Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56906

⸱

12 marca 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Streszczenie

Agregacja białek jest główną cechą większości chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Parkinsona (PD), choroby Huntingtona (HD) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Agregaty białkowe są ściśle związane z neuropatologią w tych chorobach, chociaż dokładny mechanizm, za pomocą którego nieprawidłowa agregacja białek zakłóca normalną homeostazę komórkową, nie jest znany. Pojawiające się dane dostarczają silnego wsparcia dla hipotezy, że patogenne agregaty w AD, PD, HD i ALS mają wiele podobieństw do prionów, które są czynnikami zakaźnymi odpowiedzialnymi za pasażowalne encefalopatie gąbczaste. Priony samoreplikują się, proponując konwersję natywnie sfałdowanych wersji tego samego białka, powodując rozprzestrzenianie się fenotypu agregacji. To, w jaki sposób priony i białka podobne do prionów w chorobach Alzheimera, Choroby Parkinsona, HD i ALS przemieszczają się z jednej komórki do drugiej, jest obecnie przedmiotem intensywnych badań. W tym artykule opisano model Drosophila melanogaster, który pozwala na monitorowanie prionopodobnej, międzykomórkowej transmisji zmutowanych agregatów huntingtyny (Htt) związanych z HD. Model ten wykorzystuje potężne narzędzia do manipulowania ekspresją transgenów w wielu różnych tkankach Drosophila i wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie białko cytoplazmatyczne do bezpośredniego raportowania podobnego do prionów transferu zmutowanych agregatów Htt. Co ważne, opisywane przez nas podejście może być wykorzystane do identyfikacji nowych genów i szlaków, które pośredniczą w rozprzestrzenianiu się agregatów białkowych między różnymi typami komórek in vivo. Informacje uzyskane z tych badań poszerzą ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów patogennych leżących u podstaw chorób neurodegeneracyjnych i ujawnią nowe możliwości interwencji terapeutycznej.

Wprowadzenie

Hipoteza prionowa mówi, że czynnik zakaźny odpowiedzialny za zakaźne encefalopatie gąbczaste (np. choroba Creutzfeldta-Jakoba u ludzi, trzęsawka u owiec, przewlekła choroba wyniszczająca u jeleni i łosi oraz "choroba szalonych krów" u bydła) składa się wyłącznie z białka i jest pozbawiona kwasów nukleinowych1. W chorobach prionowych komórkowe białko prionowe (PrPC) przyjmuje nienatywny, stabilny fałd (PrPSc), który jest wysoce bogaty w arkusze beta i może się samorozprzestrzeniać poprzez przekształcanie i rekrutację monomerycznych cząsteczek PrPC w stabilne agregaty amyloidowe. Agregacje PrPSc wykorzystują ten samoreplikujący się mechanizm do rozprzestrzeniania się między różnymi komórkami organizmu, a nawet między pojedynczymi organizmami2.

Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek jest również główną cechą większości chorób neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS))3. Powstawanie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowych zagregowanych zespołów białkowych w tych chorobach jest ściśle związane z cytotoksycznością4 i postępuje wzdłuż wysoce powtarzalnych i specyficznych dla choroby ścieżek przez mózg w czasie5,6. Te wzorce rozprzestrzeniania się sugerują, że agregaty chorobotwórcze związane z tymi zaburzeniami mają właściwości podobne do prionów. Obecnie istnieje silne poparcie dla podobnej do prionów transmisji agregatów związanych z AD, PD, HD i ALS - rozprzestrzeniają się one z komórki do komórki i tworzą matrycę zmiany konformacyjnej monomerycznych form tego samego białka w wcześniej niedotkniętych komórkach7,8.

Większość dotychczasowych badań nad prionowym rozprzestrzenianiem się agregatów białkowych została przeprowadzona przy użyciu modeli hodowli komórek ssaków, gdzie agregaty przenoszą się do cytoplazmy komórek naiwnych z przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub z cytoplazmy innej komórki9,10,11,12,13,14,15, lub poprzez wstrzyknięcie materiału zawierającego agregat do mózgów myszy i monitorowanie wyglądu agregatu poza miejscem wstrzyknięcia16,17,18,19,20,21,22,23. Ostatnio transgeniczne zwierzęta zostały wykorzystane do wykazania, że wewnątrzkomórkowe agregaty rozprzestrzeniają się na inne komórki w nienaruszonych mózgach24,25,26,27,28,29,30. W tym miejscu opisujemy metodę bezpośredniej wizualizacji zagregowanego transferu między poszczególnymi komórkami w nienaruszonym mózgu Drosophila melanogaster. Modele chorób HD/poliglutaminy (polyQ) zostały po raz pierwszy opracowane prawie dwie dekady temu31,32 i dostarczyły wielu bezcennych informacji na temat mechanizmów patogennych, które leżą u podstaw tych zaburzeń33. Choroba Huntingtona jest dziedziczną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną autosomalną dominującą mutacją w genie kodującym białko huntingtynę (Htt)34. Mutacja ta powoduje ekspansję odcinka polyQ w pobliżu N-końca Htt poza próg patogenny ~ 37 glutamin, powodując nieprawidłowe fałdowanie i agregację białka35,36. Białka Htt typu dzikiego zawierające <37 glutaminy na tym odcinku osiągają swoje natywne fałdowanie, ale mogą być indukowane do agregacji po bezpośrednim kontakcie fizycznym z agregatem Htt "seed"12,27,37. Wykorzystujemy tę homotypową, jądrzastą agregację Htt typu dzikiego jako odczyt dla transferu podobnego do prionów i cytoplazmatycznego wejścia zmutowanych agregatów Htt pochodzących z innych komórek.

