Artykuł metodologiczny

Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56893

⸱

31 stycznia 2018

 ,  ,  , 
1Research & Development, LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory, LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research, University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

W tym artykule

Podsumowanie

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości w szpitalnych bankach krwi. Celem jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych od nieaktywowanych, aby zoptymalizować wykorzystanie płytek krwi. Dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi pacjentom hematologicznym i onkologicznym może zmniejszyć ich wysokie ryzyko wystąpienia oporności na krwiożerczość.

Streszczenie

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości dla szpitalnych banków krwi. Komórki rozdrabniają mikrocząstki (MP), gdy są naprężone. Krew i składniki krwi mogą zawierać fragmenty komórkowe z różnych komórek, w szczególności z aktywowanych płytek krwi. Pełniąc swoje role jako wrodzone komórki odpornościowe i główni gracze w krzepnięciu i hemostazie, płytki krwi zmieniają kształt i wytwarzają mikrocząsteczki. Dzięki detekcji mikrocząstek opartej na dynamicznym rozpraszaniu światła (DLS) możliwe jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych (o wysokiej zawartości mikrocząstek) od nieaktywowanych (o niskiej zawartości mikrocząstek) w transfuzjach i zoptymalizowanie wykorzystania tego rzadkiego produktu krwiopochodnego. Wcześniejsze badania sugerują, że dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi do stosowania profilaktycznego u pacjentów hematologiczno-onkologicznych może zmniejszyć ryzyko wystąpienia oporności na leczenie i poprawić opiekę nad pacjentem. Celem tej metody badań przesiewowych jest rutynowe różnicowanie płytek krwi aktywowanych i nieaktywowanych. Opisana tutaj metoda przedstawia kroki, które należy wykonać w celu rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi w szpitalnym banku krwi: uzyskanie próbki z transfuzji płytek krwi, załadowanie próbki do kapilary w celu pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząstek oraz wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząstek do identyfikacji aktywowanych płytek krwi.

Wprowadzenie

Zainteresowanie mikrocząstkami skupiało się głównie na ich udziale w komunikacji międzykomórkowej i procesach biologicznych. 1,2,3 Ostatnio mikrocząsteczki wzbudziły zainteresowanie jako potencjalne wczesne markery diagnostyczne chorób autoimmunologicznych i sercowo-naczyniowych. 4,5 Mikrocząsteczki, znane również jako pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub egzosomy, były szeroko badane za pomocą cytometrii przepływowej. Niestety, pomimo wysiłków zmierzających do standaryzacji konwencjonalnych protokołów cytometrii przepływowej, nie ma konsensusu co do optymalnego protokołu, który należy zastosować. 6,7,8,9,10

Chociaż konwencjonalna cytometria przepływowa może charakteryzować określone subpopulacje MP,11 ma kilka zgłoszonych ograniczeń. 11,12,13,14 Niektóre z tych ograniczeń zostały rozwiązane poprzez użycie laserów i detektorów o większej mocy w tak zwanej "opcji małych cząstek",15,16, a także wykrywanie pod kątem rozproszenia 15°-25° do przodu i zmodyfikowany nacisk na osłonę. 17,18 Niemniej jednak, szybka i łatwa w użyciu metoda przesiewowa, którą można połączyć z tymi wyrafinowanymi metodami, jest nadal potrzebna do wykorzystania mikrocząsteczek jako wczesnych markerów diagnostycznych. Podwyższony poziom mikrocząsteczek jest wykrywalny u około jednej trzeciej zdrowych dawców krwi19 i może wskazywać na stany subkliniczne. W związku z tym wysoki poziom mikrocząstek w oddanych produktach krwiopochodnych może być niezgodny z wymaganiami biorców. 20

Podczas transfuzji płytek krwi istnieje ryzyko nieimmunologicznej oporności - stanu, w którym ciało pacjenta odrzuca kolejne transfuzje i nie pozwala na krążenie znacznej części płytek krwi. 21,22 Oporność na uszkodzenia może prowadzić do marnotrawstwa transfuzji, komplikacji zdrowotnych u pacjentów i przedłużających się pobytów w szpitalu. 23 Transfuzje płytek krwi zawierające dużą liczbę mikrocząsteczek mogą być czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju oporności na działanie układu immunologicznego u wrażliwych pacjentów hematologiczno-onkologicznych. 20 Możliwe jest zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi zgodnie ze składem transfuzji płytek krwi poprzez badania przesiewowe na obecność mikrocząstek, zmniejszając w ten sposób ryzyko dla wrażliwych pacjentów. Jednak większość testów mikrocząstek wymaga izolacji mikrocząstek z płytek krwi5,12 lub są w inny sposób bardzo pracochłonne24,25 i dlatego nie mogą być stosowane rutynowo w szpitalnych bankach krwi.

Opisana tutaj technika wykorzystuje dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) - znane również jako spektroskopia korelacji fotonów lub quasi-elastyczne rozpraszanie światła. Przez dziesięciolecia dynamiczne rozpraszanie światła było szeroko stosowane w przemyśle farmaceutycznym do charakteryzowania liposomalnych preparatów leków lub emulsji, w których rozmiary cząstek mieszczą się w zakresie submikronowym. 26,27 Jednak narzędzia opracowane dla tych zastosowań nie są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych produktów krwiopochodnych. Nowy system DLS został opracowany w celu przezwyciężenia ograniczeń technicznych i wykorzystania dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych transfuzji płytek krwi. 28

