenotypów długości życia¹⁵. W szczególności wszystkie tabliczki dotyczące żywotności zostały ustawione w ten sam sposób, ale monitorowano tylko kontrole ujemne. Po potwierdzeniu, że płytki kontroli ujemnej mają prawie całkowitą śmiertelność, płytki testowe zostały ocenione ręcznie. W tym badaniu przesiewowym na dużą skalę wyniki dodatnie zostały potwierdzone przez ponowne testowanie świeżo przygotowanymi substancjami chemicznymi, przy użyciu trzykrotnych powtórzeń pierwotnych wyników dodatnich.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Rosół LB
   1. Używaj wstępnie zmieszanych granulek (patrz tabela materiałów) i postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu przygotowania.
2. Pożywka wzrostowa nicieni (NGM) Agar
   1. Wymieszać 23 g agaru, 3 g NaCl, 2,5 g peptonu baktonowego i wodę dejonizowaną do 0,972 l. Autoklaw i ostudzić do temperatury 60 °C, następnie dodać 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (KPO₄) (pH 6,0), 1 ml 1 M siarczanu magnezu (_MgSO4), 1 ml 1 M chlorku wapnia (CaCl₂), i 1 ml cholesterolu 5 mg/ml (w etanolu).
3. Roztwór podchlorynu
   1. Zmieszać 5 ml 5 M KOH, 4 ml roztworu podchlorynu sodu (6%) i dejonizowany H₂O do całkowitej objętości 50 ml.
4. S podstawowy
   1. Wymieszać 5 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 6 g KH₂PO₄ i wodę dejonizowaną do 1 l, a następnie autoklaw.

2. Przygotowanie skoncentrowanej E. coli (OP50)

UWAGA: Ten krok koncentruje 1 l nasyconego roztworu E. coli w 25 ml buforu bazowego S.

1. Zaszczepić 5 ml autoklawizowanego bulionu LB (krok 1.1) pojedynczą kolonią E. coli (szczep OP50) i inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min). Użyć 0,1 ml tego roztworu do zaszczepienia 1 litra LB w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera. Inkubować kolby o pojemności 1 l przez noc (12-16 godzin) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 obr./min).
2. Odwirować 1 l kultur przez noc w butelkach wirówkowych o pojemności 500 ml przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C, aby osadzać bakterie i dekantować pozostałe pożywki. Zawiesić osad w 25 ml S Basal (krok 1.4). Przechowywać w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie płytek hodowlanych NGM

1. W przypadku płytek do hodowli masowej używanych do produkcji dużej liczby robaków, należy dozować 30 ml stopionego (60 °C) agaru NGM (krok 1.2) w komorze z przepływem laminarnym na 10-centymetrowe płytki hodowlane z automatycznym aparatem dozującym płyn lub pipetą serologiczną. Pozostawić do wyschnięcia na noc.
2. Odpipetować 2 ml stężonego OP50 na każdą płytkę o średnicy 10 cm, rozprowadzić tak, aby całkowicie pokryć powierzchnię agaru poprzez przechylanie i obracanie płytki, a następnie pozostawić płytki do wyschnięcia. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
3. W przypadku wysokoprzepustowych płytek hodowlanych używanych do badań przesiewowych należy użyć automatycznego 8-kanałowego dozownika do dozowania 0,15 ml stopionego agaru NGM do każdej studzienki 96-dołkowej płytki w komorze z przepływem laminarnym. Zachowaj ostrożność, aby upewnić się, że studnie są pozbawione pęcherzyków, ponieważ umożliwią one zakopanie robaków, które zagrożą testowi w tej studni. Pozostawić do wyschnięcia na noc. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

