Method Article

Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

DOI:

10.3791/56893

⸱

January 31st, 2018

 ,  ,  , 
1Research & Development, LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory, LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research, University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości w szpitalnych bankach krwi. Celem jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych od nieaktywowanych, aby zoptymalizować wykorzystanie płytek krwi. Dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi pacjentom hematologicznym i onkologicznym może zmniejszyć ich wysokie ryzyko wystąpienia oporności na krwiożerczość.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości dla szpitalnych banków krwi. Komórki rozdrabniają mikrocząstki (MP), gdy są naprężone. Krew i składniki krwi mogą zawierać fragmenty komórkowe z różnych komórek, w szczególności z aktywowanych płytek krwi. Pełniąc swoje role jako wrodzone komórki odpornościowe i główni gracze w krzepnięciu i hemostazie, płytki krwi zmieniają kształt i wytwarzają mikrocząsteczki. Dzięki detekcji mikrocząstek opartej na dynamicznym rozpraszaniu światła (DLS) możliwe jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych (o wysokiej zawartości mikrocząstek) od nieaktywowanych (o niskiej zawartości mikrocząstek) w transfuzjach i zoptymalizowanie wykorzystania tego rzadkiego produktu krwiopochodnego. Wcześniejsze badania sugerują, że dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi do stosowania profilaktycznego u pacjentów hematologiczno-onkologicznych może zmniejszyć ryzyko wystąpienia oporności na leczenie i poprawić opiekę nad pacjentem. Celem tej metody badań przesiewowych jest rutynowe różnicowanie płytek krwi aktywowanych i nieaktywowanych. Opisana tutaj metoda przedstawia kroki, które należy wykonać w celu rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi w szpitalnym banku krwi: uzyskanie próbki z transfuzji płytek krwi, załadowanie próbki do kapilary w celu pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząstek oraz wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząstek do identyfikacji aktywowanych płytek krwi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zainteresowanie mikrocząstkami skupiało się głównie na ich udziale w komunikacji międzykomórkowej i procesach biologicznych. 1,2,3 Ostatnio mikrocząsteczki wzbudziły zainteresowanie jako potencjalne wczesne markery diagnostyczne chorób autoimmunologicznych i sercowo-naczyniowych. 4,5 Mikrocząsteczki, znane również jako pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub egzosomy, były szeroko badane za pomocą cytometrii przepływowej. Niestety, pomimo wysiłków zmierzających do standaryzacji konwencjonalnych protokołów cytometrii przepływowej, nie ma konsensusu co do optymalnego protokołu, który należy zastosować. 6,7,8,9,10

Chociaż konwencjonalna cytometria przepływowa może charakteryzować określone subpopulacje MP,11 ma kilka zgłoszonych ograniczeń. 11,12,13,14 Niektóre z tych ograniczeń zostały rozwiązane poprzez użycie laserów i detektorów o większej mocy w tak zwanej "opcji małych cząstek",15,16, a także wykrywanie pod kątem rozproszenia 15°-25° do przodu i zmodyfikowany nacisk na osłonę. 17,18 Niemniej jednak, szybka i łatwa w użyciu metoda przesiewowa, którą można połączyć z tymi wyrafinowanymi metodami, jest nadal potrzebna do wykorzystania mikrocząsteczek jako wczesnych markerów diagnostycznych. Podwyższony poziom mikrocząsteczek jest wykrywalny u około jednej trzeciej zdrowych dawców krwi19 i może wskazywać na stany subkliniczne. W związku z tym wysoki poziom mikrocząstek w oddanych produktach krwiopochodnych może być niezgodny z wymaganiami biorców. 20

Podczas transfuzji płytek krwi istnieje ryzyko nieimmunologicznej oporności - stanu, w którym ciało pacjenta odrzuca kolejne transfuzje i nie pozwala na krążenie znacznej części płytek krwi. 21,22 Oporność na uszkodzenia może prowadzić do marnotrawstwa transfuzji, komplikacji zdrowotnych u pacjentów i przedłużających się pobytów w szpitalu. 23 Transfuzje płytek krwi zawierające dużą liczbę mikrocząsteczek mogą być czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju oporności na działanie układu immunologicznego u wrażliwych pacjentów hematologiczno-onkologicznych. 20 Możliwe jest zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi zgodnie ze składem transfuzji płytek krwi poprzez badania przesiewowe na obecność mikrocząstek, zmniejszając w ten sposób ryzyko dla wrażliwych pacjentów. Jednak większość testów mikrocząstek wymaga izolacji mikrocząstek z płytek krwi5,12 lub są w inny sposób bardzo pracochłonne24,25 i dlatego nie mogą być stosowane rutynowo w szpitalnych bankach krwi.