Dynamiczne pomiary rozpraszania światła są wykonywane poprzez oświetlanie zawieszonych cząstek światłem laserowym i analizowanie zmian w czasie intensywności rozproszonego światła, które są konsekwencją cząstek poruszających się w zawieszeniu. Co więcej, metoda ta wykorzystuje odwrotną zależność między prędkością a wielkością cząstek - małe cząstki poruszają się szybko, a duże cząstki poruszają się wolno - w celu dostarczenia informacji o rozkładach wielkości i względnych stężeniach składników próbki. Za pomocą DLS można określić ilościowo średnią zawartość mikrocząstek i średni promień składnika mikrocząstek. Zawartość mikrocząstek w produkcie krwiopochodnym jest podawana jako %MP na podstawie pola na zmierzonym histogramie dla promieni cząstek od 50 do 550 nm. Podczas gdy cząstki o promieniu poniżej 50 nm są wykrywane przez DLS i raportowane przez system DLS, nie są one uwzględniane w %MP. Zamiast izolować mikrocząstki z płytek krwi, niejednorodność transfuzji płytek krwi określa się na podstawie względnej zawartości mikrocząstek i płytek krwi w próbce. W rzeczywistości stosunek pików płytek krwi i mikrocząstek można wykorzystać do obliczenia bezwzględnego stężenia MP, gdy znana jest liczba płytek krwi. 19

System DLS dostarcza pracownikom służby zdrowia jakościowych i ilościowych informacji o mikrocząsteczkach znalezionych w próbkach pochodzących z ludzkiej krwi lub produktów krwiopochodnych. Główną przewagą opisanej techniki DLS nad technikami alternatywnymi, takimi jak cytometria przepływowa, mikroskopia elektronowa,29 nanoparticle tracking analysis30 lub tunable resistive pulse sensing31 jest przygotowanie próbki: podwielokrotności koncentratów płytek krwi mogą być mierzone bezpośrednio, bez konieczności izolowania MP od płytek krwi, rozcieńczania próbki lub innych modyfikacji. 9,17 Ponadto DLS jest bezwzględną metodą wymiarowania i nie cierpi z powodu braku koralików kalibracyjnych o odpowiednim współczynniku załamania. 14,32

Korelacja między aktywacją płytek krwi a zawartością MP została wcześniej wykazana przez mikroskopię33,20 i można ją wywnioskować ze wzrostu zawartości MP w stanach patologicznych15,34,35,36 i w warunkach in vitro, o których wiadomo, że aktywują płytki krwi. 19,37,38 Potrzebne są jednak dalsze badania, aby w pełni zrozumieć związek między zawartością mikrocząstek mierzoną przez DLS a aktywacją płytek krwi. Opierając się na naszej obecnej wiedzy, że aktywowane płytki krwi zawierają dużą liczbę mikrocząstek, najlepiej stosować je w leczeniu pacjentów z aktywnym krwawieniem39, podczas gdy pacjenci hematologiczno-onkologiczni odnoszą korzyści z nieaktywowanych płytek krwi bez mikrocząstek lub z niskim poziomem mikrocząstek20. Niedawno doniesiono, że reakcja płytek krwi dawcy w warunkach in vitro nie wpłynęła znacząco na regenerację i przeżycie tych płytek krwi w pojedynczych transfuzjach u stabilnych, w większości niekrwawiących pacjentów hematologiczno-onkologicznych40. Na podstawie tych wyników można wywnioskować, że aktywacja płytek krwi identyfikowana przez wysoką zawartość MP również nie odgrywa istotnej roli w leczeniu profilaktycznym pacjentów. Jednak ze względu na wąski wybór pacjentów, badanie to nie dotyczyło wpływu czynników dawcy na pacjentów ze złożonym stanem gorączkowym, niestabilnych i otrzymujących więcej niż jedną transfuzję płytek krwi. Pytanie, w jaki sposób można zmniejszyć złożoność tych przypadków pacjentów, co daje nadzieję na zmniejszenie ogniotrwałości, pozostaje bez odpowiedzi.

Mikrocząsteczki są wczesnymi markerami stanu zapalnego41,42,43,44 i aktywacja płytek krwi45 i dlatego są wykrywane u wielu normalnych dawców. 19 W związku z tym, aktywowane płytki krwi i mikrocząsteczki są obecne w dawstwie płytek krwi. Uzasadnione jest postawienie hipotezy, że pacjenci z gorączką, tj. w pełni aktywowanym wrodzonym układem odpornościowym, nie mogą tolerować dodatkowego wyzwania, jakim jest transfuzja aktywowanych płytek krwi. Potrzebne są jednak badania, aby udowodnić tę hipotezę. Badania przesiewowe mikrocząsteczek mogą zmniejszyć obecną niepewność co do zawartości transfuzji płytek krwi i zmniejszyć złożoność leczenia pacjentów.

Stosunek aktywowanych do nieaktywowanych płytek krwi w szpitalnym banku krwi zależy przede wszystkim od populacji dawców, a w znacznie mniejszym stopniu od transportu, napromieniania, inaktywacji patogenów i innych procesów, które mogą zwiększyć aktywację płytek krwi w koncentratach. 19 Dane z głównych szpitalnych banków krwi w Stanach Zjednoczonych wykazały, że średni skład inwentarza płytek krwi jest w 49% aktywowany i w 51% nieaktywowany (zakres dla aktywowanych płytek krwi: 38 - 62%, komunikacja osobista). Jeśli dostawcy produktów krwiopochodnych lub szpitalne banki krwi chcą wiedzieć, ile aktywowanych i nieaktywowanych koncentratów płytek krwi produkują lub otrzymują, a także chcą zarządzać swoimi zapasami w oparciu o aktywację płytek krwi zgodnie z zawartością mikrocząstek, ten protokół może być dla nich odpowiedni.