4. Przygotowanie sterylnych kultur masowych C. elegans wrażliwych na temperaturę (ts)

1. Aby rozpocząć hodowle, używając "wykałaczki do robaków" (szklanej pipety z dołączonym drutem platynowym lub wyprodukowanej szpikulca) pod mikroskopem preparacyjnym, przenieś 20 jaj (szczep TJ1060: spe-9(hc88)I; rrf-3(b26)II) na płytkę (płytki) do hodowli masowej przygotowane w kroku 3.1. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 20 °C przez 6 dni (pozwala na wzrost więcej niż jednego pokolenia, ponieważ celem jest zebranie potomstwa z 20 przeniesionych jaj).
2. Wizualnie potwierdź obecność ciężarnych dorosłych osobników (jaj obecnych w macicy) za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Zebrać ciężarne dorosłe osobniki, dozując 2-3 ml S baseal na płytkę za pomocą szklanej pipety. Ręcznie zamieszaj płyn wokół płytki, a następnie zbierz płyn do probówki o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.
3. Odwirować probówkę (1 000 x g przez 1,5 minuty w temperaturze 20 °C) w celu osadzenia robaków, a następnie odessać supernatant. Dodać 10 ml roztworu podchlorynu (krok 1.3) do osadu robaka i szybko potrząsać probówką ręcznie w kierunku od góry do dołu przez 5 sekund. Inkubować przez 5 minut, wstrząsając co 2,5 minuty.
4. Ponownie odwiruj rurkę (1000 x g przez 1,5 minuty); osad powinien być żółtawo-brązowy. Odessać supernatant. Dodaj 10 ml roztworu podchlorynu do granulki jaja i energicznie potrząśnij probówką. Inkubować 1-3 minuty, od czasu do czasu potrząsając i monitorując pojawienie się za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Potwierdź wzrokowo, że pozostały tylko jaja i przejdź do następnego kroku.
5. Odwirować probówkę (1 000 x g przez 1,5 minuty) i odessać supernatant. Granulka powinna być biała bez brązowego zabarwienia.
   UWAGA: Po usunięciu roztworu podchlorynu bardzo ważne jest użycie sterylnych technik i, ponieważ zanieczyszczenie (w szczególności bakteryjne i grzybicze) może zrujnować eksperyment, marnując cenny czas i odczynniki. W badaniu wykorzystano komorę z filtrowanym przepływem laminarnym i przenoszono ciecze wyłącznie za pomocą sterylnych pipet i końcówek.
6. Otwórz probówki w sterylnym miejscu. Przemyć osad 3 razy roztworem S basetal, odkręcając w dół (1 000 x g przez 1,5 min) i za każdym razem odsysając supernatant. Ponownie zawiesić osad jajeczny w 2-3 ml S basetal. Jaja te można teraz wykorzystać do nocnego wylęgu w buforze w celu zebrania larwy L1 (krok 5).

5. Wylęganie jaj C. elegans w buforze w celu uzyskania synchronicznych kultur (przygotowanie larwy L1 C. elegans )

1. Zdekantować granulki jaj i przelać je na sterylną szklaną szalkę Petriego z pokrywą. Opłucz pozostałe jaja z probówki do naczynia za pomocą pipety serologicznej z 2-3 ml S basetal. Dodaj 5 ml S basal, aby złagodzić stłoczenie, ponieważ może to zachęcić do wylęgu, podobnie jak lekkie potrząsanie (20 obr./min z wytrząsarką orbitalną tancerki brzucha). Inkubować przez noc w temperaturze 20 °C, aby jaja miały czas na wyklucie się (16-24 godziny). Wszystkie pisklęta zatrzymują się w 1.^{stadium larwalnym} (L1) z powodu braku pokarmu.
   UWAGA: Anegdotyczne dowody wskazują, że świeże preparaty L1 (16-36 godzin po zebraniu jaj) generują najbardziej synchroniczne populacje dorosłych robaków.
2. Zebrać L1 w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej. Odwirować L1 w wirówce (1,000 x g przez 1,5 minuty), odessać supernatant i powtarzać, aż wszystkie L1 zostaną zebrane z płytek wylęgowych, pozostawiając 10 ml S baseal do następnego kroku.
3. Z probówki zawierającej L1s wypiąć mikropipetą 0,01 ml (natychmiast po wymieszaniu) i dozować na płytkę NGM bez nasion (bez E. coli). Policz liczbę L1 na tabliczce. Powtórzyć czynność 10 razy i uzyskać średnią dla liczby L1 w każdej podwielokrotności. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewaj się od 1 do 3 L1 na μl (zaczynając od 1 płytki do masowej hodowli zawierającej 20 jaj).
4. Oznaczyć pipetą serologiczną objętość S baseal zawierającego L1s. Następnie dokonaj ekstrapolacji z ustaloną średnią liczbą robaków na 0,01 ml, uzyskaną w poprzednim kroku, aby oszacować całkowitą liczbę L1. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewaj się od 10 000 do 30 000 L1 (na płytkę do hodowli masowej zawierającą 20 jaj).
5. Aby użyć tej kultury w teście 96-dołkowym, należy rozcieńczyć zawiesinę L1 do 1 L1 na μl w sterylnej okrągłej butelce z pożywką, a następnie przejść do kroku 7. Jeśli ta kultura ma być użyta do wygenerowania dodatkowych masowych kultur C. elegans, przejdź do kroku 6.

6. Przygotowanie kultur synchronicznych na dużą skalę

UWAGA: Rozwiązania L1 mogą być używane do szybkiego zwiększania populacji robaków.