Opisana tutaj technika wykorzystuje dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) - znane również jako spektroskopia korelacji fotonów lub quasi-elastyczne rozpraszanie światła. Przez dziesięciolecia dynamiczne rozpraszanie światła było szeroko stosowane w przemyśle farmaceutycznym do charakteryzowania liposomalnych preparatów leków lub emulsji, w których rozmiary cząstek mieszczą się w zakresie submikronowym. 26,27 Jednak narzędzia opracowane dla tych zastosowań nie są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych produktów krwiopochodnych. Nowy system DLS został opracowany w celu przezwyciężenia ograniczeń technicznych i wykorzystania dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych transfuzji płytek krwi. 28

Dynamiczne pomiary rozpraszania światła są wykonywane poprzez oświetlanie zawieszonych cząstek światłem laserowym i analizowanie zmian w czasie intensywności rozproszonego światła, które są konsekwencją cząstek poruszających się w zawieszeniu. Co więcej, metoda ta wykorzystuje odwrotną zależność między prędkością a wielkością cząstek - małe cząstki poruszają się szybko, a duże cząstki poruszają się wolno - w celu dostarczenia informacji o rozkładach wielkości i względnych stężeniach składników próbki. Za pomocą DLS można określić ilościowo średnią zawartość mikrocząstek i średni promień składnika mikrocząstek. Zawartość mikrocząstek w produkcie krwiopochodnym jest podawana jako %MP na podstawie pola na zmierzonym histogramie dla promieni cząstek od 50 do 550 nm. Podczas gdy cząstki o promieniu poniżej 50 nm są wykrywane przez DLS i raportowane przez system DLS, nie są one uwzględniane w %MP. Zamiast izolować mikrocząstki z płytek krwi, niejednorodność transfuzji płytek krwi określa się na podstawie względnej zawartości mikrocząstek i płytek krwi w próbce. W rzeczywistości stosunek pików płytek krwi i mikrocząstek można wykorzystać do obliczenia bezwzględnego stężenia MP, gdy znana jest liczba płytek krwi. 19

System DLS dostarcza pracownikom służby zdrowia jakościowych i ilościowych informacji o mikrocząsteczkach znalezionych w próbkach pochodzących z ludzkiej krwi lub produktów krwiopochodnych. Główną przewagą opisanej techniki DLS nad technikami alternatywnymi, takimi jak cytometria przepływowa, mikroskopia elektronowa,29 nanoparticle tracking analysis30 lub tunable resistive pulse sensing31 jest przygotowanie próbki: podwielokrotności koncentratów płytek krwi mogą być mierzone bezpośrednio, bez konieczności izolowania MP od płytek krwi, rozcieńczania próbki lub innych modyfikacji. 9,17 Ponadto DLS jest bezwzględną metodą wymiarowania i nie cierpi z powodu braku koralików kalibracyjnych o odpowiednim współczynniku załamania. 14,32

Korelacja między aktywacją płytek krwi a zawartością MP została wcześniej wykazana przez mikroskopię33,20 i można ją wywnioskować ze wzrostu zawartości MP w stanach patologicznych15,34,35,36 i w warunkach in vitro, o których wiadomo, że aktywują płytki krwi. 19,37,38 Potrzebne są jednak dalsze badania, aby w pełni zrozumieć związek między zawartością mikrocząstek mierzoną przez DLS a aktywacją płytek krwi. Opierając się na naszej obecnej wiedzy, że aktywowane płytki krwi zawierają dużą liczbę mikrocząstek, najlepiej stosować je w leczeniu pacjentów z aktywnym krwawieniem39, podczas gdy pacjenci hematologiczno-onkologiczni odnoszą korzyści z nieaktywowanych płytek krwi bez mikrocząstek lub z niskim poziomem mikrocząstek20. Niedawno doniesiono, że reakcja płytek krwi dawcy w warunkach in vitro nie wpłynęła znacząco na regenerację i przeżycie tych płytek krwi w pojedynczych transfuzjach u stabilnych, w większości niekrwawiących pacjentów hematologiczno-onkologicznych40. Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że aktywacja płytek krwi identyfikowana przez wysoką zawartość MP również nie odgrywa istotnej roli w leczeniu profilaktycznym pacjentów. Jednak ze względu na wąski wybór pacjentów, badanie to nie dotyczyło wpływu czynników dawcy na pacjentów ze złożonym stanem gorączkowym, niestabilnych i otrzymujących więcej niż jedną transfuzję płytek krwi. Pytanie, w jaki sposób można zmniejszyć złożoność tych przypadków pacjentów, co daje nadzieję na zmniejszenie ogniotrwałości, pozostaje bez odpowiedzi.

Mikrocząsteczki są wczesnymi markerami stanu zapalnego41,42,43,44 i aktywacja płytek krwi45 i dlatego są wykrywane u wielu normalnych dawców. 19 W związku z tym, aktywowane płytki krwi i mikrocząsteczki są obecne w dawstwie płytek krwi. Uzasadnione jest postawienie hipotezy, że pacjenci z gorączką, tj. w pełni aktywowanym wrodzonym układem odpornościowym, nie mogą tolerować dodatkowego wyzwania, jakim jest transfuzja aktywowanych płytek krwi. Potrzebne są jednak badania, aby udowodnić tę hipotezę. Badania przesiewowe mikrocząsteczek mogą zmniejszyć obecną niepewność co do zawartości transfuzji płytek krwi i zmniejszyć złożoność leczenia pacjentów.

Stosunek aktywowanych do nieaktywowanych płytek krwi w szpitalnym banku krwi zależy przede wszystkim od populacji dawców, a w znacznie mniejszym stopniu od transportu, napromieniania, inaktywacji patogenów i innych procesów, które mogą zwiększyć aktywację płytek krwi w koncentratach. 19 Dane z głównych szpitalnych banków krwi w Stanach Zjednoczonych wykazały, że średni skład inwentarza płytek krwi jest w 49% aktywowany i w 51% nieaktywowany (zakres dla aktywowanych płytek krwi: 38 - 62%, komunikacja osobista). Jeśli dostawcy produktów krwiopochodnych lub szpitalne banki krwi chcą wiedzieć, ile aktywowanych i nieaktywowanych koncentratów płytek krwi produkują lub otrzymują, a także chcą zarządzać swoimi zapasami w oparciu o aktywację płytek krwi zgodnie z zawartością mikrocząstek, ten protokół może być dla nich odpowiedni.