Określenie mechanizmów, za pomocą których agregaty podobne do prionów przemieszczają się między komórkami, może prowadzić do identyfikacji nowych celów terapeutycznych dla nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych. Wykorzystujemy szybki cykl życiowy, łatwość użycia i wykonalność genetyczną Drosophila melanogaster, aby zdefiniować mechanizmy molekularne rozprzestrzeniania się zmutowanych agregatów Htt z komórki na komórkę. Nasza strategia eksperymentalna wykorzystuje dwa binarne systemy ekspresji dostępne u Drosophila, dobrze znany system sekwencji aktywującej specyficzną dla Gal4 (Gal4-UAS)38 oraz niedawno opracowany system QF-QUAS39. Sprzężenie tych dwóch niezależnych systemów pozwala na ograniczenie ekspresji zmutowanych i dzikich transgenów Htt do różnych populacji komórek w obrębie tej samej klasy fly40. Korzystając z tego podejścia, badamy podobne do prionów rozprzestrzenianie się zmutowanego Htt poprzez monitorowanie redystrybucji cytoplazmatycznego Htt typu dzikiego z jego normalnie rozproszonego, rozpuszczalnego stanu do stanu zagregowanego, co jest bezpośrednią konsekwencją fizycznego kontaktu z wcześniej uformowanym zmutowanym agregatem Htt "nasiona". Konwersję Htt typu dzikiego przez zmutowane Htt można potwierdzić za pomocą technik biochemicznych lub biofizycznych, które informują o interakcjach białko-białko, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)9,27,41.

Co ważne, możemy również uzyskać dostęp do dużej liczby narzędzi genetycznych u Drosophila, aby zidentyfikować geny i/lub szlaki, które pośredniczą w podobnym do prionów rozprzestrzenianiu się agregatów białkowych. Niedawno zastosowaliśmy to podejście, aby odkryć kluczową rolę receptora zmiatacza powierzchni komórki, Draper42,43, w przenoszeniu zmutowanych agregatów Htt z aksonów neuronalnych do pobliskiego gleju fagocytarnego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) Drosophila27. Tak więc podejście oparte na genetyce i obrazowaniu, które tutaj opisujemy, może ujawnić ważne podstawowe informacje biologiczne na temat zjawiska istotnego z punktu widzenia choroby w prostym w użyciu, ale potężnym organizmie modelowym, Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Łączenie ekspresji transgenu Htt zapośredniczonej przez Gal4 i QF u Drosophila