1. Aby wygenerować dużą liczbę robaków za pomocą roztworu L1, należy dozować do 5 000 L1 na każdą z żądanych liczb płytek do hodowli masowej. Zebrać ciężarne dorosłe osobniki 2,5 dnia później (20 °C) zgodnie z opisem w krokach 4.1-2 i przejść do kroku 4.3 w celu zebrania jaj.
2. Jak anegdotycznie zaobserwowano, powtarzające się zbieranie podchlorynu może stresować ujarzmioną populację, podzielij populacje poprzez zbieranie jaj do rozmnażania przed poddaniem pozostałej populacji działaniu podchlorynu, tak aby wiele pokoleń populacji nie było wielokrotnie poddawanych działaniu roztworu podchlorynu.

7. Konfiguracja 96-dołkowych płytek testowych

1. Pozwól, aby płytki testowe (przygotowane w kroku 3.3) osiągnęły temperaturę pokojową. Następnie w komorze z przepływem laminarnym dodaj 5 μl stężonego OP50 (przygotowanego w kroku 2.2) do każdej studzienki. Tak jak poprzednio, użyj automatycznego 8-kanałowego dozownika.
2. Dodać 10 μl zawiesiny L1 do każdej studzienki za pomocą automatycznego 8-kanałowego dozownika. Daje to średnio 10 robaków na studzienkę, ponieważ są one obecne w zawiesinie w ilości 1 L1 na μl. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie L1 z gnojowicy, dozuj L1 z okrągłej butelki z podłożem, aktywnie mieszając się z umiarkowanie wolno obracającym się mieszadłem.
3. Przykryć płytkę pokrywką, pudełka z partiami płytek i inkubować w temperaturze 25 °C przez 2 dni.

8. Leczenie 1 dnia dorosłego C. elegans za pomocą chemikaliów

1. Wyjmij płytki z biblioteki chemicznej z zamrażarki i pozwól płytkom osiągnąć temperaturę pokojową przed kontynuowaniem.
   UWAGA: Tabliczki biblioteki chemicznej, jak opisano tutaj, to 96-dołkowe płytki zawierające dyskretne związki w każdym dołku, z których wszystkie są w tym samym stężeniu i rozpuszczone w DMSO. Biblioteki te nie wykorzystują zewnętrznych kolumn, więc każda płyta zawiera maksymalnie 80 różnych substancji chemicznych. W opisanym tutaj protokole stężenie biblioteki wynosi 10 mM. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę wpływ rozpuszczalnika na fenotypy. Chociaż w tym badaniu przeprowadza się badanie przesiewowe przy stężeniu DMSO wynoszącym 0,5%, poziom ten nigdy nie został przekroczony w tych testach żywotności oraz w testach o niskiej przepustowości, w których bardziej prawdopodobne jest wybranie stężenia roztworu podstawowego związku. Protokół ten nie przekracza 0,25%, co jest poziomem, przy którym modyfikacje żywotności nie występują¹⁶, przynajmniej w odmianie N2.
2. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie wstrząsnąć płytką z prędkością 60 obr./min na wytrząsarce do mikropłytek przez 1 minutę.
3. Za pomocą zautomatyzowanego 96-dołkowego urządzenia do obsługi cieczy przenieś 0,75 μl związku (lub DMSO) z płytki bibliotecznej na płytkę testową. Głębokość pipety podczas dostarczania cieczy na płytkę testową jest dokładnie kontrolowana, tak aby końcówki pipet osoby zajmującej się cieczą dostarczały objętość 0,75 μl do ~15 μl cieczy na powierzchni agaru (z robakami i skoncentrowanym OP50 z kroków 7.1-2) i nie przebijały powierzchni agaru w studzience. Nie należy używać ręcznych 8 lub 12 pipet wielokanałowych, z wyjątkiem bardzo małych sit (<10 płytek), ponieważ mogą one zwiększyć błąd i często powodować przebicie powierzchni agaru, co pogarsza jakość testu.
4. Przygotować płytki kontroli ujemnej biblioteki chemicznej z DMSO (dimetylosulfotlenkiem), zakładając, że testowana biblioteka wykorzystuje DMSO jako rozpuszczalnik. Wykonać 1 płytkę kontroli ujemnej na każde 5 płytek testowych, do 10 płytek kontroli ujemnej. Jeśli to możliwe, należy również wykonać płytkę kontroli dodatniej (NP1¹ przy 20 mM, dla końcowego stężenia testowego 0,1 mM, jest skuteczna w tym celu; patrz sekcja Reprezentatywne wyniki). Nie dodawaj chemikaliów (testowych lub kontrolnych) do 2 zewnętrznych kolumn płyt, ponieważ są one szczególnie podatne na wysuszenie.