Na podstawie składu płytek krwi szpitalny bank krwi będzie mógł skierować nieaktywowane, jednorodne płytki krwi do użytku profilaktycznego oraz aktywowane, heterogenne płytki krwi do użytku terapeutycznego. Badania przesiewowe płytek krwi pozwalają szpitalom zmaksymalizować wykorzystanie dostępnych zapasów, co poprawia opiekę nad pacjentem i obniża koszty. Protokół ten jest przeznaczony dla personelu laboratoryjnego, który jest zaznajomiony z podstawową obsługą i manipulacją produktami krwiopochodnymi.

Przedstawiona tutaj jest metoda przesiewowa dla mikrocząsteczek w transfuzjach płytek krwi, która może być rutynowo stosowana do zarządzania zapasami szpitalnego banku krwi, gdzie wybór produktu na podstawie zawartości mikrocząstek jest pożądany. Celem niniejszego protokołu jest nakreślenie wdrożenia i oceny DLS do badań przesiewowych dawczyń krwi. Opisany protokół odpowiada na często zadawane pytania dotyczące nieinwazyjnego dostępu do próbek, integracji testów z przepływem pracy banku krwi oraz charakterystyki wydajności.

Protokół

Poniższy protokół został wykonany zgodnie ze wszystkimi wytycznymi Canadian Blood Services (CBS). Wolontariusze wyrazili zgodę na wykorzystanie ich darowizn do przeprowadzenia tych badań. Koncentraty płytek krwi zostały przygotowane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi CBS. Wszystkie opisane tutaj testy wydajności zostały przeprowadzone w Centre for Blood Research na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w Vancouver w Kanadzie, za zgodą instytucjonalnej Rady Etyki Badań.

1. Kontrola jakości

  1. Przynajmniej raz w dniu przeprowadzania badań wykonaj kontrolę jakości, aby zweryfikować prawidłowe działanie systemu DLS. Zmierz dostarczone kuleczki kontrolne (promień 50 nm) zgodnie z instrukcją użycia producenta.
  2. Wyjmij fiolkę kontrolną z przechowywania w niskiej temperaturze i pozostaw ją na 15 min w celu ogrzania do temperatury pokojowej. Kuleczki muszą osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem.
  3. Włącz system DLS przed przygotowaniem próbki, aby 15-minutowy okres rozgrzewania lasera zakończył się w momencie, gdy pierwsza próbka będzie gotowa do badania.
  4. Po uruchomieniu konsoli postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie dotykowym, aby zalogować się i wybrać opcję System Test w celu pomiaru próbki kontrolnej.
  5. Wymieszaj fiolkę w vorteksie przez 10 s, aby zapewnić reprezentatywność próbki.
  6. Napełnij kapilarę kuleczkami kontrolnymi, używając pipety o stałej objętości 10 µL, końcówki do pipety oraz kapilary z zestawu testowego.
  7. Po zakończeniu testu postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie systemu DLS.
    UWAGA: Wyniki testu kuleczek kontrolnych są automatycznie porównywane z informacjami zapisanymi w etykiecie kodowej kuleczek kontrolnych, a powiadomienie PASS lub FAIL oraz informacje o próbce są wyświetlane na ekranie systemu DLS po zakończeniu testu.

2. Pobieranie próbki z koncentratu płytek krwi

UWAGA: Kroki te opisują proces nieinwazyjnego pobierania próbek z transfuzji płytek krwi do kapilary testowej DLS w ramach rutynowego zarządzania zapasami płytek krwi. Przegląd procesu przedstawiono na Ryc. 1. Wymagane akcesoria: uszczelniacz probówek, ręczny ściągacz probówek, nożyczki oraz osłona przeciwrozpryskowa.