  1. Zebrać i/lub wygenerować transgeniczne linie Drosophila melanogaster zawierające tkankowo specyficzne „sterowniki” (drivers) Gal4 lub QF, a także linie zawierające transgeny Htt typu dzikiego lub zmutowane, znajdujące się poniżej Gal4-UAS38 lub QF-QUAS39. Należy upewnić się, że białka ekspresowane z tych transgenów są połączone z białkami fluorescencyjnymi lub posiadają znaczniki epitopowe, aby umożliwić rozróżnienie produktów transgenu Htt zmutowanego i typu dzikiego w tej samej muszce. Patrz Rysunek 1.
    UWAGA: Zazwyczaj stosujemy fragmenty eksonu 1 ludzkiego genu Htt27. Można jednak wygenerować transgeniczne muszki ekspresujące dłuższe fragmenty Htt lub inne geny, jeśli jest to pożądane.
  2. Zaplanować strategię genetyczną w taki sposób, aby transgeny Htt zmutowane i typu dzikiego były ekspresjonowane w odrębnych, niezakładających się populacjach komórek.
    1. Jeśli wystąpi jakiekolwiek nakładanie się ekspresji, białka Htt zmutowane i typu dzikiego syntetyzowane w tych samych komórkach będą współagregować, co uniemożliwi wykrycie zdarzeń prionopodobnych. Aby tego uniknąć, należy zastosować odpowiednio specyficzne represory Gal4 i QF, Gal80 oraz QS40 (Rysunek 1). Wybór sterowników Gal4 i/lub QF kontrolowanych rozwojowo może pomóc ograniczyć ekspresję zmutowanego Htt do komórek pomitotycznych, eliminując możliwość, że podziały komórkowe mogłyby przyczynić się do rozprzestrzeniania się agregatów między komórkami.
  3. Stosując standardowe warunki hodowli, skrzyżować muszki w celu uzyskania potomstwa, które ekspresuje zmutowane Htt za pomocą QF (lub Gal4) w populacji komórek „donora” oraz Htt typu dzikiego za pomocą Gal4 (lub QF) w populacji komórek „biorcy”. Patrz Rysunek 1 w celu zapoznania się ze schematem przedstawiającym możliwą kombinację genetyczną.
    UWAGA: Sterowniki QF i Gal4, które zostały użyte do wygenerowania danych przedstawionych na Rysunkach 1–4 oraz w naszej poprzedniej publikacji27, obejmują sterownik neuronów receptorowych węchowych (ORN) DA1, Or67d-QF, oraz pan-glialny sterownik repo-Gal4.
  4. Równolegle wygenerować muszki kontrolne, które ekspresują Htt typu dzikiego w populacjach komórek znakowanych zarówno QF, jak i Gal4.
  5. Zebrać potomstwo o pożądanym genotypie i pozostawić zwierzęta do osiągnięcia odpowiedniego wieku.

Systemy QF-QUAS i Gal4-UAS; schemat; kontrola ekspresji genów; donor-akceptor; proces komórkowy.
Rycina 1. Podejście genetyczne do sprzężonej ekspresji mutantowych i dzikich transgenów Htt z wykorzystaniem binarnych systemów ekspresyjnych QF-QUAS i Gal4-UAS. W „komórce A” białko mutantowe Htt znakowane mCherry, zawierające patogeniczny odcinek polyQ (Q91), jest eksprimowane przy użyciu drivera QF zlokalizowanego w regionie downstream tkankowo-specyficznego promotora A („PA”). W „komórce B” białko Htt typu dzikiego znakowane YFP, zawierające prawidłowy odcinek polyQ (Q25), jest eksprimowane za pośrednictwem drivera Gal4 kontrolowanego przez tkankowo-specyficzny promotor B („PB”). Na Rycina 2-4 użyto Or67d-QF do stymulacji ekspresji QUAS-HttQ91-mCherry w ORN DA1, a repo-Gal4 do ekspresji UAS-HttQ25-YFP we wszystkich gliach27. Co ważne, HttQ91-mCherry jest eksprimowane wyłącznie w komórkach wykazujących ekspresję QF dzięki sekwencji QUAS umieszczonej w regionie upstream transgenu. Podobnie, HttQ25-YFP jest eksprimowane wyłącznie za pośrednictwem Gal4, który specyficznie rozpoznaje UAS. Jeśli zostanie wykryte jakiekolwiek nakładanie się dystrybucji tkankowej driverów QF i Gal4, można wprowadzić transgeny kodujące QS w komórkach eksprimujących Gal4 oraz Gal80 w komórkach eksprimujących QF. Dołączenie fluorescencyjnych znaczników białkowych do Htt typu dzikiego i mutantowego pozwala na rozróżnienie obu białek podczas obrazowania oraz umożliwia pomiar FRET pomiędzy odpowiednimi parami donor/akceptor (np. CFP/YFP lub YFP/mCherry). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Mikrosekcja i utrwalanie mózgów dorosłych Drosophila

Uwaga: Niniejsza procedura sekcji została zmodyfikowana na podstawie wcześniejszej publikacji44 i może być wykorzystana do przygotowania mózgów do obrazowania bezpośredniego sygnału fluorescencyjnego z fuzji białka Htt z białkiem fluorescencyjnym. Modyfikacje procedury, które można wprowadzić w celu przeprowadzenia immunostainingu mózgów, są omówione w następnej sekcji.