9. Suszenie kultur

1. Aby usunąć płyn z powierzchni agaru, susz płytki w komorze laminarnej przez 4-8 godzin. Bardzo ważne jest, aby płytki te zostały całkowicie wysuszone, ale nie uległy wysuszeniu. Ponieważ niektóre płytki schną dłużej niż inne, uważnie monitoruj wszystkie płytki i wyjmij, gdy tylko wyschną. Potwierdzić suszenie poprzez dokładne oględziny poszczególnych dołków płyty.
   UWAGA: W zależności od czynników, które obejmują natężenie wywiewu szafy, czas ten musi być określony empirycznie. Ten etap suszenia może zająć około 4-8 godzin dla pełnej szafki.
2. Uszczelnij płytki przezroczystą folią, a następnie załóż pokrywki talerzy.
3. Obracaj 96-dołkowe płytki testowe przez 45 s przy 1,000 x g.
4. Przechowywać płytki odwrócone do góry dnem w temperaturze 25 °C.

10. Punktacja kultur C. Elegans dla długowieczności

1. Monitoruj płytki kontroli ujemnej do momentu zaobserwowania śmiertelności >95%. Sprawdzaj tabliczki co tydzień przez pierwsze dwa tygodnie, a następnie codziennie. Kohorty Caenorhabditis tego samego szczepu i gatunku mogą wykazywać znacznie różną długość życia w zależności od próby¹⁷.
   UWAGA: W opisanym tutaj teście długości życia, ze zwierzętami TJ1060 hodowanymi w temperaturze 25 °C, 95% śmiertelność w tych populacjach wystąpiła od 16 do 20 dnia dorosłości.
2. Jeżeli uznaje się, że studzienki kontroli ujemnej osiągnęły poziom >95 %, należy odwirowywać wszystkie 96-dołkowe płytki testowe przez 45 s na wirówce stołowej z wirnikiem przystosowanym do mikropłytek (250 x g przez 45 s w temperaturze 20 °C).
3. Punktow wszystkie dołki na płytkach kontrolnych. Odbywa się to poprzez liczenie i rejestrowanie liczby żywych i martwych zwierząt w każdej studzience. Martwe robaki można odróżnić od żywych robaków po ich całkowitym braku ruchu. Sprowokuj ruch u żywych robaków, upuszczając 96-dołkową płytkę z około 7 cm na powierzchnię mikroskopu preparacyjnego, patrząc przez okular w poszukiwaniu wywołanej reakcji. Martwe robaki nie będą reagować, a pobliscy koledzy z laboratorium mogą nie doceniać powtarzającego się hałasu.
4. W przypadku płytek testowych należy liczyć i zapisywać tylko studzienki zawierające żywe robaki. Kiedy zaobserwuje się żywego robaka, policz wszystkie żywe i martwe zwierzęta w tej studni, wraz z pozycją studni i płytą.
   UWAGA: Często przydatne jest ponowne nacięcie płytek po tym, jak >99% robaków kontroli ujemnej jest martwych. W przypadku ekranów o dużej skali może to być najlepszy punkt do wykonania wstępnej oceny. W obu przypadkach oceń/ponownie oceń zgodnie z powyższym opisem

11. Ponowne testowanie związków

1. W przypadku testowania tylko niewielkiej liczby związków kandydujących (<320 związków), jak w przypadku ponownego testu lub badania przesiewowego (patrz Reprezentatywne wyniki), należy ograniczyć test do 32 studzienek centralnych, aby zminimalizować możliwe efekty płytki. To pozostawia 2 studzienki najbliżej krawędzi płytki niepoddane obróbce, ale nadal zawierające agar, pokarm i robaki.

Wyniki

Zaczynamy od zbadania reprezentatywnych wyników z zastosowania tego protokołu dla testów żywotności 96 odwiertów. W pierwszym przykładzie metoda została wykorzystana do przesiewania 30 000 substancji chemicznych w celu pomyślnej identyfikacji substancji chemicznych, które przedłużają żywotność C. elegans, a także obejmuje wyniki z dalszego ponownego badania przesiewowego najlepiej działających substancji chemicznych przy użyciu tego samego protokołu. Te wyniki zostały wcześniej opisane¹. W drugim przykładzie wykorzystano ten sam protokół w mniejszym badaniu przesiewowym związków kandydujących.