Na podstawie składu płytek krwi szpitalny bank krwi będzie mógł skierować nieaktywowane, jednorodne płytki krwi do użytku profilaktycznego oraz aktywowane, heterogenne płytki krwi do użytku terapeutycznego. Badania przesiewowe płytek krwi pozwalają szpitalom zmaksymalizować wykorzystanie dostępnych zapasów, co poprawia opiekę nad pacjentem i obniża koszty. Protokół ten jest przeznaczony dla personelu laboratoryjnego, który jest zaznajomiony z podstawową obsługą i manipulacją produktami krwiopochodnymi.

Przedstawiona tutaj jest metoda przesiewowa dla mikrocząsteczek w transfuzjach płytek krwi, która może być rutynowo stosowana do zarządzania zapasami szpitalnego banku krwi, gdzie wybór produktu na podstawie zawartości mikrocząstek jest pożądany. Celem niniejszego protokołu jest nakreślenie wdrożenia i oceny DLS do badań przesiewowych dawczyń krwi. Opisany protokół odpowiada na często zadawane pytania dotyczące nieinwazyjnego dostępu do próbek, integracji testów z przepływem pracy banku krwi oraz charakterystyki wydajności.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół został przeprowadzony zgodnie ze wszystkimi wytycznymi Kanadyjskiej Służby Krwi (CBS). Ochotnicy wyrazili zgodę, że ich darowizny mogą zostać wykorzystane do przeprowadzenia tych badań. Koncentraty płytek krwi przygotowano zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi CBS. Wszystkie opisane tutaj testy wydajności zostały przeprowadzone w Centrum Badań Krwi na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie za zgodą instytucjonalnej Rady Etyki Badań Naukowych.

1. Kontrola jakości

  1. Przeprowadzaj kontrolę jakości co najmniej raz na dzień testowy, aby zweryfikować prawidłowe działanie systemu DLS. Zmierz dostarczone kulki kontrolne (promień 50 nm) zgodnie z instrukcją użytkowania producenta.
  2. Wyjąć fiolkę kontrolną z chłodni i odczekać 15 minut, aby ogrzać się do temperatury pokojowej. Przed użyciem koraliki muszą osiągnąć temperaturę pokojową.
  3. Włącz system DLS przed przygotowaniem próbki, tak aby 15-minutowy okres nagrzewania lasera zakończył się, zanim pierwsza próbka będzie gotowa do badania.
  4. Po uruchomieniu konsoli postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie dotykowym, aby się zalogować i wybierz opcję Test systemu, aby zmierzyć próbkę kontrolną.
  5. Mieszać fiolkę wirowo przez 10 s, aby uzyskać reprezentatywną próbkę.
  6. Napełnij kapilarę kulkami kontrolnymi za pomocą pipety o stałej objętości 100 μl, końcówki pipety i kapilary z zestawu testowego.
  7. Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie systemu DLS.
    UWAGA: Wyniki testu stopki kontrolnej są automatycznie porównywane z informacjami zapisanymi na etykiecie z kodem kreskowym stopki kontrolnej, a powiadomienie o wyniku pozytywnym lub negatywnym oraz informacje o próbce są wyświetlane na ekranie systemu DLS po zakończeniu testu.

2. Pobieranie próbki z koncentratu płytek krwi

UWAGA: Te kroki opisują proces nieinwazyjnego pobierania próbek z transfuzji płytek krwi do kapilarni testowej DLS w celu rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi. Przegląd jest pokazany w Rysunek 1. Wymagane akcesoria: zgrzewarka do tub, ręczny ściągacz izolacji, nożyczki i osłona przeciwbryzgowa.