  1. Przygotować następujące materiały i umieścić je w lodzie: fosforanowo-buforowy roztwór soli zawierający 0,03% Triton X-100 (PBS/T); probówki do mikrocentryfugi zawierające 970 µL 4% roztworu utrwalającego paraformaldehydu (PFA), przygotowanego poprzez dodanie 200 µL 20% PFA do 770 µL PBS/T; przezroczyste szklane naczynie z wgłębieniami; jednorazową pipetę transferową; dwie pęsety sekcyjne (jedną nr 3 i jedną nr 5).
  2. Zanurzyć dorosłe muchy w CO2 w celu znieczulenia, a następnie przenieść je do jednego z wgłębień szklanego naczynia umieszczonego w lodzie.
  3. Za pomocą pipety transferowej dodać niewielką ilość (~ 500 µL) zimnego PBS/T do wgłębienia z muchami oraz do pustego wgłębienia. Należy unikać wprowadzania zbyt wielu pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one utrudniać sekcję.
  4. Umieścić szklane naczynie na płaskiej powierzchni pod mikroskopem sekcyjnym i dostosować powiększenie tak, aby ciało muchy wypełniało pole widzenia i było w ostrości.
  5. Ustawić dwa elastyczne źródła światła tak, aby oświetlały obie strony szklanego naczynia. Pod naczyniem umieścić złożoną chusteczkę laboratoryjną do odkładania części ciała i kutykuli podczas sekcji.
  6. Używając pęsety nr 3 w niedominującej ręce, przenieść jedną muchę do wgłębienia zawierającego PBS/T. Unieruchomić muchę, chwytając ją za odwłok stroną brzuszną do góry.
  7. Trzymając muchę całkowicie zanurzoną w PBS/T, odciąć głowę muchy za pomocą pęsety nr 5 w dominującej ręce. Wsunąć jeden koniec pęsety pod kutykulę w niewielką przestrzeń sąsiadującą z trąbką po jednej stronie głowy muchy. Zabezpieczyć uchwyt głowy, zaciskając pęsetę tak, aby objąć oko z obu stron.
  8. Oddzielić głowę muchy od ciała, rozsuwając obie pęsety. Odłożyć ciało muchy na znajdującą się w pobliżu chusteczkę laboratoryjną. Utrzymać nacisk pęsety w dominującej ręce, aby nie zgubić głowy muchy.
  9. Umieścić jeden koniec pęsety nr 3 w niedominującej ręce w tej samej małej przestrzeni pod kutykulą po drugiej stronie trąbki. Po ustawieniu zacisnąć pęsetę, aby uchwycić oczy w tym samym miejscu po obu stronach głowy.
  10. Po pewnym uchwyceniu kutykuli, ostrożnie rozsunąć pęsety pod kątem 180°. Czynność ta spowoduje rozłupanie kutykuli głowy bez uszkodzenia mózgu. Resztki kutykuli usunąć na chusteczkę laboratoryjną.
    1. Mimo że jest to sytuacja idealna, kutykula głowy może nie zostać całkowicie usunięta w jednym kroku. W takim przypadku usuwać kutykulę fragment po fragmencie, aż mózg zostanie całkowicie odsłonięty. Należy uważać, aby nie uszkodzić mózgu, unikając bezpośredniego kontaktu z pęsetami.
  11. Wyjąć wypreparowany mózg z PBS/T, chwytając za przytwierdzoną tchawicę lub aspirując mózg w przestrzeń między końcówkami pęset dzięki działaniu kapilarnemu.
    UWAGA: Usunięcie tchawicy jest opcjonalne, ponieważ zazwyczaj nie zasłania ona płatów antenowych na przedniej powierzchni mózgu, gdzie zazwyczaj wykonuje się obrazowanie. Jeśli jednak tchawica przeszkadza w obrazowaniu, należy ją ostrożnie usunąć, tak aby nie uszkodzić mózgu podczas tej manipulacji.
  12. Przenieść mózg muchy do jednej z probówek do mikrocentryfugi zawierających roztwór utrwalający w lodzie. Upewnić się, że mózg oddzielił się od pęsety i jest zanurzony w roztworze utrwalającym.
  13. Po wypreparowaniu wszystkich mózgów poddać je „krótkiej utrwalaniu”, umieszczając zamknięte probówki na nutatorze przez ~ 5 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    ​UWAGA: Ten krótki etap utrwalania sprawia, że mózgi są łatwiejsze w obsłudze w kolejnych krokach i nie przylegają do ścianek probówki do mikrocentryfugi.
  14. Usunąć większość roztworu utrwalającego za pomocą pipety P1000 i ją wylać.
    1. Unikać aspirowania mózgów z probówki podczas tego i każdego kolejnego etapu płukania. Ustawić pipetę P1000 na mniejszą objętość (np. 650 µL) i usunąć nadsącz w dwóch krokach. Dodatkowo, podczas aspiracji trzymać probówki do mikrocentryfugi w linii ze źródłem światła (np. oświetleniem górnym), aby lepiej widzieć mózgi.
  15. Dodać 1 mL świeżego PBS/T do mózgów. Płukać szybko (< 1 min) w ciemności, aspirować nadsącz z mózgów i wylać.
  16. Powtórzyć płukanie PBS/T w ciemności w temperaturze pokojowej zgodnie z następującym harmonogramem: 2 szybkie płukania (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min i 1 X 1 h. Zamknąć probówki do mikrocentryfugi i umieszczać je na nutatorze pomiędzy płukaniami.
    1. Jeśli pożądane jest barwienie DAPI, zastąpić ostatnie płukanie trwające 1 h inkubacją 1 X 30 min z DAPI w stężeniu 250 ng/mL rozpuszczonym w PBS/T, a następnie wykonać 2 X szybkie i 1 X 20-minutowe płukania.
  17. Po ostatnim płukaniu usunąć większość nadsączu z buforu do płukania, uważając, aby nie poruszyć mózgów, i dodać do mózgów 30 µL odczynnika antyfadingowego na bazie glicerolu. Inkubować w 4 °C w ciemności bez ruchu przez co najmniej 1 h, maksymalnie do 24 h.