Badanie przesiewowe na dużą skalę i ponowny test: Badanie przesiewowe na dużą skalę na 30 000 związków zostało przeprowadzone po podaniu pojedynczej dawki, w dwóch egzemplarzach. Każda substancja chemiczna została zatem przetestowana w dwóch odwiertach, w których spodziewano się całkowitej populacji zwierząt wynoszącej 20 sztuk. Aby to osiągnąć, trzy dyskretne zestawy 10 000 związków (w dwóch egzemplarzach) zostały przebadane przez okres ~3 miesięcy, aby pokryć całe 30 000 związków. Zostało to zrobione częściowo, aby zapewnić możliwą do opanowania ilość ręcznego oceniania na końcu testu i wymagało łącznie 260 z 96-dołkowych płytek testowych w każdym z zestawów. Na tablicach bibliotecznych tylko 80 studni zawierało związek; Jedna replika 10 000 związków daje 125 płytek testowych. W badaniu tym wykorzystano 2 powtórzenia z 10 płytkami kontroli ujemnej w każdym zestawie. Aby zwiększyć przepustowość, płytki oceniano, gdy oceniano, że populacje kontroli ujemnej doświadczyły ~99% śmiertelności. Wszystkie studnie testowe zostały następnie zbadane na obecność żywych robaków.

Chemikalia w studniach z jednym żywym robakiem zostały nazwane trafieniami. Chemikalia w studniach zawierających więcej niż 1 robaka żywego nazywano również trafieniami, a dodatkowo wszystkie robaki w tych studniach (żywe i martwe) były liczone w celu wygenerowania prostego wyniku (procent żywych robaków; liczba żywych robaków podzielona przez liczbę martwych robaków). Każda substancja chemiczna w bibliotece może być zatem dwukrotnie nazwana trafieniem, a te trafienia mogą, ale nie muszą, mieć powiązane z nimi wyniki. 512 różnych substancji chemicznych zostało nazwanych trafieniami (co najmniej raz) z ekranu 30 000 związków. Badania przesiewowe przeprowadzono z zamiarem zidentyfikowania silnych i/lub silnych (odtwarzalnych) efektów sprzyjających długowieczności. Te dwie różne właściwości mogą mieć różne skutki. Silne chemikalia mogą znacznie wydłużyć żywotność, w takim przypadku spodziewalibyśmy się, że wysoki procent robaków będzie żył w studni tej substancji chemicznej. W przypadku silnych substancji chemicznych oczekuje się, że obie kontrpróby będą zawierały żywe robaki. Lista trafień została uszeregowana na podstawie tych kryteriów. 179 substancji chemicznych uzyskało wysoki odsetek żywych wyników lub zostało trafionych w obu powtórzeniach i dlatego zostały wybrane do ponownego testowania. Większość pozostałych substancji chemicznych, które zostały nazwane trafieniami, ale nie zostały wybrane do ponownego testowania, zawierała tylko jednego żywego robaka w jednym z powtórzonych odwiertów.

Przeprowadzono ponowne testy trafień, podobne do głównego ekranu, z wyjątkiem 3 powtórzeń (oczekiwana całkowita populacja zwierząt wynosząca 30) i dokładnej kwantyfikacji długości życia zwierząt na nieleczonych płytkach kontrolnych. Zmiany te zostały dodane, aby pomóc w porównaniu studzienek testowych i kontrolnych. 179 uderzeń chemicznych zostało ponownie uporządkowanych, rozcieńczonych do 10 mM i przeniesionych do 96 płytek dołkowych. Tylko wewnętrzne 24 dołki zostały użyte do ponownego testu (obecne wersje tego protokołu wykorzystałyby wewnętrzne 32 dołki, jak opisano w sekcji protokołu dla badań przesiewowych ponownego testu), a związki zostały ponownie przetestowane w trzech egzemplarzach z sześcioma płytkami do testów kontroli ujemnej potraktowanymi rozpuszczalnikiem DMSO. Jedna płytka kontroli ujemnej była okresowo oceniana pod kątem całkowitego przeżycia (Rysunek 1A). Gdy około 95% zwierząt kontrolnych było martwych, wszystkie płytki zostały całkowicie nacięte (policzono wszystkie leczone żywe i martwe robaki).

Aby wywołać trafienia z wyników ponownego testu, dokonano odcięcia przy średnim procencie żywych wyników kontroli negatywnej +2 odchylenia standardowe (SD). W przypadku studzienek testowych uśrednione wyniki procentu żywych (w momencie oceniania) obliczono poprzez uśrednienie procentu żywych wyników z trzech powtórzeń dla każdego dołka. W przypadku tego konkretnego testu średni procent żywych studzienek kontrolnych obliczono jako średnią z trzech powtórzeń dla 48 studzienek (2 zestawy potrójnych płytek kontroli ujemnej). SD używany do wywoływania trafień z zestawu substancji chemicznych do ponownego badania to SD w 48 uśrednionych wynikach kontroli ujemnej przy odsetku żywych pacjentów. Stosując tę strategię, badanie to wykazało 57 trafień z biblioteki 179 związków z ponownego testu, wykazując, że w sumie 32% ponownie testowanych substancji chemicznych dało wynik pozytywny (Rysunek 1B). Grupowanie uśrednionych wyników procentu żywych zwierząt dla kontroli ujemnej i studzienek testowych wykazało, że studzienki testowe przewyższały studzienki kontrolne (Rysunek 1C).