  1. Usunąć koncentrat płytek krwi z nieprzetestowanego inwentarza.
  2. Pobrać próbkę produktu płytkowego z nieużywanego woreczka do pobierania próbek (przejść do kroku 2.3) lub segmentu rurki (przejść do kroku 2.4, jeśli jest pusty, lub kroku 2.5, jeśli nie jest pusty).
    Aby odłączyć rurkę woreczka lub segment rurki, użyj zgrzewarki do rur. Aby uruchomić zgrzewarkę do tub, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, zaciśnij rurkę, która ma być uszczelniona, w precyzyjnej pozycji między dwiema rozgrzanymi szczękami. W urządzeniu przenośnym należy ścisnąć stopione rurki i schłodzić pod wysokim ciśnieniem, jednocześnie naciskając dźwignię (czas trwania jest wskazywany przez zielone światło), co skutkuje trwałym, szczelnym uszczelnieniem.
  3. Pobieranie próbek z torebki
    1. Dobrze wymieszaj zawartość worka płytkowego, delikatnie przesuwając się w poziomie przez 5 sekund (pięciokrotnie przechylając się od końca do końca).
    2. Otwórz zacisk do woreczka. Worek jest ewakuowany i sam się napełni. Nie jest konieczne całkowite napełnienie torebki, ponieważ do badania DLS wymagane będzie tylko 100 μl próbki.
    3. Odłącz woreczek od worka, zgrzewając rurkę łączącą za pomocą zgrzewarki do rurek. Przejdź do kroku 3.
  4. Pobieranie próbek z pustych przewodów rurowych
    1. Sprawdzić, czy rurka worka płytkowego była przechowywana pusta, a blok rurki jest nadal na swoim miejscu. Sprawdź wzrokowo rurkę, aby upewnić się, że nie ma w niej znacznej ilości koncentratu płytek krwi. Jeśli rurka nie jest pusta, przejdź do kroku 2.5.
    2. Zamknij ściągacz izolacji na wężyku jak najbliżej bloku rurki, ściskając uchwyty, aby ścisnąć rurkę między rolkami.
    3. Zawieś torbę pionowo i ściskaj uchwyty strippera.
    4. Trzymając ściągacz izolacji w pozycji zamkniętej, zwolnij blok rurki.
    5. Powoli pociągnij ściągacz izolacji w dół pustej rurki, pozwalając, aby rurka powoli napełniała się za striptizerką. Kontynuuj, aż sekcja poniżej ściągacza izolacji zostanie całkowicie napompowana lub do momentu, gdy ściągacz znajdzie się w odległości nie większej niż 1 cal od końca rurki.
    6. Po osiągnięciu punktu zatrzymania za pomocą ściągacza izolacji, użyj zgrzewarki do rur, aby uszczelnić rurkę na gorąco 1 cal nad ściągaczem izolacji.
    7. Zwolnij uchwyty ręcznego ściągacza izolacji.
    8. Ponownie zgrzewaj 1 do 2 cali powyżej poprzedniej uszczelki, aby utworzyć segment testowy.
    9. Odciąć segment testowy od jednostki płytek krwi. Ten segment będzie używany do testowania DLS.
  5. Pobieranie próbek z przewodów, które nie są puste
    1. Zawieś torbę pionowo i zwolnij blok rurki, jeśli jest na swoim miejscu.
    2. Sprawdź wzrokowo rurkę, aby ustalić, czy nie ma znacznych stałych grudek. Jeśli istnieją stałe grudki, uszczelnij je nad nimi tak, aby nie można było ich wedrzeć do worka.
    3. Zamknij ściągacz izolacji na wężyku jak najbliżej uszczelnionego końca rurki.
    4. Zbierz zawartość rurki do worka, ściskając uchwyty, aby ścisnąć rurkę między rolkami i, zachowując siłę zacisku, przesuwaj ściągacz izolacji wzdłuż rurki w kierunku worka.
    5. Wyjmij worek płytkowy z haczyka do zawieszania i delikatnie mieszaj worek przez 5 sekund, przechylając go od końca do końca pięć razy, trzymając striptizerkę zamkniętą.
    6. Zawieś torbę pionowo, trzymając striptizerkę zamkniętą.
    7. Powoli pociągnij ściągacz izolacji w dół pustego wężyka, pozwalając, aby rurka powoli wypełniała się za stripperem. Kontynuuj, aż sekcja poniżej ściągacza izolacji zostanie całkowicie napompowana lub do momentu, gdy ściągacz znajdzie się w odległości nie większej niż 1 cal od końca rurki.
    8. Po osiągnięciu punktu zatrzymania za pomocą ściągacza izolacji, użyj zgrzewarki do rur, aby uszczelnić rurkę na gorąco 1 cal nad ściągaczem izolacji.
    9. Zwolnij zdzierak.
    10. Ponownie zgrzewaj 1 do 2 cali powyżej poprzedniej uszczelki, aby utworzyć segment testowy.
    11. Odetnij i wyrzuć ostatnią część rurki.
    12. Odciąć segment testowy od jednostki płytek krwi. Ten segment będzie używany do testowania DLS.

3. Napełnianie próbki do kapilary testowej DLS

  1. Używając osłony przeciwbryzgowej i czystych, suchych nożyczek, odetnij jeden koniec rurki woreczka lub segmentu testowego.
    UWAGA: Kapilarę używaną do testowania DLS należy natychmiast napełnić.
  2. Napełnij kapilarę za pomocą narzędzia do pobierania próbek (zmontowana pipeta o stałej objętości 100 μl, końcówka pipety i kapilara) w celu pobrania próbki bezpośrednio z otwartej torebki lub segmentu rurki do kapilary.
  3. Uszczelnij dno napełnionej kapilary, delikatnie wciskając wypełnioną kapilę w uszczelniacz rurki kapilarnej, jednocześnie delikatnie skręcając i wywierając pewien nacisk na tackę.
  4. Odłączyć pipetę i końcówkę o stałej objętości 100 μl od kapilary, upewniając się, że kapilara pozostaje mocno osadzona w uszczelniaczu rurki kapilarnej.
  5. Wyjmij kapilę z tacki na uszczelniacz rurki kapilarnej, przetrzyj wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym i upewnij się, że nie utknęły żadne pęcherzyki powietrza, delikatnie przesuwając spód kapilary.
  6. Umieść kapilarnę w systemie DLS.