  1. Wyjąć koncentrat płytek krwi z zapasu nieprzebadanych próbek.
  2. Pobrać próbkę produktu płytkowego albo z nieużywanego woreczka pobraniowego (przejść do kroku 2.3), albo z segmentu przewodu (przejść do kroku 2.4, jeśli jest pusty, lub do kroku 2.5, jeśli nie jest pusty).
    Aby odłączyć przewód woreczka lub segment przewodu, należy użyć zgrzewarki do przewodów. Urządzenie to należy obsługiwać zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: należy zacisnąć przewód w precyzyjnie określonym miejscu między dwiema podgrzewanymi szczękami. W urządzeniu ręcznym należy docisnąć stopione ścianki przewodu i schłodzić je pod wysokim ciśnieniem, naciskając dźwignię (czas trwania procesu jest sygnalizowany zielonym światłem), co zapewni trwałe i szczelne zamknięcie.
  3. Pobieranie próbki z woreczka
    1. Dokładnie wymieszać zawartość worka z płytkami, wykonując delikatne ruchy poziome przez 5 s (przechylając worek z jednego końca na drugi pięć razy).
    2. Otworzyć zacisk woreczka. Woreczek jest ewakuowany i napełni się samoczynnie. Nie ma potrzeby całkowitego napełnienia woreczka, ponieważ do testów DLS wymagana będzie jedynie próbka o objętości 10 µL.
    3. Odłączyć woreczek od worka, zgrzewając termicznie łączący je przewód za pomocą zgrzewarki do przewodów. Kontynuować od kroku 3.
  4. Pobieranie próbki z pustego przewodu
    1. Upewnić się, że przewód worka z płytkami był przechowywany w stanie pustym i że blokada przewodu jest nadal na miejscu. Wizualnie sprawdzić przewód, aby upewnić się, że nie znajduje się w nim znacząca ilość koncentratu płytek. Jeśli przewód nie jest pusty, kontynuować od kroku 2.5.
    2. Zamknąć wyciskacz do przewodów na przewodzie tak blisko blokady przewodu, jak to możliwe, ściskając uchwyty, aby docisnąć przewód między rolkami.
    3. Zawiesić worek pionowo i nadal ściskać uchwyty wyciskacza.
    4. Trzymając wyciskacz zamknięty, zwolnić blokadę przewodu.
    5. Powoli przesuwać wyciskacz w dół pustego przewodu, pozwalając na powolne napełnianie się przewodu za wyciskaczem. Kontynuować, aż sekcja poniżej wyciskacza zostanie całkowicie nadmuchana lub aż wyciskacz znajdzie się w odległości 1 cala od końca przewodu.
    6. Po osiągnięciu punktu zatrzymania wyciskacza, użyć zgrzewarki do przewodów, aby termicznie zgrzać przewód 1 cal powyżej wyciskacza.
    7. Zwolnić uchwyty ręcznego wyciskacza do przewodów.
    8. Zgrzać termicznie ponownie 1 do 2 cali powyżej poprzedniego zgrzewu, aby utworzyć segment testowy.
    9. Odciąć segment testowy od jednostki płytek. Segment ten zostanie wykorzystany do testów DLS.
  5. Pobieranie próbki z przewodu, który nie jest pusty
    1. Zawiesić worek pionowo i zwolnić blokadę przewodu, jeśli jest założona.
    2. Wizualnie sprawdzić przewód, aby ustalić, czy nie ma w nim znaczących grudek stałych. Jeśli grudki występują, należy zgrzać przewód powyżej nich, tak aby nie mogły zostać wyciśnięte do worka.
    3. Zamknąć wyciskacz do przewodów na przewodzie tak blisko zgrzanego końca przewodu, jak to możliwe.
    4. Wypchnąć zawartość przewodu do worka, ściskając uchwyty w celu dociśnięcia przewodu między rolkami i, utrzymując siłę zacisku, przesuwając wyciskacz wzdłuż przewodu w kierunku worka.
    5. Zdjąć worek z płytkami z haka i delikatnie wymieszać zawartość przez 5 s, przechylając go z jednego końca na drugi pięć razy, trzymając wyciskacz zamknięty.
    6. Zawiesić worek pionowo, utrzymując wyciskacz zamknięty.
    7. Powoli przesuwać wyciskacz w dół pustego przewodu, pozwalając na powolne napełnianie się przewodu za wyciskaczem. Kontynuować, aż sekcja poniżej wyciskacza zostanie całkowicie nadmuchana lub aż wyciskacz znajdzie się w odległości 1 cala od końca przewodu.
    8. Po osiągnięciu punktu zatrzymania wyciskacza, użyć zgrzewarki do przewodów, aby termicznie zgrzać przewód 1 cal powyżej wyciskacza.
    9. Zwolnić wyciskacz.
    10. Zgrzać termicznie ponownie 1 do 2 cali powyżej poprzedniego zgrzewu, aby utworzyć segment testowy.
    11. Odciąć i wyrzucić ostatnią część przewodu.
    12. Odciąć segment testowy od jednostki płytek. Segment ten zostanie wykorzystany do testów DLS.

3. Napełnianie kapilary testowej DLS próbką

  1. Używając osłony przed rozpryskami oraz czystych i suchych nożyczek, odetnij jeden koniec rurki z woreczka lub segmentu testowego.
    UWAGA: Kapilarę wykorzystywaną do testów DLS należy napełnić natychmiast.
  2. Napełnij kapilarę, używając narzędzia do pobierania próbek (złożonej pipety o stałej objętości 10 µL, końcówki pipety i kapilary), aby pobrać próbkę bezpośrednio z otwartego woreczka lub segmentu rurki do wnętrza kapilary.
  3. Uszczelnij dno napełnionej kapilary, delikatnie wsuwając ją w uszczelniacz do kapilar, lekko obracając i dociskając do tacki.
  4. Odłącz pipetę o stałej objętości 100 µL i końcówkę od kapilary, upewniając się, że kapilara pozostaje mocno osadzona w uszczelniaczu do kapilar.
  5. Wyjmij kapilarę z tacki z uszczelniaczem, przetrzyj ją wacikiem z izopropylowym alkoholem i upewnij się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza, delikatnie strzepując dno kapilary.
  6. Umieść kapilarę w systemie DLS.

4. Przeprowadzenie testu DLS

  1. Wybierz opcję testu MP, aby rozpocząć nowy test DLS w celu pomiaru zawartości mikrocząstek w próbce płytek krwi.
  2. Wprowadź informacje o próbce (numer identyfikacyjny donacji (ISBT), datę ważności zbioru/produkcji oraz kod produktu) za pomocą skanera kodów kreskowych lub ręcznie.
  3. Jeśli nie jest dostępny kod produktu, z którego system DLS mógłby pobrać informacje o ośrodku płynnym, wybierz odpowiedni ośrodek płynny ręcznie (dla większości koncentratów płytek wybierz plazmę, a dla próbek zawierających roztwór dodatkowy do płytek (PAS) wprowadź procent pozostałej plazmy).
    UWAGA: Niewielkie odchylenie procentowej zawartości PAS od nominalnych 65% spowoduje niewielki błąd w obliczeniu lepkości (obliczanej automatycznie przez system DLS), co minimalnie wpływa na obliczony promień MP, ale nie na %MP.
  4. Włóż kapilarę do systemu DLS po wyświetleniu instrukcji i rozpocznij test.
  5. Po zakończeniu testu wyjmij próbkę z uchwytu kapilary i zutylizuj materiały zużywalne zgodnie z wytycznymi placówki. Wyjmij próbkę z uchwytu kapilary i zutylizuj materiały zużywalne zgodnie z wytycznymi placówki.
  6. Oznakuj worek z płytkami kolorem odpowiadającym wynikowi, na przykład pomarańczowym dla nieaktywowanych (homogennych) przy %MP równym lub niższym niż 15% oraz różowym dla aktywowanych (heterogennych) przy %MP powyżej 15%.