Ekran kandydata: Małe ekrany mogą być wykonywane w sposób podobny do opisanego powyżej ponownego testu. W tym miejscu opisujemy wyniki z kandydującego badania przesiewowego ze 139 związkami. Kandydaci ci zostali zmontowani jako struktury, które mogą promować długowieczność. W przypadku tego badania przesiewowego przeprowadziliśmy 5 powtórzeń płytek testowych w dwóch różnych dawkach (50 μM i 100 μM). Dodatkowo użyliśmy 8 płytek kontroli ujemnej, przy czym jedna płytka kontroli dodatniej (NP1) zawierała dwie różne dawki; 50 μM oraz 100 μM.

Płytki kontroli negatywnej były monitorowane do momentu, gdy ~90% zwierząt było martwych. W tym czasie studnie były oceniane poprzez liczenie żywych i martwych robaków we wszystkich studzienkach kontrolnych oraz ze studni testowych, które zawierały żywe robaki. Procent żyjących w momencie punktacji wykorzystano do obliczenia uśrednionego procentu żywych wyników dla każdego dołka. W przypadku kontroli ujemnych 32 studnie miały procentowe wyniki życia z 8 powtórzeń. W przypadku kontroli dodatnich stwierdzono uśrednienie 4 wyników studzienek w 4 powtórzeniach dla każdej dawki. Trafienia wywołano do studni ze średnim procentem żywego wyniku, który był większy niż uśredniony procent żywych punktów kontroli negatywnej +2 SD. To odcięcie pozostawiło 14 trafień z ekranu kandydatów i wykluczyło wszystkie studzienki kontroli negatywnej. Punkt odcięcia obejmował również wszystkie studzienki kontroli dodatniej poddane działaniu 100 μM i 50 % kontroli dodatnich poddanych działaniu 50 μM. Wyniki te są tutaj przedstawione jako uśrednione wyniki procentu życia zarówno dla ekranów testowych 50 μM (Rysunek 2A), jak i 100 μM (Rysunek 2B).

Na koniec, wszystkie płytki zostały ponownie ocenione w późnym momencie, co odpowiadało czasowi, kiedy więcej niż 99% zwierząt poddanych kontroli negatywnej było martwych. Wyniki te wskazały, że studzienki kontroli pozytywnej znacznie przewyższały studzienki kontroli ujemnej i testowe (Rysunek 2C). Podczas gdy studnie testowe były nieco lepsze niż kontrole negatywne. Ten ostatni wynik jest tendencyjny ze względu na wskazanie, że wiele studzienek testowych wydaje się wykazywać toksyczność w stosunku do leczenia kontrolnego (Tabela 1), co zakłóca tę prostą interpretację. Można się było tego spodziewać, ponieważ biblioteka kandydująca była prawdziwym badaniem przesiewowym substancji chemicznych o nieznanej aktywności biologicznej u C. elegans, podczas gdy badanie przesiewowe ponownego testu było zasadniczo wstępnie przebadane pod kątem związków, które nie były toksyczne. Ponieważ to główne badanie przesiewowe dotyczyło związków, które wydłużały żywotność, znacznie toksyczne chemikalia nie powinny znaleźć się w zestawie do ponownego testowania.