4. Przeprowadzanie testu DLS

  1. Wybierz opcję Test MP, aby zainicjować nowy test DLS do pomiaru zawartości mikrocząstek w próbce płytek krwi.
  2. Wprowadź informacje o próbce (numer identyfikacyjny darowizny (ISBT), datę ważności pobrania/produkcji i kod produktu) za pomocą skanera kodów kreskowych lub ręcznie.
  3. Jeśli nie jest dostępny kod produktu, z którego system DLS może wyodrębnić informacje o podłożu płynnym, należy ręcznie wybrać odpowiednie podłoże płynne (w przypadku większości koncentratów płytek krwi należy wybrać osocze, ale w przypadku próbek zawierających roztwór dodatku płytek krwi (PAS) należy wprowadzić procentową zawartość pozostałego osocza).
    UWAGA: Niewielkie odchylenie procentu PAS od nominalnych 65% spowoduje mały błąd lepkości (automatycznie obliczany przez system DLS), który w minimalnym stopniu wpływa na obliczony promień MP, ale nie %MP.
  4. Umieść kapilarnę w systemie DLS zgodnie z instrukcją i rozpocznij test.
  5. Po zakończeniu testu wyjmij próbkę z uchwytu kapilarnego i zutylizuj materiały eksploatacyjne w odpowiedni sposób, zgodnie z wytycznymi zakładu. Wyjmij próbkę z uchwytu kapilarnego i zutylizuj materiały eksploatacyjne w odpowiedni sposób, zgodnie z wytycznymi zakładu.
  6. Oznacz worek płytkowy kolorem odpowiadającym wynikowi, na przykład pomarańczowym dla nieaktywowanych (jednorodnych) z %MP równym lub mniejszym niż 15% i różowym dla aktywowanych (niejednorodnych) z %MP powyżej 15%.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd metody. Przegląd kroków, które należy wykonać w celu rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi w szpitalnym banku krwi: uzyskanie próbki z koncentratu płytek krwi, załadowanie próbki do kapilary w celu pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząstek i wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząstek do identyfikacji aktywowanych płytek krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Średni czas przygotowania
Proces badań przesiewowych płytek krwi przy użyciu systemu DLS jest podsumowany w Rysunek 1. Płytki krwi są badane za pomocą systemu DLS w momencie otrzymania od dawcy krwi. Jak wyszczególniono w tabeli 1, średni czas przygotowania dla przeszkolonych użytkowników wynosi 2 min 23 s, podczas gdy czas pracy związanej z czyszczeniem i posttestem wynosi odpowiednio 14 s i 46 s. W sumie przeciętny użytkownik potrzebuje 3 minuty i 23 sekundy czasu praktycznego na test.

aktywność Aktywny czas Czas testu po odejściu łączny Przygotowanie systemu DLS 14 sekund Zmontuj narzędzie do pobierania próbek 28 sekund Uzyskiwanie segmentu 52 sekundy Napełnij kapilar i rozpocznij test 49 sekund Czas trwania: 5 min Sprzątanie 14 sekund Przywieszka i inwentaryzacja worka na płytki krwi 46 sekund Całkowity czas potrzebny na próbkę 3 min 23 s Czas trwania: 5 min 8 min 23 s

Tabela 1: Podział czasu aktywnego testowania. Sam test jest testem odejścia, którego średni czas trwania wynosi 5 minut. Przeciętny użytkownik potrzebuje 3 min 23 s na przygotowanie systemu DLS do testu, pobranie i przetestowanie próbki zgodnie z tym protokołem oraz oznaczenie worka płytkowego.

Precyzja
Precyzja systemu DLS została oceniona na trzech poziomach mikrocząstek: 0-7%, 12-25% i 28-75%. Klinicznie istotny zakres %MP wynosi od 3 do 75%. Dwóch operatorów testowało niskie, średnie i wysokie próbki kontrolne przez 16 dni roboczych na dwóch równoległych systemach DLS. Próbki były badane dwukrotnie, ale w kolejności losowej w każdym dniu testów.

Tabela 2 podsumowuje precyzję pomiarów DLS w urządzeniu dla procentu mikrocząstek (%MP) w stosunku do płytek krwi.

Zawartość mikrocząsteczek niski Średni wysoki Średnia %MP (%) 4.4 19,5 53,8 pkt. Odchylenie standardowe (%) 1.8 2.6 5,8 CV (%) 40,4 pkt. Rozdział 13,2 Rozdział 10.6

Tabela 2: Precyzja procentowa mikrocząstek (%MP) w urządzeniu. Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząstek małe płytki krwi mogą przyczyniać się do %MP, co skutkuje zwiększoną zmiennością w przypadku próbek o niskiej zawartości mikrocząstek.

Tabela 3 pokazuje precyzję pomiarów DLS wewnątrz urządzenia dla średniego promienia mikrocząstek między 50-550 nm.

Zawartość mikrocząsteczek niski Średni wysoki Średni promień (nm) Okręg wyborczy 331 TGL 161 szt. Rozdział 188 Odchylenie standardowe (mm) Rozdział 133 Rozdział 41 25 CV (%) 40,1 pkt. Dnia 25,2 Rozdział 13,5

Tabela 3: Precyzja promienia mikrocząstek w urządzeniu. Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząstek małe płytki krwi mogą przyczyniać się do procentu mikrocząstek (%MP), co skutkuje zwiększoną zmiennością w przypadku próbek o niskiej zawartości mikrocząstek.

Tabela 4 pokazuje odtwarzalność pomiarów DLS dla procentu mikrocząstek (%MP).

Zawartość mikrocząsteczek niski Średni wysoki Średnia %MP (%) 4.4 Pytanie 29,2 53,6 pkt. Odtwarzalność (%) 1,5 2.3 5 CV (%) 35 Rozdział Rozdział 11,8 Pytanie 9,4

Tabela 4: Odtwarzalność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) dla procentu mikrocząstek (%MP).

