Artykuł metodologiczny

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56898

⸱

16 stycznia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of tRNA Biology, Department of Biology, College of Charleston, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, MUSC, 3Department of Biology, College of Charleston

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Streszczenie

Transferowe RNA (tRNA) to obfite krótkie niekodujące gatunki RNA, które zazwyczaj mają długość od 76 do 90 nukleotydów. tRNA są bezpośrednio odpowiedzialne za syntezę białek poprzez translację kodonów w mRNA na sekwencje aminokwasów. tRNA przez długi czas były uważane za cząsteczki porządkowe, które nie pełniły funkcji regulacyjnych. Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na to, że poziomy tRNA w komórkach wahają się w zależności od różnych warunków, takich jak typ komórki, środowisko i stres. Fluktuacja ekspresji tRNA bezpośrednio wpływa na translację genów, sprzyjając lub hamując ekspresję poszczególnych białek. Ostateczne zrozumienie dynamiki syntezy białek wymaga opracowania metod zdolnych do dostarczania wysokiej jakości profili tRNA. Metoda, którą tutaj prezentujemy, nosi nazwę SPOt, co oznacza Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt składa się z trzech etapów, począwszy od znakowania metabolicznego kultur komórkowych radioaktywnym ortofosforanem, następnie ekstrakcji tiocyjanianianem guanidyny, fenolem i chloroformem radioaktywnych całkowitych RNA, a na końcu hybrydyzacja na drukowanych we własnym zakresie makromacierzach. Poziomy tRNA szacuje się poprzez ilościowe określenie intensywności radioaktywności w każdym punkcie sondy. W przedstawionym tutaj protokole profilujemy tRNA w Mycobacterium smegmatis mc2155, niepatogennej bakterii często wykorzystywanej jako organizm modelowy do badania gruźlicy.

Wprowadzenie

Poziomy komórkowego tRNA zmieniają się w zależności od warunków takich jak typ komórki, środowisko i stres1,2,3. SPOt, Streamlined Platform for Observing tRNA, to oryginalna, niezawodna i prosta technika, która umożliwia szybkie i precyzyjne określanie ilościowe poziomów transferowego RNA w organizmach hodowanych w laboratorium.

tRNA mają niezwykle stabilne struktury drugorzędowe i trzeciorzędowe4. Wyświetlają również liczne modyfikacje potranskrypcyjne5. Cechy te reprezentują znaczące strukturalne i sekwencyjne przeszkody, stronnicze lub czasami uniemożliwiające bezpośrednie i powtarzalne profilowanie tRNA przy użyciu standardowych wzorcowych technik kwantyfikacji RNA6. Grupy badawcze na całym świecie zostały zmuszone do opracowania kreatywnych, ale często zawiłych technik oceny poziomu komórkowego tRNA. Niektóre z tych metod obejmują: (1) dwuwymiarową elektroforetyczną separację metabolicznie znakowanych tRNA w połączeniu z metodycznym przypisywaniem miejsca za pomocą Northern blot1; (2) indywidualna kwantyfikacja metodą Northern blot przy użyciu starannie standaryzowanych radioaktywnych sond DNA7; (3) znakowanie po ekstrakcji fluorochromami cyjaninowymi, a następnie analiza mikromacierzy3 oraz (4) usuwanie in vitro modyfikacji tRNA przy użyciu rekombinowanych enzymów demodyfikacyjnych w połączeniu z odwrotną transkrypcją i późniejszym sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości8.

SPOt to prosta i oryginalna kombinacja dwóch standardowych i nieskomplikowanych podejść: (1) znakowanie ciała RNA, które polega na syntezie, w rosnących organizmach, radioaktywnych całkowitych RNA i (2) makromacierz tRNA, systematyczne i zminiaturyzowane narzędzie genomiczne zoptymalizowane pod kątem segregacji tRNA.

Próbki są przesyłane z żywych organizmów do platformy kwantyfikacji. Są one bezpośrednio analizowane po ekstrakcji i nie są dalej przetwarzane, co znacznie ogranicza odchylenia w porównaniu z technikami wymagającymi amplifikacji po ekstrakcji lub zabiegów enzymatycznych. SPOt jest wszechstronny i można go łatwo połączyć z frakcjonowaniem polisomów w celu identyfikacji i ilościowego określenia subpopulacji tRNA, które są fizycznie związane z translacją rybosomów.

Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany pod kątem Mycobacterium smegmatis, a także został z powodzeniem wykorzystany do profilowania tRNA u Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, myszy i hodowle komórek ludzkich11.

Protokół

1. Etykietowanie kultur i metabolizmu

  1. Szturchnij raz środek nakrętki sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml igłą o rozmiarze 18, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Zaszczepić 500 μl uzupełnionego sterylnego bulionu 7H9 z 5 μl M. smegmatis z kultury starterowej wyhodowanej przez noc12.
    UWAGA: Przepis na jeden litr bulionu 7H9 to: 4,7 g komercyjnego proszku 7H9, 2 ml glicerolu, 1 ml Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g albuminy, 2 g dekstrozy, H2O (aby uzyskać całkowitą objętość do 1 l).
    1. (UWAGA) Postępując zgodnie ze standardowymi praktykami ochrony przed promieniowaniem, należy zwiększyć pożywkę hodowlaną o 20 μCi/ml [32P] Na2HPO4. Hoduj bakterie w temperaturze 37 °C i mieszaniu 1 200 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką umieszczonym za akrylową osłoną o grubości 9 mm.
  2. W fazie midlog (O.D.600 nm ~ 0,5) przenieś całą kulturę do probówki z zakrętką o pojemności 2 ml i osadź radioaktywne bakterie w temperaturze pokojowej, wirując przez 2 minuty przy 10 000 x g. Zebrać supernatant zawierający niewłączony radioaktywny ortofosforan do odpowiedniego pojemnika na odpady.

2. Przygotowanie całkowitej liczby RNA

UWAGA: Całkowite RNA są ekstrahowane z granulek bakteryjnych za pomocą komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA (zawierającego tiocyjanian guanidyny, fenol i chloroform) zgodnie z protokołem producenta.

  1. Dodać 1 ml dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji RNA i około 200 μl szklanych kulek na osad. Szczelnie zamknij probówkę i rozbij bakterię w homogenizatorze na 2 minuty przy maksymalnym zamieszaniu (ustawienie numer pięć na wybranym instrumencie (patrz Tabela Materiałów)).
  2. Odwirować próbkę o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i odpowiednio wyrzucić kulki. Dodaj 0,2 ml chloroformu i energicznie potrząsaj probówką ręcznie przez 15 sekund. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Pobrać fazę wodną próbki do nowej probówki, ustawiając probówkę pod kątem 45°. Unikaj rysowania jakiejkolwiek warstwy interfazowej lub organicznej. Dodać 2 μl kolorowego środka strącającego i 0,5 ml 100% izopropanolu. Potrząsaj energicznie tubką ręcznie przez 5 sekund. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
  4. Usunąć supernatant z probówki i odpowiednio wyrzucić, ponieważ frakcja ciekła może zawierać śladowe ilości promieniotwórczości. Suchy na powietrzu granulat przez 5 minut, a następnie ponownie zamieszać w 200 μL 2X cytrynian soli sodowej (SSC), 0,1% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) final.
    UWAGA: Skład zapasu 20 X SSC to 3,0 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu, pH 7,0.

3. Przygotowanie 96-dołkowych płyt do drukarek

UWAGA: mikromacierze tRNA są ręcznie drukowane z czterdziestoma dwoma 70-merowymi oligonukleotydami DNA komplementarnymi do końca 3' każdego M. smegmatis tRNA (z wyłączeniem terminala CCA) za pomocą ośmiopinowej tablicy. Podano sekwencje sond oligonukleotydowych DNA, jak również układ sondy w płytce studzienkowej i matrycy (plik uzupełniający 1 - arkusz 1 do 3 odpowiednio).

  1. Projektuj sondy DNA, najpierw pobierając sekwencje tRNA lub geny kodujące tRNA z baz danych tRNA, takich jak Genomic tRNA Database13. Przyciąć zachowany koniec 3' CCA, jeśli jest zakodowany. Odwrotne uzupełnienie wynikowej sekwencji. Zamów sondę na podstawie pierwszych 70 nukleotydów.
  2. Zawieś suche sondy DNA w wodzie. Dostosuj stężenie sondy do 100 μM. Na 96-dołkowej płytce przygotować 120 μl 50 μM oligonukleotydów w 3X SSC, 0,01% (w/v) SDS final (rozcieńczyć 60 μL sond wyjściowych w indywidualnym dołku z 60 μL 6X SSC, 0,01% (w/v) SDS.
  3. Przykryj płytę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu lub zanieczyszczeniu, natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.