3. Modyfikacje sekcji 2 w celu przeprowadzenia immunostainingu mózgów dorosłych osobników

Uwaga: Należy stosować ten protokół do obrazowania białek niefluorescencyjnych lub fuzji białek fluorescencyjnych o słabej fluorescencji.

  1. Zwiększ 10-krotnie stężenie Triton X-100 w PBS/T (PBS + 0,3% Triton X-100) dla każdego etapu. Zapewnia to obecność wystarczającej ilości detergentu do permeabilizacji błon komórkowych i umożliwia przeciwciałom dostęp do przestrzeni wewnątrzkomórkowych.
  2. Utrwal mózgi w 4% PFA w PBS/T przez 20 min w temperaturze pokojowej.
  3. Po wykonaniu wszystkich etapów przemywania inkubuj mózgi w świeżo przygotowanym buforze blokującym (PBS/T + 5% normalnego surowicy koziej (NGS)) przez 30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Usuń i wylej bufor blokujący. Do każdej probówki dodaj 0,5 mL roztworu przeciwciał pierwszorzędowych przygotowanego jako master mix poprzez odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w świeżym buforze blokującym (zob. Tabela materiałów w celu sprawdzenia powszechnie stosowanych przeciwciał i rozcieńczeń). Inkubuj mózgi z przeciwciałami pierwszorzędowymi na nutatorze przez co najmniej 24 h w temperaturze 4 °C w ciemności.
  5. Usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych z probówek za pomocą pipety P1000 i przechowuj go w nowej probówce. Dodaj 1 mL PBS/T, aby przemyć mózgi.
    UWAGA: Zachowany roztwór przeciwciał pierwszorzędowych można przechowywać w temperaturze 4 °C do czterech tygodni. Z powodzeniem odzyskiwaliśmy przeciwciała pierwszorzędowe do dwóch razy w kolejnych eksperymentach.
  6. Przemyj mózgi szybko (< 1 min) w PBS/T, odessij nadsącz z probówek i wylej go. Powtórz to szybkie przemywanie jeszcze raz.
  7. Kontynuuj przemywanie 1 mL PBS/T w temperaturze pokojowej zgodnie z następującym harmonogramem: 1 x 5 min, 3 x 20 min oraz 1 x 1 h. Zamknij szczelnie probówki do mikrocentryfugi i umieść je na nutatorze podczas przemywania.
  8. Po ostatnim przemywaniu usuń większość nadsączu PBS/T i dodaj 0,5 mL roztworu przeciwciał drugorzędowych przygotowanego jako master mix poprzez odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał w świeżym buforze blokującym (zob. Tabela materiałów w celu sprawdzenia powszechnie stosowanych przeciwciał i rozcieńczeń). Inkubuj mózgi z przeciwciałami drugorzędowymi przez 24 h w temperaturze 4 °C w ciemności.
  9. Po inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi powtórz etapy przemywania opisane w krokach 3.5, 3.6 i 3.7.
  10. Po końcowym przemywaniu usuń większość buforu do przemywania i upewnij się, że wszystkie mózgi znajdują się na dnie probówki. Dodaj do mózgów 30 µL odczynnika antyblaknącego (antifade). Inkubuj w temperaturze 4 °C w ciemności, bez mieszania, przez 16–24 h.