Liniowość
Rysunek 2 pokazuje, że wyniki DLS są liniowe, tzn. pasują do linii prostej w stosunku do przypisanych wartości próbek. Przygotowano siedem próbek o różnej zawartości mikrocząstek. Próbki o wysokiej (MP7) i niskiej (MP1) zawartości mikrocząstek oraz odpowiadającym im stężeniu płytek krwi przygotowano i zmieszano w różnych proporcjach w celu utworzenia próbek pośrednich (MPx). Próbki przetestowano za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej19, a wyniki DLS i %MP dla każdego stężenia zostały wykreślone jako wejście i wyjście. Stwierdzono, że współczynnik determinacji wynosi 0,985. Przykłady histogramów DLS dla niskiej i wysokiej zawartości mikrocząstek są pokazane w Rysunek 3A. Wyniki DLS zostały potwierdzone za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3B).

figure-results-1
Rysunek 2: Porównanie wyników cytometrii przepływowej i DLS.Liniowa zależność między %MP wyznaczona przez cytometrię przepływową (wejście) a DLS (wyjście), oryginalne dane DLS z dwóch próbek oznaczonych symbolem otwartym ○ są pokazane w Rysunek 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Zawartość mikrocząsteczek do rozróżnienia między aktywowanymi i nieaktywowanymi płytkami krwi. orazWyniki DLS dotyczące zawartości MP w aktywowanych płytkach krwi (linia przerywana) wyniosły 57% w porównaniu do 4% w przypadku płytek krwi nieaktywowanych (linia ciągła). Testy przeprowadzono w temperaturze pomiaru 37 °C, ustawieniu lepkości osocza 1,06 x10-3 Pa·s i całkowitym natężeniu w zakresie 200-600 kHz. (B) Wyniki cytometrii przepływowej (uzyskane zgodnie z opisem wcześniej19) tych samych próbek, jak pokazano w (A); w histogramach rozproszenia do przodu P1 i P2 reprezentują odpowiednio MP i bramki płytkowe; w przypadku aktywowanych płytek krwi (po lewej) 76% zdarzeń wpadło do bramki MP w porównaniu z 6% w przypadku nieaktywowanych płytek krwi (po prawej). Linia regresji liniowej sugeruje stały względny udział szumu tła w %MP za pomocą cytometrii przepływowej, co prowadzi do konsekwentnie wyższych wyników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Specyficzność/Interferencja
Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (ISO) definiuje specyficzność analityczną jako zdolność procedury pomiarowej do wykrywania lub mierzenia tylko wielkości mierzonej, podczas gdy w próbce obecne są inne wielkości. Na swoistość analityczną badań przesiewowych mikrocząstek mogą mieć wpływ czerwone krwinki (RBC). DLS mierzy zawartość MP w stosunku do zawartości płytek krwi. Erytrocyty mogą zakłócać, ponieważ udział krwinek czerwonych w rozpraszaniu jest uwzględniony w udziale rozpraszania płytek krwi, co zmniejsza względny udział MP. Istnieją regulacyjne limity dopuszczalnej zawartości krwinek czerwonych w produktach krwiopochodnych; zachowawcza konwersja progu zalecanego przez AABB dla dopuszczalnego stężenia RBC w koncentratach płytek krwi – 2 ml upakowanych RBC w jednej jednostce płytek krwi – dała wynik 8,0x10 10 komórek/L (założenia: objętość RBC wynosi 8,5 x10-14 L, hematokryt upakowanych RBC wynosi 68%, objętość jednostki płytek krwi wynosi 200 ml). Zgłoszone resztkowe stężenia RBC w różnych produktach są znacznie poniżej tego progu46.

Trzech różnych dawców oddało płytki krwi i czerwone krwinki (RBC) w dwóch różnych dniach, jako uprawnieni, do trzech niezależnych eksperymentów. Początkowa zawartość erytrocytów czerwonych w koncentratach płytek krwi (próbka referencyjna) wynosiła 0,05 - 0,15 x109 komórek/l oznaczona hemocytometrem. Pięć dodatkowych próbek utworzono poprzez wprowadzenie znanych ilości RBC do podwielokrotności koncentratu płytek krwi; docelowe poziomy RBC w tych próbkach wynosiły 1,0, 5,0, 10, 40 i 80 x109 komórek/l.

Próg interferencji czerwonych krwinek wynosił około 1,0x10 10 komórek/L (Rysunek 4), co również korelowało z poziomem, przy którym obecność czerwonych krwinek była wizualnie widoczna (Rysunek 5). Powyżej tego poziomu %MP był niedoszacowany, co oznacza, że w wizualnie czerwonych próbkach - które zawierają RBC, a nie hemoglobinę - podawana zawartość mikrocząstek będzie zbyt niska.

figure-results-3
Rysunek 4: Liniowa zależność między %MP (DLS) a stężeniem RBC (komórki/L).Zwiększenie stężenia erytrocytów o 0,1 x109, 1,0 x109, 5,0 x109, 1,0 x1010, 4,0 x1010 i 8,0x10 10 komórek/L (od lewej do prawej) z 3 niezależnych eksperymentów (○ eksperyment 1, ● eksperyment 2 □ eksperyment 3, linie regresji liniowej są pokazane dla każdego eksperymentu). Powyżej 1,0 x1010 RBC/L prowadzi do niedoszacowania %MP. Wygląd próbek zawierających RBC jest pokazany na Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Wygląd próbek RBC zawierających.Zaczerwienienie próbek płytek krwi zawierających stężenia RBC 0,1 x109, 1,0 x109, 5,0 x109, 1,0x10 10, 4,0 x1010 i 8,0x10 10 komórek/L od lewej do prawej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dokładność
Dokładność definiuje się jako różnicę między pojedynczym wynikiem pomiaru a rzeczywistą wartością ilości przypisaną do próbki. Ten błąd pomiaru obejmuje składową systematyczną oszacowaną na podstawie błędu systematycznego pomiaru oraz składową losową oszacowaną na podstawie odchylenia standardowego. Tak więc dokładność wyniku pomiaru jest połączeniem poprawności i precyzji.