4. Drukowanie tablicy

  1. Rozmrozić 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej (trwa około 20 minut).
  2. Oznacz szkiełka ze szkła pokrytego aminą pisakiem diamentowym. Umieść szkiełka w jednostce indeksującej. Postępuj zgodnie z rozmieszczeniem siatki i wykonaj następujące czynności.
    1. Ostrożnie zanurz kołki replikatora w studzienkach.
    2. Delikatnie wydrukuj tablicę na szkiełkach, używając minimalnego nacisku (poczujesz niewielki opór). Kontynuuj drukowanie bez czyszczenia macierzy, aż skończysz z blokiem A.
  3. Gdy będziesz gotowy do przejścia do następnego bloku, postępuj zgodnie z procedurą prania opisaną poniżej.
    1. Zanurz replikator w 5% wybielaczu i delikatnie wstrząśnij.
    2. Wciśnij replikator w papier chłonny.
    3. Zanurz replikator w wodzie destylowanej, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier. Powtórz ten krok raz.
    4. Zanurz replikator w izopropanolu, delikatnie wstrząśnij i wciśnij w papier.
    5. Wysuszyć replikator na wentylatorze przez około 20 sekund przed przejściem do następnego bloku płytki 96-dołkowej. Przejdź do żądanej liczby wydruków.
  4. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, a następnie usieciuj oligonukleotydy ze szkiełkiem za pomocą środka sieciującego UV o długości fali 254 nm.
    1. Ustaw poziom energii na 999,990 μJ/cm2.
    2. Połóż szkiełka stroną zadrukowaną do góry na czystej powierzchni w sieciowniku. Naciśnij "start".
  5. Zablokować matryce na noc w 450 ml roztworu blokującego na mieszadle magnetycznym, w temperaturze pokojowej i przy powolnym mieszaniu. Zbierz i ponownie użyj roztworu blokującego do czterech razy.
    UWAGA: Przepis na roztwór blokujący to: 125 mM bufor fosforanowy (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5X SSC, 1% BSA (w/v).
  6. Myć szkiełka 2 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej w 500 ml wody destylowanej. Wysuszyć szkiełka, wirując przez 10 s w temperaturze pokojowej w wirówce z mikromatrycą. Przechowuj tablice w suchym i ciemnym miejscu do 6 miesięcy.

5. Hybrydyzacja tablicy

  1. Przed hybrydyzacją przepłukać szkiełka we wrzącej wodzie i wysuszyć przez odwirowanie (jak w ppkt 4.6).
  2. Umieść matrycę w kasecie hybrydyzacyjnej i załaduj znakowaną radioaktywnie próbkę RNA.
  3. Uruchom zautomatyzowaną stację hybrydyzacji i mycia, aby uzyskać maksymalną powtarzalność.
    1. Kroki programu w następujący sposób. Kondycjonować uszczelki przez 2 minuty w temperaturze 75 °C. Wprowadzić sondę w temperaturze 60 °C.
      Denaturyzacja sond i próbek 5 minut w temperaturze 90 °C. Hybrydyzować próbki przez 3 godziny w temperaturze 60 °C.
      1. Umyć szkiełka w temperaturze 50 °C dwukrotnie za pomocą 2X SSC, 0,1% (w/v) SDS, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s. Umyć szkiełka w temperaturze 42 °C dwukrotnie za pomocą 0,1X SSC, 0,1% SDS, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s. Umyć szkiełka w temperaturze 42 °C dwukrotnie za pomocą 0,1 X SSC, przepływ 10 s i przytrzymać 20 s.
  4. Suche szkiełka przez odwirowanie (jak w ppkt 4.6).