Analiza próbek krwi metodą DLS; wykres przedstawia rozmiar cząstek płytek krwi nieaktywowanych w porównaniu do aktywowanych.
Rycina 1Przegląd metody. Przegląd etapów rutynowego zarządzania zapasami koncentratów krwopławczych w szpitalnej banku krwi: pobranie próbki z koncentratu krwopławczkowego, wprowadzenie próbki do kapilary do pomiaru DLS, wykonanie testu DLS w celu identyfikacji mikrocząsteczek oraz wykorzystanie zgłoszonej zawartości mikrocząsteczek do identyfikacji aktywowanych krwopławczyków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki

Średni czas przygotowania
Proces przesiewania płytek krwi z wykorzystaniem systemu DLS przedstawiono w podsumowaniu na Rysunku 1. Płytki krwi są badane za pomocą systemu DLS w momencie ich otrzymania od dostawcy krwi. Jak szczegółowo opisano w Tabeli 1, średni czas przygotowania dla przeszkolonych użytkowników wynosi 2 min 23 s, natomiast czas oczyszczania i prace po teście trwają odpowiednio 14 s i 46 s. Łącznie średni czas pracy manualnej użytkownika na jeden test wynosi 3 min 23 s.

Aktywność Czas aktywnyCzas badania bezobsługowegoSUMARYCZNIE
Przygotowanie systemu DLS14 s
Montaż narzędzia do pobierania próbek28 s
Pozyskanie segmentu52 s
Napełnić kapilarę i rozpocząć test49 s
5 min
Oczyszczanie14 s
Oznaczenie i ewidencja worka z koncentratem krążków krwi46 s
Całkowity czas potrzebny na jedną próbkę3 min 23 s5 min8 min 23 s

Tabela 1: Podział czasu aktywnego badania. Samo badanie jest testem typu „walk away” o średnim czasie trwania 5 min. Średni czas potrzebny użytkownikowi na przygotowanie systemu DLS do badania, pobranie i przetestowanie próbki zgodnie z niniejszym protokołem oraz oznaczenie worka z płytkami wynosi 3 min 23 s.

Precyzja
Precyzję systemu DLS oceniono dla trzech poziomów mikrocząstek: 0-7%, 12-25% oraz 28-75%. Klinicznie istotny zakres %MP wynosi 3 - 75%. Dwóch operatorów testowało próbki kontrolne o niskim, średnim i wysokim stężeniu przez 16 dni roboczych na dwóch systemach DLS równolegle. Próbki analizowano w dwóch powtórzeniach, lecz w losowej kolejności każdego dnia badań.

Tabela 2 podsumowuje precyzję wewnątrzpomiarową pomiarów DLS dla procentowej zawartości mikrocząstek (%MP) w stosunku do płytek krwi.

Zawartość mikrocząsteczek
NiskiPożywkaWysoki
Średnia %MP (%)4.419.553.8
Odchylenie standardowe (%)1.82.65.8
CV (%)40.413.210.6

Tabela 2: Precyzja wewnątrz urządzenia dla procentowej zawartości mikrocząsteczek (%MP). Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząsteczek małe płytki krwi mogą wpływać na %MP, co prowadzi do zwiększonej zmienności w próbkach o niskiej zawartości mikrocząsteczek.

Tabela 3 przedstawia precyzję wewnątrzpomiarową pomiarów DLS dla średniego promienia mikrocząstek w zakresie od 50-50 nm.

Zawartość mikrocząstek
NiskaŚredniaWysoka
Średni promień (nm)3116118
Odchylenie standardowe (mm)134125
CV (%)40.125.213.5

Tabela 3: Precyzja wewnątrz urządzenia dla promienia mikrocząsteczek. Przy bardzo niskiej zawartości mikrocząsteczek małe płytki krwi mogą wpływać na procent mikrocząsteczek (%MP), co prowadzi do zwiększonej zmienności w próbkach o niskiej zawartości mikrocząsteczek.

Tabela 4 przedstawia powtarzalność pomiarów DLS dla procentowej zawartości mikrocząsteczek (%MP).

Zawartość mikrocząsteczek
NiskiPożywkaWysoki
Średnia wartość %MP (%)4.429.253.6
Powtarzalność (%)1.52.35
CV (%)3511.89.4

Tabela 4: Powtarzalność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS) dla procentowej zawartości mikrocząstek (%MP).

Liniowość
Rysunek 2 wykazuje, że wyniki DLS są liniowe, t.j.następnie dopasowano linię prostą względem przypisanych wartości próbek. Przygotowano siedem próbek o różnej zawartości mikrocząsteczek. Próbki o wysokiej (MP7) oraz niskim (MP1) zawartość mikrocząsteczek oraz odpowiadające im stężenie płytek krwi zostały przygotowane i zmieszane w różnych proporcjach w celu stworzenia próbek pośrednich (MPProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.). Próbki poddano analizie cytometrycznej zgodnie z opisaną wcześniej procedurą19 wyniki DLS i %MP dla każdego stężenia przedstawiono na wykresie jako wartości wejściowe i wyjściowe. Współczynnik determinacji wyniósł 0,985. Przykładowe histogramy DLS dla niskiej i wysokiej zawartości mikrocząsteczek przedstawiono w Rysunek 3AWyniki DLS potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3B).