Do określenia dokładności testu DLS użyto standardu koralików. Dokładność oceniano przy dwóch stężeniach w klinicznie istotnym zakresie testu wynoszącym 3 - 75% MP. Do przygotowania próbek o znanych stężeniach użyto mieszanin kulek referencyjnych, ponieważ kulki referencyjne mają znaną wielkość i stężenie. W związku z tym kulki referencyjne można mieszać w celu uzyskania próbek o pożądanych rozmiarach i stężeniach cząstek.

Standardowe kulki polistyrenowe o promieniu 125 nm były używane do reprezentowania mikrocząstek, a kulki o promieniu 1,5 μm były używane do reprezentowania płytek krwi. Dokładność testu mikrocząstek oceniano za pomocą mieszanin kulek o zawartości około 20% i 50% MP. Dokładność zmierzonych promieni cząstek porównano z promieniami cząstek udokumentowanymi w świadectwach analizy dla kulek odniesienia, jak pokazano w tabeli 5.

koraliki 125 nm 1,5 μm koraliki Certyfikat Analizy Certyfikat Analizy 20% PM 50% PM 20% PM 50% PM Średni promień 122,0 szt. 113,8 pkt. 124,4 pkt. 1,5 1.6 Godzina 1,60 Standardowe odchylenie od dewelopera Rozdział 4.5 Godzina 2,83 3.6 0,035 pkt. 0,06 0,07 pkt. CV 3,60% 2,48% 2,89% 2,20% 3,74% 4,05% dokładność 6,70% 2,00% 6,50% 6,30%

Tabela 5: Dokładność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Porównanie wielkości dla wyników DLS z certyfikatem analizy dla kulek o promieniu 125 nm i promieniu 1,5 μm w mieszaninach.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych mikrocząstek, zoptymalizowaną pod kątem wysokich stężeń cząstek występujących w próbkach biologicznych, takich jak koncentraty płytek krwi. Metoda DLS jest z natury ustandaryzowana w celu dokładnego pomiaru rozmiaru. Względne stężenie mikrocząstek można przekształcić w stężenie bezwzględne, jeśli stężenie płytek krwi jest znane, a powierzchnia piku płytkowego jest używana jako pik odniesienia19. Ponieważ stężenia płytek krwi są zwykle uzyskiwane za pomocą analizatorów hematologicznych lub cytometrów przepływowych, metody te można uznać za technologie towarzyszące DLS.

Funkcjonalność systemu DLS jest zapewniona poprzez regularne uruchamianie koralików kontrolnych. Wodę destylowaną można zmierzyć, aby sprawdzić, czy hałas tła jest minimalny. Dostępne na rynku wzorce płytek krwi mogą być analizowane jako kontrole ujemne MP, a po dodaniu kulek o promieniu 125 nm jako kontrole dodatnie MP. W biologicznym zakresie stężeń MP będących przedmiotem zainteresowania, procedury są praktyczne i szybkie do wykonania w ramach rutynowej pracy banku krwi.

W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, metoda ta nie opiera się na porównaniu intensywności rozpraszania cząstek, ale raczej na prędkości ich ruchu Browna. W ten sposób egzosomy mogą być również wykrywane pomimo ich niewielkich rozmiarów i są zgłaszane oddzielnie od MP.

Metoda ta, zaprojektowana jako narzędzie przesiewowe, wiąże się z jej niezdolnością do rozróżnienia różnych typów mikrocząstek. Istnieje potencjalne pole do poprawy, jeżeli zastosowane zostaną dodatkowe etapy izolacji; Próbki można testować przed i po specyficznym usunięciu mikrocząstek poprzez wychwytywanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami. Ponadto nie można założyć, że wszystkie wykryte mikrocząstki są pochodzenia komórkowego, ponieważ chylomikrony powstałe w hiperlipidemii47,48 oraz małe bakterie lub wirusy6 zostaną również zgłoszone w zakresie mikrocząstek. Istnieją jednak inne zabezpieczenia w zakresie zaopatrzenia w krew, aby zapobiec przedostawaniu się do inwentarza szpitalnego banku krwi silnie lipemicznego lub zanieczyszczonych płytek krwi.

Wybór antykoagulantu w próbce wpływa na stopień aktywacji płytek krwi, a tym samym na zawartość MP49. W przypadku porównań różnych produktów należy wziąć pod uwagę ten czynnik. Ponadto wymiana osocza na pożywki zawiesinowe wolne od MP, takie jak PAS, wpłynie na zawartość MP i próg oznaczania niejednorodności - jeśli tylko około jedna trzecia pierwotnej zawartości MP pozostanie w osoczu resztkowym w koncentracie, odpowiednio niższy próg zawartości MP będzie wskazywał na taki sam poziom aktywacji płytek krwi, jak w 100% osoczu. Procent MP to zawartość MP w stosunku do płytek krwi. Wcześniej informowano, że średnia liczba płytek krwi w produkcie PAS była niższa, tak że średni %MP nadal wynosił 9,5%19. Próg %MP dla płytek krwi PAS zarejestrowanych w USA jest obecnie ustawiony na 10%.