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki z wysokoprzepustowego ekranu i ponownego testowania
(A) Krzywa przeżywalności z reprezentatywnej płytki kontroli ujemnej użytej w teście ponownego badania. Krzywa ta została skonstruowana na podstawie 4-krotnego nacinania wszystkich żywych i martwych robaków w 24 studzienkach użytych w tym teście w ciągu 18 dni testu. W 18 dniu dorosłości oceniono, że grupa kontrolna ma ~5% przeżycia, a następnie oceniono wszystkie testy kontrolne i płytki. (B) Tabela podsumowująca wyniki badania przesiewowego i ponownego testu. (C) Grupowanie studzienek uśredniało procentowe wyniki życia zarówno w warunkach kontrolnych, jak i testowych z ekranu ponownego testu. W przypadku kontroli wyniki pochodzą z 48 dołków, z których każdy składa się ze średniej z 3 powtórzeń. Wyniki testów pochodzą ze 179 dołków, z których każdy składa się ze uśrednionego wyniku z trzech powtórzeń. Rysunek 1 jest reprodukowany z poprzedniej publikacji¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki z ekranu kandydata
(A) Grupowanie wyników z badania przesiewowego kandydującego 50 μM. 139 wyników studzienek testowych reprezentuje uśredniony procent żywego wyniku z 5 powtórzeń. 32 wyniki kontroli ujemnej składają się ze uśrednionego procentu żywych wyników z 8 powtórzeń. 4 wyniki kontroli pozytywnej składają się ze uśrednionego procentu żywych wyników z 4 kontrprób (łącznie 16 studzienek zawierających NP1 w stężeniu 50 μM). (B) Grupowanie wyników z ekranu kandydackiego 100 μM. Wszystko jest takie samo jak w (A), z wyjątkiem tego, że studzienki testowe i kontrole pozytywne zostały poddane działaniu stężeń 100 μM. Te same tabliczki kontroli ujemnej są pokazane w obu (A i B). (C) Reprezentatywne wyniki ponownego nacinania płytek w stosunkowo ekstremalnie późnym punkcie czasowym. Kontrole pozytywne znacznie przewyższyły wszystkie inne, jeśli weźmie się pod uwagę tylko procent studni z żywymi robakami w tym momencie, który jest stronniczy w stosunku do studni testowych, jak opisano w tekście głównym i Tabeli 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Binowanie uśrednionych wyników procentu żywych Zgrupowane wyniki Wszyscy martwi (0) 1-10 11-20 21-30 31-40 Rozdział >41 Ponowne testowanie # z (-) Kontroli 16 Rozdział 31 1 0 0 0 # studni testowych (50μM) Rozdział 46 Rozdział 69 50 Rozdział 8 3 3 Ekran kandydata # z (-) Kontroli 0 11 21 0 0 0 # z (+) kontroli (50μM) 0 0 cyfra arabska cyfra arabska 0 0 # z (+) kontroli (100μM) 0 0 0 0 cyfra arabska cyfra arabska # studni testowych (50μM) 94 Rozdział 94 22 Rozdział 22 21 cyfra arabska 0 0 # studni testowych (100 μM) Rozdział 86 25 21 6 1 0

Tabela 1: Reprezentatywne wyniki z łączenia różnych ekranów
W tym miejscu przedstawiamy kategoryzację uśrednionych wyników procentu żywych zwierząt z dwóch ekranów (ponowny test i kandydat). Na ekranie ponownego testu szczyt jest podobny do kontroli ujemnej, przy czym ponowne testy znacznie przewyższają kontrolę ujemną po prawej (długotrwałej) stronie tabeli. Wskazuje to na obecność wielu związków pro-długowiecznych obecnych w zestawie do ponownego testu. Na ekranie kandydata widzimy, że szczyt znajduje się w kategorii wszystkich martwych, podczas gdy jest też wyraźny sygnał z prawej strony tabeli. Wskazuje to na obecność związków pro-długowiecznych w zestawie kandydującym, ale także wskazuje na obecność znaczącej toksyczności wśród kandydującego zestawu związków.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy prostą metodę hodowli C. elegans na 96-dołkowych płytkach. Opisujemy te kultury do stosowania w chemicznych badaniach przesiewowych i testach długości życia, ale mogą być one używane do wielu rodzajów testów. Chociaż warunki hodowli wielostudziennej do badań przesiewowych substancji chemicznych były już wcześniej opisywane⁸, w tym w przypadku analizy długości życia¹⁰, opisany tutaj test różni się pod kilkoma względami. Opisany tutaj test żywotności wykorzystuje 96-dołkowe płytki, opiera się na sterylnych mutantach (zamiast sterylizacji chemicznej), wykorzystuje warunki hodowli agaru, wykorzystuje prostą obsługę płynów do przemieszczania robaków i jest ręcznie oceniany w punkcie końcowym. Różne podejścia zastosowane w tym teście mogą być pomocne dla badaczy poszukujących metod badań przesiewowych, które obejmują te schorzenia.