Wykres cytometrii przepływowej a DLS; analiza korelacji wielkości cząstek; wykres rozrzutu z linią trendu.
Rycina 2Porównanie wyników cytometrii przepływowej i DLS. Liniowa zależność między wartością %MP wyznaczoną za pomocą cytometrii przepływowej (wejście) a DLS (wyjście); oryginalne dane DLS z dwóch próbek oznaczone pustym symbolem ○ przedstawiono w Rycina 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład wielkości cząstek, analiza wykresu rozrzutu, wykres intensywności/logarytmu promienia, wyniki dopasowania danych.
Rysunek 3Zawartość mikrocząsteczek w celu rozróżnienia między płytkami krwi aktywowanymi a nieaktywowanymi. (A) Wyniki DLS dla zawartości MP w płytkach aktywowanych (linia przerywana) wyniosły 57% w porównaniu do 4% w płytkach nieaktywowanych (linia ciągła). Testy przeprowadzono w temperaturze pomiaru wynoszącej 37 °C, ustawienie lepkości plazmy wynoszące 1,06 x10-3 Pa·s oraz ustawienia całkowitej intensywności w zakresie 20–60 kHz. (B) Wyniki analizy cytometrii przepływowej (uzyskane zgodnie z wcześniejszym opisem)19) tych samych próbek, co pokazano na (A); na histogramach rozprosiania przedniego P1 i P2 reprezentują odpowiednio bramki dla MP i płytek krwi; w przypadku płytek aktywowanych (po lewej) 76% zdarzeń znalazło się w bramce MP, w porównaniu do 6% dla płytek nieaktywowanych (po prawej). Linia regresji liniowej sugeruje stały relatywny wkład szumu tła do wartości %MP w cytometrii przepływowej, co prowadzi do konsekwentnie wyższych wyników. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Specyficzność/Interferencje
Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (ISO) definiuje specyficzność analityczną jako zdolność procedury pomiarowej do wykrywania lub pomiaru wyłącznie mierzanego składnika (measurandu) w obecności innych ilości w próbce. Specyficzność analityczna przesiewu mikrocząsteczek może być wpływana przez erytrocyty (RBC). Metoda DLS mierzy zawartość MP w stosunku do zawartości płytek krwi. Erytrocyty mogą powodować interferencję, ponieważ ich udział w rozpraszaniu jest wliczony do udziału płytek krwi w rozpraszaniu, co zmniejsza względny udział MP. Istnieją limity regulacyjne dotyczące dopuszczalnej zawartości erytrocytów w produktach krwi; konserwatywna konwersja progu zalecanego przez AABB dla dopuszczalnego stężenia erytrocytów w koncentratach płytek krwi – 2 ml upakowanych erytrocytów w jednej jednostce płytek – poskutkowała wartością 8,0 x 1010 komórek/L (założenia: objętość RBC wynosi 8,5 x10-14L, hematokryt koncentratu erytrocytów wynosi 68%, objętość jednostki płytek wynosi 20 ml). Zgłaszane stężenia resztkowe erytrocytów w różnych produktach znajdują się znacznie poniżej tego progu46.

Trzech różnych dawców przekazało płytki krwi oraz erytrocyty (RBC) w dwa różne dni, zgodnie z kwalifikacją, na potrzeby trzech niezależnych eksperymentów. Początkowa zawartość RBC w koncentratach płytek krwi (próbka referencyjna) wynosiła 0,05 - 0,15 x109 komórek/L, co określono za pomocą hemocytometru. Pięć dodatkowych próbek przygotowano poprzez dodanie znanych ilości RBC do alikwotów koncentratu płytek krwi; docelowe poziomy RBC w tych próbkach wynosiły odpowiednio 1,0, 5,0, 10, 40 i 80 x109 komórek/L.

Próg interferencji erytrocytów wynosił około 1,0 x1010 komórek/L (Rysunek 4), co korelowało z poziomem, przy którym obecność erytrocytów była widoczna wizualnie (Rysunek 5). Powyżej tego poziomu wartość %MP była niedoszacowana, co oznacza, że w próbkach widocznie czerwonych – zawierających erytrocyty, a nie hemoglobinę – zgłaszana zawartość mikrocząsteczek będzie zbyt niska.

Wykres reologiczny, stężenie RBC względem %MP (DLS), analiza danych, wyniki regresji liniowej.
Rycina 4Zależność liniowa między %MP (DLS) a stężeniem RBC (komórki/L). zwiększające się stężenia RBC o 0,1 x109, 1,0 x109, 5,0 x109, 1,0 x1010, 4,0 x 1010, oraz 8,0 x 1010 komórek/L (od lewej do prawej) z 3 niezależnych eksperymentów (○ eksperyment 1, ● eksperyment 2, □ eksperyment 3, dla każdego eksperymentu przedstawiono linie regresji liniowej). Powyżej 1,0 x1010 Liczba RBC/L prowadzi do niedoszacowania %MP. Wygląd próbek zawierających RBC przedstawiono w Rycina 5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment spektroskopowy prezentujący wyniki reakcji kolorymetrycznej w probówkach; zaobserwowano gradient barw.
Rysunek 5Wygląd zewnętrzny próbek zawierających erytrocyty (RBC). Zaczerwienienie próbek płytek krwi zawierających stężenia RBC wynoszące 0,1 x109, 1,0 x 109, 5,0 x109, 1,0 x1010, 4,0 x1010, oraz 8,0 x 1010 komórek/L od lewej do prawej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dokładność
Dokładność definiuje się jako różnica między pojedynczym wynikiem pomiaru a prawdziwą wartością wielkości przypisanej do próbki. Ten błąd pomiarowy obejmuje komponent systematyczny szacowany przez błąd systematyczny (bias) oraz komponent losowy szacowany przez odchylenie standardowe. Zatem dokładność wyniku pomiaru jest kombinacją prawdziwości i precyzji.