Podczas gdy głównym źródłem MP w koncentratach płytek krwi jest dawca, procesy, które powodują stres u płytek krwi, zwiększą poziom MP w zależności od podatności płytek krwi na stres - jeśli płytki krwi są już silnie aktywowane, drobne czynniki stresogenne, takie jak wydłużony okres przydatności do spożycia, inaktywacja patogenów, mycie, napromienianie lub transport na duże odległości, mogą prowadzić do znacznego wzrostu zawartości MP. Wykazano, że żaden z tych czynników stresogennych nie wpływa znacząco na jednorodne, nieaktywowane płytki krwi19. Ponadto należy zwrócić uwagę na możliwość wystąpienia zmian w składzie próbki w obrębie kapilary, jeżeli nie zostanie ona przebadana natychmiast po przygotowaniu (zakończenie kroku 3 niniejszego protokołu).

Protokół ten koncentruje się na określeniu składu cząstek obecnych w transfuzjach płytek krwi i wykorzystaniu mikrocząstek jako biomarkerów aktywacji płytek krwi. Transfuzje płytek krwi są oznaczane jako nieaktywowane (pomarańczowy) lub aktywowane (różowe) w oparciu o próg procentowy mikrocząstek wynoszący 15%. Próg 15% MP dla płytek krwi w 100% osoczu określono empirycznie jako średni 66. percentyl z wielu miejsc.

Celem zarządzania zapasami płytek krwi w oparciu o rutynowe badania przesiewowe mikrocząsteczek za pomocą DLS jest poprawa opieki nad pacjentem i zwiększenie efektywności kosztowej poprzez zapobieganie nieimmunologicznej oporności na płytki krwi. Wdrożenie systemu DLS do badań przesiewowych worków płytkowych umożliwi użytkownikowi kierowanie nieaktywowanych płytek krwi do populacji pacjentów najbardziej narażonych na rozwój ogniotrwałości płytek krwi.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EMS jest założycielem LightIntegra Technology Inc., firmy produkującej urządzenia medyczne, która opracowała system ThromboLUX do badania jakości mikrocząstek i płytek krwi. Wszyscy pozostali autorzy są pracownikami firmy LightIntegra Technology. Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez LightIntegra Technology Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dawcom krwi i personelowi Centrum Rozwoju Stosowanego Kanadyjskiej Sieci Usług Krwiodawstwa za pobranie i produkcję jednostek płytek krwi używanych w tym badaniu. Dziękujemy Kanadyjskiej Fundacji Innowacji i Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem za finansowanie infrastruktury w Centrum Badań Krwi UBC. Finansowanie publikacji zapewniła firma LightIntegra Technology Inc., producent szczepionki ThromboLUX.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ThromboLUX-MLightIntegra Technology Inc. LPN120DLS System
Oprogramowanie ThromboSightLightIntegra Technology Inc. Oprogramowanie analityczne LPN124DLS
KapilaryLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Optinova MLE)LPN065Niestandardowa wytłaczana, nieaktywująca, niedwójnomocna rurka z tworzywa sztucznego, sprawdzona i napromieniowana
MiniPet LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca TriContinent Scientific)LPN082100 µ L pipeta o stałej objętości do pobierania próbek   
MicroFlex 1-200 i mikro; L Końcówki do pipetLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca ESBE Scientific)LPN080Końcówki do pipet do pobierania próbek
Critoseal LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Fisher Scientific)LPN075Uszczelniacz do rurek kapilarnych
Dukal Alcohol Pad lub równoważnyLightIntegra Technology Inc. (zawarty w zestawie testowym, dostawca Dukal Corp.)LPN085Podkładka izopropylowa (nasycona 70% alkoholem izopropylowym)
Koraliki kontrolne, promień 50 nmLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca PolySciences Inc.)LPN128Koraliki kontrolne
Mikrokulki NIST Identyfikowalny rozmiar cząstek Standardowy, 3 i mikro; mPolySciences Inc.64060Standardowe mikrokulki: 1,5 i mikro; m promień Koraliki polistyrenowe; zakres 1,43-1,58 i mikro; m; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nmPolySciences Inc.64014-15Standardowe nanokulki: promień 125 nm Kulki polistyrenowe; zakres 120 - 130 nm; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej
Genesis BPS RapidSeal II lub odpowiednikGenesis BPS428-SE640Zgrzewarka do tub
Fresenius Kabi Tube Stripper lub odpowiednikFresenius Kabi6R4452Ręczna maszyna do ściągania izolacji z tubek
Biohazard Shield - Cell Counter lub odpowiednikCardinalHealthS1389-75Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer lub odpowiednikCorning Incorporated6775Vortex mixer
FACSCanto II Cytometr przepływowy  z oprogramowaniem FACSDiva w wersji 6.1.3 lub równoważnymCytometr przepływowyBD Biosciences338960

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
  2. Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
  3. Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
  4. Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
  5. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
  6. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  7. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
  8. Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
  9. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  10. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  11. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 36-45 (2013).
  15. Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
  16. Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812(2015).
  17. Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
  18. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  19. Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
  20. Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
  21. Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
  22. Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
  23. Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
  24. Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
  25. Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
  26. Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
  27. Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
  28. Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
  29. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  30. Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
  31. Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
  32. Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
  33. Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
  34. Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
  35. Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293(2016).
  36. Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
  37. Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
  38. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  39. Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, Suppl 1 54-61 (2014).
  40. Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
  41. Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
  42. Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
  43. Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
  44. Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67(2011).
  45. Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
  46. Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
  47. Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
  48. Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779(2017).
  49. Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microparticle DetectionPlatelet TransfusionsDynamic Light ScatteringPlatelet ActivationBlood Bank ScreeningCapillary SamplingMicroparticle ContentPlatelet InventoryTransfusion MedicineDLS Testing

Related Articles