6. Kwantyfikacja tablicy

  1. Owiń szkiełka cienką folią z tworzywa sztucznego. Sprawdź slajdy pod kątem sygnału radioaktywnego za pomocą licznika Geigera na jego najbardziej czułym ustawieniu. Umieść szkiełka na ekranie luminoforowym do przechowywania w kasecie naświetlającej w temperaturze pokojowej przez 10 do 90 godzin, w zależności od siły sygnału.
    UWAGA: Ponieważ czułość liczników Geigera różni się w zależności od instrumentu, czasy ekspozycji muszą być zoptymalizowane empirycznie.
  2. Zeskanuj szkiełko z rozdzielczością 50 μm za pomocą luminoobrazurów. Określ ilościowo i odejmij intensywność promieniotwórczości w każdym punkcie sondy za pomocą bezpłatnego oprogramowania Image J zaktualizowanego o profiler mikromacierzy.
  3. Organizuj i przetwarzaj dane za pomocą elektronicznego arkusza kalkulacyjnego. Generuj mapy skupień za pomocą narzędzia do formatowania warunkowego. Przedstaw na przykład każdy sygnał sondy jako ułamek (wyrażony w ‰) całkowitego sygnału sondy.

Wyniki

Trzy niezależne powtórzenia biologiczne wykazują, że w testowanych warunkach wzrostu wszystkie tRNA M. smegmatis są wyrażane powyżej poziomu tła (Rycina 1). W tym konkretnym eksperymencie zaobserwowane odchylenie standardowe dla każdej sondy mieści się w przedziale od 2% (Arg (TCT)) do 2% (Cys (GCA)), przy medianie wynoszącej 5% (Rycina 1). Błędne różnice między powtórzeniami są w znacznym stopniu uwarunkowane czynnikami takimi jak przygotowanie macierzy oraz hybrydyzacja. Wysoka powtarzalność została osiągnięta dzięki starannemu i spójnemu nanoszeniu macierzy, a także zautomatyzowanej hybrydyzacji próbek. Różnica między tRNA Ile (GAT) a tRNA Val (TAC) — odpowiednio najliczniejszym i najrzadszym gatunkiem — wynosi 5-krotność. Analiza SPOt wykazuje, że ekspresja izoakceptorów tRNA nie jest jednolita. Izoakceptory to gatunki, które przenoszą ten sam aminokwas, ale posiadają różne sekwencje antykodonów i w związku z tym dekodują różne kodony w mRNA. Na przykład wszystkie izoakceptory alaniny są wyrażane na podobnym poziomie, podczas gdy tRNA przyjmujące argininę o najwyższej i najniższej ekspresji różnią się 3-krotnie.

wyniki macierzy mikroarray wiązania tRNA; analiza plamek tRNA; wykres słupkowy porównujący M. smegmatis, M. musculus, H. sapiens.
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki makromaciierzy tRNA. (A) Zeskanowane makromacierze bakteryjne, mysie i ludzkie. M. smegmatis Macierze wykorzystują jedynie 43 sondy zamiast 48 dla myszy i człowieka. W konsekwencji macierz bakteryjna wykazuje 40 pustych punktów (sondy są powielone ośmiokrotnie na każdej macierzy), które zlewają się z tłem. Większość z nich skupiona jest w lewym górnym rogu. (B) Reprezentacje w formie histogramu i mapy ciepła profili tRNA w M. smegmatis w optymalnych warunkach wzrostu. Sygnały sond stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów (obejmujących wzrost bakterii, znakowanie metaboliczne, ekstrakcję i hybrydyzację macierzy) i są wyrażone jako wartości na tysiąc całkowitej liczby tRNA. Odchylenia standardowe dla trzech powtórzeń zaznaczono odpowiednio w postaci słupków błędu na histogramie oraz odcieni pomarańczowego na mapie ciepła. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Emisje cząstek beta są znanymi czynnikami bakteriostatycznymi i bakteriobójczymi14, jednak promieniowanie w badanym zakresie nie ma znaczącego wpływu na sprawność komórek. Zliczanie scyntylacyjne wykazało, że radioaktywność jest włączana do 25% ekstraktów komórkowych, a następnie do 1% oczyszczonych całkowitych RNA.

Identyczne rozmiary sond, porównywalna temperatura topnienia i zawartość GC, wraz z jednolitym protokołem wykrywania makromacierzy, hybrydyzacji i kwantyfikacji pozwalają na bezstronny pomiar poziomów tRNA bezpośrednio z sygnałów punktowych.