Do oznaczenia dokładności testu DLS wykorzystano standard kulek. Dokładność oceniano przy dwóch stężeniach w klinicznie istotnym zakresie analizy wynoszącym 3 - 75% MP. Do przygotowania próbek o znanych stężeniach użyto referencyjnych mieszanin kulek, ponieważ kulki referencyjne mają znaną wielkość i stężenie. W związku z tym kulki referencyjne można mieszać w celu uzyskania próbek o pożądanych rozmiarach cząstek i stężeniach.

Do reprezentowania mikrocząsteczek wykorzystano standardowe kulek polistyrenowe o promieniu 125 nm, a do reprezentowania płytek krwi kulki o promieniu 1,5 µm. Dokładność analizy mikrocząsteczek oceniono za pomocą mieszanin kulek o zawartości MP wynoszącej odpowiednio około 20% i 50%. Dokładność pomiaru promieni cząsteczek porównano z promieniami cząsteczek udokumentowanymi w certyfikatach analizy (Certificates of Analysis) dla kulek referencyjnych, zgodnie z Tabelą 5.

kuleczki o średnicy 125 nm1.5 µm beady/kuleczki
Certyfikat analizyCertyfikat analizy
20% MP50% MP20% MP50% MP
Średnia wartość promienia122.0113.8124.41.51.61.60
Odchylenie std.4.52.833.60.0350.060.07
Życiorys zawodowy3.60%2.48%2.89%2.20%3.74%4.05%
Dokładność6.70%2.00%6.50%6.30%

Tabela 5: Dokładność pomiarów dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Porównanie rozmiarów z wyników DLS z certyfikatem analizy dla kulek o promieniu 125 nm i promieniu 1,5 µm w mieszaninach.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę dynamicznego rozpraszania światła do badań przesiewowych mikrocząstek, zoptymalizowaną pod kątem wysokich stężeń cząstek występujących w próbkach biologicznych, takich jak koncentraty płytek krwi. Metoda DLS jest z natury ustandaryzowana w celu dokładnego pomiaru rozmiaru. Względne stężenie mikrocząstek można przekształcić w stężenie bezwzględne, jeśli stężenie płytek krwi jest znane, a powierzchnia piku płytkowego jest używana jako pik odniesienia19. Ponieważ stężenia płytek krwi są zwykle uzyskiwane za pomocą analizatorów hematologicznych lub cytometrów przepływowych, metody te można uznać za technologie towarzyszące DLS.

Funkcjonalność systemu DLS jest zapewniona poprzez regularne uruchamianie koralików kontrolnych. Wodę destylowaną można zmierzyć, aby sprawdzić, czy hałas tła jest minimalny. Dostępne na rynku wzorce płytek krwi mogą być analizowane jako kontrole ujemne MP, a po dodaniu kulek o promieniu 125 nm jako kontrole dodatnie MP. W biologicznym zakresie stężeń MP będących przedmiotem zainteresowania, procedury są praktyczne i szybkie do wykonania w ramach rutynowej pracy banku krwi.

W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, metoda ta nie opiera się na porównaniu intensywności rozpraszania cząstek, ale raczej na prędkości ich ruchu Browna. W ten sposób egzosomy mogą być również wykrywane pomimo ich niewielkich rozmiarów i są zgłaszane oddzielnie od MP.

Metoda ta, zaprojektowana jako narzędzie przesiewowe, wiąże się z jej niezdolnością do rozróżnienia różnych typów mikrocząstek. Istnieje potencjalne pole do poprawy, jeżeli zastosowane zostaną dodatkowe etapy izolacji; Próbki można testować przed i po specyficznym usunięciu mikrocząstek poprzez wychwytywanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami. Ponadto nie można założyć, że wszystkie wykryte mikrocząstki są pochodzenia komórkowego, ponieważ chylomikrony powstałe w hiperlipidemii47,48 oraz małe bakterie lub wirusy6 zostaną również zgłoszone w zakresie mikrocząstek. Istnieją jednak inne zabezpieczenia w zakresie zaopatrzenia w krew, aby zapobiec przedostawaniu się do inwentarza szpitalnego banku krwi silnie lipemicznego lub zanieczyszczonych płytek krwi.

Wybór antykoagulantu w próbce wpływa na stopień aktywacji płytek krwi, a tym samym na zawartość MP49. W przypadku porównań różnych produktów należy wziąć pod uwagę ten czynnik. Ponadto wymiana osocza na pożywki zawiesinowe wolne od MP, takie jak PAS, wpłynie na zawartość MP i próg oznaczania niejednorodności - jeśli tylko około jedna trzecia pierwotnej zawartości MP pozostanie w osoczu resztkowym w koncentracie, odpowiednio niższy próg zawartości MP będzie wskazywał na taki sam poziom aktywacji płytek krwi, jak w 100% osoczu. Procent MP to zawartość MP w stosunku do płytek krwi. Wcześniej informowano, że średnia liczba płytek krwi w produkcie PAS była niższa, tak że średni %MP nadal wynosił 9,5%19. Próg %MP dla płytek krwi PAS zarejestrowanych w USA jest obecnie ustawiony na 10%.