4. Montowanie całego mózgu

  1. Umieść szklany preparat mikroskopowy pod mikroskopem stereoskopowym i opisz go za pomocą informacji identyfikacyjnych.
    UWAGA: Alternatywnie mózgi można zamontować bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym, aby uzyskać dostęp do obu stron mózgu podczas obrazowania. Protokół opisujący tę procedurę montażu został opublikowany wcześniej45.
  2. Wyjmij mózgi z każdej probówki do mikrocentryfugi za pomocą stępionego końcówki pipety (przygotowanej za pomocą żyletki poprzez odcięcie dolnych ~ 1 cm końcówki 1-200 µL) i przenieś je na środek preparatu. Przenieś jak najmniej odczynnika antifade wraz z mózgami.
  3. Użyj pęsety, aby ustawić mózgi w pożądanej orientacji (np. stroną grzbietową skierowaną ku górze preparatu i powierzchnią przednią skierowaną do góry w celu obrazowania płata antenowego). Podczas orientowania mózgów weź pod uwagę drogę światła mikroskopu, który będzie użyty do ich obrazowania.
  4. Usuń nadmiar odczynnika antifade z preparatu za pomocą zaostrzonego rogu złożonej chusteczki laboratoryjnej, nie poruszając mózgami. Pozostaw preparat na ~ 5-10 min w ciemności, aby mózgi przylgnęły do szkła.
  5. Otocz mózgi muchy czterema małymi kawałkami rozbitego szkiełka nakrywkowego, umieszczając je po każdej stronie mózgów, tak aby utworzyły kwadrat o wymiarach ~ 19 mm x 19 mm. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego nr 1.5 o wymiarach 22 mm x 22 mm tuż poza jednym z tych małych kawałków szkła i delikatnie opuść szkiełko na mózgi, aby dokończyć montaż pomostowy.
  6. Powoli dozuj świeży odczynnik antifade, aby wypełnić przestrzeń pod szkiełkiem nakrywkowym, uważając, aby nie poruszyć szkiełka ani mózgów. Wytrzyj nadmiar odczynnika antifade za pomocą zaostrzonego rogu złożonej chusteczki laboratoryjnej, unikając bezpośredniego kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym.
  7. Nałóż kroplę bezbarwnego, szybkoschnącego lakieru do paznokci na każdy z czterech rogów szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na ~ 10 min. Następnie uszczelnij cztery krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci, aby całkowicie zamknąć mózgi.
  8. Obrazuj mózgi natychmiast lub przechowuj w 4 °C do momentu rozpoczęcia pracy.
    1. W przypadku obrazowania fluorescencji wewnątrzpochodnej z fuzji białka Htt-fluorescencyjnego, obrazuj mózgi w ciągu 24 h, aby uzyskać najlepszy sygnał.