Kluczowe elementy tego protokołu koncentrują się głównie na jakości płytek wyprodukowanych do testu. Po pierwsze, podczas wykonywania talerzy konieczne jest, aby powierzchnia agaru była wolna od pęcherzyków i innych niedoskonałości. Te różnice w powierzchni agaru prawie zawsze prowadzą do zakopywania się i utraty studni. Po drugie, protokół ten opiera się na wysuszaniu płynów osadzonych na etapie konfiguracji i lekowania. Bardzo ważne jest, aby te płyny zostały całkowicie usunięte, ale agar nie wysycha. Anegdotycznie wydaje się, że robaki w studniach, które nie są całkowicie wysuszone (pływające w cieczy) żyją dłużej niż prawidłowo wysuszone studnie, podczas gdy nadmierne wysuszenie płytek prowadzi do wysuszenia i pękania agaru, co prowadzi do zakopywania się i utraty robaków. Kolejnym istotnym elementem tego protokołu jest utrzymanie sterylnych warunków. Podobnie jak w przypadku każdego testu żywotności, konfiguracja płytki wiąże się z dużą ilością pracy, a także istnieje wiele możliwości i czasu, aby test rujnujący zanieczyszczenie osiadło i rosło na płytkach.

Chociaż opisany tutaj test długości życia jest przydatny do badań przesiewowych związków u C. elegans, jest ograniczony do określonych środowisk genetycznych, ponieważ opiera się na sterylnym szczepie wrażliwym na temperaturę (ts); użyliśmy TJ1060, który ma wysoką penetrację sterylności. Ogranicza to liczbę szczepów dostępnych do badań przesiewowych tą metodą. Alternatywne podejścia, w tym krzyżowanie sterylnych mutacji ts na pożądanym tle lub stosowanie sterylizacji chemicznej. Nie próbowaliśmy sterylizacji chemicznej za pomocą tego testu, ale powinno to być możliwe. Potencjalne przeszkody obejmują umieszczenie sterylizatora na robakach na odpowiednim etapie i w odpowiedniej dawce. Opisany tutaj protokół wykorzystuje dozownik płynu, który jest szybki, ale nie wydaje się, aby skutecznie dozować dorosłych. Tak więc robaki te rozwijają się na płytkach i dlatego muszą być traktowane środkiem chemicznym do sterylizacji na płytkach. Określenie optymalnej dawki i czasu będzie ważne dla osiągnięcia sukcesu. Alternatywne strategie obejmują użycie metody dozowania, która może poruszać dorosłych. W przeszłości odkryliśmy, że maszyny zdolne do identyfikacji i sortowania dorosłych osobników są na ogół znacznie wolniejsze niż proste urządzenia do obsługi płynów, które mogą dozować jednorodne zawiesiny zawieszonych larw.

Ogólnie rzecz biorąc, używamy tej metody do szybkiego badania chemikaliów i zabiegów pod kątem dużego pozytywnego wpływu na długość życia. Metoda ta jest szczególnie skuteczna, gdy jest stosowana w przypadku wielu dawek, dużej liczby powtórzeń i ścisłego monitorowania kontroli ujemnych, które są zawsze utrzymywane i przeplatane między płytkami testowymi. Kontrole dodatnie są również przydatne przy projektowaniu i wdrażaniu badań przesiewowych opisanych w niniejszym manuskrypcie. Jednak, aby być skutecznym pozytywnym, kontrola musiałaby być dość silna i/lub wysoce wytrzymała. Kiedy ekran został pierwotnie zainstalowany, nie można było zidentyfikować odpowiednio silnego i wytrzymałego związku. Obecnie w literaturze dotyczącej "starzenia się" znajduje się wiele doniesień o prawdopodobnych kandydatach do kontroli pozytywnych, przydatnych w opisanych tutaj badaniach przesiewowych. Jak opisano w sekcji dotyczącej kandydatów na ekran w sekcji dotyczącej oczekiwanych wyników niniejszego manuskryptu oraz na rysunku 2 i w tabeli 1, związek NP1 jest skuteczną kontrolą pozytywną dla tego badania. Zazwyczaj potwierdzamy pozytywne trafienia z tych ekranów za pomocą standardowych testów żywotności na płytkach hodowlanych 3 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB Bulion Miller Granulat	VWR
Unispense	Zautomatyzowany aparat dozujący płyny	Wheaton Science Products
96-dołkowa płytka testowa; COSTAR 3370	Corning
Multidrop 384; automatyczny 8-kanałowy dozownik	Thermo Fisher Scientific
wyprodukowany pick do robaków	Genesee Scientific
Belly Dancer Wytrząsarka orbitalna	Stovall Life Science Inc.
wytrząsarka do mikropłytek; MTS 2/4 Digital	IKA Works, inc.
zautomatyzowana 96-dołkowa obsługa cieczy; Płyn do obsługi Biomek FX	Zautomatyzowana
; Pipet stołowy	Sorenson Bioscience, inc.
Ręczne pipety wielokanałowe 8 lub 12	Używamy Rainin&Hellip;
przezroczysta 96-dołkowa pokrywa filmowa; Folia optyczna TempPlate RT	USA Naukowa
wirówka stołowa; Wirówka 5810 R	Eppendorf