Podczas gdy głównym źródłem MP w koncentratach płytek krwi jest dawca, procesy, które powodują stres u płytek krwi, zwiększą poziom MP w zależności od podatności płytek krwi na stres - jeśli płytki krwi są już silnie aktywowane, drobne czynniki stresogenne, takie jak wydłużony okres przydatności do spożycia, inaktywacja patogenów, mycie, napromienianie lub transport na duże odległości, mogą prowadzić do znacznego wzrostu zawartości MP. Wykazano, że żaden z tych czynników stresogennych nie wpływa znacząco na jednorodne, nieaktywowane płytki krwi19. Ponadto należy zwrócić uwagę na możliwość wystąpienia zmian w składzie próbki w obrębie kapilary, jeżeli nie zostanie ona przebadana natychmiast po przygotowaniu (zakończenie kroku 3 niniejszego protokołu).

Protokół ten koncentruje się na określeniu składu cząstek obecnych w transfuzjach płytek krwi i wykorzystaniu mikrocząstek jako biomarkerów aktywacji płytek krwi. Transfuzje płytek krwi są oznaczane jako nieaktywowane (pomarańczowy) lub aktywowane (różowe) w oparciu o próg procentowy mikrocząstek wynoszący 15%. Próg 15% MP dla płytek krwi w 100% osoczu określono empirycznie jako średni 66. percentyl z wielu miejsc.

Celem zarządzania zapasami płytek krwi w oparciu o rutynowe badania przesiewowe mikrocząsteczek za pomocą DLS jest poprawa opieki nad pacjentem i zwiększenie efektywności kosztowej poprzez zapobieganie nieimmunologicznej oporności na płytki krwi. Wdrożenie systemu DLS do badań przesiewowych worków płytkowych umożliwi użytkownikowi kierowanie nieaktywowanych płytek krwi do populacji pacjentów najbardziej narażonych na rozwój ogniotrwałości płytek krwi.

Oświadczenia

EMS jest założycielem LightIntegra Technology Inc., firmy produkującej urządzenia medyczne, która opracowała system ThromboLUX do badania jakości mikrocząstek i płytek krwi. Wszyscy pozostali autorzy są pracownikami firmy LightIntegra Technology. Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez LightIntegra Technology Inc.

Podziękowania

Dziękujemy dawcom krwi i personelowi Centrum Rozwoju Stosowanego Kanadyjskiej Sieci Usług Krwiodawstwa za pobranie i produkcję jednostek płytek krwi używanych w tym badaniu. Dziękujemy Kanadyjskiej Fundacji Innowacji i Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem za finansowanie infrastruktury w Centrum Badań Krwi UBC. Finansowanie publikacji zapewniła firma LightIntegra Technology Inc., producent szczepionki ThromboLUX.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ThromboLUX-MLightIntegra Technology Inc. LPN120DLS System
Oprogramowanie ThromboSightLightIntegra Technology Inc. Oprogramowanie analityczne LPN124DLS
KapilaryLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Optinova MLE)LPN065Niestandardowa wytłaczana, nieaktywująca, niedwójnomocna rurka z tworzywa sztucznego, sprawdzona i napromieniowana
MiniPet LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca TriContinent Scientific)LPN082100 µ L pipeta o stałej objętości do pobierania próbek   
MicroFlex 1-200 i mikro; L Końcówki do pipetLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca ESBE Scientific)LPN080Końcówki do pipet do pobierania próbek
Critoseal LightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca Fisher Scientific)LPN075Uszczelniacz do rurek kapilarnych
Dukal Alcohol Pad lub równoważnyLightIntegra Technology Inc. (zawarty w zestawie testowym, dostawca Dukal Corp.)LPN085Podkładka izopropylowa (nasycona 70% alkoholem izopropylowym)
Koraliki kontrolne, promień 50 nmLightIntegra Technology Inc. (zawarte w zestawie testowym, dostawca PolySciences Inc.)LPN128Koraliki kontrolne
Mikrokulki NIST Identyfikowalny rozmiar cząstek Standardowy, 3 i mikro; mPolySciences Inc.64060Standardowe mikrokulki: 1,5 i mikro; m promień Koraliki polistyrenowe; zakres 1,43-1,58 i mikro; m; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nmPolySciences Inc.64014-15Standardowe nanokulki: promień 125 nm Kulki polistyrenowe; zakres 120 - 130 nm; 1% zawiesiny ciał stałych w wodzie dejonizowanej
Genesis BPS RapidSeal II lub odpowiednikGenesis BPS428-SE640Zgrzewarka do tub
Fresenius Kabi Tube Stripper lub odpowiednikFresenius Kabi6R4452Ręczna maszyna do ściągania izolacji z tubek
Biohazard Shield - Cell Counter lub odpowiednikCardinalHealthS1389-75Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer lub odpowiednikCorning Incorporated6775Vortex mixer
FACSCanto II Cytometr przepływowy  z oprogramowaniem FACSDiva w wersji 6.1.3 lub równoważnymCytometr przepływowyBD Biosciences338960

Bibliografia

  1. Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
  2. Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
  3. Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
  4. Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
  5. Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
  6. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  7. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
  8. Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
  9. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  10. Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
  11. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 36-45 (2013).
  15. Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
  16. Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812(2015).
  17. Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
  18. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  19. Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
  20. Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
  21. Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
  22. Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
  23. Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
  24. Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
  25. Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
  26. Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
  27. Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
  28. Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
  29. Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
  30. Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
  31. Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
  32. Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
  33. Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
  34. Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
  35. Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293(2016).
  36. Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
  37. Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
  38. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  39. Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, Suppl 1 54-61 (2014).
  40. Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
  41. Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
  42. Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
  43. Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
  44. Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67(2011).
  45. Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
  46. Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
  47. Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
  48. Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779(2017).
  49. Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie mikrocząstekdynamiczne rozpraszanie światłaaktywacja płytek krwiprzesiew banku krwipobieranie krwi z naczyń kapilarnychzawartość mikrocząstekzasoby płytek krwimedycyna transfuzjologicznabadania DLS
Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.