5. Obrazowanie i kwantyfikacja prionopodobnej transmisji agregatów

  1. Wykonaj obrazowanie zamocowanych mózgów za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40X lub 60/63X, aby zebrać obrazy przekrojów z w obszarze mózgu, w którym eksprymowane są wybrane drivery Gal4 i QF (Rysunek 2A, B).
    1. Wzbudź fuzje białek fluorescencyjnych lub białka znakowane immunochemicznie za pomocą odpowiednich laserów (np. 488 nm dla GFP/YFP/FITC lub 552 nm dla mCherry/Cy3). Ustaw okna detekcji tak, aby uchwycić maksymalny sygnał fluorescencyjny przy jednoczesnej eliminacji przesłuchów między kanałami, korzystając z systemu detekcji spektralnej lub filtrów emisyjnych pasmowych/długoprzepustowych specyficznych dla każdego fluoroforu.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obrazowania agregatów białkowych. Piksele w centrum każdego agregatu mogą łatwo ulec nasyceniu, szczególnie w przypadku większych agregatów. Staraj się zminimalizować nasycenie na obrazie, mając jednak na uwadze ryzyko utraty sygnału z mniejszych form zagregowanych (Rysunek 2B, C, D). Zbyt duże nasycenie zwiększy tło obrazu, co utrudni identyfikację odizolowanych punktów (puncta). Przed wykonaniem końcowych obrazów w każdym zestawie danych przetestuj różne ustawienia obrazowania w celu ich optymalizacji.
  2. Przeanalizuj dane poprzez kwantyfikację poszczególnych punktów, wykonując to ręcznie poprzez przeglądanie pojedynczych przekrojów z (np. Rysunek 2C oraz Rysunek 4A) lub po wyrenderowaniu przekrojów konfokalnych w 3 wymiarach (Rysunek 3A, B).
    ​UWAGA: Można to wykonać w programie Image J lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazów.
    1. Jeśli agregaty są dobrze odseparowane, a fluorescencja tła jest minimalna, użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby systematycznie identyfikować, kwantyfikować i analizować agregaty jako odrębne „obiekty” lub „powierzchnie” w rekonstrukcji 3D stosu konfokalnego (Rysunek 3B).
      UWAGA: Opisane czynności programowe są specyficzne dla instrumentu i oprogramowania użytego w tej procedurze (patrz Tabela Materiałów).
      1. Zwizualizuj serię z konfokalną w trybie widoku 3D. Użyj kreatora „Analysis”, aby zidentyfikować poszczególne punkty w wybranym kanale (np. kanale czerwonym dla agregatów HttQ91-mCherry na Rysunku 3). Dostosuj progowanie i filtry, aby dokładnie przedstawić wszystkie agregaty o niejednorodnych rozmiarach jako oddzielne obiekty na obrazie.
      2. Włącz funkcję „Split objects” w sekcji „Binary Processing Pre-Filter”, aby rozdzielić blisko położone agregaty, które zostały błędnie połączone przez algorytm oprogramowania. Całkowita liczba obiektów oraz powiązane z nimi pomiary są raportowane w sekcji „Measurements”.
        UWAGA: Ta metoda kwantyfikacji agregatów mutantnego Htt nie nadaje się do protokołu immunobarwienia, ponieważ centrum agregatów amyloidalnych jest nieprzenikalne dla przeciwciał. W rezultacie agregaty widoczne są w mikroskopie jako struktury pierścieniowate, a oprogramowanie do analizy obrazu nie jest w stanie dokładnie zidentyfikować i rozróżnić tych poszczególnych „punktów”.
    2. Kwantyfikuj agregaty Htt typu dzikiego poprzez ręczne przeglądanie stosu z i ocenianie agregatów Htt typu dzikiego, upewniając się, że żadne agregaty nie zostały policzone dwukrotnie, jeśli pojawiają się na więcej niż jednym przekroju (Rysunek 4A).
      UWAGA: To podejście do ręcznej kwantyfikacji można stosować, gdy liczba agregatów w każdym stosie konfokalnym jest umiarkowana (np. 20-50). Jest ono również pomocne, gdy oprogramowanie do analizy obrazu nie potrafi odróżnić poszczególnych punktów od sygnału otaczającego w tym samym kanale (np. sygnału z rozproszonego Htt typu dzikiego w pobliskich komórkach) (Rysunek 2B, C oraz Rysunek 4A). Kwantyfikacja agregatów Htt typu dzikiego może być również trudna, ponieważ wiele normalnych struktur w mózgu ma charakter punktowy (np. wypustki komórkowe i synapsy). Ko-lokalizacja sygnałów Htt typu dzikiego i mutantnego może służyć jako kryterium selekcji; możliwe jest jednak, że niektóre „ziarna” (seeds) mutantnego Htt znajdują się poniżej granicy detekcji mikroskopu konfokalnego. Do znakowania niepowiązanych struktur punktowych w mózgu można użyć białka innego niż Htt, które nie agreguje w komórkach biorcy (np. GFP).
  3. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby przeprowadzić dalszą charakterystykę poszczególnych agregatów. Na przykład określ rozkład wielkości agregatów (Rysunek 3C), procent ko-lokalizacji między białkami Htt mutantnym a typu dzikiego (Rysunek 4A) lub bezpośrednio zmierz oddziaływania białko-białko za pomocą FRET (Rysunek 4B).
    1. Określ rozkład wielkości poszczególnych punktów za pomocą algorytmu detekcji punktów lub powierzchni, który dokładnie identyfikuje wszystkie widoczne agregaty w danym kanale. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby wykonać odpowiednie pomiary punktów lub powierzchni, np. uzyskując informacje o „średnicy agregatu” (Rys. 3C), „objętości” lub „intensywności” z sekcji „Measurements” w kreatorze „Analysis” opisanym w kroku 5.2.1.
      UWAGA: Na Rysunku 3C przedstawiamy rozkład średnic dla wszystkich punktów HttQ91-mCherry zidentyfikowanych w jednym kłębku DA1.
    2. Określ procent ko-lokalizacji między agregatami HttQ25-YFP a HttQ91-mCherry poprzez ręczne przeglądanie przekrój po przekroju stosu konfokalnego z (metoda najdokładniejsza). Należy jednak uważać, aby nie liczyć żadnego agregatu dwukrotnie. Aby temu zapobiec, licz agregaty w danym przekroju z tylko wtedy, gdy płaszczyzna ostrości przechodzi przez centrum agregatu (Rysunek 4A).
    3. Oblicz wydajność FRET dla indukowanych agregatów HttQ25-YFP z ko-lokalizowanym sygnałem HttQ91-mCherry, stosując metodę fotowybielania akceptora.
      1. Najpierw wyeliminuj potencjalne przesłuchy między kanałami YFP i mCherry poprzez ustalenie okien detekcji dla sygnałów wyłącznie mCherry i wyłącznie YFP, które nie generują sygnału w drugim kanale. Korzystając z tych ustawień, wykonaj „obraz przed” (before image) poszczególnych punktów HttQ25-YFP i powiązanego z nimi sygnału HttQ91-mCherry (Rysunek 4B).
      2. Następnie przeprowadź fotowybielanie sygnału mCherry, ustawiając laser czerwony (np. 552 nm) na 100% intensywności i skanując do momentu zaniku sygnału. Powróć do ustawień użytych dla „obrazu przed” i wykonaj „obraz po” (after image) tych samych punktów (Rysunek 4B).
      3. Oblicz pomiary intensywności fluorescencji dla każdego punktu przed i po fotowybielaniu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
      4. Oblicz wydajność FRET, odejmując fluorescencję donora YFP zmierzoną na „obrazie przed” (YFPinitial) od fluorescencji donora YFP na „obrazie po” (YFPfinal). Podziel tę wartość przez YFPfinal i pomnóż przez 100.
        UWAGA: Wydajność FRET można obliczyć dla każdego piksela lub ogólnie dla każdego agregatu HttQ25-YFP (Rysunek 4B). Fotowybielanie akceptora jest szczególnie użyteczną techniką obliczania wydajności FRET, gdy sygnał mCherry powiązany z każdym punktem HttQ25-YFP jest wystarczająco wysoki, aby po fotowybielaniu mCherry wywołać wykrywalne zniesienie wygaszania (dequenching) YFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metody opisane w niniejszym opracowaniu dostarczają wiarygodnych danych wykazujących prionopodobny transfer agregatów białka Htt z jednej populacji komórek do drugiej w nienaruszonym OUN muchy. Konwersja białka Htt typu dzikiego z formy rozproszonej w punktową jest obserwowana poprzez bezpośrednią fluorescencję tego białka fuzyjnego z YFP w glii biorcy jako wynik ekspresji HttQ91-mCherry w donorskich ORN (Rycina 2A-C oraz