SPOt jest powtarzalny i specyficzny. Jego duży zakres dynamiki i łatwo regulowany próg umożliwiają profilowanie gatunków o niskiej liczebności, takich jak tRNA związane z polisomami, po prostu poprzez wydłużenie czasu ekspozycji matrycy9. Po początkowej inwestycji w niezbędny sprzęt koszt eksploatacji na próbkę, w tym materiały eksploatacyjne, wynosi średnio 15 USD za próbkę.

SPOt ma zastosowanie do każdego organizmu, którego genom jest dostępny do zaprojektowania sondy. Organizmy modelowe hodowane in vitro są idealnymi kandydatami do znakowania metabolicznego. Ponieważ genomy ssaków często kodują wiele izodekoderów (tRNA, które mają identyczne antykodony, ale wykazują niewielkie różnice w sekwencjach ciała), sondy muszą być częściowo zdegenerowane, aby zachować jednorodną hybrydyzację bliskich gatunków tRNA. Wreszcie, przylegające komórki ssaków dają zazwyczaj mniejsze ilości całkowitego RNA w porównaniu z organizmami hodowanymi w zawiesinie, takimi jak M. smegmatis, więc hodowle muszą być znacznie zwiększone.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant SC INBRE z National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 do R.G.) oraz granty CA555536 & CA154664 z National Cancer Institute dla P.H.H. Program ten był częściowo wspierany przez grant dla College of Charleston z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach Programu Edukacji Przedszkolnej i Licencjackiej oraz przez granty z National Center for Research Resources (5 P20 RR016461) i National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) z National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System indeksowania szkiełV& P Naukowy, Inc.VP 470
Replikator prowadnic szklanychV& P Naukowy, Inc.VP 478
96-dołkowy system indeksowania mikropłytekV& P Naukowy, Inc.VP 472
Stacja do mycia i osuszaniaV& P Naukowy, Inc.VP 475
Suszarka do sworzni replikatoraV& P Naukowy, Inc.VP 474
Szkiełka powlekane aminąUrządzenia molekularneK2615
Hybrydyzator / Zautomatyzowana stacja hybrydyzacji i myciaDigilabHyb10022
Inkubator z wytrząsarkąEppendorf Themomixer05-400-200
Zakrętka rurki 2 mlThermo Scientific21-403-201
[32P] Na2HPO4Perkin Elmer
Tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform (Trizol)Invitrogen15596026
Koraliki szklane 0,5 mmResearch Products International Corp.9831
Mini młyn do kulekVWR25-020
Przechowywanie sita fosforowegoFujifilmBAS-IP SR 0813
PhosphorimagerGE HealthcareTyphoon FLA7000
Oligonukleotydy DNAIdtN/A
Środek sieciujący UVSpectrolineSelect series 254 nm
Wirówka mikromacierzowaArrayit CorporationMHC110V
Mycobacterium smegmatisATCC700084
Igły jednorazowego użytkuBD (Becton Dickinson)305185
probówka wirówkowa 2 mlFisherbrand14-666-317
Środek strącający (GlucoBlue)InvitrogenAM9516
7H9 bulionDifco271310
ChloroformFisher ChemicalsC298-500
IzopropanolFisher ChemicalsA451-4
20 X SSCLonza51205
SDSFisher BioreagentsBP166-100
GE Healthcare63-0035-44
GlicerolFisher ScientificBP229-1
Tween 80AmrescoM126-100ML
NaClFisher ScientificBP358-212
Chemikalia o spektrumalbuminA3611
DekstrozaFisher ChemicalsD16-1
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Odczynniki FisherBP2482-500
0,5 M Bufor fosforanowy pH 7,2Alfa AesarAAJ63974AP
NEX011001MC Kaseta do hybrydyzacji

Bibliografia

  1. Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
  2. Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221(2006).
  3. Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
  4. Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
  5. Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
  6. Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
  7. Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
  8. Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
  9. Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939(2017).
  10. Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).
  11. Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
  12. Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
  13. Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
  14. Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie tRNAanaliza makromacierzyekstrakcja RNAradioaktywny ortofosforanhybrydyzacja tRNAkwantyfikacja za pomoc fosforobrazeraMycobacterium smegmatisprojektowanie sonddrukowanie macierzy
Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.