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ponieważ liczba pacjentów cierpiących na choroby neurodegeneracyjne stale rośnie, istnieje pilna potrzeba lepszego zrozumienia patogenezy molekularnej tych chorób, aby można było opracować lepsze terapie. W tym miejscu opisano metody, które pozwalają na monitorowanie podobnej do prionów transmisji patogennych agregatów białkowych między różnymi typami komórek w organizmie modelowym, Drosophila melanogaster. Niedawno zastosowaliśmy tę metodologię, aby zademonstrować podobną do prionów transmisję zmutowanych agreg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratoriów Kopito, Luo i Pearce za wiele pomocnych dyskusji podczas rozwoju tych metod. Dziękujemy również Brianowi Temsamritowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez fundusze z University of the Sciences i W.W. Smith Charitable Trusts.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X, pH 7,4ThermoFisher ScientificAM9625Rozcieńczony do 1X
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
Chusteczki KimwipesThomas Scientific2904F24
20% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Sciences15713-S
Normalna surowica kozia (NGS), filtrowanaLampire Laboratoria biologiczne7332500Podaniec i zamrozić po otrzymaniu
Kurczak anty-GFPAvesLabs GFP-1020Stosować w rozcieńczeniu 1:500
Królik anty-DsRedClontech632496Stosować w rozcieńczeniu 1:2000; potrafi rozpoznać białka fluorescencyjne na bazie DsRed (np. mCherry, mStrawberry, tdTomato itp.)
Mysie badania rozwojowe anty-BruchpilotHybridoma Banknc82Stosować w rozcieńczeniu 1:100; oznaczy aktywne struktury presynaptyczne w mózgu muchy
FITC anty-kurczakThermoFisher ScientificSA1-7200Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Alexa Fluor 568 anty-królikLife TechnologiesA11011Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Alexa Fluor 647 przeciwciało anty-mysieLife TechnologieA21235Stosować w rozcieńczeniu 1:250
Slowfade Gold Antifade ReagentLife TechnologiesS36936
(25 x 75 x 1,0 mm)Fisher Scientific12-550-143
Szkło nakrywkowe (22 x 22 mm)Globe Scientific1404-15
Kleszcze Dumont Biology Grade, styl 3Ted Pella503zastosowanie w niedominującej ręce
Kleszcze Dumont Biology Grade, Styl 5Ted Pella505zastosowanie w dominującej dłoni
Oprogramowanie do analizy obrazu LAS XLeica
ImarisBitplane
Szkiełka mikroskopowe Oprogramowanie do analizy obrazu

Bibliografia

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64(2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57(2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302(2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768(2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005(2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346(2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Agregaty zmutowanej huntingtynyznakowanie bia kami fluorescencyjnymiprotok sekcji m zguobrazowanie mikroskopem konfokalnymanaliza ilo ciowa punkt w punctagenetyczne systemy steruj ceprzeniesienie rezonansowe fluorescencji
Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.